Модифікований поліпептид, обдадающий гомосеринацетилтрансферазной активністю, і экспрессирующий його мікроорганізм

 

Рівень техніки, що передує винаходу

1. Область техніки, до якої належить винахід

Даний винахід відноситься до поліпептиду, який є модифікований так, що володіє гомосеринацетилтрансферазной активністю, кодирующему його полинуклеотиду, рекомбинантному вектора, що містить полинуклеотид, мікроорганізму, який є трансформованим рекомбінантним вектором, і способу отримання O-ацетилгомосерина з використанням мікроорганізму.

2. Опис пов'язаної області

Метіонін являє собою одну з незамінних амінокислот в організмі, і широко використовується як корм для тварин і харчової добавки, а також компонента медичних водних розчинів та інших вихідних речовин для лікарських засобів. Метіонін діє як попередник холіну (лецитину) і креатиніну, і його також використовують в якості вихідної речовини для синтезу цистеїну і таурину. Крім того, він функціонує як донор сірки.

S-аденозилметионин отримують з L-метіоніну, він служить в якості донора метилу в організмі, і він бере участь у синтезі різних нейромедіаторів у головному мозку. Також виявлено, що метіонін та/або S-аденозил-L-метіонін (SAM) ія, захворювань печінки та м'язовому болю.

Метіонін можна синтезувати хімічно або біологічно для використання в кормах для тварин, їжі і лікарських препаратах.

При хімічному синтезі L-метіонін переважно отримують гідролізом 5-(β-метилмеркаптоэтил)гідантоїн. Однак хімічно синтезований метіонін має недолік, його отримують тільки в змішаній формі L-типу і D-типу.

Щодо біологічного синтезу L-метіоніну в патентній публікації США № US2005/0054060A1 описаний спосіб синтезу гомоцистеїну або метіоніну безпосередньо з використанням H2S або CH3SH, при цьому без використання цистеїну, за допомогою модифікації цистатіонін синтази для отримання мікроорганізмів. У цьому способі модифіковану цистатіонін синтезу безпосередньо вводять у клітини для синтезу метіоніну за способом внутрішньоклітинного синтезу метіоніну. Однак існують певні проблеми в цьому, цим способом отримують тільки невелика кількість метіоніну внаслідок інгібують активностей синтезованого метіоніну, обумовлених використанням внутрішньоклітинних метаболічних шляхів метіоніну, і H2S або CH3SH також викликають цитотоксичність.

Для вирішення цих п�а в L-метіонін допомогою ферментативної реакції (PCT/KR2007/003650). Цей двостадійний спосіб може вирішувати зазначені вище проблеми цитотоксичності H2S або CH3SH і інгібування метаболічного процесу одержуваним L-метіоніном. Крім того, цей спосіб характеризується тим, що він є дуже ефективним для отримання вибірково тільки L-метіоніну, а не змішаної форми D-метіоніну і L-метіоніну.

У цьому двостадійному способі O-сукцинилгомосерин і O-ацетилгомосерин можна використовувати в якості попередника метіоніну. В ході реакції конверсії метіоніну O-ацетилгомосерин є кращим O-сукцинилгомосерину щодо виходу продукту співвідношення попередника до метіоніну. Конкретно можна отримувати 0,91 моль метіоніну з 1 моль O-ацетилгомосерина, тоді як з 1 моль O-сукцинилгомосерина можна отримувати тільки 0,67 моль метіоніну. Таким чином, витрати на отримання кінцевого продукту метіоніну можна знижувати за допомогою використання O-ацетилгомосерина в якості попередника метіоніну, і високий вихід продукту O-ацетилгомосерина є визначальним фактором для масового отримання метіоніну.

При цьому використання O-ацетилгомосерина або O-сукцинилгомосерина в якості попередника метіоніну залежить від тs, продукують O-сукцинилгомосерин з гомосерина і сукцинил-КоА допомогою L-гомосерин O-сукцинилтрансферази (Biochemistry, 1999 Oct. 26, 38(43): 14416-23), і мікроорганізми, що належать до роду Corynebacterium, Leptospira, Deinococcus, Pseudomonas і Mycobacterium, продукують O-ацетилгомосерин з гомосерина і ацетил-КоА допомогою L-гомосерин O-ацетилтрансферази (Journal of Bacteriology, Mar. 2002, p. 1277-1286).

Таким чином, експресія O-ацетилгомосеринтрансферази, опосередкована введенням metX, чужорідним геном, необхідна для біосинтезу O-ацетилгомосерина з використанням мікроорганізмів роду Escherichia, яких використовують для одержання рекомбінантних білків для експериментальних і промислових цілей. Однак існують проблеми, пов'язані з негативним ставленням споживачів до введення чужорідних генів у мікроорганізми, використовувані для одержання харчових продуктів, і доказом безпеки введення чужорідних генів.

Таким чином, автори цього винаходу доклали зусиль для одержання штаму роду Escherichia, який продукує O-ацетилгомосерин, переважний щодо виходу продукту, без введення чужорідних генів. У результаті автори цього винаходу виявили, що гомосеринсукцинилтрансферазную активність�птида, одержуваного заміною глутамінової кислоти на амінокислоту в положенні 111 O-сукцинилгомосеринтрансферази, яка відбувається з E. coli, таким чином, здійснюючи даний винахід.

Сутність винаходу

Метою справжнього винаходу є надання модифікованого поліпептиду, в якому поліпептид, що володіє гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю, є конвертованим, щоб мати гомосеринацетилтрансферазной активністю.

Іншою метою цього винаходу є надання полинуклеотида, що кодує зазначений вище модифікований поліпептид.

Іншою метою цього винаходу є надання рекомбінантного вектора, що містить полинуклеотидние послідовності, функціонально пов'язані з зазначеним вище полинуклеотидом.

Іншою метою цього винаходу є надання мікроорганізму, що містить зазначений вище полинуклеотид.

Іншою метою цього винаходу є надання мікроорганізму, який трансформують у рекомбінантний вектор, функціонально пов'язаний з зазначеним вище полинуклеотидом.

Іншою метою цього винаходу є надання сп� поліпептид, володіє гомосеринацетилтрансферазной активністю.

Короткий опис креслень

Фіг. 1 являє собою діаграму, що демонструє рекомбінантний вектор, який є функціонально пов'язаним з полинуклеотидом, кодирующим модифікований поліпептид по справжньому винаходу.

На фіг. 2 представлено порівняння гомології первинних амінокислотних послідовностей гомосерин-O-сукцинилтрансферази між варіантами E. coli.

На фіг. 3 і 4 наведено порівняння гомології первинних амінокислотних послідовностей мутантної гомосерин-O-сукцинилтрансферази, стійкої до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном, в яких для порівняння використовували первинні амінокислотні послідовності гомосерин-O-сукцинилтрансферази дикого типу, стійкої до регулювання зі зворотним зв'язком мутантної гомосерин-O-сукцинилтрансферази met10A і met11A, описаних у публікації PCT № WO 2008/127240, і стійку до регулювання зі зворотним зв'язком мутантную гомосерин-O-сукцинилтрансферазу, описану в публікації PCT № WO 2005/108561, і

Фіг. 5 являє собою діаграму, що демонструє отримання FRT-одностадиной делеционной касети допомогою ПЛР за методом перекривающегося сплайсинг-розширення для �ня

В одному з аспектів для досягнення зазначених вище цілей даний винахід відноситься до модифікованому поліпептиду, що володіє гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю, який містить аминокислотную послідовність SEQ OD No:17, або щонайменше на 95% гомологичную їй, в якій амінокислота в положенні 111 від початкової амінокислоти, метіоніну, послідовності заміщена глутамінової кислотою.

В рамках винаходу поліпептид, що володіє гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю, означає поліпептид, що володіє активністю синтезувати O-сукцинилгомосерин з гомосерина і сукцинил-КоА, представлених у шляхах біосинтезу метіоніну, як показано в нижченаведеній схемі реакції.

гомосерин + сукцинил-КоА -> O-сукцинилгомосерин

Поліпептид, що володіє гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю, може представляти собою рекомбінантний поліпептид, який походить від мікроорганізму роду Enterobacteria, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus або Escherichia, переважно рекомбінантний поліпептид, що володіє гомосеринсукцинилтрансферазной активністю, який походить від мікроорганізму роду Escherichia, і більш переважно рекомбинант поліпептид, що володіє гомосерин-O-сукций гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю, може включати поліпептид, що володіє гомосеринсукцинилтрансферазной активністю, який складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO:17, або щонайменше на 95% гомологічною їй за умови, що він володіє активністю, зазначеної у наведеній вище схемі реакції.

