Гуманізовані антитіла проти cd79b і иммуноконъюгати і способи застосування

 

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА ПОВ'ЯЗАНІ ЗАЯВКИ

За заявкою, не є тимчасовою, поданої згідно 37 CFR §1.53(b), заявляється пріоритет згідно 35 USC §119(e) з тимчасової заявці США з серійним номером No. 60/950088, поданої 16 липня 2007 року, яка включена в цей документ у якості посилання в повному обсязі.

ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до композицій, підходящим для лікування гемопоетичної пухлини у ссавців, і до способів застосування цих композицій.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Злоякісні пухлини (рак) є другий з провідних причин смертності в США, після захворювань серця (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). Злоякісна пухлина характеризується підвищенням кількості аномальних, або неопластичних клітин, що походять з нормальної тканини, які проліферують з утворенням пухлинної маси, інвазією цих неопластичних пухлинних клітин в сусідні тканини і утворенням злоякісних клітин, які в кінцевому підсумку поширюються через кров або лімфатичну систему в регіональні лімфатичні вузли і у віддалені ділянки в результаті процесу, званого метастазуванням. У злоякісному стані клітина пролиферир�, характеризуються різними ступенями інвазивності та агресивності.

Злоякісні пухлини, які втягують клітини, утворені в ході гемопоезу - процесу, за допомогою якого утворюються клітинні елементи крові, такі як лімфоцити, лейкоцити, тромбоцити, еритроцити та природні кілери - називають гемопоэтическими злоякісними пухлинами. Лімфоцити, які можуть знаходитися в крові і лімфатичної тканини і є важливими для імунної відповіді, підрозділяють на два основних класи лімфоцитів: B-лімфоцити (B-клітини) і T-лімфоцити (Т-клітини), які опосередковують гуморальний і клітинно-опосредуемий імунітет, відповідно.

B-клітини, що дозрівають у кістковому мозку і залишають кістковий мозок, экспрессируя зв'язує антиген антитіло на їх клітинної поверхні. Коли наївна B-клітина вперше зустрічає антиген, до якого її мембраносвязанное антитіло є специфічним, клітина починає швидко ділитися і її потомство диференціюється B-клітини пам'яті і ефекторні клітини, звані "плазматичними клітинами". B-клітини пам'яті володіють більшою тривалістю життя і продовжують експресувати мембраносвязанное антитіло з тієї ж специфічністю, що і вихідна роцируют антитіло в формі, яка може секретироваться. Секретируемие антитіла є основною ефекторній молекулою для гуморального імунітету.

Пов'язані з B-клітками порушення включають, але не обмежуються ними, злоякісну лімфому (неходжкинскую лімфому, NHL), множинне миелому (MM) і хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL, B-клітинний лейкоз (CD5+ B-лімфоцити). Неходжскинские лімфоми (НХЛ), гетерогенна група злоякісних пухлин, головним чином, виникають з B-лімфоцитів, що становлять приблизно 4% від всіх знову діагностованих пухлин (Jemal, A. et al., CA-Cancer J Clin., 52: 23-47 (2002)). Агресивна NHL становить приблизно 30-40% дорослого NHL (Harris, N. L. et al., Hematol. J., 1:53-66 (2001)) і включає дифузну B-крупноклеточную лімфому (DLBCL), лімфому з клітин мантійній зони (MCL), периферичну T-клітинну лімфому і анапластическую крупноклеточную лімфому. Комбінована хіміотерапія першої лінії забезпечує лікування менш ніж половини пацієнтів з агресивною NHL, і більшість пацієнтів в кінцевому підсумку гинуть від цього захворювання (Fischer, R. I., Semin. Oncol., 27 (suppl 12): 2-8 (2000)).

T-клітини дозрівають в тимусе, який забезпечує навколишнє середовище для проліферації і диференціювання незрілих T-клітин. В ході дозрівання T-клітин, T-клеї негативну селекцію, яка допомагає визначити фенотип клітинної поверхні зрілої T-клітини. Характерними маркерами клітинної поверхні зрілих Т-клітин є комплекс CD3:T-клітинний рецептор і один з корецепторів, CD4 + або CD8.

У спробах знайти ефективні клітинні мішені для терапії злоякісних пухлин дослідники проводили пошук в цілях ідентифікації трансмембранних або іншим чином асоційованих з мембраною поліпептидів, які специфічно експресуються на поверхні одного або декількох конкретного типу(ів) злоякісних клітин у порівнянні з однією або кількома нормальної незлоякісною клітиною(ами). Часто, такі асоційовані з мембраною поліпептиди в більшій кількості експресуються на поверхні злоякісних клітин порівняно з поверхнею незлокачественних клітин. Ідентифікація таких асоційованих з пухлиною антигенних поліпептидів клітинної поверхні забезпечила можливість специфічного націлювання злоякісних клітин на знищення за допомогою терапії на основі антитіл. В цьому відношенні, наголошується, що було з'ясовано, що терапія на основі антитіл є високо ефективною при лікуванні певних злоякісних опух�користовують для лікування раку молочної залози і неходжскинской лімфоми, відповідно. Більш конкретно, HERCEPTIN® являє собою рекомбинантное утворене з ДНК гуманізоване моноклональне антитіло, який селективно зв'язується з протоонкогеном позаклітинного домену рецептора епідермального фактора росту людини 2 (HER2). Надекспресія білка HER2 спостерігається у 25-30% випадків первинного раку молочної залози. RITUXAN® являє собою отримане способами генетичної інженерії химерное моноклональне антитіло миші/людини, спрямоване проти антигену CD20, що знаходиться на поверхні нормальних і злоякісних B-лімфоцитів. Обидва ці антитіла рекомбинантно продукують у клітинах CHO.

В інших спробах з'ясувати ефективні клітинні мішені для терапії злоякісної пухлини, дослідники провели пошук, щоб ідентифікувати (1) не асоційовані з мембраною поліпептиди, які специфічно продукуються одним або кількома конкретним типом(ами) злоякісної клітини(ок) у порівнянні з одним або кількома конкретним типом(ами) незлоякісною нормальної клітини(ок), (2) поліпептиди, які продукуються злоякісними клітинами на рівні експресії, який значимо перевищує рівень експресії одного або декількох нормал�про одного (або дуже обмеженої кількості відрізняються) типу тканини(їй) як у злоякісному, так і в незлокачественном стані (наприклад, нормальна тканина передміхурової залози і пухлинна тканина передміхурової залози). Такі поліпептидів можуть залишатися розташованими внутрішньоклітинно або вони можуть секретироваться злоякісної кліткою. Більше того, такі поліпептидів можуть экспрессироваться не самої злоякісної кліткою, а, замість цього, клітинами, що продукують та/або секретують поліпептиди, що володіють ефектом стимуляції або посилення росту злоякісних клітин. Такі секретируемие поліпептиди часто представляють собою білки, які забезпечують злоякісним клітинам перевага при зростанні відносно нормальних клітин, і включають, наприклад, такі поліпептиди як ангиогенние фактори, фактори клітинної адгезії, чинники зростання і т. п. Можна очікувати, що ідентифікація антагоністів таких не асоційованих з мембраною поліпептидів може служити в якості ефективних лікарських засобів для лікування таких злоякісних пухлин. Більш того, ідентифікація особливостей експресії таких поліпептидів може бути корисною для діагностики конкретних злоякісних пухлин у ссавців.

Незважаючи на зазначені вище досягнення в терапії злоксредствах, здатних детектувати наявність пухлини у ссавця, і в ефективному інгібуванні неопластичного росту клітин, відповідно. Таким чином, завданням цього винаходу є ідентифікація поліпептидів, асоційованих з клітинною мембраною, секретуються або внутрішньоклітинних поліпептидів, експресія яких специфічно обмежена тільки одним (або дуже обмеженою кількістю різних) типом(ами) тканини, гемопоэтическими тканинами, як у злоякісному, так і в незлокачественном стані, і застосування цих поліпептидів і кодують їх нуклеїнових кислот для одержання композицій, придатних для медикаментозного лікування та/або детекції гемопоетичної злоякісної пухлини у ссавців.

