Спосіб отримання дигаплоидних рослин ячменю з культивованих мікроспор in vitro

 

Область техніки. Винахід відноситься до галузі сільськогосподарської біотехнології, зокрема прикладних досліджень, пов'язаних зі створенням нових сортів і гібридів, і може бути затребуване освітніми та науковими установами біотехнологічного і сільськогосподарського профілю, насінницькими компаніями і селекційними станціями.

Актуальність винаходу. Ячмінь належить до числа найважливіших сільськогосподарських культур, селекції яких показана перспективність використання подвоєних гаплоидов. Використання подвоєних гаплоидов ячменю може істотно скоротити час селекційного процесу, а також підвищити його ефективність (Maluszynski М. et al. 2003).

Найбільш перспективним способом одержання гаплоидних рослин є метод індукції ембріогенезу в культурі ізольованих мікроспор (Touraev A. et al. 2009). Микроспора являє собою гаплоидную клітку вищих рослин, з якої в процесі нормального гаметофитного розвитку формується зріле пильцевое зерно, готове до запиленню. За допомогою спеціальних технологій (стресова обробка, особливий склад живильного середовища тощо) можна змінити шлях розвитку мікроспори від гаметофитного до спорофитномнное гаплоидное рослина буде мати одинарний набір хромосом, тобто геном представлений однієї алелем кожного гена. При штучному (використання антимитотических речовин) або спонтанне (мимовільне) подвоєння геному, алелі теж подвоюються і гаплоидное рослина переходить в диплоидное (дигаплоидное) стан, тобто виходить гомозіготний (инбредное) рослина. На відміну від цього при класичному розмноженні в геномі рослини об'єднуються і чоловічі і жіночі хромосоми, тобто відбувається поєднання різних алелів, які можуть маскувати один одного. Наявність всього однієї подвоєною алелі (у дигаплоидов) дозволяє ознакою проявити себе у фенотипі навіть у тому випадку, якщо спочатку в популяції він завжди рецесивний. Генетичне розщеплення при використанні дигаплоидов менш складно, що дозволяє використовувати для виділення певної комбінації генів порівняно нечисленні популяції (Wedzony М. et al. 2009).

Рівень техніки. Проблеми створення дигаплоидних рослин присвячено багато оглядів. Існують публікації і патенти на винаходи, в яких пропонується використовувати віддалену гібридизацію (Патент WO 2005084420 (2005-09-15), Kasha K. J. and Kao K. N., 1970, Mujeeb-Kazi A. and Riera-Lizarazu О., 1996), жіночий гаметофит (Патент JPH 0698648 (1994-04-12), Keller E. and Korzun L. 1996)), культуру �), SUS 6764854 В2 (2004-07-20). Через складності отримання гаплоидних рослин всі роботи описують рішення якої-небудь приватної проблеми, придатною для конкретного сорту або виду рослини.

Метод отримання гаплоидних рослин ячменю через елімінування хромосом

Даний метод заснований на феномені елімінування половини хромосом у клітинах гібридного ячменю на ранніх стадіях ембріогенезу (Kasha K. J. and Kao K. N., 1970). Цей процес можна спостерігати при межвидовом схрещуванні ячменю (Н.vulgare) з ячменем цибулинних (Н.bulbosum). Результатом такого процесу стає елімінування хромосом Н.bulbosum.

Метод отримання гаплоидних рослин через межвидовую гібридизацію вдосконалювався протягом декількох років, що зробило його досить ефективним (Hayes P. et al. 2003, Devaux P. 2003). До теперішнього часу метод елімінування хромосом дозволив отримати велику кількість гаплоидних і дигаплоидних ліній і дана технологія застосовується в селекційних програмах ряду компаній (Devaux Р. 2003).

Проте у цьому методі можна відзначити ряд істотних недоліків: складність відбору отриманих гібридів за ознакою гаплоїдії, тривалість самого експериментального процесу і його низька ефективність. До позитивних сторо�вання, і вона може бути проведена в звичайних для селекційного процесу умовах і майже не залежить від генотипу (Maluszynski М. et al. 2003).

Метод отримання гаплоидних рослин з жіночого гаметофита (партеногенез)

Протягом декількох років були зроблені спроби культивування in vitro ізольованих яйцеклітин, зародкових мішків, неопиленних зав'язей або семяпочек з метою отримання гаплоидов шляхом партеногенезу (Keller Є. and Korzun L. 1996). Найбільш ефективно даний метод показав себе на таких культурах, як картопля, цукрові буряки, цибулю і огірок (Metwally et al. 1998). Гаплоиди ячменю також були отримані за допомогою культури сім'ябруньки, однак метод виявився низькоефективних (0,2-1,4%) і трудомістким, що не дозволило знайти їй широке застосування для прикладних цілей (Yean-San L. H. 1987).

Метод отримання гаплоидних рослин ячменю культуру пиляків

Отримання гаплоидних рослин з ізольованих пиляків може проходити двома шляхами: пряма регенерація соматичних зародків (эмбриоидогенез) і через каллусогенез. Ефективність формування эмбриоидов є генотипзависимим процесом і може істотно відрізнятися, варіюючи від 0 до 95% (Germana М. А. 2011).

Суть методики полягає в тому, що з рослин, вираѻосья культивують 14-28 днів при низьких температурах 4-8°C, потім виділяють пильовики і переносять їх на бідні середовища з манітолом (0,3-0,7 М) на 3-4 дні. Після стресової обробки пильовики переносять на штучні живильні середовища і культивують в темряві при 23-28°C протягом 3-5 тижнів до формування эмбриоидов, які, в свою чергу, переносять на середовище для регенерації. Склад середовищ варіюється в залежності від генотипу (Szarejko I., Kasha K. J. 1991, Cistué L. et al. 1994, Hoekstra S. et al. 1997, Jacquard C. 2006).

Головним і суттєвим недоліком крім високої генотипической залежності цієї методики є те, що отримані рослини можуть мати різну ступінь плоїдності (із-за можливості регенерації рослин із соматичних тканин пильовика): від гаплоидних до ди-, полі - та анеуплоїдних. До того ж, при використанні цієї технології відбувається формування великої кількості альбіносів серед рослин-регенерантів (Castillo A. M. et al. 2000, Li H, Devaux P. 2005, Jacquard C. 2006, Germana M. A. 2011).