У прикладах цього винаходу порівнювали гомологію амінокислотних послідовностей гомосерин-O-сукцинилтрансферази між різними видами E. coli. В результаті існувало менше 5% варіацій в полипептидах гомосерин-O-сукцинилтрансферази між різними видами E. coli (таким чином, вони мають щонайменше 95% гомологією), але не існувало значущої відмінності в гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активності (фіг. 2). Ці результати свідчать про те, що поліпептиди, що володіють 95% або більше гомологією по відношенню до поліпептиду SEQ ID NO:17 по справжньому винаходу, також мають ідентичною гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю, яка зрозуміла фахівцям в даній області, і яку автори цього винаходу продемонстрували.

В рамках винаходу термін "модифікований поліпептид" означає поліпептид, що володіє гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю, одержуваний посер�еразной активністю, відмінною від дикого типу. Таким чином, модифікований поліпептид по справжньому винаходу означає модифікований поліпептид, що володіє аналогічною активністю, як у наведеній нижче схемі реакції, який володіє субстратної специфічністю до ацетил-КоА на відміну від сукцинил-КоА, одержуваний заміною частини амінокислотних послідовностей поліпептиду, що володіє гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю.

гомосерин + ацетил-КоА -> O-ацетилгомосерин

У цьому винаході зазначений вище модифікований поліпептид може представляти собою модифікований поліпептид, в якому амінокислоту в положенні 111 поліпептиду, що володіє амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:17, або поліпептид, що володіє 95% або більше гомологією її послідовності, замінюють глутамінової кислоти(SEQ ID NO:18), і амінокислоту в положенні 112 поліпептиду додатково замінюють треонином (SEQ ID NO:19) або гистидином (SEQ ID NO:20).

Виявлено, що додаткова заміна треоніна або гістидину амінокислоти лейцину в положенні 112 посилює гомосеринацетилтрансферазную активність (таблиці 2 і 3).

Відповідно до одного кращого варіанту здійснення зазначений вище модифікований D NO:18-20.

У прикладах по справжньому винаходу отримують плазміду, здатну експресувати поліпептид, де амінокислота гліцин в положенні 111 гомосеринсукцинилтрансферази, кодованої геном metA E. coli, що складається з нуклеотидних послідовностей, наданих SEQ ID NO:39, замінена глутамінової кислотою, і плазміду, здатну експресувати поліпептид, де амінокислота в положенні 112 в доповнення до вказаної вище заміні, замінена треонином або гистидином (приклад 2).

Крім того, в експериментальних прикладах по справжньому винаходу продемонстровано, що тільки O-сукцинилгомосерин продуцировался CJM2 pCL_Pcj1_metA(wt) і CJM3 pCL_Pcj1_metA(wt), трансформованими плазміди, що містить ген metA дикого типу (SEQ ID NO:39). На відміну від цього, тільки O-ацетилгомосерин накопичувався штамом, який трансформували плазміди, що містить ген, що кодує модифікований поліпептид по справжньому винаходу (експериментальний приклад 2, таблиці 2 і 3).

Таким чином, мікроорганізм, экспрессирующий модифікований поліпептид по справжньому винаходу, є кращим в тому, що він здатний продукувати O-ацетилгомосерин в якості попередника метіоніну з високим виходом продукту без запровадження� модифікований поліпептид може бути стійким до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном внаслідок заміни частини амінокислот поліпептиду, володіє гомосеринсукцинилтрансферазной активністю. Таким чином, найбільш активна гомосеринсукцинилтрансфераза регулюється інгібуванням за типом зворотного зв'язку невеликою кількістю метіоніну в середовищі, і, таким чином, модифікований поліпептид по справжньому винаходу може бути стійким до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном для масового отримання O-ацетилгомосерина.

У цьому винаході можна проводити заміну амінокислоти для усунення регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном способом, описаним у публікації PCT № WO 2008/127240. У більш докладному викладі, регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном можна усувати заміною проліну для амінокислоти в положенні 29, заміною гліцину для амінокислоти в положенні 114, заміною для серину амінокислоти в положенні 140 поліпептиду, що володіє гомосеринсукцинилтрансферазной активністю, або однієї чи більше комбінаціями трьох замін амінокислот. Переважно можна замінювати дві або більше і найбільш переважно три амінокислоти.

Відповідно до одного кращого варіанту здійснення модифікований поліпептид, стійкий до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном, може представляти собою модифиц�едовательностей SEQ ID NO:21-23.

У прикладах по справжньому винаходу амінокислоти в положенні 29, 114 та 140 рекомбінантного поліпептиду, що володіє гомосеринсукцинилтрансферазной активністю, який кодує ген metA E. coli, замінювали пролін, гліцином і серином відповідно так, щоб усунути регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном. Крім того, конструювали плазміди, що містять полінуклеотиди, що кодують модифіковані поліпептиди, які мають гомосеринацетилтрансферазной активністю, які являють собою [pCL_Pcj1_metA#11(EL)], отриманий заміною глутамінової кислоти амінокислоти в положенні 111, [pCL_Pcj1_metA#11(ET)], отриманий заміною глутамінової кислоти і треоніна для амінокислот у положенні 111 і 112, і [pCL_Pcj1_metA#11(EH)], отриманий заміною глутамінової кислоти і гістидину для амінокислот у положенні 111 і 112 (приклад 3).

Крім того, в експериментальних прикладах по справжньому винаходу продемонстровано, що серед штамів, які експресують модифіковані поліпептиди, стійкі до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном, для штамів CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EH і CJM3 pCL_Pcj1_metA(#11)EH, одержуваних заміною глутамінової кислоти і гістидину для амінокислот у положенні 111 і 112, продемонстровані високі продукції O-ацетилгомосерина 11 введенням чужорідного гена гомосеринацетилтрансферази (експериментальний приклад 2, таблиці 2 і 3).

В іншому аспекті даний винахід відноситься до полинуклеотиду, кодирующему модифікований поліпептид або рекомбінантний вектор, що містить полинуклеотидние послідовності, функціонально пов'язані з полинуклеотидом.

У цьому винаході зазначений вище полинуклеотид являє собою нуклеотидний полімер, що складається з нуклеотидних мономерів, ковалентно зв'язаних в ланцюзі, і його приклади являють собою ланцюги ДНК або РНК з визначеної або більшою довжиною, і він являє собою полинуклеотид, що кодує зазначений вище модифікований поліпептид.

У цьому винаході зазначений вище полинуклеотид може представляти собою полинуклеотид, що містить будь-які нуклеотидні послідовності SEQ ID NO:24-29.

В рамках винаходу зазначений вище термін "рекомбінантний вектор" являє собою засіб для експресії модифікованого поліпептиду допомогою введення ДНК в клітину-хазяїна для отримання мікроорганізму, экспрессирующего модифікований поліпептид по справжньому винаходу, і можна використовувати відомі експресують вектори, такі як плазмідний вектор, космидний вектор і вектор на основі бактеріофага. Спецекомбинантних ДНК.

У цьому винаході рекомбінантний вектор може представляти собою вектор pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322 або pMW118 і переважно вектор pCL1920.

Термін "функціонально зв'язаний" означає, що регуляторна послідовність експресії є пов'язаною таким чином, що регулює транскрипцію і трансляцію полінуклеотидного послідовності, що кодує модифікований поліпептид, і включає підтримку конкретної рамки трансляції таким чином, що модифікований поліпептид, кодований полінуклеотидного послідовністю, продукується, коли полинуклеотидная послідовність експресується під контролем регуляторних послідовностей (включаючи промотор).

В іншому аспекті даний винахід відноситься до мікроорганізму, що містить полинуклеотид, що кодує зазначений вище модифікований поліпептид, і мікроорганізму, який трансформують рекомбінантним вектором, функціонально пов'язаних з полинуклеотидом, кодирующим зазначений вище модифікований поліпептид.

В рамках винаходу термін "трансформація" означає спосіб, в якому ген вводять у клітину-господаря для того, щоб він експресувався у клітині-хазяїні. Трансформирова�господаря або може існувати незалежно від хромосоми.