CD79 являє собою компонент передачі сигналу B-клітинним рецептором, що складається з ковалентного гетеродимера, що містить CD79a (Igα, mb-1) і CD79b (Igβ, B29). Як CD79a, так і CD79b, містять позаклітинний иммуноглобулиновий домен (Ig), трансмембранний домен, домен внутрішньоклітинної передачі сигналу, домен иммунорецепторного тирозин-зв'язуючого активаторного мотиву (ITAM). CD79 експресується на B-клітинах і в клітинах неходжкінської лімфоми (НХЛ) (Cabezudo et al., Haematologica, 84:413-418 (1999); D Arena et al., Am. J. Hatsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol, 13(3): 270-7)). Середня експресія на поверхні CD79b на NHL схожа з поверхневою експресією на нормальних B-клітинах, але її рівень вище (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol, 13(3): 270-7 (2001)).

З урахуванням експресії CD79b, є корисним отримання терапевтичних антитіл до антигену CD79b, які створюють мінімальну антигенність, або не створюють її, при введенні пацієнтам, особливо при тривалому лікуванні. Даний винахід задовольняє цю та інші потреби. Даний винахід відноситься до антитілам проти CD79b, які долають обмеження сучасних терапевтичних композицій, а також забезпечують додаткові переваги, які стануть очевидними з докладного опису, нижче.

Застосування кон'югатів антитіло-лікарський засіб (ADC), тобто иммуноконъюгатов, для місцевої доставки цитотоксичних та цитостатичних засобів, тобто лікарських засобів для знищення або інгібування пухлинних клітин при лікуванні злоякісної пухлини (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4975278) дозволяє націлену доставку групи лікарського засобу в пухлини�може призводити до неприйнятних рівнів токсичності у нормальних клітинах, крім пухлинних клітин, що підлягають усуненню (Baldwin et al. (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). Спроби підвищити терапевтичний індекс, тобто максимальну ефективність і мінімальну токсичність ADC, сфокусовані на селективності поліклональних (Rowland et al. (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87) та моноклональних антитіл (mAb), а також на властивості зв'язування лікарських засобів і вивільнення лікарських засобів (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549). Групи лікарських засобів, які використовуються в конъюгатах антитіло-лікарський засіб, що містять білкові токсини бактерій, такі як дифтерійний токсин, білкові токсини рослин, такі як рицин, низькомолекулярні сполуки, такі як ауристатини, гелданамицин (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиди (EP 1391213; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), дауномицин, доксорубіцин, метотрексат і виндезин (Rowland et al. (1986), вище). Групи лікарських засобів можуть впливати на цитотоксичні та цитостатичні механізми, включаючи связиванЂва мають тенденцію до інактивації або зниження активності при конъюгировании з великими антитілами або білковими лігандами рецепторів.

Пептиди ауристатина, ауристатин E (AE) і монометилауристатин (MMAE), синтетичні аналоги доластатина (WO 02/088172), кон'югують в якості груп лікарського засобу з: (i) химерними моноклональними антитілами cBR96 (специфічними до Lewis Y на карцинома); (ii) cAC10, яке є специфічним до CD30 на гематологічних злоякісних пухлинах (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465; US 2004/0018194; (iii) антитілами проти CD20, такими як ритуксан (WO 04/032828) для лікування експресують CD20 пухлин та імунних порушень; (iv) антитілом проти EphB2R 2H9 для лікування раку ободової і прямої кишки (Mao et al. (2004) Cancer Research 64(3):781-788); (v) антитілом проти E-селектина (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); (vi) трастузумабом (HERCEPTIN®, US 2005/0238649), і (vi) антитілами проти CD30 (WO 03/043583). Варіанти ауристатина E описані в US 5767237 і US 6124431. Монометилауристатин E, кон'югований з моноклональними антитілами, описаний в Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представленої 28 березня 2004 року. Аналоги ауристатина MMAE і MMAF кон'югують з різними антитілами (US 2005/0238649).

Загальноприйняті способи приєднання, тобто зв'язування ковалентними зв'язками, групи лікарського засобу з антитілом, як пра�ами антитіла. Наприклад, цитотоксичні лікарські засоби, як правило, кон'югують з антитілами часто через численні залишки лізину антитіла, з утворенням гетерогенної суміші антитіло-лікарський засіб. Залежно від умов реакції, гетерогенна суміш, як правило, містить антитіла з діапазоном пов'язаних з ним груп лікарського засобу від 0 до 8. Крім того, в кожній підгрупі кон'югатів з конкретним числовим відношенням груп лікарського засобу до антителу знаходиться потенційно гетерогенна суміш, де група лікарського засобу пов'язана з різними ділянками антитіла. Аналітичні та препаративні методи можуть бути недостатніми для поділу і охарактеризации типів молекул кон'югату антитіло-лікарський засіб у гетерогенної суміші, отриманої при реакції кон'югації. Антитіла являють собою великі, комплексні та структурно різноманітні біомолекули, часто зі безліч реакційно-здатних функціональних груп. Їх реакційна здатність до линкерним реагентів і проміжним з'єднанням лікарський засіб-лінкер залежать від таких факторів, як рн, концентрація, концентрація солі і сорастворители. Більш того, многостадийтеризации реагентів і проміжних сполук.

Тиольние групи цистеїну є реакційно-здатними при нейтральних значеннях рн, на відміну від більшості амінів, які є протонированними і менш нуклеофільними при рн близько 7. Оскільки вільні тиольние (RSH, сульфгідрильні) групи є відносно реакційно-здатними, білки із залишками цистеїну часто знаходяться в окисленій формі в якості пов'язаних дисульфідом олігомерів або мають дисульфідними групами з внутрішніми містками. Позаклітинні білки, як правило, не мають вільних тіолів (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, page 55). Тиольние групи цистеїну антитіл, як правило, є більш реакційно-здатними, тобто більш нуклеофільними, щодо електрофільних реагентів для кон'югації, ніж аміногрупи або гідроксильні групи антитіла. Залишки цистеїну вбудовували в білки способами генетичної інженерії для утворення ковалентних зв'язків з лігандами або для утворення нових внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків (Better et al. (1994) J. Товарbiol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Хмара et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; US 6248564). Однак вбудовування тиоа є потенційно проблематичною, зокрема у разі неспарених (вільних Cys) залишків або залишків, які є відносно доступними для реакції або окислення. У концентрованих розчинах білка, як в периплазмеE. coli, так і в культуральних супернатантах, або в частково або повністю очищеному білку, неспарені залишки Cys на поверхні білка можуть утворювати пари і окислюватися з утворенням міжмолекулярних дисульфидов, і, таким чином, димерів або мультимеров білків. Освіта дисульфидного димеру робить новий Cys нереакционно-здатним для кон'югації з лікарським засобом, лігандом або інший міткою. Більш того, якщо білок окислювальним шляхом утворює внутримолекулярную дисульфідні зв'язки між знову конструированним залишком Cys та існуючим залишком Cys, обидві тиольние групи Cys є недоступними для участі і взаємодій в активному центрі. Більш того, білок може стати неактивним або неспецифічним внаслідок неправильного згортання або втрати третинної структури (Zhang et al. (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9).

Антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну конструюють як FAB-фрагментів антитіл (тво-Fab) і експресують як повнорозмірних моноклональних антитіл IgG (тво-лок). Антитіла тво-Fab і тво-Mab кон'югують через линкери на знову внесених тиольних групах цистеїну з допомогою реакційно-здатних до тиолу линкерних реагентів і реагентів лікарський засіб-лінкер з отриманням кон'югатів антитіло-лікарський засіб (тво-ADC).