Метод отримання гаплоидних рослин через культуру ізольованих мікроспор

Інший підхід для отримання гаплоидних рослин заснований на культивуванні in vitro ізольованих мікроспор. Зовні цей метод схожий з методом ізольованих пиляків, проте у своїй основі вони сильно різняться, т�оцесс культивування в рідкому поживному середовищі генеративних клітин, звільнених від соматичних тканин пильовика. Даний метод технологічно відрізняється від культури пиляків. Головною відмінністю культури ізольованих мікроспор від культури пиляків є процес і час ізоляції микроспоральних клітин. Основна схема експерименту по ізоляції мікроспор наступна: ізольовані пильовики або фрагменти колоса мацерируются в живильному середовищі. Для ефективного виділення чистої популяції мікроспор отримана пульпа фільтрується і центрифугируется кілька разів. Подальше культивування мікроспор здійснюється в рідких поживних середовищах, склад яких розрізняється залежно від генотипів або цілей експерименту.

В даний час існує кілька патентів на даний метод отримання дигаплоидних рослин. Однак пропоновані в них методи розроблені і підходять тільки для таких культур як перець (Capsicum annuum L.) (Патент KR 100952103 (2009-07-01)) і кукурудза (Zéa máys L.) (WO 2002052926 A3 (2002-01-02)), рис (SUS 6764854 B2 (2004-07-20)). Пропонований нами метод дозволяє отримувати гаплоїдні рослини ячменю (H. vulgare).

В даний час описано два способи отримання гаплоидних рослини ячменю, які найбільш близькі до нашої роботи (Kasha K. J. et al. 2003, Devies P. A. 2003). Однак вони значно�озраст використовуваного рослини-донора, по наявності і тривалості стресовій обробки рослин, способу ізоляції мікроспор, по щільності мікроспор в індукційній живильному середовищі і складу індукційної живильного середовища та складу живильного середовища для регенерації рослин.

Запропоновані методи мають також кілька суттєвих недоліків: необхідність визначення стадії розвитку мікроспори цитологічними методами, висока частота отримання рослин-альбіносів, висока залежність ефективності отримання дигаплоидов від генотипу рослини. Ми пропонуємо ефективний малозависимий від генотипу метод отримання дигаплоидних рослин ячменю з високим рівнем спонтанного подвоєння хромосом та низьким виходом альбиносних рослин.

Подвоєння хромосом у гаплоидов

Для того щоб від гаплоидних рослин можна було отримати здорове потомство, на одній зі стадій розвитку необхідно провести подвоєння хромосом в клітинах рослини, що в більшості випадків індукується застосуванням антимитотического агента - колхіцину. Дана речовина має здатність зв'язуватися з особливими структурами клітини, відповідальними за розподіл, блокувати розбіжність дочірніх клітин, що призводить до формування клітин з двоак відносно клітин, так і у відношенні персоналу (Ade R. and Rai М. K. 2010).

Метод обробки рослин колхіцином не зазнав значних змін з 1938 року, коли він вперше був описаний (Levan А. 1938): колхіцином обробляють коріння, верхівкові меристеми і т. п. (Wong С. K. 1989, Swanson Е. В. 1990, Mathias R. and Robbelen G. 1991). Процедури обробки рослин у зв'язку з необхідністю використовувати високі концентрації препарату є потенційно небезпечними і дорогими (De Раере R. et al. 1981, Hansen F. L. et al. 1988, Barnabas B. et al. 1991, Hassawi D. S. and Liang G. H. 1991, Zhao J. P. and Davidson D. 1984).

При цьому процедура обробки рослин колхіцином не завжди дозволяє досягти бажаного результату, так як після такого впливу формується велика кількість химерних рослин, анеуплоїдів і т. д. (Zhao J. P. and Davidson D. 1984, Barnabas B. et al. 1991, Mathias R. and Robbelen G. 1991).

Структурна формула колхіцину була визначена в 1955 році (Corrodi and Hardegger, 1955). Згідно з певною структурою колхіцин являє собою комплекс з триметоксифенила, семичленного кільця, несучого ацетамид в положенні 7 і трополоновое кільце.

Для подвоєння хромосом та перекладу гаплоидних рослин ячменю в дигаплоидние ми пропонуємо використовувати аминопроизводний аналог колхіцину - N-діацетил-N-(β,γ-эпоксипропил)аминоколхицин (Малюнків�вязивать тубуліну (T. Resh and A. Touraev неопубліковані дані).

Розкриття винаходу

Розроблена методика являє собою спосіб отримання гаплоидних і дигаплоидних рослин ячменю з мікроспор, виділених з пиляків, і складається з наступних основних етапів:

- вирощування рослин-донорів при певних умовах (яровизация насіння і проростків, знижена температура повітря 15-20°C, світловий режим: 16 ч день/8 ч ніч, вологістю повітря 60-70%, інтенсивність освітлення 10000-15000 люкс, фітосанітарна обробка);

- використання рослин-донорів на стадії відкриття піхви прапорцевого листка, коли колос знаходиться всередині прапорцевого листка;

- низькотемпературна обробка свіжозібраних колосків рослин-донорів на середовищі з манітолом (при 4°C, бідна середовище з 60 г/л манітол, 7 днів);

- наявність у середовищі для індукції ембріогенезу 6% мальтози, зав'язей (10 зав. на 1,5 мл культури) та регуляторів росту рослин (1 мг/л 2,4-Д, 0,2 мг/л зеатина).

Додавання всіх компонентів середовища перед додаванням мікроспор;

- регенерація рослин з эмбриоидов на середовищі без додавання регуляторів росту рослин,

- обробка молодих гаплоидних рослин для отримання подвоєних гаплоидов (замочування тепличних растентечественной селекції (3 озимих і 3 ярих). Ефективність регенерації рослин виявилася високою для всіх досліджуваних сортів, незалежно від генотипу і становила від 16 до 20 зелених рослин на один колос. При цьому спонтанне подвоєння хромосом відбулося у 78% отриманих рослин-регенерантів. В результаті застосування N-діацетил-N-(β,γ-эпоксипропил)аминоколхицина подвоєння хромосом відбулося у 80% оброблених гаплоидних рослин і таким чином загальна ефективність методики склала від 16-19 дигаплоидних рослин на один використаний колос. Даний показник свідчить про високу ефективність запропонованого способу.