Крім того, ген містить ДНК і РНК в якості полинуклеотида, здатного кодувати поліпептид. Ген можна вводить в будь-якому вигляді за умови, що його можна вводити в клітку-господаря, і він може экспрессироваться в ній. Наприклад, ген можна вводити в клітку-господаря у вигляді экспрессирующей касети, яка являє собою полинуклеотидную конструкцію, що містить всі елементи для експресії гена самого по собі. Як правило, экспрессирующая касета містить промотор, сигнал термінації транскрипції, ділянка зв'язування рибосоми і сигнал термінації трансляції, які є функціонально пов'язаними з геном. Экспрессирующая касета може знаходитися у вигляді экспрессирующего вектора, здатного до самореплікації. Зазначений вище ген можна також вводити в клітку-господаря як сам по собі або у вигляді полінуклеотидного конструкції таким чином, щоб він був функціонально пов'язаними з послідовністю, необхідної для експресії в клітині-хазяїні.

Зазначений вище мікроорганізм являє собою прокариотический або эукариотический мікроорганізм, який здатний експресувати модифікований поліпептид допомогою змісту полинуклеотида, що кодує модифікований �ом, кодирующим модифікований поліпептид, і, наприклад, він може являти собою мікроорганізм, що належить до роду Escherichia, Bacillus, Aerobacter, Serratia, Providencia, Erwinia, Schizosaccharomyces, Enterobacteria, Zygosaccharomyces, Leptospira, Deinococcus, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Salmonella, Streptomyces, Pseudomonas, Brevibacterium або Corynebacterium.

У цьому винаході мікроорганізм экспрессирует поліпептид, що володіє гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю. Наприклад, він може являти собою мікроорганізм, що належить до роду Bacillus, Escherichia, Enterobacteria або Salmonella, переважно мікроорганізм, що належить до роду Escherichia і більш переважно E. coli.

У прикладах по справжньому винаходу отримують штами CJM2 pCL_Pcj1_metAEL, CJM2 pCL_Pcj1_metAET і CJM2 pCL_Pcj1_metAEH E. coli, трансформовані рекомбінантним вектором, що містить полинуклеотид, що кодує модифікований поліпептид по справжньому винаходу (приклад 2 і експериментальний приклад 2), та штами CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EL, CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)ET, і CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EH E. coli, трансформовані рекомбінантним вектором, що містить полинуклеотид, що кодує модифікований поліпептид, стійкий до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном і володіє гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю по справжньому изобрети CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EH позначали як CA05-0546, CA05-0547 і CA05-0548 відповідно, і вони депоновані в Корейському центрі культур мікроорганізмів станом на 14 грудня 2010 року, та їм присвоєні номери доступу KCCM11145P, KCCM11146P і KCCM11147P відповідно.

Даний винахід відноситься до модифікованому поліпептиду, що володіє гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю, в якому замінено частину амінокислотних послідовностей поліпептиду, що володіє гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю. Таким чином, кращим є те, що коли модифікований поліпептид по справжньому винаходу експресується в микроорганизме, экспрессирующем поліпептид, який має лише гомосерин-O-сукцинилтрансферазной активністю, поліпептид, що володіє гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю, може экспрессироваться без введення чужорідного гена, такого як metX, що кодує гомосерин-O-ацетилтрансфераза.

У цьому винаході зазначений вище мікроорганізм може представляти собою мікроорганізм, який додатково модифікують так, щоб він мав підвищену ацетил-КоА-синтетазной активністю, або додатково модифікують так, щоб він мав пантотенаткиназной активністю, стійкої до регуляції сретении ацетил-КоА-синтетаза і пантотенаткиназа, які походять від різних мікроорганізмів, і гени, що кодують білки, що володіють такими активностями, як правило, називають acs і coaA відповідно.

У цьому винаході підвищення ацетил-КоА-синтетазной активності можна отримувати підвищенням експресії гена за допомогою модифікації нуклеотидних послідовностей області промотору та області 5'-UTR гена acs, що кодує ацетил-КоА-синтетазу, і можна збільшувати активність білка введенням мутації в область ORF відповідного гена, і можна збільшувати рівень експресії білка введенням додаткової копії відповідного гена в хромосомі або введенням відповідного гена з власним промотором або посиленим іншим промотором в штамі.

Більш конкретно ацетил-КоА-синтетазную активність можна збільшувати за допомогою заміни промотору із збільшеною активністю, введенням мутації промотору для збільшення активності або збільшення числа копій гена, і, таким чином, даний винахід відноситься до способу поліпшення продукції O-ацетилгомосерина і одержуваної способом E. coli. Для заміни промотору із збільшеною активністю можна використовувати pTac, pTrc, pPro, pR і pL, для яких відомо, що вони володіють збільшеною актив�дуцирующему O-ацетилгомосерин штаму, в якому ген acs, що бере участь в біосинтезі ацетил-КоА є сверхэкспрессированним допомогою заміни конституційного промотору експресії, промотора pro, на його промотор. Промотор pro може являти собою частину або повну SEQ ID NO:30.

Даний винахід додатково відноситься до мікроорганізму, який вводять модифіковану пантотенаткиназу, стійку до регуляції інгібування за типом зворотного зв'язку накопиченням КоА в шляхах біосинтезу КоА. Більш конкретно амінокислоту аргінін в положенні 106 в амінокислотної послідовності пантотенаткинази замінюють аланіном (SEQ ID NO:40), таким чином, що вона стає стійкою до регуляції інгібування за типом зворотного зв'язку накопиченням КоА, що приводить до поліпшення продукції O-ацетилгомосерина.

У цьому винаході зазначений вище мікроорганізм може представляти собою мікроорганізм, в якому збільшено число копій одного або більше генів, вибраних з групи, що складається з гена, що кодує фосфоенолпируваткарбоксилаза (ppc), гена, що кодує аспартатаминотрансферазу (aspC), і гена, що кодує аспартатполуальдегидегидрогеназу (asd), або промотор гена замінюють промотором із збільшеною активністю або вводять мутацію дл�остю для синтезу O-ацетилгомосерина з фосфоенолпирувата, як продемонстровано в наведених нижче схемах реакцій. Таким чином, можна індукувати накопичення O-ацетилгомосерина в клітці збільшенням експресії генів, що володіють такими активностями.

Фосфоенолпируваткарбоксилаза (ppc)

Фосфоенолпируват + H2O + CO2<-> оксалоацетат + фосфат

Аспартатамінотрансфераза (aspC)

Оксалоацетат + глутамінат <-> аспартат + α-кетоглутарат

Аспартаткиназа (thrA)

Аспартат + АТФ <-> аспартил-4-фосфат + АДФ

Аспартатполуальдегиддегидрогеназа (asd)

Аспартил-4-фосфат + NADPH <-> аспартатполуальдегид + фосфат + NADP+

Гомосериндегидрогеназа (thrA)

Аспартатполуальдегид + NADPH <-> гомосерин

У схемах реакцій ген thrA, що кодує біфункціональний фермент аспартаткиназу/гомосериндегидрогеназу, попередньо підсилюють за допомогою ослаблення регулювання інгібування за типом зворотного зв'язку в штамі CJM2 в експериментальному прикладі 2, і решту три ферменту можна підсилювати за допомогою збільшення числа копій гена, заміною промотору зазначеного вище промотор гена зі збільшеною активністю або введенням мутації промотору для збільшення активності.

В рамках винаходу термін "збільшення числа копій" означ�визначає відповідний фермент ген.

У прикладах по справжньому винаходу штам CJM2-AP отримували за допомогою делеції промотору acs metA і штаму CJM2 з делецією metB і заміною його промотору pro, а потім трансформували, щоб він володів стійкістю до регулювання зі зворотним зв'язком coaA таким чином, щоб отримувати штам CJM2-AP/CO, володіє підвищеним пулом ацетил-КоА, з подальшим отриманням штаму CJM3, що містить дві копії трьох генів ppc, aspC і asd. Надалі конструювали штами CJM3 з введеними pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) і pCL_Pcj1_metA#11(ET) у вигляді CA05-0578, CA05-0579 і CA05-0580 відповідно і депонировали в Корейському центрі культур мікроорганізмів станом на 12 грудня 2011 року, і привласнювали номери доступу KCCM11228P, KCCM11229P і KCCM11230P відповідно (експериментальний приклад 2).

В іншому аспекті даний винахід відноситься до способу отримання O-ацетилгомосерина, що включає етапи культивування мікроорганізму, що містить полинуклеотид, що кодує модифікований поліпептид, або мікроорганізму, який трансформують рекомбінантним вектором, функціонально пов'язаних з полинуклеотидом, кодирующим модифікований поліпептид, і отримання O-ацетилгомосерина, який продукується в ході зазначеної вище культивації мікроорганізму.