Всі посилання, цитовані в цьому документі, включаючи патентні заявки та публікації, включені в якості посилань в повному обсязі.

СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ

Винахід відноситься до антитілам проти CD79b або їх функціональним фрагментів, і до способу їх застосування для лікування гемопоетичних пухлин.

В одному аспекті винахід відноситься до антителу, яке пов'язується, переважно специфічно, з будь-яким з описаних вище або нижче поліпептидів. Необов'язково, антитіло являє собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, включаючи Fab-, Fab'-, F(ab')2- і Fv-фрагмент, диатело (diabody), однодоменное антитіло, химерное антитіло, гуманізоване антитіло, одноцепочечное антитіло або антитіло, який конкурентно інгібує зв'язування антитіла проти поліпептиду CD79b з його відповідним антигенним эпитопом. Антитіла по справжньому винаходу необов'язково можна конъюгировать з інгібуючим зростання средствоолостатина або калихеамицин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолитический фермент або подібні з ними. Антитіла по справжньому винаходу необов'язково можна продукувати у клітках CHO або в бактеріальних клітинах, і переважно вони індукують загибель клітини, з якої вони зв'язуються. Для цілей детекції, антитіла по справжньому винаходу можна мітити піддається детекції міткою, пов'язувати з твердою підкладкою або подібні з ними.

В одному аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де одновалентна афінність (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагменти до CD79b) або афінність антитіла до CD79b в його двовалентній формі (наприклад, афінність антитіла у вигляді фрагмента IgG до CD79b) є по суті такою ж як, нижчою або вищою ніж, одновалентна афінність або афінність в двовалентній формі, відповідно, антитіла миші (наприклад, афінність антитіла миші у вигляді Fab-фрагменти або у вигляді фрагмента IgG до CD79b) або химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді Fab-фрагменти або у вигляді фрагмента IgG до CD79b), що містить послідовність вариабельного домену легкого ланцюга і важкої ланцюга, як показано на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), сос�тителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до CD79b) становить 2,0 нМ.

В одному аспекті передбачено антитіло, яке пов'язується з CD79b, де антитіло містить: (a) щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість HVR, вибраних з групи, що складається з:

(i) HVR-L1, містить послідовність A1-A15, де A1-A16 являє собою KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(ii) HVR-L2, що містить послідовність B1-B7, де B1-B7 являє собою LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(iii) HVR-L3, містить послідовність C1-C9, де C1-C9 являє собою WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61)

(iv) HVR-H1, містить послідовність D1-D10, де D1-D10 являє собою GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(v) HVR-H2, що містить послідовність E1-E18, де E1-E18 являє собою GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO:63) і

(vi) HVR-H3, що містить послідовність F1-F6, де F1-F10 являє собою ARNLYL (SEQ ID NO:64).

В одному аспекті предусмотривается антитіло, яке пов'язується з CD79b, де антитіло містить щонайменше один варіант HVR, де варіант послідовності HVR містить модифікацію щонайменше одного залишку послідовності, представленого в SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 або 64.

В одному аспекті винахід відноситься до антителу, що містить варіабельний дор>В одному аспекті винахід відноситься до антителу, що містить варіабельний домен легкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-LC, HVR2-LC і/або HVR3-LC, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:23-25).

В одному аспекті винахід відноситься до антителу проти CD79b, що містить варіабельний домен важкої ланцюга SEQ ID NO:16. В іншому аспекті винахід відноситься до антителу проти CD79b, що містить варіабельний домен легкої ланцюга SEQ ID NO:12.

В одному аспекті винахід відноситься до антителу проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну, який містить один або кілька залишків амінокислоти цистеїну і послідовність, обрану з SEQ ID NO:91-122. Антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну може зв'язуватися з поліпептидом CD79b. Антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну можна отримувати за допомогою процесу, що включає заміну одного або декількох амінокислотних залишків вихідного антитіла проти CD79b цистеїном.

В одному аспекті винахід відноситься до антителу проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну, який містить один або кілька вільних залишків амінокислоти цистеїну, де антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну зв'язується з пів�ходного антитіла проти CD79b цистеїном, де початкове антитіло містить щонайменше одну послідовність HVR, обрану з:

(a) HVR-L1, містить послідовність A1-A15, де A1-A16 являє собою KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59);

(b) HVR-L2, що містить послідовність B1-B7, де B1-B7 являє собою LVSKLDS (SEQ ID NO:60);

(c) HVR-L3, містить послідовність C1-C9, де C1-C9 являє собою WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61) або FQGTHFPFT (SEQ ID NO:79);

(d) HVR-H1, містить послідовність D1-D10, де D1-D10 являє собою GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62);

(e) HVR-H2, що містить послідовність E1-E18 де E1-E18 являє собою GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO:63);

(f) HVR-H3, що містить послідовність F1-F6, де F1-F10 являє собою ARNLYL (SEQ ID NO:64).

Антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну може представляти собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, химерное антитіло, гуманізоване антитіло, одноцепочечное антитіло або антитіло, який конкурентно інгібує зв'язування антитіла проти поліпептиду CD79b з його відповідним антигенним эпитопом. Антитіла по справжньому винаходу необов'язково можна конъюгировать з інгібуючим зростання засобом або цитотоксичним засобом, таким як токсин, включаючи, наприклад, ауристатин або майтанзиноид. Антитіла за настояѾ вони інгібують ріст або проліферацію клітини, з якою вони зв'язуються, або індукують її загибель. Для діагностичних цілей, антитіла по справжньому винаходу можна мітити піддається детекції міткою, пов'язувати з твердою підкладкою, або подібні з ними.

В одному аспекті винахід відноситься до способів одержання антитіла щодо винаходу. Наприклад, винахід відноситься до способу отримання антитіла проти CD79b (яке, як зазначено в цьому документі, включає интактное антитіло і його фрагменти), причому зазначений спосіб включає експресію у відповідній клітині-хазяїні рекомбінантного вектора по винаходу, що кодує зазначене антитіло (або його фрагмент), і виділення зазначеного антитіла.

В одному аспекті винахід відноситься до фармацевтичного складу, що містить антитіло щодо винаходу або кон'югат антитіло-лікарський засіб щодо винаходу, і фармацевтично прийнятний розчинник, носій або эксципиент.

В одному аспекті винахід відноситься до виробу, що містить контейнер; і композиції, що знаходиться в контейнері, де композиція містить одне або кілька антитіл проти CD79b щодо винаходу.

В одному аспекті винахід відноситься до набору, містить перший контейнер, що містить пісні>� одному аспекті винахід відноситься до застосування антитіла проти CD79b щодо винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення.

В одному аспекті винахід відноситься до застосування виробу щодо винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення.

В одному аспекті винахід відноситься до застосування набору винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення.

В одному аспекті винахід відноситься до способу інгібування росту клітини, яка экспрессирует CD79b, причому зазначений спосіб включає контактування зазначеної клітини з антитілом щодо винаходу, тим самим викликаючи інгібування росту зазначеної клітини. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті �ться до способу медикаментозного лікування ссавця, має злоякісну пухлину, яка містить клітку, яка экспрессирует CD79b, причому зазначений спосіб включає введення вказаною ссавцю терапевтично ефективного кількості антитіла щодо винаходу, тим самим ефективно здійснюючи лікування зазначеного ссавця. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу лікування або профілактики клітинно-проліферативного порушення, пов'язаного з підвищеною експресією CD79b, причому зазначений спосіб включає введення індивіду, нужденному в такому лікуванні, ефективного кількості антитіла щодо винаходу, тим самим ефективно здійснюючи лікування або профілактику зазначеного клітинно-проліферативного порушення. В одному варіанті здійснення, зазначене проліферативне порушення являє собою злоякісну пухлину. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу�ок в ток зростання, причому зазначений спосіб включає контактування клітини з ефективним кількістю антитіла щодо винаходу, тим самим інгібуючи зростання зазначеної клітини. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу медикаментозного лікування пухлини у ссавця, де зростання зазначеної пухлини щонайменше частково залежить від ефекту CD79b на посилення росту, причому зазначений спосіб включає контактування клітини з ефективним кількістю антитіла щодо винаходу, тим самим ефективно здійснюючи лікування зазначеної пухлини. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу лікування злоякісної пухлини, що включає введення пацієнту фармацевтичного складу, що містить иммуноконъюгат, описаний у цьому документі, прийнятний розчинник, носій або эксципиент.