Короткий опис креслень

На кресленні представлена структурна формула N-діацетил-N-(β,γ-эпоксипропил)аминоколхицин

Здійснення винаходу

Приклад 1. Вирощування рослин-донорів

Вирощування якісних рослин-донорів є необхідною умовою для отримання эмбриогенних мікроспор для подальшого ембріогенезу і регенерації гаплоидних і дигаплоидних рослин. Крім обов'язкового захисту рослин від таких захворювань як борошниста роса, карликова іржа, кореневі гнилі та комах (павутинний кліщ, попелиці, трипси тощо), повинні бути створені оптимальні умови вегетациПодготовка і пророщування насіння. Щоб підвищити схожість насіння витримували при температурі 4°C не менше 2 тижнів, а потім шелушили для видалення щільного насінної шкірки. Для знезараження насіння обробляли 2%-ним розчином KMnO4протягом 20 хв. Обробку насіння проводили при кімнатній температурі з наступним відмиванням водопровідною водою. Для приготування 2%-ного розчину - 2 г KMnO4розчиняли у 100 мл води. Далі насіння замочували у воді на 12-24 год, а потім переносили на вологий фільтрувальний папір і культивували в темряві 2-3 дні до появи проростків, при температурі 15-20°C.

Пророслі насіння ячменю по 3-5 шт. висівали в горщики зі стерильним грунтовим субстратом (pH 6,5-7). Глибина загортання 3-4 див. Насіння пророщували в умовах штучного клімату при температурі 15/12°C (день/ніч), зі світловим режимом: 16 ч день/8 ч ніч, вологістю повітря 60-70% і інтенсивність освітлення 10000-15000 люкс. Після появи сходів температура культивування підвищувалася до 15-20°C. Насіння озимих сортів висівали на 1,5-2 місяці раніше ярових для проведення етапу яровизації.

Яровизация ячменю. Пророслі саджанці озимих сортів ячменю проходили етап яровизації протягом 1,5-2 місяців при 4°C і вологості повітря 70-80%. Після яровизації про�Після утворення 2-3 листків, перед початком стадії кущення, проводилася проривка і бракування нетипових рослин. У горщиках залишали по 1-му рослині і проводили присипку ґрунтових грунтом. Полив сумішшю з водорозчинних добрив проводили раз на 8-12 днів.

Вирощування рослин з метою отримання мікроспор.

Рослини вирощували при поливі водопровідною водою в міру підсихання ґрунтового субстрату при 60-70% вологості повітря. Для поліпшення аерації кореневої системи, проводилося розпушування верхнього ґрунтового шару не менше 1 разу на 10 днів. Температура в приміщенні підтримувалася у межах 15-20°C, освітленість 10-15 тис. люкс при 16-годинному фотопериоде. Кожні 2 тижні проводилася прикореневе підживлення рослин органічними добривами та мікроелементами.

Фітосанітарна обробка. Дуже важливим при вирощуванні рослин-донорів є запобігання захворювань рослин і поява шкідників, оскільки ці фактори сильно знижують фертильність рослин і ефективність ембріогенезу в культурі мікроспор. Перед посадкою та під час вирощування рослин проводили профілактичну обробку рослин сумішшю фунгіцидів і бактерицидів, а при виявленні уражених рослин виробляли їх негайну ізоляцію.

�епарати знижували життєздатність останніх. Після появи прапорцевого листка у рослин проводили щотижневу підгодівлю водним розчином добрив NPK(20:20:20).

Приклад 2. Збір і низькотемпературна обробка колосків

Колоски збирали з рослин-донорів на стадії, коли піхві прапорцевого листка відкривалося, але суцвіття ще знаходиться всередині прапорцевого листка. Велика частина мікроспор в таких рослинах перебували в пізньої одноядерної фазі розвитку (70-80% мікроспор).

Стебло відрізали на 8-10 см нижче колоса (прапороносець лист видаляли), поміщали в склянку з водою і переносили в лабораторію. До початку стерилізації піхві прапорцевого листка не видаляли.

В стерильних умовах (ламінарний бокс) з колоса знімали піхві прапорцевого листка і колос поміщали на 1 хв в 70%-вий етиловий спирт і потім ретельно промивали у стерильній дистильованій воді.

Потім колосся поміщали в пробірки з бідної середовищем і манітолом (KCl 1,5 г/л, MgSO4×7H2O 0,25 г/л, CaCl2×2H2O 0,1 г/л, манітол 60 г/л, калій-фосфатний буфер (pH 7) 1 мл/л, pH - 7,0) таким чином, щоб у середовищі знаходилася тільки нижня частина (ость) колоса. Пробірки, що герметично закривали і поміщали в холодильник (4°C, темрява) на 7 днів.

Приклад 3. Виділення мікроспор

У стерильних умо�ня і нижні колоски (1-2 см). Колосся розрізали на сегменти по 2-3 см і поміщають в стерильну чашу блендера (Waring Blender, USA) об'ємом від 50 до 200 мл (в залежності від кількості колосків), так щоб колоски не займали більше половини обсягу. До колосків одразу додавали охолоджену бідну середу з манітолом (2-4°C) в такому обсязі, щоб вона покривала колоски (від 25 до 100 мл). Подрібнювали при низьких оборотах близько 5 с, потім отриману суспензію пропускали через фільтр (100 мкм) стерильні колби. Потім суспензію розділяли по пробірках для центрифугування об'ємом 15 мл і центрифугували при 900 об/хв протягом 5 хв. Супернатант видаляли, а обложені мікроспори промивали шляхом дворазового центрифугування в охолодженій середовищі з манітол (по 15 мл) по 5 хв при 600 об/хв. Супернатант видаляли і до обложеним микроспорам додавали в модифіковану середу №1 (табл. 1), до приблизної щільності 2×104. Для підрахунку кількості мікроспор на мл середовища використовували камеру Горяєва. Суспензію мікроспор переносили на чашки Петрі (35×10 мм) по 1,5 мл на чашку і додавали до них свежевиделенние зав'язі (10 шт. на чашку). З кожного колоса отримували 3-4 чашки з культурою мікроспор, які щільно запечатували парафильмом (Parafilm, USA) і культивували в темнЕвежесрезанних і простерилізованих за описаною вище методикою колосків.