В �ицированний поліпептид, можна проводити у відповідній середовищі та умовах, відомих в даній області. Фахівцям в даній області добре зрозуміло, що спосіб культивування можна легко коригувати у відповідності з вибираемим штамом.

Приклади способу культивування включають, але не обмежуються ними, періодичну, безперервну і підживлюється культуру. Використовувана в культивуванні середовище має відповідати умовам культивування конкретного штаму.

Використовувана в цьому винаході середовище може містити будь-вуглецевий джерело сахарози, глюкози, гліцерину і оцтової кислоти або їх поєднань, і прикладом джерела азоту, який необхідно використовувати, є органічні джерела азоту, такі як пептон, екстракт дріжджів, м'ясний екстракт, екстракт солоду, кукурудзяний екстракт рідкий і соєве борошно, і неорганічні джерела азоту, такі як сечовина, сульфат амонію, хлорид амонію, фосфат амонію, карбонат амонію та нітрат амонію, або їх поєднання.

В якості джерела фосфату середовище може містити первинний кислий фосфат калію, вторинний кислий фосфат калію і відповідні містять натрій солі. Середовище також може містити сіль металу, таку як сульфат ственники. Середу або попередники можна додавати в культуру періодичного типу або безперервного типу. При культивуванні можна регулювати pH культури додаванням відповідним чином сполуки, такого як гідроксид амонію, гідроксид калію, аміак, фосфорна кислота і сірчана кислота, та при культивуванні можна пригнічувати утворення піни використанням противовспенивателя, такого як складний ефір полігліколя і жирної кислоти.

Для підтримки аеробних умов культури можна вводити кисень або містить кисень газ в культуру. Для підтримки анаеробних умови і микроаэробних умов можна не вводити газ чи можна вводити азот, водень або діоксид вуглецю. Температура культури може становити від 27°с до 37°C і переважно від 30°C до 35°C. Період культивування може бути тривалим за умови, що продукується бажане речовина, і переважно становить від 10 до 100 годин.

Далі в цьому описі даний винахід більш докладно описано у відношенні прикладів і експериментальних прикладів. Проте ці приклади наведені винятково з ілюстративними цілями, і не припускають, що винахід обмежена цими прикладами.

Приклад 1: Конструкція пла�metA, кодує гомосерин-O-сукцинилтрансферазу, проводили ПЛР з використанням хромосоми штаму W3110 E. coli (номер доступу ATCC9637), що купується від Американської колекції типових культур, в якості матриці і праймерів SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2.

Застосовувані в ПЛР праймери отримували на підставі послідовності хромосоми E. coli NC_000913, зареєстрованої в банку генів Національного інституту здоров'я (NIH), і праймери SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2 містили ділянки рестрикції EcoRV та HindIII відповідно.

SEQ ID NO:1

5' AATTGATATCATGCCGATTCGTGTGCCGG 3'

SEQ ID NO:2

5' AATTAAGCTTTTAATCCAGCGTTGGATTCATGTG 3'

Для ампліфікації гена metX, що кодує гомосерин-O-ацетилтрансферазу (SEQ ID NO:44) проводили ПЛР з використанням в якості матриці хромосоми Deinococcus radiodurans і праймерів SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4. Праймери SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4 містили ділянки рестрикції EcoRV та HindIII відповідно.

SEQ ID NO:3

5' AATTGATATCATGACCGCCGTGCTCGC 3'

SEQ ID NO:4

5' AATTAAGCTTTCAACTCCTGAGAAACGCCCC 3'

ПЛР проводили в наступних умовах: денатурація при 94°C протягом 3 хвилин, 25 циклів, що складаються з денатурації при 94°C протягом 30 секунд, відпалу при 56°C протягом 30 секунд і полімеризації при 72°C протягом 5 хвилин, і полімеризації при 72°C протягом 7 хвилин.

Одержувані продукти ПЛР клонували в плазміду pCL1920, содержащу�алі клонованими плазмідами і відбирали трансформовані E. coli DH5α в середовищі LB для чашок Петрі, містить 50 мкг/мл спектиномицина, таким чином, щоб отримувати плазміди. Одержувані плазміди позначали як pCL_Pcj1_metA і pCL_Pcj1_metXdr відповідно.

Приклад 2: Конструкція модифікованого поліпептиду, що володіє гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю

Амінокислоту гліцин (Gly) у положенні 111 O-сукцинилтрансферази замінювали глутамінової кислотою (Glu) з використанням плазміди pCL_Pcj1_metA, одержуваної в прикладі 1, в якості матриці та набору для сайт-спрямованого мутагенезу (Stratagene, USA) (G111E). Послідовності використовуються праймерів представляли собою такі, як зазначено нижче:

SEQ ID NO:5

5' ttgtaactggtgcgccgctggaactggtggggtttaatgatgtc 3'

SEQ ID NO:6

5' gacatcattaaaccccaccagttccagcggcgcaccagttacaa 3'

Конструируемую плазміду, що містить мутантний ген G111E metA, позначали як pCL_Pcj1_metA(EL).

Крім того, амінокислоту гліцин (Gly) у положенні 111 O-сукцинилтрансферази замінювали глутамінової кислотою (Glu) і амінокислоту лейцин в положенні 112 O-сукцинилтрансферази замінювали треонином (L112T) або гистидином (L112H). На цей раз послідовності використовуються праймерів представляли собою такі, як зазначено нижче:

Заміна треоніна на лейцин

SEQ ID NO:7

5' tgtaactggtgcgccgctggaaaccgtggggtttaatgatgtcg 3'

SEQ ID NO:8

5' cgacatcattaaaccccacggtttccagcggcgcaccagttaca 3'

Заменр>

У числі конструйованих плазмід містить ген metA плазміду, в якій амінокислоту гліцин в положенні 111 замінювали глутамінової кислотою і амінокислоту лейцин в положенні 112 замінювали треонином, позначали як pCL_Pcj1_metA(ET). А також плазміду, що містить ген metA, в якій амінокислоту гліцин в положенні 111 замінювали глутамінової кислотою і амінокислоту лейцин в положенні 112 замінювали гистидином, позначали як pCL_Pcj1_metA(EH).

Приклад 3: Конструкція стійкого до регулювання зі зворотним зв'язком модифікованого поліпептиду, що володіє гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю

Ген metA із стійкістю до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном (metA#11) конструювали з використанням плазміди pCL_Pcj1_metA, одержуваної в прикладі 1, в якості матриці, таким же чином, як у прикладі 2. Конкретно способом, описаним у публікації PCT № WO 2008/127240, замінювали серин, глутамінову кислоту і фенілаланін у положенні 29, 114 та 140 O-сукцинилтрансферази на пролін (S29P), гліцин (E114G) і серин (F140S) відповідно. Послідовності використовуються праймерів являють собою, як зазначено нижче.

Заміна проліну на серин

SEQ ID NO:11

5' ATGACAACTTCTCGTGCGCCTGGTCAGGAAATTCG 3

SEQ ID NO:12

5' CGAATTTCCTGACCAGGCGCACGAGAAGTTGTCAT 3'

Заміна гліцину на гли�ріна на фенілаланін

SEQ ID NO:15

5' CACGTCACCTCGACGCTGAGTGTCTGCTGGGCGGT 3'

SEQ ID NO:16

5' ACCGCCCAGCAGACACTCAGCGTCGAGGTGACGTG 3'

Кожну з мутацій послідовно вводили в конструкцію плазміди, що містить ген metA(#11) з трьома мутаціями, яку позначали як pCL_Pcj1_metA#11.

Потім конструювали плазміди для експресії поліпептидів, що містять мутації ідентичні мутацій, модифікованих поліпептидів, що володіють гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю з прикладу 2, з використанням в якості матриці одержуваної плазміди pCL_Pcj1_metA#11.

У числі конструйованих плазмід містить ген metA#11 плазміду, в якій амінокислоту гліцин в положенні 111 замінювали глутамінової кислотою, позначали як pCL_Pcj1_metA#11(EL), що містить ген metA#11 плазміду, в якій амінокислоту гліцин в положенні 111 замінювали глутамінової кислотою і амінокислотою лейцин в положенні 112 замінювали треонином, позначали як pCL_Pcj1_metA#11(ET), і містить ген metA#11 плазміду, в якій амінокислоту гліцин в положенні 111 замінювали глутамінової кислотою і амінокислоту лейцин в положенні 112 замінювали гистидином, позначали як pCL_Pcj1_metA#11(EH).