В одному аспекті винахід відноситься до способу інгібування пролиф�умовах, дозволяють зв'язування иммуноконъюгата з CD79b.

В одному аспекті винахід відноситься до способу визначення наявності CD79b в зразку, імовірно містить CD79b, причому зазначений спосіб включає вплив на вказаний зразок антитіла щодо винаходу, і визначення зв'язування зазначеного антитіла з CD79b у зазначеному зразку, де зв'язування зазначеного антитіла з CD79b у зазначеному зразку вказує на наявність зазначеного білка в зазначеному зразку.

В одному аспекті винахід відноситься до способу діагностики клітинно-проліферативного порушення, пов'язаного із збільшенням числа клітин, таких як B-клітини, що експресують CD79b, причому спосіб включає контактування досліджуваних клітин в біологічному зразку з будь-якими із зазначених вище антитіл; визначення рівня антитіла, що зв'язався з досліджуваними клітинами в зразку, шляхом детекції зв'язування антитіла з CD79b; і порівняння з рівнем антитіла, що зв'язався з клітинами, в контрольному зразку, де рівень зв'язався антитіла нормалізований щодо кількості експресують CD79b клітин в тестованому та контрольному зразках, і де більш високий рівень антитіла, зв'язався з досліджуваним зразком порівняно з контрольним образ>p>В одному аспекті винахід відноситься до способу детекції розчинної CD79b в крові або сироватці, причому спосіб включає контактування досліджуваного зразка крові або сироватці від ссавця, імовірно страждає B-клітинно-проліферативним порушенням, з антитілом проти CD79b щодо винаходу, і детекцію підвищення розчинної CD79b в тестованому зразку щодо контрольного зразка крові або сироватки від здорового ссавця.

В одному аспекті винахід відноситься до способу зв'язування антитіла з винаходу з клітиною, яка экспрессирует CD79b, причому зазначений спосіб включає контактування зазначеної клітини з антитілом щодо винаходу. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

КОРОТКИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ

На малюнку 1 представлена нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO:1) кДНК PRO36249, де SEQ ID NO:1 являє собою клон, позначуваний в цьому документі як "DNA225786" (також позначається у цьому документ як "CD79b"). Нуклеотидна послідовність кодує CD79b, і кодон ініціації і стоп-кодон показано напівжирним шрифтом Љей послідовністю SEQ ID NO:1, представленої на малюнку 1.

На малюнку 3 представлена нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO:3) легкого ланцюга химерного 2F2 (ch2F2) IgG1 (2F2 являє собою моноклональне антитіло миші проти CD79b). Нуклеотидна послідовність кодує легку ланцюг ch2F2, представлену на фігурі 4, і перший кодон (кодує першу амінокислоту SEQ ID NO:4) зазначено жирним шрифтом і підкреслять.

На малюнку 4 представлена амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:4), утворена кодує послідовністю SEQ ID NO:3, представленої на малюнку 3. Вариабельние області представляють собою не підкреслені області.

На малюнку 5 представлена нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO:5) важкої ланцюга химерного 2F2 (ch2F2) IgG1 (2F2 являє собою моноклональне антитіло миші проти CD79b). Нуклеотидна послідовність кодує важку ланцюг ch2F2, представлену на фігурі 6, і перший кодон (кодує першу амінокислоту SEQ ID NO:6) зазначено жирним шрифтом і підкреслять.

На малюнку 6 представлена амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:6), утворена кодує послідовністю SEQ ID NO:5, представленої на малюнку 5. Вариабельние області представляють собою не підкреслені ділянки.

На фігурі 7 представлено виравнЕть легкої ланцюга каппа I людини (позначена як "huKI"; SEQ ID NO:9) з VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4 (SEQ ID NO:65-68, відповідно), антитіло 2F2 миші проти CD79b (позначене як "mu2F2" і також в цьому документі позначається як "2F2"; SEQ ID NO:10), "гуманізоване" антитіло з пересадженою послідовністю 2F2 (позначається як "hu2F2 з пересадженою послідовністю"; SEQ ID NO:11) і варіант 7 "гуманизированного" антитіла з пересадженою послідовністю 2F2 (позначається як "hu2F2.D7"; SEQ ID NO:12) (містить 71A, 73T і 78A). Положення пронумеровані згідно Кабат, і гипервариабельние області (HVR), пересаджені з 2F2 миші в консенсусну каркасну область змінної галузі легкої ланцюга каппа I, укладені в рамку.

На фігурах 8A-B представлено вирівнювання послідовностей варіабельних областей важких ланцюгів для наступних: консенсусна послідовність важкої ланцюга підгрупи III людини (позначена як "humIII"; SEQ ID NO:13) з VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 і VH-FR4 (SEQ ID NO:69-72, відповідно), антитіло 2F2 миші проти CD79b (позначене як "mu2F2" і також в цьому документі позначається як "2F2"; SEQ ID NO:14), "гуманізоване" антитіло з пересадженою послідовністю 2F2 (позначається як "hu2F2 з пересадженою послідовністю"; SEQ ID NO:15) (містить 71A, 73T і 78A) і варіант 7 "гуманизированного" антитіла з пересаджений�ласно Кабат, і гипервариабельние області (HVR), пересаджені з mu2F2 в консенсусну каркасну область змінної галузі важкої ланцюга підгрупи III, укладені в рамку.

На фігурі 9 представлена послідовність HVR обраного варіанту "гуманизированного" антитіла з пересадженою послідовністю 2F2 (SEQ ID NO:18), де варіант володіє безліччю змін амінокислот в окремій області HVR "гуманизированного" антитіла з пересадженою послідовністю 2F2 (частина HVR-L3 (SEQ ID NO:61) представлена на фігурі 9 в якості SEQ ID NO:17). Послідовності змінної галузі легкої ланцюга і змінної галузі важкої ланцюга поза показаних амінокислотних змін були ідентичні пересадженої послідовності 2F2 і не показані. Не було виявлено змін у HVR-L1 (SEQ ID NO:59), HVR-L2 (SEQ ID NO:60), HVR-H1 (SEQ ID NO:62); HVR-H2 (SEQ ID NO:63) або HVR-H3 (SEQ ID NO:64) "гуманизированного" антитіла з пересадженою послідовністю 2F2.

На фігурі 10 представлений аналіз Biacore вибраних антитіл проти CD79b, включаючи антитіло ch2F2 (позначається як "ch2F2"), "гуманізоване" антитіло з пересадженою послідовністю 2F2 (позначається як "hu2F2 з пересадженою послідовністю" і також позначається в цьому документі як "2F2 з пересадженою послідовністю"), і позначених антигенів, включаючи позаклітинний домен CD79b людини (huCD79becd), позаклітинний домен CD79b людини, злитий з Fc (huCD79becd-Fc), і пептид з 16 амінокислот, містить епітоп для 2F2 (16-мірний пептид; SEQ ID NO:78; епітоп з амінокислот 1-11 SEQ ID NO:78). Не виявлене зв'язування позначено на фігурі як "NB".