Таблиця 1
Склад використаних поживних середовищ для отримання гаплоидов ячменю в культурі мікроспор*
Компоненти (мг/л)Живильне середовище індукції ембріогенезу (Середа №1)Живильне середовище для культивування эмбриоидов (Середа №2)Живильне середовище для культивування рослин (Середа №3)
KNO3300030002000
(NH4)2SO4450450-
NH4NO3--1700
KH2PO4400400180
CaCl2·2H2O200200200400
Na2EDTA404040
FeSO4·7H2O303030
MnSO4·H2O1010-
MnSO4·4H2O--25
Н3ВО3336
ZnSO4·7H2O22-
ZnSO4·4H2O--9
NaMoO4·2H2O0,250,250,25
CuSO40,025--0,025
CaCl2·6H2O0,0250,0250,025
KI0,750,750,8
Гліцин--2
Міо-інозитол100100100
Pyridoxine HCl110,5
Нікотинова кислота110,5
Thiamine HCl10100,5
2,4-Д1--
Зеатин0,2td align="center">--
Глутамін500--
Мальтоза6000020000-
Сахароза--30000
Фитагель-2500-
Агар--7000
рН6,25,85,8
* - Для стерилізації рідких середовищ використовували фільтри (0,22 мкм), для стерилізації твердих середовищ - автоклавування. У всі середовища додавали (після автоклавування) антибіотик цефотаксим (200 мг/л), для запобігання контамінації культури.

Приклад 4. Індукція эмбриоидогенеза

Чашки з мікроспорії культивували в темряві при 25�бриогенеза (з мальтозою, фітогормонами і зав'язі) протягом 5 днів становить від 69 до 91% в залежності від генотипу (табл. 2). Эмбриоиди формувалися протягом 20-30 днів. Середня кількість эмбриоидов сформованих з мікроспор склало від 188 до 214 шт. на використаний колос (табл. 2).

Таблиця 2
Ефективність эмбриоидогенеза мікроспор ячменю в культурі in vitro
Сорти ячменюЗміст живих мікроспор через 5 днів культивування, %Середня кількість эмбриоидов на колосКількість зелених рослин на колос, шт.Кількість гаплоидних рослин до і після обробки N-діацетил-N-(β,γ-эпоксипропил)аминоколхицином, шт.Кількість дигаплоидних рослин, шт.
допісля
ГОРДІЙоз85%205МАЙСТЕРоз67%192196217
РУБІЖоз88%214205119
ПРЕРІЯяр91%250192019
ЗЕВСяр81%188174116
ДІНАяр69%195163016

Приклад 5. Регенерація ) з твердим середовищем №2 для культивування эмбриоидов (табл. 1) по 20-25 шт. на чашку і культивували протягом 4-5 днів в темряві. Потім чашки переносили на світло при 25°C і культивували до формування проростків (близько 2 тижнів). Приблизно 8-10% з сформувалися эмбриоидов регенерували в повноцінні зелені рослини, ще близько 2% сформованих рослин були альбіносів (табл. 2).

Після формування 2-3 листків з отриманих рослин відбирали зелені і переносили на середовище №3 Мурасіге і Скуга (Murashige Т. and Skoog F. 1962) для культивування рослин (табл. 1). Культивування здійснювали в пробірках або контейнерах зі світловим режимом: 16 год день, 8 ч ніч при 25°C до утворення добре розвинених коренів (2-4 тижні). Потім рослини витримували при 4°C протягом 4 тижнів у кліматичній камері при низкоинтенсивном світловому режимі: 8 год день, 16 ч ніч (етап яровизації). Потім збільшували температуру та інтенсивність освітлення до 15°C і 12/12 ч день/ніч відповідно. При такому режимі культивували ще 1 тиждень.

Після яровизації рослини з пробірок переносили в горщики з грунтовою сумішшю для вирощування в теплиці. Протягом першого тижня після перенесення рослин у теплицю на них залишали пластикові контейнери, які поступово відчиняли, для м'яких адаптацое подвоєння хромосом відбувалося у 78% отриманих рослин, що свідчить про високої ефективності, розробленого протоколу. Кількість отриманих дигаплоидов склало від 13 до 17 шт. на один використаний колос. Плоїдності рослин визначали з використанням стандартних методів (Maluszynski М. et al.).

Приклад 6. Обробка гаплоидних рослин ячменю антімітотіческім препаратом для отримання подвоєних гаплоидов

Рослини, які пройшли етап яровизації та адаптації до умов теплиці, доращивали до формування не менше двох пагонів. Потім рослини витягували з грунту, промивали коріння і обрізали їх на 1-2 див. Опускали коріння і нижню частину пагонів на 5-8 см у 0,05%-ний розчин антимитотического агента (500 мг/л N-діацетил-N-(β,γ-эпоксипропил)аминоколхицина + 20 мл/л DMSO + 100 мг/л гиббереллиновой кислоти + 20 крапель/л TWEEN 20) і залишали на 5 год при температурі 15-20°C і інтенсивному освітленні (10-15 тис. люкс). Потім промивали коріння проточною водою і поміщали в грунтовий грунт. Далі рослини культивували за описаною вище методикою вирощування рослин-донорів до отримання зрілих зернівок.

В результаті застосування N-діацетил-N-(β,γ-эпоксипропил)аминоколхицина подвоєння хромосом відбулося у 80% оброблених гаплоидних рослин і, таким чином, загальна ефективність м>p>1. Ade R., Rai M. K. Review: Colchicine, current advances and future prospects. 2010. Nusantara Bioscience. Vol.2, No.2, P. 90-96.

2. Barnabas Ст., Pfahler P., Kovacs G. Direct effect of colchicine on the microspore embriogenesis to produce dihaploid plants in wheat (Triticum aestivum L.) 1991. Theor Appl Genet. 81:675-678.

3. Castillo A. M., Vallés M. P., Cistué L. Comparison of anther and isolated microspore culture in barley. Effects of culture density and regeneration medium. 2000. Euphytica 113:1-8.

4. Cistué L., Ramos A., Castillo A. M., Romagosa I. Production of large numbers of doubled haploid plants from barley anthers pretreated with high concentrations of mannitol // Plant Cell. 1994. Vol.13. P. 709-712.

5. Corrodi H., Hardegger E. Die configuration des colchicins und verwandter Verbindungen Helv. Acta 1955. 38, 2030-2033.

6. De Paepe R., Bleton D., Gnangbe F. Basis and extent of genetic variability among doubled haploid plants obtained by pollen culture in Nicotiana sylvestris. 1981. Theor Appl Genet. 59:177-84.

7. Devaux P. The Hordeum bulbosum (L.) method. In: Maluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I (eds) Doubled haploid crop production in plants // A manual. 2003. P. 15-19.

8. Devies P. A. Barley isolated microspore culture (IMC) method In: Maluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I (eds) Doubled haploid crop production in plants // A manual. 2003. P 49-52.

9. Germana M. A. Anther culture for haploid and doubled haploid production // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2011. Vol. 104. P. 283-300.