Експериментальний приклад 1: Порівняння гомології між гомосеринсукцинилтрансферазой E. coli і стійкою до регулювання зі зворотним зв'язком гомосеринсукпо порядком] варіантів гомосерин-O-сукцинилтрансферази 09:H4 E. coli (штам HS), 0139:H28 E. coli (штам E24377A) і 0157:H7 E. coli (штам ATCC8739) з використанням програми CLC Main Workbench (CLC bio, Denmark).

Як показано на фіг. 2, спостерігали менше 5% варіацій у первинних амінокислотних послідовностях гомосерин-O-сукцинилтрансферази варіантів E. coli (фіг. 2).

Також порівнювали первинні амінокислотні послідовності мутантної гомосерин-O-сукцинилтрансферази, стійкої до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном, з використанням казанной вище програми. Для порівняння використовували первинні амінокислотні послідовності гомосерин-O-сукцинилтрансферази дикого типу, стійкої до регулювання зі зворотним зв'язком мутантної гомосерин-O-сукцинилтрансферази met10A і met11A, описаної в публікація PCT № WO 2008/127240, і стійкою до регулювання зі зворотним зв'язком мутантної гомосерин-O-сукцинилтрансферази, описаної в публікація PCT № WO 2005/108561.

Як показано на фіг. 3 і 4, спостерігали менше 5% варіацій у первинних амінокислотних послідовностях мутантної гомосерин-O-сукцинилтрансферази, стійкої до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном (фіг. 3 і 4).

Ці результати свідчать про те, що поліпептиди гомосерин-O-сукцинилтрансферази, що містяться в E. coli, володіли 95% й активності навіть при розходженні послідовностей менше 5%.

Експериментальний приклад 2: Порівняння субстратної специфічності та активності модифікованих поліпептидів, що володіють гомосеринацетилтрансферазной активністю

2-1: Отримання тестованих штамів

2-1-1. Делеція генів metA і metB

Для порівняння активностей модифікованих поліпептидів, що продукують надлишкові кількості O-ацетилгомосерина, отримували штам, накопичує гомосерин і містить делецию утилізації O-ацетилгомосерина. Штам з делецією генів metA і metB отримували способами з прикладів від 1-1 до 1-4, описаних у публікації патенту EP2108693A2, на основі продукує треонін штаму FTR2533 (KCCM 10541), описаного в PCT/KR2005/00344. Штам позначали як CJM2. CJM2 являє собою штам, який накопичує велику кількість гомосерина і продукує O-ацетилгомосерин або O-сукцинилгомосерин в залежності від введеного гена.

2-1-2. Заміна промотору acs

Для отримання надлишкової кількості O-ацетилгомосерина необхідно забезпечувати продукцію гомосерина і ацетил-КоА. По-перше, для забезпечення надання ацетил-КоА промотор гена acs (ацетил-КоА-синтетази) замінювали конститутивним промотором pro SEQ ID NO:30 таким чином, щоб індукувати конститутивную сверхэкспрессию бажаного генети, як показано на фіг. 5, одержувану з pKD3 (PNAS (2000) vol.97: 6640-6645) стійку до хлорамфеніколу FRT-касету піддавали ПЛР з використанням SEQ ID NO:31 і SEQ ID NO:33, і область промотору pro піддавали ПЛР з використанням SEQ ID NO:32 і SEQ ID NO:34. Два продукту ПЛР піддавали ПЛР за методом перекривающегося сплайсинг-розширення для отримання окремої касети (касета з віддаленим промотором acs-заміненим промотором pro) (Nucleic Acids Res. 1988 August 11, 16(15): 7351-7367). ПЛР проводили в наступних умовах: 30 циклів, що складаються з денатурації при 94°C протягом 30 секунд, відпалу при 55°C протягом 30 секунд і полімеризації при 72°C протягом 1 хвилини.

SEQ ID NO:31

5' AGGGGCTTCATCCGAATTGCGCCATTGTTGCAATGGCGGTGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTC 3'

SEQ ID NO:32

5' GATATTCATATGGACCATGGCTCGAGCATAGCATTTTTATCC 3'

SEQ ID NO:33

5' GGATAAAAATGCTATGCTCGAGCCATGGTCCATATGAATATC 3'

SEQ ID NO:34

5' CGATGTTGGCAGGAATGGTGTGTTTGTGAATTTGGCTCATATGTACCTTTCTCCTCTTTA 3'

Одержуваний продукт ПЛР піддавали електрофорезу на 1,0% агарозному гелі, а потім очищали ДНК з смуги приблизно 1,2 т. п. н. Одержуваний фрагмент ДНК электропорировали в штам CJM2 попередньо трансформований вектором pKD46 (PNAS (2000) vol.97: 6640-6645). Перед электропорацией штам CJM2, трансформований pKD46, культивували при 30°C в середовищі LB, що містить 100 мкг/л ампіциліну і 5 мМ L-арабинози до тих пір, поки OD600 не достигалерином. Электропорацию проводили при 2500 Ст. Отриманий штам сіяли штрихом у середу LB для чашок Петрі, що містить 25 мкг/л хлорамфеніколу, з подальшим культивуванням при 37°C протягом ночі. Потім, таким чином, відбирали штам, проявляє стійкість до хлорамфеніколу.

ПЛР проводили з використанням відібраного штаму в якості матриці та аналогічних праймерів в тих же умовах. Делецию промотору acs і заміну промотору pro встановлювали підтвердженням гена розміром 1,2 т. п. н. на 1,0% агарозному гелі. Потім штам трансформували вектором pCP20 (PNAS (2000) vol.97: 6640-6645) і культивували в середовищі LB. Конструювали кінцевий штам з віддаленим промотором acs і заміненим промотором pro, в якому розмір гена зменшували до 150 п. н. на 1,0% агарозному гелі за допомогою ПЛР у тих же експериментальних умовах, і підтверджували, що маркерний ген хлорамфеніколу видаляли. Конструированний штам позначали як CJM2-AP.

2-1-3. Заміна стійкого до регулювання зі зворотним зв'язком coaA

Для одержання штаму CJM2-AP з стійкістю до регулювання зі зворотним зв'язком coaA проводили ПЛР з використанням гДНК w3110 в якості матриці і праймерів SEQ ID NO:35 і SEQ ID NO:36, містять ділянку рестрикції EcoRI так, щоб отримувати ген coaA, що кодує пантотен�умовах 30 циклів, складаються з денатурації denaturation при 96°C протягом 30 секунд, відпалу при 50°C протягом 30 секунд і полімеризації при 72°C протягом 2 хвилин.

Після обробки одержуваного гена coaA і плазміди pSG76C (Journal of Bacteriology, July 1997, 4426-4428) ферментом рестрикції EcoRI, їх лігувати один з одним. E. coli DH5α трансформували конструированной плазміди, а потім відбирали трансформований DH5α E. coli на середовищі LB для чашок Петрі, що містить 25 мкг/мл хлорамфеніколу, так, щоб отримувати pSG-76C-coaA.

SEQ ID NO:35

5' ATGAGTATAAAAGAGCAAAC 3'

SEQ ID NO:36

5' TTATTTGCGTAGTCTGACC 3'

pSG-76C-coaA (R106A) конструювали з використанням одержуваного pSG-76C-coaA і праймерів SEQ ID NO:37 і SEQ ID NO:38 сайт-спрямованим мутагенезом (Stratagene, USA).

SEQ ID NO:37

5' GGAAAAGTACAACCGCCgccGTATTGCAGGCGctatt 3'

SEQ ID NO:38

5' AATAGCGCCTGCAATACggcGGCGGTTGTACTtttcc 3'

Штам CJM2-AP трансформували плазміди pSG76C-coaA (R106A) і культивували в середовищі LB-Cm (10 г/л дріжджового екстракту, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 25 мкг/л хлорамфеніколу) для відбору колоній, стійких до хлорамфеніколу. Відбирається трансформант представляв собою штам, в якому pSG76c-coaA (R106A) переважно вбудований в область coaA геному.

Штам з вбудованим геном coaA (R106A) трансформували вектором pASceP (Journal of Bacteriology, July 1997, 4426-4428), экспрессирующим фермент рестрикції I-SceI, який �кта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 100 мкг/л ампіциліну). Ген coaA ампліфікували з відбору штаму з використанням праймерів SEQ ID NO:35 і SEQ ID NO:36 і заміну coaA (R106) в амплифицируемом гені підтверджували секвенированием в компанії Macrogen (Корея) (Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No.22 4409-4415). Отриманий штам позначали як CJM2-AP/CO. Штам CJM2-AP/CO являє собою штам, що володіє підвищеним пулом гомосерина і ацетил-КоА.