На фігурі 11A-B (консенсусні каркасні області змінної галузі важкої ланцюга (VH)) і на фігурі 12 (консенсусні каркасні області змінної галузі легкої ланцюга (VL)) представлені ілюстративні послідовності акцепторних консенсусних каркасних областей людини для застосування на практиці цього винаходу з такими ідентифікаторами послідовностей: (постать 11A-B) консенсусна каркасна область VH підгрупи I людини без CDR за Кабат (SEQ ID NO:36), консенсусна каркасна область VH підгрупи I людини без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:37-39), консенсусна каркасна область VH підгрупи II людину без CDR за Кабат (SEQ ID NO:40), консенсусна каркасна область VH підгрупи II людину без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:41-43), консенсусна каркасна область VH підгрупи III людини без CDR за Кабат (SEQ ID NO:44), консенсусна каркасна область VH підгрупи III людини без подовжених гіпер�я каркасна область VH людини без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:49-50), акцепоторная каркасна область 2 VH людини без CDR за Кабат (SEQ ID NO:51) і акцепоторная каркасна область 2 VH людини без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:52-54) і (фігура 12) консенсусна каркасна область VL підгрупи I капа людини (SEQ ID NO:55), консенсусна каркасна область VL підгрупи II каппа людини (SEQ ID NO:56), консенсусна каркасна область VL підгрупи III каппа людини (SEQ ID NO:57) і консенсусна каркасна область VL підгрупи IV каппа людини (SEQ ID NO:58).

На фігурі 13A (легка ланцюг) і 13B (важка ланцюг) показана амінокислотна послідовність антитіла щодо винаходу (2F2.D7). На фігурах 13A (легка ланцюг) і 13B (важка ланцюг) представлені амінокислотні послідовності каркасної області (FR), гипервариабельной області (HVR), першого константного домену (CL або CH1) і Fc-області (Fc) одного з варіантів здійснення антитіла щодо винаходу (hu2F2.D7) (SEQ ID NO:19-26 (фігура 13A) і SEQ ID NO:27-35 (фігура 13B)). Представлені повнорозмірні амінокислотні послідовності (вариабельние і константние ділянки) легкої і важкої ланцюгів 2F2.D7 (SEQ ID NO:89 (фігура 13A) і 90 (фігура 13B) відповідно, і константние домени підкреслені. Показано амінокислотні послідовності варіабельних доменів (SEQ ID NO:12 (фігура 13A для легкого ланцюга) иностей CD79b людини (SEQ ID NO:2), яванського макака (cyno) (SEQ ID NO:7) та миші (SEQ ID NO:8). CD79b людини і яванського макака володіють 85% амінокислотної ідентичністю. Вказані сигнальна послідовність, досліджуваний пептид (епітоп з 11 амінокислот для антитіла 2F2, описаний у прикладі 1; амінокислоти 1-11 (ARSEDRYRNPK) SEQ ID NO:78), трансмембранний (TM) домен і домен иммунорецепторного зв'язує тирозин активаційного мотиву (ITAM). Область, укладена в рамку, являє собою область CD79b, яка відсутня у варіанті з сплайсингу CD79b (описаному в прикладі 1).

На фігурі 15 представлено зображення кон'югатів антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу (ADC), де група лікарського засобу пов'язана з вбудованою групою цистеїну в: легкого ланцюга (LC-ADC); важкої ланцюга (HC-ADC); Fc-області (Fc-ADC).

На фігурі 16 представлені стадії: (i) відновлення адуктів дисульфіду цистеїну і межцепочечних і внутрицепочечних дисульфидов в антителе проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну (тво-Mab) відновником TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфіну гідрохлорид); (ii) часткове окиснення, тобто повторне окислення для перетворення межцепочечних і внутрицепочечних дисульфидов, за допомогою dhAA (дегидроаскорбиново�о-лінкер з утворенням кон'югату антитіла проти CD79b з вбудованими залишками цистеїну та лікарського засобу (ADC).

На фігурі 17 представлена (A) послідовність легкого ланцюга (SEQ ID NO:86) і (B) послідовність важкої ланцюга (SEQ ID NO:85) гуманизированного антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну (thio-hu2F2.D7-HC-A118C), в якому аланін в положенні 118 по EU (положення аланіну по послідовності 118; положення Кабат 114) важкої ланцюга замінений на цистеїн. Група лікарського засобу може бути пов'язана з вбудованою групою цистеїну в важкої ланцюга. На кожній фігурі змінена амінокислота представлена напівжирним шрифтом з подвійним підкресленням. Одноразовим підкресленням показано константние області. Вариабельние області представляють собою не підкреслені області. Fc-область позначено курсивом. "Тво" відноситься до антителу зі вбудованим в нього цистеїном, а "hu" відноситься до гуманизированному антителу.

На фігурі 18 представлені (A) послідовність легкого ланцюга (SEQ ID NO:88) і (B) послідовність важкої ланцюга (SEQ ID NO:87) антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну (Thio-hu2F2.D7-LC-V205C), в якому валін у положенні 205 з Кабат (положення в послідовності: валін 210) легкого ланцюга замінений цистеїном. Амінокислота D в положенні 6 по EU (зафарбований на фігурі) важкої ланцюга альтернативно може перед ланцюга. На кожній фігурі змінена амінокислота показана напівжирним шрифтом з подвійним підкресленням. Одноразовим підкресленням вказані константние області. Вариабельние області представляють собою не підкреслені області. Fc-область позначено курсивом. "Тво" відноситься до антителу з вбудованими в нього залишками цистеїну.

На фігурі 19 представлений графік інгібування росту пухлиниin vivoв моделі з ксенотрансплантацией BJAB-люцифераза, який демонструє, що введення антитіл проти CD79b ((a) ch2F2-SMCC-DM1, навантаження лікарським засобом становила приблизно 3 (таблиця 7) і (b) hu2F2.D7-SMCC-DM1, навантаження лікарським засобом становила приблизно 2,3 (таблиця 7)), мишам SCID, має B-клітинні пухлини людини, значимо інгібувало зростання пухлини. Контроль включали HERCEPTIN® (трастузумаб)-SMCC-DM1 (антитіло проти HER2-SMCC-DM1). "hu" відноситься до гуманизированному антителу і "ch" відноситься до химерному антителу.

На фігурі 20A представлений графік інгібування росту пухлиниin vivoв моделі з ксенотрансплантатом Granta-519 (лімфома з клітин мантійній зони людини), на якому показано, що введення антитіла проти CD79b, hu2F2.D7-SMCC-DM1, навантаження лікарським засобом становила приблизно 2,8 (таблиця 8), мишЂрастузумаб)-SMCC-DM1 (антитіло проти HER2-SMCC-DM1). На фігурі 20B представлений графік відсоткового зміни маси мишей у дослідженні з ксенотрансплантатом Granta-519 (фігура 20A і таблиця 8), на якому показано, що відсутні значні зміни маси протягом перших 7 діб дослідження, "hu" відноситься до гуманизированному антителу.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ПЕРЕВАЖНИХ ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ

Даний винахід відноситься до способів, композиціям, наборів і виробів для ідентифікації композицій, придатних для лікування гематопоэтических пухлин у ссавців, і до способів застосування зазначених композицій.

У цьому документі представлені деталі цих способів, композицій, наборів і виробів.

I.Загальні способи

У практиці цього винаходувикористовують, якщо немає інших вказівок, звичайні способи молекулярної біології (включаючи рекомбінантні способи), мікробіології, клітинної біології, біохімії та імунології, які відомі фахівцям в даній області. Такі способи повністю описані в літературі, такий як, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", друге видання (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, і периодическ�ratory Manual" (Barbas et al., 2001).

II.Визначення

Для цілей роз'яснення розглянутого опису, будуть використані наступні визначення, і там, де це необхідно, терміни, зазначені в єдино числі, також включають множину, і навпаки. У тому разі, якщо подані далі визначення суперечать будь-якого документа, включеного в справжній документ в якості посилання, слід керуватися визначеннями, наведеними в цьому документі.