10. Hansen F. L., Andersen S. B., Due I. K., Olsen A. Nitrous oxide as a possible alternative agent for chromosome doubling of wheat haploids. Plant Sci. 1988. 54:219-222.

11. Hassawi D. S., Liang G. H. Antimitotic agents: effects of double haploid production in wheat. 1991. Crop Sci. 31:723-726.

12. Hayes P., Corey A., DeNoma J. Doubled haploid production in using the barley Hordeum bulbosum (L.) technique. In: Maluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I (eds) Doubled haploid crop production in plants // A manual. 2003. P. 5-14.

13. Hoekstra S., van Bergen S/p>

14. Jacquard C., Asakaviciute R., Hamalian A. M., Sangwan R. S., Devaux P., Clément C. Barley anther culture: effects of annual cycle and spike position on microspore embryogenesis and albinism // Plant Cell Rep. 2006. Vol. 25. P. 375-381.

15. Kasha K. J., Simion E., Oro R. and Shim Y. S. Barley isolated microspore culture protocol Maluszynski M. et al. (eds.), Doubled Haploid Crop Production in Plants, 43-47.

16. Kasha K. J., Kao K. N. (1970) High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature 225:874-876.

17. Keller E. R. J., Korzun L. (1996) Ovary and ovule culture for haploid production. In: Mohan Jain S, Sopory SK, Veilleux RE (eds) In vitro Haploid Production in Higher Plants, Vol. 1, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, P. 217-236.

18. Levan A. The effect of colchicines on root mitoses in allium. 1938. Hereditas. V 24,I 4, 471-486.

19. Li H., Devaux P. Isolated microspore culture over performs anther culture for green plant regeneration in barley (Hordeum vulgare L.). Acta Physiol Plant 2005 V 27:611-619.

20. Maluszynski M., Kasha K. J., Forster B. P., Szarejko I. Doubled haploid crop production in plants: a manual // Kluwer Academic Publishers. 2003

21. Mathias R., Robbelen G. Effective diplodization of microspore-derived haploids of rape (Brassica napus L.) by in vitro colchicines treatment. 1991. Plant breed 106:82-84.

22. Metwally E. I., Moustafa S. A., El-Sawy B. I., Haroun S. A., Shalaby Т. А. (1998) Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cucurbita pepo. Plant Cell Tiss Org Cult 52:117-121.

23. Mujeeb-Kazi A., Riera-Lizarazu О. (1996) Polahaploid production in the Triticeae by sexual hybridization. In: Mohan Jain S, Sopory SK, Veilleux RE (eds) In vitro Haploid Production in Higher Plants, Vol. 1, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 275-296.

24. Murashige T. and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 15:437-497.

25. Swanson E. B. Microspore culture in Brassica. 1990. In: J. W. Walker (Eds), Methods in molecular biology. V 6. Plant cell tir and B. P., Jain, Shri Mohan Advances in Haploid Production in Higher Plants. 2009. Springer Science + Business Media B. V, ISBN 978-1-4020-8853-7.

28. Wedzony M., Forster B. P., Žur I., Golemiec E., Szechyńska-Hebda M., dmytro furayev E., Gotębiowska G. Progress in doubled haploid technology in higher plants. In: Advances in Haploid Production in Higher Plants // Springer Science. 2009. P. 1-34.

29. Wong C. K. A new approach to chromosome doubling for haploid rice plants. 1989. Theoretical and applied genetics. 149-151.

30. Yean-San L. H. Gynogenèse in vitro. Variabilité des haploides doublés issus d androgenèse in vitro et de croisement interspécifique chez Hordeum vulgare L. 1987 Thèse Doctorat d'etat, Université de Paris-sud, France.

31. Zhao J. P., Davidson D. Distribution of chromosomes into discrete group in colchicines-induced C-metaphases of barley. 1984. Caryologia. 37:331-42.

32. JPH 0698648 (1994-04-12) Method For Creating Haploid Plant From Female Gamete Of Seed Plant.

33. KR 100952103 (2009-07-01) Method For Plant Production From Embryos Obtained By Microspore Culture Of Hot Pepper (Capsicum Annuum L.).

34. SUS 6764854 B2 (2004-07-20) Methods For Generating Doubled Haploid Rice Plant.

35. US 6362393 B1 (1999-08-26) Methods For Generating Doubled Haploid Plants.

36. US 5770788 A (1995-06-06) Inducing Chromosome Doubling In Anther Culture In Maize.

37. WO 2002052926 A3 (2002-01-02) Methods For Generating Doubled Haploid Maize Plants.

38. WO 2005084420 (2005-09-15) Breeding A Material Which Can Induce Wheat Hybrids To Produce Genetically Pure Diploid Plants And The Practical Method Thereof.

1. Спосіб отримання дигаплоидних рослин ячменю з культивованих мікроспор in vitro, включає:
- вирощування рослин-донорів при зниженій температурі повітря 15-20°C, світловому режимі: 16 ч день/8 ч ніч, вологості повітря 60-70%, інтенсивності освітлення 10000-15000 люкс, з �ства піхви прапорцевого листка, коли суцвіття знаходиться всередині прапорцевого листка,
- стресову обробку колосків при 4°C, в пробірках з бідної середовищем, що містить KCl - 1,5 г/л, MgSO4×7H2O - 0,25 г/л, CaCl2×2Н2Про - 0,1 г/л, манітол - 60 г/л, калій-фосфатний буфер - 1 мл/л, pH 7,0, протягом 7 днів для перемикання з гаметофитного шляху розвитку мікроспори на спорофитний шлях,
- виділення мікроспор з колосків у стерильних умовах,
- культивування виділених мікроспор на модифікованому середовищі для індукції ембріогенезу включає 6% мальтозу, 10 зав'язей на 1,5 мл культури та регулятори росту рослин в кількості 1 мг/л 2,4-Д, 0,2 мг/л зеатина, причому додавання вищевказаних компонентів здійснюється перед додаванням мікроспор,
- регенерацію рослин з эмбриоидов шляхом культивування на твердому живильному середовищі Мурашига і Скуга без додавання регуляторів росту рослин,
- обробку гаплоидних рослин ячменю антімітотіческім препаратом N-діацетил-N-(β,γ-эпоксипропил) аминоколхицином для подвоєння хромосом та отримання дигаплоидих рослин.