2-1-4. Збільшення числа копій ключових генів шляхів біосинтезу гомосерина

Навіть незважаючи на те, що штам CJM2 або CJM2-AP/CO являє собою штам, продукує надмірну кількість гомосерина, збільшували число копій трьох генів ppc, aspC і asd, щоб ще додатково покращувати продукцію гомосерина. Плазміди pSG7 6c-2ppc, pSG76c-2aspC і pSG76c-2asd конструювали способами, описаними в прикладах від <1-1> <1-3> публікації патенту № KR2011-0023703, і вводили плазміди в штам CJM2-AP/CO для одержання штаму, що містить дві копії трьох генів, способом з прикладу <1-5>. Отриманий штам позначали як CJM3. CJM3 являє собою штам, який накопичує велику кількість гомосерина порівняно зі штамом CJM2 і продукує O-ацетилгомосерин або O-сукцинилгомосерин залежно від введеної плазміди.

2-2: Експериментальні спос� вводили 9 плазмід pCL_Pcj1_metX, pCL_Pcj1_metA, pCL_Pcj1_metA(EL), pCL_Pcj1_metA(EH), pCL_Pcj1_metA(ET), pCL_Pcj1_metA#11, pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) і pCL_Pcj1_metA#11(ET) в компетентні клітини за допомогою електропорації відповідно.

У їх числі штами CJM2, в які вводили pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) і pCL_Pcj1_metA#11(ET), позначали як CA05-0546, CA05-0547 і CA05-0548 відповідно. Їх депонировали в Корейському центрі культур мікроорганізмів станом на 14 грудня 2010 року і привласнювали номери доступу KCCM11145P, KCCM11146P і KCCM11147P відповідно.

Крім того, штами CJM3, в які вводили pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) і pCL_Pcj1_metA#11(ET), позначали як CA05-0578, CA05-0579 і CA05-0580 відповідно. Їх депонировали в Корейському центрі культур мікроорганізмів станом на 12 грудня 2011 року і привласнювали номери доступу KCCM11228P, KCCM11229P і KCCM11230P відповідно.

Надалі проводили тест в колбі для порівняння типів і продукції попередників метіоніну, які продукувалися кожним штамом, в які вводили 9 типів плазмід. У тесті в колбі після штриховий розведення кожного штаму на середовищі LB для чашок Петрі і культивування їх в інкубаторі при 31°C протягом 16 годин окремі колонії інокулював в 3 мл середовища LB, а потім культивували в інкубаторі при 200 об/хв/31°C протягом 16 годин.

25 мл середовища для продукції прльонов. Потім колби інкубували в інкубаторі при 200 об/хв/31°C протягом 40 годин і порівнювали ВЕРХ тип і продукцію попередника метіоніну, продукованого кожним із штамів, які вводили плазміди. Результати представлені в таблиці 2 (результати штамів типу CJM2) і в таблиці 3 (результати штамів типу CJM3).

Таблиця 1
КомпозиціяКонцентрація (на літр)
Глюкоза70 г
Сульфат амонію25 г
KH2PO41 г
MgSO4·7H2O0,5 г
FeSO4·7H2O5 мг
MnSO4·8H2O5 мг
ZnSO45 мг
Карбонат кальцію30 г
Дріжджовий екстрактТреонін1,5 м

Таблиця 2
ШтамиODСпоживання цукру (г/л)Продукт (г/л)Кількість продукції (г/л)
CJM2 pCL_Pcj1_metX35,663,8O-ацетилгомосерин12,3
CJM2 pCL_Pcj1_metA (дикий тип)31,349,1O-сукцинилгомосерин2,7
CJM2 pCL_Pcj1_metA EL32,648,3O-ацетилгомосерин2,5
CJM2 pCL_Pcj1_metA ET33,650,2O-ацетилгомосерин2,0
CJM2 pCL_Pcj1_metA EH31,947,5="1">29,556,2O-сукцинилгомосерин11,3
CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EL32,749,0O-ацетилгомосерин7,8
CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)ET3853,7O-ацетилгомосерин6
CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EH34,559,1O-ацетилгомосерин11,1

Таблиця 3
ШтамиODСпоживання цукру (г/л)Продукт (г/л)Кількість продукції (г/л)
CJM3 pCL_Pcj1_metX17,267,0O-ацетилгомосерин23,7
CJM3 pCL_Pcj1_metA (дикий тип)1,2
CJM3 pCL_Pcj1_metA EL18,560,5O-ацетилгомосерин2,1
CJM3 pCL_Pcj1_metA ET18,061,0O-ацетилгомосерин2,2
CJM3 pCL Pcj1_metA EH17,862,2O-ацетилгомосерин3,2
CJM3 pCL_Pcj1_metA(#11)14,667,0O-сукцинилгомосерин16,1
CJM3 pCL_Pcj1_metA(#11)EL17,163,2O-ацетилгомосерин12,5
CJM3 pCL_Pcj1_metA(#11)ET18,265,1O-ацетилгомосерин16,7
CJM3 pCL_Pcj1_metA(#11)EH19,067,8

Крім того, в числі трьох мутантів штамів типу CJM3 штам (EL), одержуваний заміною глутамінової кислоти амінокислоти в положенні 111, продукував 2,1 г/л O-ацетилгомосерина, тоді як штам (EH), одержуваний додаткової заміною гістидину для амінокислоти в положенні 112, продукував 3,2 г/л O-ацетилгомосерина, що є найвищим виходом продукту O-ацетилгомосерина.

Для штамів, що експресують модифіковані поліпептиди, які мають гомосеринацетилтрансферазной активністю, стійкі до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном, також продемонстровані аналогічні результати. Конкретно штам з введеним геном metA#11(EH), який володів стійкістю до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном і містив заміни глутамінової кислоти і гістидину для амінокислот у положенні 111 і 112, продукував найбільша кількість O-ацетилгомосерина (24,8 г/л), вказуючи на те, що він накапливаетJM3 pCL_Pcj1_metX, 23,7 г/л).

Ефект винаходу

По справжньому винаходу O-ацетилгомосерин можна отримувати з гомосерина без введення чужорідного гена в мікроорганізм, який экспрессирует фермент, який конвертують гомосерин в O-сукцинилгомосерин, і зазначений вище O-ацетилгомосерин можна використовувати в якості попередника для отримання метіоніну. Таким чином, коли застосовують даний винахід для отримання метіонін для застосування в харчових продуктах, воно є кращим тим, що можна вирішувати проблеми тривожності і негативного ставлення споживачів щодо введення чужорідних генів і надання докази безпеки введення чужорідних генів.

1. Модифікований поліпептид c гомосерин-O-ацетилтрансферазной активністю з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:17 або з щонайменше 95% гомологією з нею, в якому амінокислоту в положенні 111 від початкової амінокислоти метіоніну послідовності замінюють глутамінової кислотою.

2. Модифікований поліпептид з п. 1, де амінокислоту в положенні 112 поліпептиду додатково замінюють треонином або гистидином.

3. Модифікований поліпептид з п. 1 або 2, де модифікований по�. , де модифікований поліпептид проявляє стійкість до регулювання зі зворотним зв'язком метіоніном при заміні амінокислот.

5. Модифікований поліпептид з п. 4, де амінокислоту в положенні 29 замінюють пролін у положенні 114 замінюють гліцином, в положенні 140 замінюють серином, або однієї чи більше їх комбінацій.

6. Модифікований поліпептид з п. 5, де амінокислоту в положенні 112 поліпептиду додатково замінюють треонином або гистидином.

7. Модифікований поліпептид з п. 5 або 6, де модифікований поліпептид має будь-яку з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO:21-23.

8. Полинуклеотид, що кодує модифікований поліпептид з п. 1.

9. Полинуклеотид за п. 8, де полинуклеотид має будь-яку з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NO:24-29.

10. Рекомбінантний вектор експресії, що містить полинуклеотидние послідовності, функціонально пов'язані з полинуклеотидом за п. 8.

11. Мікроорганізм роду Escherichia для продукції про-ацетилгомосерина, що містить полинуклеотид за п. 8.

12. Мікроорганізм за п. 11, де мікроорганізм додатково модифікують, щоб він мав підвищену ацетил-КоА-синтетазной активністю порівняно з ендогенною ацетил-КоА-синтетазной аегуляции інгібування за типом зворотного зв'язку накопиченням КоА.