Терміни "маркер B-клітинної поверхні" або "антиген B-клітинної поверхні" в цьому документі позначають антиген, экспрессируемий на поверхні B-клітини, на який може бути націлений антагоніст, який з ним пов'язується, включаючи, але не обмежуючись ними, антитіла до антигену B-клітинної поверхні або розчинну форму антигену B-клітинної поверхні, здатні здійснювати антагонізм зв'язування ліганду з природним антигеном B-клітини. Приклади маркерів B-клітинної поверхні включають маркери поверхні лейкоцитів CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 і CD86 (для опису див. The Leukocyte Antigen Facts Book, 2ndEdition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Інші маркери B-клеточноМА, і 239287. Представляє особливий інтерес маркер B-клітинної поверхні експресується переважно на B-клітинах, порівняно з іншими не В-клітинними тканинами ссавців, і він може экспрессироваться як на попереднику B-клітин, так і на зрілих B-клітинах.

Термін "CD79b", як використовують у цьому документі, відноситься до будь-якого нативному CD79b будь-якого хребетного тварини, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад люди, яванські макаки (cyno)) і гризуни (наприклад, миші й пацюки), якщо немає інших вказівок. CD79b людини також позначають у цьому документі як "PRO36249" (SEQ ID NO:2) і він кодується нуклеотидної послідовністю (SEQ ID NO:1), яку також визначають у цьому документі як "DNA225786". Термін "CD79b" включає "повнорозмірне" непроцессированное CD79b, а також будь-яку форму CD79b, яка утворюється в результаті процесингу в клітці. Термін також включає зустрічаються в природі варіанти CD79b, наприклад, варіант з сплайсингу, алельні варіанти і ізоформи. Поліпептиди CD79b, описані в цьому документі, можна виділяти з різних джерел, наприклад, з тканин людини або з інших джерел, або отримувати, використовуючи рекомбінантні або синтетичні способи. Термін "поліпептид CD�ответствующего поліпептиду CD79b, отриманого з природного джерела. Такі поліпептиди CD79b з нативними послідовностями можна виділяти з природних джерел чи можна отримувати, використовуючи рекомбінантні або синтетичні способи. Термін "поліпептид CD79b з нативною послідовністю" конкретно включає зустрічаються в природі укорочені або секретируемие форми конкретного поліпептиду CD79b (наприклад, позаклітинне послідовність домену), форми зустрічаються в природі варіантів (наприклад, альтернативно сплайсированние форми) і зустрічаються в природі алельні варіанти поліпептиду. В деяких варіантах цього винаходу, поліпептиди CD79b з природними послідовностями, описані в цьому документі, є зрілими або повнорозмірними поліпептидами з нативною послідовністю,включають повнорозмірні послідовності амінокислот, представленими на доданих малюнках. Кодон ініціації і стоп кодон (якщо вказано) вказані напівжирним шрифтом та підкреслені на малюнках. Залишки нуклеїнової кислоти, що позначаються як "N" на доданих малюнках являють собою будь-які залишки нуклеїнових кислот. Однак, хоча на доданих малюнках показано, що описані поліпептиди CD79b �ах, ймовірно і можливо, що в якості початкового амінокислотного залишку для поліпептидів CD79b можна використовувати інші залишки метіоніну, розташовані або вище, або нижче, від положення амінокислоти 1 на малюнках.

Термін"2F2" використовують у цьому документі для позначення моноклонального антитіла миші проти CD79b (також позначуваного в цьому документі як "mu2F2" або "2F2" миші) або химерного антитіла (також позначуваного в цьому документі як "ch2F2").

Терміни"mu2F2" або "2F2 миші" використовують у цьому документі для позначення моноклонального антитіла миші проти CD79b, де антитіло миші включає варіабельний домен легкої ланцюга SEQ ID NO:10 (фіг. 7) і варіабельний домен важкої ланцюга SEQ ID NO:14 (фіг. 8A-B). Mu2F2 можна отримувати з гібридом, депонованих в ATCC як PTA-7712 11 липня 2006 року.

Термін"ch2F2" або "химерное антитіло 2F2" використовують у цьому документі для позначення химерного антитіла (як раніше описано в патентній заявці США Ser. No. 11/462336, поданої 3 серпня 2006 року), де химерное антитіло включає легку ланцюг SEQ ID NO:4 (фіг. 4), де вказана легка ланцюг включає варіабельний домен SEQ ID NO:10 (фіг. 7) і легку ланцюг константного домену IgG1 людини. Химерное антитіло далі включає тялой ланцюга IgG1 людини.

Терміни "пересаджена послідовність 2F2" або "гуманізоване" антитіло з пересадженою послідовністю 2F2" або "пересаджена послідовність hu2F2" використовують у цьому документі для позначення конкретно пересадженої послідовності, отриманої пересадкою гипервариабельних областей з антитіла 2F2 миші (mu2F2) в акцепторную консенсусну VL каппа I людини (huKI) і консенсусну VH підгрупи III людини (huIII) з R71A, N73T і L78A (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)) (див. приклад 1A і фігури 7 (SEQ ID NO:11) і 8 (SEQ ID NO:15)).

Термін "модифікація" амінокислотного залишку/положення, як використовують у цьому документі, належить до зміни первинної амінокислотної послідовності порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю, де зазначена зміна відбувається в результаті зміни послідовності, утягує зазначені амінокислотні залишки/положення. Наприклад, типові модифікації включають заміну залишку (або в зазначеному положенні) інший амінокислотою (наприклад, консервативну або неконсервативную заміну), вставку однієї чи більше (зазвичай менше 5 або 3) амінокислот, сусідніх із зазначеним залишком/положенням і делецию зазначеного залишку/положення. Термін "амінокислот амінокислотної послідовності відрізняється амінокислотним залишком. Зазвичай і переважно, результатом модифікації є зміна щонайменше одного виду фізико-біохімічної активності варіанти поліпептиду порівняно з поліпептидом, що містить вихідну аминокислотную послідовність (або аминокислотную послідовність "дикого типу"). Наприклад, у разі антитіла, фізико-біохімічна активність, яка змінюється, може представляти собою афінність зв'язування, зв'язуючу здатність і/або ефект зв'язування щодо молекули-мішені.

Термін "антитіло" використовують у найбільш широкому сенсі і, конкретно, він охоплює, наприклад, окремі моноклональні антитіла проти CD79b (включаючи агонистические, антагоністичні, нейтралізують, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), композиції антитіл проти CD79b з полиэпитопной специфічністю, поліклональні антитіла, полівалентні антитіла, полиспецифические антитіла (наприклад, биспецифические антитіла, за умови, що вони проявляють необхідну біологічну активність), утворені щонайменше з двох інтактних антитіл, одноцепочечние антитіла проти CD79b і фрагменти антитіл проти CD79b (див. нижче), включаючи Fab-, Fab'-, F(ab')2- і Fv-фрагменти, диатела, одноцеп�. У цьому документі терміни "імуноглобулін" (Ig) і "антитіло" використовують як взаємозамінні. Антитіло може бути антитілом людини, гуманизированним антитілом і/або антитілом з дозрілої аффинностью.

Термін "антитіло проти CD79b" або "антитіло, яке пов'язується з CD79b" відноситься до антителу, яке здатне зв'язувати CD79b з достатньою аффинностью, так що антитіло є прийнятним в якості діагностичного та/або лікарського засобу при націлення на CD79b. Переважно, ступінь зв'язування антитіла проти CD79b з неродственним не CD79b-білком становить менш ніж приблизно 10% від зв'язування антитіла з CD79b при вимірюванні, наприклад, радиоиммунним аналізом (RIA). У певних варіантах здійснення, антитіло, яке пов'язується з CD79b, має константу дисоціації (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ або ≤0,1 нМ. У певних варіантах здійснення, антитіло проти CD79b зв'язується з эпитопом CD79b, який є консервативним серед CD79b з різних видів.