 

Схожі патенти:

Опосередкована наночастинками доставка сіквенс-специфічних нуклеаз

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу введення сіквенс-специфічної нуклеази (ССН) в рослинну клітину. При цьому спосіб включає: забезпечення наявності рослинної клітини, має клітинну стінку; покриття наночастинки золота CCH; приведення рослинної клітини, має клітинну стінку, і покритою наночастинки в контакт один з одним; і інкубацію клітини, має клітинну стінку, спільно з покритою наночастицей таким чином, щоб забезпечити поглинання наночастинки і CCH у рослинну клітину, що містить клітинну стінку. Винахід дозволяє ефективно вводити ССН в рослинну клітину, має клітинну стінку. 13 з.п. ф-ли, 7 іл., 5 пр.

Білки, пов'язані з формою зерен і листя рису, гени, що кодують зазначені білки, і їх застосування

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до застосування гена, що кодує білок, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO.2, для отримання трансгенного рису з довгими, великими і численними зернами і збільшеною врожайністю, збільшеною кількістю зерен у волоті і скрученими листям. Розкрито застосування трансгенної лінії клітин рису і рекомбінантного вектора для отримання трансгенного рису з довгими, великими і численними зернами і збільшеною врожайністю, збільшеною кількістю зерен у волоті і скрученими листям. Винахід дозволяє ефективно отримувати трансгенний рис з довгими, великими і численними зернами і збільшеною врожайністю, збільшеною кількістю зерен у волоті і скрученими листям. 3 н. і 2 з.п. ф-ли, 16 іл., 4 табл., 2 пр.

Стійкі до гербіцидів рослини соняшнику

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу боротьби з бур'янами поблизу від рослини соняшнику. При цьому спосіб включає нанесення на бур'яни і рослина соняшника ефективного кількості будь-якого з гербіцидів, вибраних з групи, що складається з гербіциду імідазолінона, гербіциду сульфонілсечовини, гербіциду триазолопиримидина, гербіциду пиримидинилоксибензоата і їх сумішей. Зазначене рослина соняшника містить у своєму геномі принаймні одну копію принаймні гена синтази ацетогидроксикислоти (AHAS), що кодує стійкий до гербіциду білок, що має аминокислотную послідовність, представлену SEQ ID NO:2. Винахід дозволяє ефективно боротися з бур'янами поблизу від рослини соняшнику. 8 з.п. ф-ли, 13 іл., 14 табл.

Фарнезен-синтаза

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Представлені: виділений з томату полинуклеотид, відповідний SEQ ID NO:1, представленої в описі, або полинуклеотид, який має, щонайменше, 70% ідентичність з нуклеотидної послідовністю SEQ ID NO:1, або їх фрагмент, які кодують поліпептид з активністю фарнезен-синтази, відповідний SEQ ID NO:2, представленої в описі, або має, щонайменше, 70% ідентичність з амінокислотною послідовністю, відповідної SEQ ID NO:2, або їх частину. Описані генетичні конструкції, які містять вказаний полинуклеотид, де генетичні конструкції являють собою трансформаційний вектор і экспрессионний вектор. Розкрито трансформаційний вектор, що містить полинуклеотид, який гибридизуется з полинуклеотидом, кодирующим зазначений поліпептид. Описана клітина-господар для експресії фарнезен-синтази, що містить генетичну конструкцію, обрану з зазначених. Запропоновано спосіб отримання альфа-фарнезена і/або бета-фарнезена, що включає стадії культивування зазначеної клітини-господаря з отриманням підвищеної активності альфа-фарнезен-синтази та/або активності бета-фарнезен-синтази; і необов'язково отримання клетквания продукування рослиною альфа-фарнезена і бета-фарнезена, включає підвищення або зменшення експресії зазначеної фарнезен-синтази, де зазначеного підвищення або зменшення досягають за допомогою генетичної модифікації для зміни експресії полинуклеотида, що кодує зазначений поліпептид. Запропоновано застосування полинуклеотида по справжньому винаходу для картування молекулярного (ДНК) маркера, пов'язаного з зазначеної нуклеотидної послідовністю. Винахід дозволяє отримувати альфа-фарнезен і бета-фарнезен в клітині-хазяїні. 13 н. і 3 з.п. ф-ли, 8 іл., 1 табл., 1 пр.

Системи експресії білка

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до конструкції для експресії генів, що містить: (a) послідовність енхансера експресії, отриману з сегменту геному RNA-2 двокомпонентного РНК-вірусу родини Comoviridae, b) полилинкер для полегшення вбудовування гена в систему для експресії генів. Розкрито вектор для експресії генів, що містить зазначену конструкцію і гетерологичний ген. Також описаний вектор для експресії генів, що містить: (a) послідовність енхансера експресії, отриману з сегменту геному RNA-2 двокомпонентного РНК-вірусу родини Comoviridae, (b) гетерологичний ген, який кодує представляє інтерес білок, а також спосіб експресії представляє інтерес білка з його використанням. Розкрито спосіб підвищення активності посилення трансляції представляє інтерес гетерологічного білка з гетерологічного гена, що кодує зазначений білок, спосіб посилення трансляції представляє інтерес гетерологічного білка з гетерологічного гена або гетерологичной відкритої рамки зчитування, кодує зазначений білок. Також описаний організм-господар, трансформований вищевказаним вектором, а також спосіб отримання представляє інтерес білка, включтавляющего інтерес гетерологічного білка з гетерологічного гена. 8 н. і 18 з.п. ф-ли, 15 іл., 4 табл., 6 пр.

Рослини із зміненим зростанням і/чи розвитком і спосіб їх створення

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу збільшення біомаси або поліпшення проліферації клітин, розвитку аркуша та/або репродуктивного розвитку рослини, що містить збільшення в рослині експресії нуклеїнової кислоти, кодує Убіквітин-Специфічну Протеазу, а також до рослини, частини рослини і насіння рослини, біомаса яких збільшена або проліферація клітин, розвиток листків та/або репродуктивне розвиток яких поліпшені вказаним способом. Описані вектор для застосування в способі отримання рослин з збільшеною біомасою або покращеної проліферацією клітин, розвитком листків і/або репродуктивним розвитком, а також рослина та частина рослини, трансформовані зазначеним вектором. Розкрито застосування нуклеїнової кислоти, кодує Убіквітин-Специфічну Протеазу. Також розкрито спосіб отримання трансгенної рослини із збільшеною біомасою або поліпшеними проліферацією клітин, розвитком листків і/або репродуктивним розвитком, а також трансгенна рослина із збільшеною біомасою або поліпшеними проліферацією клітин, розвитком листків і/або репродуктивним розвитком порівняно з контрольними рослинами, отримане в результаті збільшеної ек�про отримувати рослина, біомаса якого збільшена або проліферація клітин, розвиток листків та/або репродуктивне розвиток якого покращені. 11 н. і 6 з.п. ф-ли, 11 іл., 3 табл., 28 пр.