13. Мікроорганізм за п. 11, де збільшують число копій одного або більше генів, вибраних з групи, що складається з гена, що кодує фосфоенолпируваткарбоксилазу (ppc), гена, що кодує аспартатаминотрансферазу (aspC), і гена, що кодує аспартатполуальдегиддегидрогеназу (asd), або промотор гена замінюють промотором із збільшеною активністю або в нього вводять мутацію, щоб він мав підвищену активністю.

14. Мікроорганізм роду Escherichia для продукції про-ацетилгомосерина, трансформований рекомбінантним вектором за п. 10.

15. Мікроорганізм за п. 14, де мікроорганізм належить до роду Escherichia.

16. Мікроорганізм за п. 15, де мікроорганізм являє собою E. coli.

17. Мікроорганізм за п. 16, де депонований мікроорганізм під номером доступу KCCM11145P, KCCM11146P, KCCM11147P, KCCM11228P, KCCM11229P або KCCM11230P.

18. Спосіб отримання O-ацетилгомосерина, що включає культивування мікроорганізму по кожному з пп. 11-17, отримання O-ацетилгомосерина, який продукується при культивації мікроорганізму.



 

Схожі патенти:

Спосіб синтезу n-заміщених акриламидов і рекомбінантний штам rhodococcus erythropolis для його реалізації (варіанти)

Група винаходів відноситься до біотехнології. Сконструйовано рекомбінантні штами Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami МКПМ Ac-1937 і Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami МКПМ Ac-1938, конститутивно продукують фермент ациламидазу з ацилирующей активністю. Також розроблено спосіб синтезу N-заміщених акриламидов, зокрема N-изопропилакриламида і N-диметиламинопропилакриламида, з використанням цих штамів в якості біокаталізатора. Заявлені винаходи дозволяють підвищити ефективність отримання N-заміщених акриламидов. 3 н.п. ф-ли, 1 табл., 1 іл., 9 пр.

Спосіб отримання іммобілізованого біокаталізатора для синтезу водних розчинів амідів

Винахід відноситься до галузі біохімії. Запропоновано спосіб отримання іммобілізованого біокаталізатора для синтезу водних розчинів амідів, в тому числі акриламіду і нікотинаміду з нітрилів карбонових кислот. Отримують мікрогранули хітозану діаметром 1-2 мм у результаті продавлювання його 2-4% розчину в 2% оцтовій кислоті з допомогою екструдера в 1М розчин гідроксиду калію. Далі активують хітозан 0,01-0,5% розчином бензохинона у співвідношенні 1:1. Потім мобілізують ферментний препарат нитрилгидратази за 20 хв інкубації при температурі 22-25°C. Іммобілізована нитрилгидратаза при конверсії нітрилів не втрачає своєї активності щонайменше в п'ятдесяти циклах реакцій, що працює при кислотності середовища від 2,7 до 9,5. 3 іл., 5 пр.
Винахід відноситься до біотехнології, зокрема до отримання водних розчинів акриламіду

Спосіб отримання щонайменше одного органічної сполуки

Винахід відноситься до ферментативному отримання органічних сполук з щонайменше 3 атомами вуглецю або принаймні 2 атомами вуглецю і щонайменше одним атомом азоту при застосуванні містить цукор середовища, яка включає щонайменше одну частину не містять крохмаль твердих складових джерела крохмалю, для культивування мікроорганізмів
Винахід відноситься до галузі біотехнології, зокрема до способу отримання этиленненасищенного аміда або этиленненасищенной карбонової кислоти або її солі з відповідного этиленненасищенного нітрилу, в якому нітрил вводять у реакцію гідратації або гідролізу у водному середовищі в присутності біокаталізатора, в якому нітрил містить більш як 2 мас

Стійкі до ціаніду нитрилгидратази

Винахід відноситься до біотехнології і являє собою стійку до ціаніду нитрилгидратазу, продуковану мікроорганізмом роду Pseudomonas, яка володіє підвищеною стійкістю до ціаніду

Рекомбінантна днк pa3, рекомбінантна днк pqe 30-pa3, що забезпечують отримання поліпептиду a3, штам e. coli м 15-a3, трансформований рекомбінантної плазмідної днк pqe 30-pa3 і экспрессирующий рекомбінантний поліпептид a3, рекомбінантний поліпептид a3, має здатність селективно зв'язувати чва, і тест-система рфа для якісного виявлення мікроальбумінурії, тест-система для кількісного визначення мікроальбумінурії

Винаходи стосуються рекомбінантної ДНК pA3, рекомбінантної плазмідної ДНК pQE 30-pA3, штаму Е. coli М 15-A3, рекомбінантного поліпептиду A3, тест-систем для якісного виявлення та кількісного визначення мікроальбумінурії. Охарактеризована рекомбінантна ДНК pA3 отримана методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням хромосомної ДНК штаму DG 13 стрептококів групи G і сконструйованих праймерів. Амплификационний фрагмент клонували допомогою системи экспрессионних векторів pQE-pQE 30 в Е. coli М 15 з отриманням рекомбінантної ДНК pQE 30-pA3, яка кодує аминокислотную послідовність рекомбінантного поліпептиду A3, що володіє здатністю селективно зв'язувати людський сироватковий альбумін (ЧВА). Представлені винаходу можуть бути використані в медичній практиці і промисловості для виробництва тест-систем для виявлення та кількісного визначення мікроальбумінурії - одного з ранніх ознак ураження нирок у хворих на цукровий діабет та есенціальною артеріальною гіпертензією. 6 н. п. ф-ли, 9 іл., 1 табл., 8 пр.

Экспрессионная плазміда, що містить фрагмент днк, що кодує мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, бактерія e. coli - продуцент білка-попередника мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, спосіб отримання рекомбінантного мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, рекомбінантний мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом

Экспрессионная плазміда, що містить фрагмент днк, що кодує мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, бактерія e. coli - продуцент білка-попередника мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, спосіб отримання рекомбінантного мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, рекомбінантний мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом // 2550027
Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використане для рекомбінантного отримання тканинного фактора людини (чТФ). Конструюють плазміду pHYP-10ETFCS6 довжиною 5912 п. о. з фізичною картою, представленої на Фіг. 2, для експресії в бактерії роду Escherichia попередника мутеина [C245S] чТФ, що містить отщепляемий N-кінцевий лидерний пептид, що містить декагистидиновий кластер і послідовність впізнавання ентерокінази, злиту в рамці з послідовністю, кодує зазначений мутеин, злитий в рамці з послідовністю, кодує додатковий неотщепляемий C-кінцевий пептид, що містить гексагистидиновий кластер. Спосіб отримання попередника мутеина [C245S] чТФ включає культивування бактерії-продуцента в живильному середовищі, виділення тілець включення, солюбилизацию білка-попередника, металлохелатную хроматографію в денатуруючих умовах, рефолдинг і диафильтрацию розчину білка. Спосіб отримання зрілого мутеина [C245S] чТФ, включає відділення N-кінцевого лидерного пептиду від вказаного попередника мутеина з використанням ентерокінази і виділення цільового білка. Винахід дозволяє підвищити рівень біосинтезу і вихід прокоагуляционно актив�

Виділений полинуклеотид, що кодує поліпептид, залучений в біосинтез пирипиропена а, вектор і клітина-господар містять такий полинуклеотид та спосіб отримання попередника пирипиропена а (варіанти)

Представлені винаходи стосуються виділеного полинуклеотида, що кодує поліпептид, залучений в біосинтез пирипиропена А, вектора і клітини-господаря, що включають такий поліпептид, і способів отримання попередників пирипиропена А, включають культивування клітини-господаря. Представлений полинуклеотид кодує поліпептид, що володіє якою-небудь однієї або більше з активностей - поликетидсинтази, пренилтрансферази, гідроксилази, ацетилтрансферази або аденилатсинтази. Представлені винаходи дозволяють синтезувати пирипиропен А, який є інсектицидним агентом, і можуть бути використані при формуванні стійкості рослин до комах-шкідників. 5 н. і 11 з.п. ф-ли, 11 іл., 1 табл., 11 пр.