"Виділене антитіло" являє собою антитіло, яка ідентифікована і відокремлене і/або вилучено з компонента його природних навколишніх умов. Забруднюючі компоненти природних умов пр�енти, гормони та інші білкові або небелковие розчинені речовини. У кращих варіантах здійснення антитіло є очищеним (1) до більш ніж 95% по масі антитіла, як визначають способом Лоурі, і найбільш переважно до більш ніж 99% по масі, (2) до ступеню, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевий або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з обертовим склянкою, або (3) до гомогенності при SDS-PAGE в відновлюють або невосстанавливающих умовах з використанням кумасси синього або, переважно, фарбування сріблом. Виділене антитіло включає антитіло в рекомбінантних клітинахin situ,оскільки в цьому випадку відсутній щонайменше один компонент умов природного оточення антитіла. Однак, як правило, виділене антитіло отримують за допомогою щонайменше однієї стадії очищення.

Основний елемент антитіла з 4-ланцюгів являє собою гетеротетрамерний глікопротеїн, що складається з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (H) ланцюгів (антитіло IgM складається з 5 основних гетеротетрамерних елементів разом з додатковим поліпептидом, званим J-ланцюгом, і, таким чином, про� освітою полівалентних систем, містять 2-5 основних елементів з 4-ланцюгів разом з J-ланцюгом). У разі IgG, елемент 4-ланцюгів, як правило, має масу 150000 дальтон. Кожна L-ланцюг пов'язана з H-ланцюгом однієї ковалентного дисульфидной зв'язком, в той час як дві H-ланцюги пов'язані один з одним однією або кількома дисульфідними зв'язками, в залежності від изотипа H-ланцюга. Кожна H - і L-ланцюг має розташовані з рівними інтервалами межцепочечние дисульфідні містки. Кожна H-ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VH), за яким слідують три константних домену (CHдля кожної з α - і γ-ланцюгів і чотири CH-домену для изотипов μ і ε. Кожна L-ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VL), за яким слід константний домен (CL) на її іншому кінці. VLвирівнюється з VHі CLвирівнюється з першим константним доменом важкої ланцюга (CH1). Вважають, що конкретні амінокислотні залишки утворюють поверхню контакту між вариабельними доменами легкого ланцюга і важкої ланцюга. Освіта пари VHі VLформує один антиген-зв'язуючий ділянку. Для структури і властивостей різних класів антитіл, див., наприклад, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, pag�азиваемих каппа і лямбда, на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. Залежно від амінокислотної послідовності константного домену їх важких ланцюгів (CH), імуноглобуліни можна віднести до різних класів або изотипам. Існує п'ять класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, що мають важкі ланцюги, що позначаються як α, δ, ε, γ і μ, відповідно. Класи γ і α далі поділяються на підкласи на основі відносно невеликих відмінностей у послідовності CHі функції, наприклад, у людини експресуються наступні підкласи: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2.

"Варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" антитіла відноситься до N-кінцевих доменів важкої і легкої ланцюга антитіла. Варіабельний домен важкої ланцюга може бути позначений як "VH". Варіабельний домен легкої ланцюга може бути позначений як "VL". Ці домени, як правило, є найбільш вариабельними частинами антитіла і містять антиген-зв'язуючі центри.

Термін "варіабельний" ставиться до того факту, що послідовності певних сегментів варіабельних доменів значно відрізняються серед антитіл. V-домен опосередковує зв'язування антигену і визначає специфічність конкретної антитіла до його конкретного ант�ислот. Замість цього, V-ділянки складаються з щодо інваріантних ділянок, званих каркасними областями (FR), з 15-30 амінокислот, розділених короткими ділянками високої варіабельності, званими "гипервариабельними областями", довжина яких становить 9-12 амінокислот. Вариабельние домени нативних важких і легких ланцюгів містять чотири FR, головним чином, приминающих конфігурацію β-шарів, з'єднаних трьома гипервариабельними ділянками, які формують петлі, що об'єднують структуру β-шарів, і, в деяких випадках, формують її частина. Гипервариабельние області в кожній ланцюга розташовані разом в безпосередній близькості від FR і, спільно з гипервариабельними областями інший ланцюга, беруть участь у формуванні антиген-зв'язуючого центру антитіл (див. Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константние домени не залучені безпосередньо до зв'язування антитіла з антигеном, але вони проявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC).

"Интактное" антитіло являє собою антитіло, яке містить антиген-зв'язуючий центр, а також CLі з меншою обой константние домени з нативною послідовністю (наприклад, константние домени людини з нативною послідовністю) або їх варіант амінокислотної послідовності. Переважно, интактное антитіло володіє однією або кількома ефекторними функціями.

""Голе" антитіло" для цілей цього опису являє собою антитіло, яке не конъюгировано з цитотоксичною групою або радіоактивною міткою.

"Фрагменти антитіла" містять частину інтактного антитіла, переважно антиген-зв'язує або вариабельную область інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають Fab-, Fab'-, F(ab')2- і Fv-фрагменти, диатела, лінійні антитіла (див., наприклад, патент США No. 5641870, приклад 2, Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 [1995]); одноцепочечние молекули антитіл; і полиспецифические антитіла, утворені фрагментами антитіл. В одному варіанті здійснення, фрагмент антитіла містить антиген-зв'язуючий центр інтактного антитіла і, таким чином, зберігає здатність зв'язувати антиген.

Розщеплення антитіл папаїном призводить до утворення двох ідентичних антиген-зв'язуючих фрагментів, званих "Fab"-фрагментами, і залишкового "Fc-фрагмента, назва якого відображає його здатність легко кристалізується. Fab-фрагмент упоряд� важкої ланцюга (CH1). Кожен Fab-фрагмент є одновалентним щодо зв'язування антигену, тобто, він володіє одним антиген-зв'язуючою ділянкою. Обробка антитіла пепсином призводить до одному великому F(ab')2-фрагменту, який приблизно відповідає двом пов'язаним дисульфідом Fab-фрагментів, що мають двухвалентную антиген-зв'язуючу активність, і, крім того, здатний до перехресного зв'язування антигену. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів наявністю додаткових кількох залишків на с-кінці домену CH1, включаючи один або кілька цистеинов з шарнірної області антитіла. Fab'-SH являє собою позначення для Fab', в якому залишок(ки) цистеїну константних доменів має вільної тіольної групою. F(ab')2-фрагменти антитіла початково були отримані в якості пар Fab'-фрагментів, які володіють шарнірними цистеинами між ними. Також відомо інше хімічне зв'язування фрагментів антитіл.

Fc-фрагмент містить C-кінцеві частини обох H-ланцюгів, утримувані разом дисульфидами. Ефекторні функції антитіл визначаються послідовностями Fc-ділянки, який також є частиною, розпізнаваної Fc-рецепторами (FcR), що зустрічаються на певних типах клетоктиген-зв'язуючий центр. Цей фрагмент складається з димера, що складається з одного вариабельного домену важкої ланцюга і одного вариабельного домену легкої ланцюга, пов'язаних міцної нековалентной зв'язком. В одноланцюгових типах Fv (scFv), один варіабельний домен важкої ланцюга і один варіабельний домен легкої ланцюга можуть бути ковалентно пов'язані рухомим пептидним лінкером, так щоб легка і важка ланцюга могли асоціювати в "димерні" структурні аналоги, аналогічні двохланцюговим типами Fv. Згортання цих двох доменів утворює шість гипервариабельних петель (3 петлі в кожній з H - і L-ланцюга), які надають амінокислотні залишки для зв'язування антигену і забезпечують специфічність зв'язування антигену антитілом. Однак, навіть один варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три CDR, специфічних до антигенів) має здатність розпізнавати і зв'язувати антиген, хоча і з більш низькою аффинностью, ніж цілий ділянку зв'язування.

"Одноцепочечние Fv", також сокращаемие як "sFv" або "scFv", являють собою фрагменти антитіл, які містять VHі VL-домени антитіла, з'єднані в єдину полипептидную ланцюг. Переважно, поліпептид sFv також необов'язково містить унікальний поліпептидний лінкер між�зивания антигену. Для огляду sFv, див. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, нижче.