Трансгенні рослини

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до генетичної конструкції для експресії нечутливою до треонину аспартаткинази в рослині, де конструкція містить специфічний для фази старіння промотор, функціонально пов'язаний з кодує послідовність, яка кодує поліпептид, що володіє активністю нечутливою до треонину аспартаткинази, і в якій специфічний до старіння промотор обраний із групи, що складається з SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 і SAG18, або їх функціональних варіантів, або фрагментів. Розкрито вектор, рослинна клітина, трансгенна рослина, матеріал для розмноження рослини, зібраний лист, курильний тютюн, містять вищевказану генетичну конструкцію. Також розкрито спосіб отримання трансгенної рослини, яке має здатність накопичувати треонін в в'янучих листках у більшій кількості, ніж у листках відповідного рослини дикого типу, і спосіб підвищення рівня треоніна в листі старіючого рослини до рівнів треоніна, що перевищують вміст треоніна у листках рослини дикого типу без погіршення пристосованості рослини з використанням вищевказаної генетичної конструкції. Винахід дозволяє отримувати т�даль, ніж у листках рослини дикого типу. 9 н. і 13 з.п. ф-ли, 16 іл., 2 табл., 4 пр.

Поліпшений спосіб мутагенезу з використанням поліетиленгліколь-опосередкованого введення мутагенних нуклеїнових підстав рослинні протопласти

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способів спрямованого зміни дуплексної акцепторної ДНК-послідовності та поліпшення ефективності спрямованого мутагенезу в рослинних протопластах. Заявлені способи включають введення в протопласти рослинних клітин одноцепочечного мутагенної олигонуклеотида, що має в своєму складі щонайменше один помилковий нуклеотид по відношенню до дуплексної акцепторної ДНК-послідовності, яку необхідно змінити, з використанням ПЕГ-опосередкованої трансформації. Винахід дозволяє підвищити частоту спрямованого мутагенезу. 2 н. і 8 з.п. ф-ли, 3 табл.

Гени і способи забезпечення стійкості до фітофторозу пасльонових

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до генами стійкості Rpi для підвищення стійкості до фітофторозу пасльонових рослин сімейства пасльонових, а також до білків, здатним опосередкувати відповідь проти Р.infestans. Розкрито трансгенні рослини сімейства пасльонових, що володіють підвищеною стійкістю до фітофторозу пасльонових, що містять вищевказані гени, а також спосіб отримання таких рослин. Описані вектори для експресії білка, що містять вищевказані гени. Також розкрито способи забезпечення тривалої стійкості до захворювання у картоплі з використанням вищевказаних генів. Використання винаходу дозволяє отримати рослини сімейства пасльонових, що володіють підвищеною стійкістю до фітофторозу пасльонових порівняно з рослиною сімейства пасльонових дикого типу. 9 н. і 6 з.п. ф-ли, 12 іл., 6 табл., 7 пр.

Нове з'єднання, що міститься в блакитній троянді

Даний винахід відноситься до нового з'єднанню, який представляє собою пігмент рослини, яке належить до родини Rosaceae роду Rosa, конкретно троянді. Це нове з'єднання, що міститься в блакитній троянді, здатне змінювати забарвлення кольору рослини і має хімічну структуру, представлену загальною формулою (I), зазначену нижче, де R1 представляє групу, як зазначено у п.1, і R2 - - ВІН або R1 і R2 утворюють разом-O-. Також розкрито, що зміна кольору відбувається саме в важливої частини рослини - у зрізаному квітці, 6 н. і 1 з.п. ф-ли, 3 ін., 14 іл.

Спосіб клонального мікророзмноження та оздоровлення підщеп яблуні in vitro з використанням антибіотика гризеофульвін

Винахід відноситься до сільськогосподарської біотехнології. Винахід являє собою спосіб клонального мікророзмноження підщеп яблуні ММ 106, СК 2, СК 3, СК 4, СК 7, де на етапах введення в культуру в середовище Мурасіге-Скуга додається в якості сануючих агента антибіотик гризеофульвін 500 мг/л. Винахід дозволяє підвищити вихід оздоровлених підщеп яблуні, отриманих меристемним методом in vitro за рахунок зниження частки загиблих від зараження грибний і дрожжевидной інфекцією експлантів. 1 табл., 7 пр.

Спосіб розмноження гвоздики in vitro

Винахід відноситься до галузі садівництва і може бути використане для мікророзмноження рослин гвоздики in vitro. Винахід являє собою спосіб розмноження гвоздики in vitro, включає відділення експлантів, стерилізацію, посадку на живильне середовище Мурасіге-Скуга, доповнену сахарозою 30 г/л і регуляторами росту 1 мг/л 6-бензиламинопурина і 0,2 мг/л нафтилоцтової кислоти, мікророзмноження шляхом відділення пагонів від експлантів, їх укорінення на живильному середовищі Мурасіге-Скуга та подальше вкорінення в ґрунті, який відрізняється тим, що при микроразмножении експланти укорінюють на агаризованому живильне середовище Мурасіге-Скуга, доповнену Риба-Екстра 0,01-0,1 мг/л, і укорінюють в умовах ex vitro в грунті, що складається з суміші дернової землі - 50%, торфу низинного з перегноєм - 30% і піску 20%. Винахід дозволяє спростити процес мікророзмноження. 1 табл.

Спосіб розмноження копійочник чайного (hedysarum theinum krasnob.)