Спосіб отримання рекомбінантного ферментативно-міченого антигену g2 хантавируса в клітинах e. coli з метою його застосування у иммуноферментном при аналізі діагностики ггнс

Винахід відноситься до галузі біотехнології, зокрема до отримання рекомбінантного ферментативно-міченого антигену G2 хантавируса Добрава. Суть винаходу полягає в тому, що пропонований спосіб отримання антигену G2 хантавируса Добрава полягає в експресії антигену в клітинах E. coli у вигляді ферментативно-міченого антигену G2 хантавирусов на основі білка-антигена НТ. Ферментативної міткою для білка-антигена служить бета-галактозидаза, є високоактивним стабільним ферментом. Наявність комерційно доступного хромогенного субстрату бета-галактозидази (X-gal) дає можливість швидко оцінювати результат імунологічної реакції візуально або по зміні оптичної щільності розчину у видимій області. Винахід може бути використано для підвищення специфічності і відтворюваності імуноферментного аналізу при діагностиці ГГНС. 6 іл.

Рекомбінантний біфункціональний білок psh, володіє антиоксидантною активністю супероксиддисмутази і пероксидази, кодує його химерна нуклеїнова кислота, рекомбінантний плазмідний вектор її містить і застосування білка psh при реперфузії серця

Винахід відноситься до біохімії і являє собою новий біфункціональний білок PSH, що включає людський пероксиредоксин Prx6 і марганцеву супероксиддисмутазу MnSOD, володіє антиоксидантною активністю супероксиддисмутази і пероксидази. Описана також химерна нуклеїнова кислота, що кодує запропонований білок. Розкрито спосіб отримання запропонованого білка шляхом культивування клітин штаму E. coli BL21(PSH), трансформованих сконструйованим рекомбінантним вектором експресії на основі плазміди pET22b(+). Винахід дозволяє отримати високу вихід білка PSH, що володіє високою антиоксидантною активністю. 3 н. і 1 з.п. ф-ли, 6 іл., 3 табл., 7 пр.

Рекомбінантна днк, що кодує гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини (g-csf) і рекомбінантна плазміда рas017, що забезпечує синтез g-csf в клітинах escherichia coli

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до рекомбинантному одержанню G-CSF, і може бути використане для продукування G-CSF в клітинах Е.coli. Для ефективної продукції білка в клітинах Е.coli оптимізують послідовність ДНК, що кодує G-CSF. На основі отриманої оптимізованої послідовності ДНК конструюють плазміду pAS017, яка включає також NdeI/BamHI-фрагмент ДНК вектора рЕТМ-50 і має фізичну карту, представлену на кресленні. 2 н.п. ф-ли, 1 іл., 1 табл., 3 пр.

Рекомбінантна днк, що кодує гібридний білок епідермального фактора росту людини злитого послідовністю глутатіон-s-трансферази (gst-hegf) і рекомбінантна плазміда pas007, що забезпечує синтез gst-hegf в клітинах escherichia coli

Винахід відноситься до біотехнології, зокрема генно-інженерного отримання білків людини, і може бути використано для отримання епідермального фактора росту людини (чЭФР) у клітинах бактерій у вигляді гібридного білка з глутатіон-3-трансферазой. Конструюють рекомбинантную ДНК, що кодує гібридний білок GST-hEGF, який складається з амінокислотної послідовності глутатіон-S-трансферази та амінокислотної послідовності епідермального фактора росту людини, розділених сайтом розщеплення энтерокиназой, і характеризується нуклеотидної послідовністю SEQ ID NO:1. На основі KpnI/XhoI-фрагмента вектора рЕТ41 і зазначеної рекомбінантної ДНК створюють рекомбинантную плазміду рАS007 для експресії гібридного білка GST-hEGF в клітинах E.coli. Винахід дозволяє досягти високих рівнів експресії GST-hEGF в клітинах E.coli. 2 н.п. ф-ли, 3 іл., 1 табл., 5 пр.

Рекомбінантна плазмидная днк pg1-rm7, що забезпечує синтез гібридного білка g1-rm7, і гібридний білок, що зв'язує фактор некрозу пухлин і володіє активністю биолюминесцентной

Група винаходів відноситься до біотехнології, генної та білкової інженерії, конкретно до рекомбінантної плазмідної ДНК pG1-Rm7, що забезпечує в клітинах Escherichia coli синтез гібридного білка G1-Rm7, здатного зв'язувати фактор некрозу пухлин і володіє биолюминесцентной активністю люциферази Renilla muelleri, де зазначена плазмидная ДНК включає нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1, і може бути використана в медицині. Винаходи також відносяться до білка pG1-Rm7 з молекулярною масою 65,4 кДа, що складається з одноцепочечного антитіла проти фактора некрозу пухлин, пептиду GGSGGS і модифікованої люциферази Renalla muelleri і характеризується SEQ ID NO: 2. Винаходи дозволяють отримати високочутливий репортер для виявлення фактора некрозу пухлин методом біолюмінесцентного аналізу. 2 н.п. ф-ли, 4 іл., 3 пр.

Рекомбінантна плазмидная днк pqe-p35d, що забезпечує синтез рекомбінантного білка p35d вірусу віспи корів, штам бактерій escherichia coli - продуцент рекомбінантного білка p35d вірусу віспи корів і рекомбінантний білок p35d вірусу віспи корів, використовуваний для створення тест-систем та конструювання субодиничних вакцин проти інфекцій ортопоксвирусних

Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується отримання генетичної конструкції, що забезпечує синтез в клітинах Escherichia coli рекомбінантного білка p35d. Представлені: рекомбінантна плазмидная ДНК pQE-p35d, що забезпечує синтез рекомбінантного білка p35d вірусу віспи корів і містить у відповідності з фізичної та генетичної картою плазміди, наведеною на фіг. 2: плазмідний вектор pQE30, фрагмент, що кодує олигопептид MRGSHHHHHHG і фрагмент розміром 717 п.о., що кодує фрагмент білка р35 вірусу віспи корів з 1 по 239 амінокислотний залишок (фіг.1); штам бактерій Escherichia coli XL1Blue/pQE-p35d В-1252 - продуцент рекомбінантного білка p35d вірусу віспи корів, що містить рекомбинантную плазмидную ДНК pQE-p35d, депонований у Колекції бактерій, бактеріофагів і грибів ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» під реєстраційним номером В-1252 і рекомбінантний білок p35d вірусу віспи корів. Охарактеризовані рішення можуть бути використані для створення тест-систем та конструювання субодиничних вакцин проти ортопоксвирусних інфекцій. 3 н. п. ф-ли, 7 іл., 5 пр.

Спосіб отримання рекомбінантного антигену g2 хантавируса добрава в клітинах e.coli

Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується способу отримання рекомбінантного антигену G2 хантавирусов. Представлений спосіб характеризується тим, що ДНК конструкції pGHF, що кодує злитий білок з трьох частин, де N-кінцеве положення займає зелений флуоресцентний білок GFP, центральне - пептид довжиною 73 а.о. з послідовністю амінокислот SRKKCNFATTPICEYDGNMVSGYKKVMATIDSFQAFNTSYIHYTDEQIEWKDPDGMLKDHLNILVTKDIDFDT, а C-кінцеве - міні-домен фолдон фибритина колифага JS98C3 (фіг.2), вводять у клітини E.coli, культивують трансформовані даною конструкцією клітини, лизируют біомасу, відокремлюють нерозчинну фракцію лізату центрифугуванням, продукт експресії у формі тілець включення солюбілізують з допомогою денатурату, проводять хроматографію і використовують отриманий продукт для виявлення специфічних антитіл у сироватці хворих геморагічної гарячкою з нирковим синдромом. Представлене рішення дозволяє поліпшити відтворюваність і чутливість імуноферментного аналізу при діагностиці ГГНС. 7 іл.

Мутантні про-фосфосеринсульфгидрилази та спосіб отримання цистеїну з їх застосуванням

Група винаходів відноситься до біотехнології, зокрема до мутантної O-фосфосеринсульфгидрилазе (OPSS) з Mycobacterium smegmatis з амінокислотною послідовністю, відповідної послідовності SEQ ID NO: 1, в якій відсутні від трьох до семи C-кінцевих амінокислотних залишків. Винаходу відносяться також до молекули нуклеїнової кислоти, кодує мутантную OPSS, до экспрессионному вектору, який несе молекулу нуклеїнової кислоти, і до трансформанту, трансформированному экспрессионним вектором. Крім того, пропонується спосіб отримання цистеїну, в якому O-фосфорна-L-серин (OPS) вводиться в реакцію з сульфідом в присутності мутантної OPSS. Мутантна OPSS має поліпшену ферментативну активність і може застосовуватися для отримання L-цистеїну в умовах, сприятливих для навколишнього середовища, шляхом простої ферментативної реакції перетворення. Група винаходів забезпечує високий вихід продукції L-цестеина. 8 н. і 8 з.п. ф-ли, 7 іл., 20 табл., 19 пр.
Up!