Винахід відноситься до сільськогосподарської біотехнології. Винахід являє собою спосіб розмноження копійочник чайного, де визрілі простерилізовані насіння копійочник чайного (Hedysarum theinum Krasnob.) висаджують на поживні середовища Мурасіге-Скуга для введення в культуру тканини, через 20-30 діб розвинулися паростки пересаджують середовища на розмноження MS, потім утворилися конгломерати мікропагонів ділять і пересаджують на середовища, що містять 1,0 БАП+L-глютамін і аденін сульфат 100 мг/л. Рослини-регенеранти розмножують, укорінюють і адаптують до нестерильним умов. Винахід дозволяє підвищити ефективність процесу, тиражируемости, адаптації в умовах гідропоніки і отримати стандартні саджанці копійочник чайного. 4 іл., 1 табл.
Винахід відноситься до сільськогосподарської біотехнології. Винахід являє собою спосіб клонального мікророзмноження винограду in vitro з деконтаминацией від мікоплазменної інфекції, що включає микрочеренкование пробіркових рослин, висаджування їх на тверде живильне середовище Мурасіге і Скуга без ростових речовин, із зменшеною кількістю макроелементів. При цьому до складу живильного середовища додатково вводиться антибіотик гентаміцин у два етапи: при першому субкультивировании гентаміцин вводиться в концентраціях 0,05-0,3 мл/л; при другому - в концентраціях 0,01-0,04 мл/л одночасно з введенням препарату емістим в розведенні 10-6-10-12 мл/л. Використання заявленого способу дозволяє підвищити ефективність клонального мікророзмноження рослин винограду в культурі in vitro, підвищити життєздатність і вихід оздоровлених від мікоплазм рослин з поліпшеним морфогенезом і якісними характеристиками. 7 табл.

Спосіб клонального мікророзмноження винограду in vitro

Винахід відноситься до біотехнології. Винахід являє собою спосіб клонального мікророзмноження винограду in vitro, включає микрочеренкование пробіркових рослин, висаджування їх на поживне середовище в присутності ростових речовин і культивування, де висадку та культивування здійснюють на твердому живильному середовищі Мурасіге і Скуга, що містить в якості росторегулюючої речовини препарат Мелафен в концентрації 10-7-10-11%. Заявляється спосіб дозволяє збільшити вихід рослин за рахунок ефективної приживлюваності микрочеренков, хорошою регенерації, поліпшення якісних показників рослин. 6 табл.
Винахід відноситься до сільськогосподарської біотехнології. Винахід являє собою спосіб розмноження гречки in vitro, включає розмноження гречки з асептичних проростків насіння. Насіння попередньо стерилізують концентрованої сірчаної кислотою і культивують на середовищі Мурасіге і Скуга без фітогормонів. Субкультивируют, використовуючи верхню частину пагона проростка з ниркою, пазухи з отриманням микрорастений на живильному середовищі Мурасіге і Скуга з фітогормонами з вмістом сірчанокислої міді в кількості від 9,2 до 23,0 мг/л, які ділять на живці, культивують, субкультивируют і укорінюють на цій середовищі. Використання заявленого способу дозволяє підвищити ефективність процесу розмноження микрорастений гречки в умовах in vitro за рахунок її спрощення, прискорення, зниження витрат і збільшення виходу пробіркових рослин. 3 табл.
Винахід відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до селекції. Винахід являє собою спосіб підвищення коефіцієнта розмноження капусти білоголової в умовах in vitro, включає вирощування експлантів, культирование їх на живильному середовищі Мурасіге-Скуга, внесення регуляторів росту тидиазурон в концентрації 1 мг/л у поєднанні з індол-3-оцтової кислотою - 0,5 мг/л, при використанні цветолож розміром 0,2-0,3 мм, ізольованих з бутонів довжиною 0,5-0,7 мм, де квітколоже використовують за 1-2 дні до розпускання квіток і після вирощування їх на поживних середовищах культивують до утворення нирок протягом 14-21 діб. Спосіб дозволяє отримати велику кількість рослин-регенерантів з ознаками ЦМС і отримати генетично стабільний урожай селекційних зразків. 3 табл.
Спосіб регенерації адвентивних мікропагонів Hyssopus officinalis L. в умовах in vitro включає відділення листьевих дисків від мікропагонів після 4-5 пасажу, отриманих в культурі in vitro, подальше культивування їх на модифікованому живильному середовищі Мурасіге і Скуга з половинною концентрацією макроелементів і доповненої речовиною цитокининового типу дії, а саме тидиазуроном, при цьому культивування проводять при зниженій інтенсивності освітлення. 4 табл.

Спосіб отримання перстачу білої (potentilla alba)

Винахід відноситься до сільськогосподарської біотехнології. Винахід являє собою спосіб розмноження рослин перстачу білої (Potentilla alba) методом культури in vitro, включає відділення вегетативних бруньок від кореневища, стерилізацію, висаджування на поживні середовища, мікророзмноження пагонів, укорінення пагонів, адаптацію рослин-регенерантів до нестерильним умов. Використання заявленого способу дозволяє отримати більш 150 тисяч саджанців на рік від однієї експланта. 5 іл., 1 табл.
(57) Винахід відноситься до галузі біотехнології і генної інженерії. Листові експланти, вичлененние з тридцятиденних асептичних рослин вихідних сортів, вирощених в судинах 1 л, поміщають в чашки Петрі з рідким середовищем певного складу і прединкубируют, кокультивируют і культивують на поживних середовищах певного складу. При появі регенерантів розміром не менше 10 мм, їх зрізають і переносять на середовище певного складу. Проводять перший етап добору форм, стійких до збудників фітофторозу та альтернаріозу, шляхом культивування зрізаних регенерантів на середовищі МС з 50 мл/л канаміцину сульфату протягом 30-45 днів при 22-25°C і освітленості 6000-10000 лк при 16-годинному фотопериоде з подальшим відбором укорінених регенерантів картоплі з зеленим листям і стеблами. Проводять другий етап добору форм, стійких до возбудитялям фітофторозу і альтернаріозу, що включає перевірку укорінених рослин методом ПЛР на наявність цільової ДНК і розмноження регенерантів з підтвердженою ПЛР вставкою цільової ДНК микрочеренкованием. Використання заявленого способу дозволяє отримати стійкі до збудників фітофторозу та альтернаріозу форми картоплі. 5 табл.

Brassica juncea якості омега-9

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до трансгенному рослини Brassica juncea, ендогенне вміст жирних кислот насіння якого містить приблизно від 70% до 78% олеїнової кислоти за масою і від приблизно 2% до 3% ліноленової кислоти за масою, де рослина містить fad2 або fad3 алель, що кодує мутантний білок дельта-12-десатураз жирних кислот, має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO:5-7, а також до насіння вищевказаного рослини і до масла зазначеного насіння, вміст жирних кислот якого включає приблизно 70,0% до 78% олеїнової кислоти за масою і від приблизно 2% до 3% ліноленової кислоти за масою, в іншому має властивості олії насіння Brassica juncea. Винахід дозволяє ефективно отримувати олія насіння Brassica juncea, вміст жирних кислот якого включає приблизно 70,0% до 78% олеїнової кислоти за масою і від приблизно 2% до 3% ліноленової кислоти за масою. 3 н. і 4 з.п. ф-ли, 4 іл., 6 пр.
Up!