Термін "диатела" відноситься до невеликих фрагментів антитіла з двома антиген-зв'язуючими ділянками, причому ці фрагменти містять варіабельний домен важкої ланцюга (VH), пов'язаний з варіабельний домен легкого ланцюга (VL) в одного поліпептидного ланцюга (VH-VL). Невеликі фрагменти антитіл отримують конструюванням sFv-фрагментів (див. попередній абзац) з короткими линкерами (приблизно 5-10 залишків) між VH- і VL-доменами, так що забезпечується межцепочечное, але не внутрицепочечное, освіта пар V-доменів, що призводить до двухвалентному фрагменту, тобто, фрагменту, що володіє двома антиген-зв'язуючими центрами. Диатела можуть бути двухвалентними або биспецифическими. Биспецифические диатела являють собою гетеродимери з двох "пересічних" sFv-фрагментів, в яких VH- і VL-домени двох антитіл знаходяться на різних поліпептидних ланцюгах. Диатела більш докладно описані, наприклад, у EP 404097; WO93/11161; Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134; і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). Триатела (triabody) і тетратела (tetrabody) також описані в Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134.

Як використовують в насто� антитіл, тобто окремі антитіла, що становлять сукупність, є ідентичними, за винятком можливих мутацій, наприклад, зустрічаються в природі мутацій, які можуть бути представлені в невеликих кількостях. Моноклональні антитіла є високо специфічними і спрямовані проти одного антигенного ділянки. Більш того, у протилежність препаратів поліклональних антитіл, які включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. На додаток до їх специфічності, препарати моноклонального антитіла є переважними в тому, що їх можна синтезувати без домішок інших антитіл. Визначення "моноклональний" не передбачає того, що антитіло повинно бути отримано яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування у відповідності з цим винаходом, можуть бути отримані способом гібридом, вперше описаним Kohler et al.,Nature,256:495 (1975), або вони можуть бути отримані способами рекомбінантних ДНК бактеріальних, эукариотических клітинах, а також в клітинах тварин і рослин (див., наприклад, патент США No. 4816567�, описаних, наприклад, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al., J. Mol. Товарbiol, 222:581-597 (1991).

Моноклональні антитіла у цьому документі конкретно включають "химерні" антитіла, в яких ділянку важкої і/або легкого ланцюга ідентичний або гомологічний відповідним послідовності в антитіл, отриманих з конкретного виду або належать до конкретного класу або підкласу антитіл, в той час як решта ланцюга(їй) ідентична або гомологична відповідним послідовності в антитіл, отриманих з іншого виду або належать іншій класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови, що вони проявляють необхідну біологічну активність (патент США No 4816567; Morrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляють інтерес в рамках цієї заявки химерні антитіла включають "приматизированние" антитіла, які містять антиген-зв'язувальні послідовності вариабельного домену не відноситься до людини примату (наприклад, старосвітської мавпи, мавпи тощо) і послідовності константного домену людини.

"Гуманізовані" форми, не є людськими антитіл (наприклад, гризунів), являють собою химерні антитіла, які з�ом, гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципиентное антитіло), в яких залишки з гипервариабельной області реципієнта замінені залишками з гипервариабельной області видів, що не відносяться до людини, (донорное антитіло), таких як миша, щур, кролик або не належать до людини примати, які мають необхідну специфічністю, аффинностью і ємністю. У деяких випадках, залишки каркасної області (FR) імуноглобуліну людини замінюють відповідними залишками, які не є людськими. Більш того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які відсутні в реципиентном антителе або в донорном антителе. Ці модифікації проводять для додаткового поліпшення параметрів антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло містить по суті всі щонайменше з одного, і, як правило, з двох, варіабельних доменів, у яких всі або по суті всі гипервариабельние петлі відповідають гипервариабельним петель імуноглобуліну, не є людським, і всі або по суті всі FR-області є FR-області з послідовності імуноглобуліну людини. Також гуманізоване антитіло необов'язково сод�оглобулина людини. Для більш детальної інформації див. Jones et al.,Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Товарbiol. 2:593-596 (1992). Див. також такі оглядові статті та посилання, цитовані в них: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

"Тво" при використанні в цій статті, належить до антителу з вбудованими в нього залишками цистеїну, а "hu" при використанні в цій статті, належить до гуманизированному антителу.

"Антитіло людини" являє собою антитіло, яке містить аминокислотную послідовність, що відповідає послідовності антитіла, що продукується у людини і/або отриманої з використанням будь-яких способів отримання антитіл людини, як описано в цьому документі. Це визначення антитіла людини, зокрема, не включає гуманізоване антитіло, що містить антиген-зв'язувальні залишки не людини. Антитіла людини можна отримувати з використанням різних способів, відомих у цій галузі, включаючи бібліотеки фагового дисплею. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Товарbiol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Товарbiol, 222:581 (1991). Також для отримання моноклональних антитіл людини доступні способи, описані в Cole et 74 (2001). Антитіла людини можна отримати шляхом введення антигену трансгенному тварині, модифікованої для продукції таких антитіл у відповідь на навантаження антигеном, але має пошкоджені ендогенні локуси, наприклад, імунізованим ксеномишам (див., наприклад, патенти США No. 6075181 і 6150584 щодо технології XENOMOUSETM). Див. також, наприклад, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) щодо антитіл людини, отриманих технологією B-клітинних гібридом людини.

Терміни "гіперваріативна область", "HVR", або "HV", як використовують у цьому документі, відносяться до ділянок вариабельного домену антитіла, які є гипервариабельними по послідовності і/або утворюють структурно певні петлі. Зазвичай антитіла включають шість гипервариабельних областей: три в VH (H1, H2, H3), і три в VL (L1, L2, L3). Використовують кілька способів позначення гипервариабельних областей, і вони включені в цей опис. Визначають комплементарність області (CDR) за Кабат, засновані на варіабельності послідовностей і використовуються найбільш часто (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia замість цього посилається на розташування структурних петель (Chothia арует між H32 і H34 в залежності від довжини петлі (це відбувається з-за того, що схема нумерації Кабат поміщає вставки у H35A і H35B; якщо ні 35A, ні 35B, не присутні, петля закінчується у 32; якщо присутній тільки 35A, петля закінчується у 33; якщо присутні і 35A і 35B, тоді петля закінчується біля 34). Гипервариабельние області AbM являють собою компроміс між CDR за Кабат і структурними петлями по Chothia, і вони використовуються в програмному забезпеченні моделювання антитіл Oxford Molecular's AbM. "Контактні" гипервариабельние ділянки засновані на аналізі доступних комплексних кристалічних структур. Залишки з кожного з зазначених гипервариабельних ділянок відзначені далі.

ПетляКабатAbMChothiaКонтакт
L1L24-L34L24-L34L24-L34L30-L36
L2L50-L56L50-L56L50-L56L46-L55
L3L89-L97="center">H31-H35BH26-H35BH26-H32...34H30-H35B
(Нумерація за Кабат)
H1H31-H35H26-H35H26-H32H30-H35
(Нумерація за Chothia)
H2H50-H65H50-H58H52-H56.hvosting.uaH47-H58
H3H95-H102H95-H102H95-H102H93-H101

Гипервариабельние ділянки можуть включати такі "подовжені гипервариабельние ділянки": 24-36 або 24-34 (L1), 46-56 або 50-56 (L2) і 89-97 (L3) VL і 26-35B (H1), 50-65, 47-65 або 49-65 (H2) і 93-102, 94-102 або 95-102 (H3) в VH. Залишки варіабельних доменів пронумеровані згідно Кабат (Kabat et al., вище) для кожного з цих визначень.

"Каркасні" залишки або "FR" є залишками варіабельних доменів, що не відносяться до залишків гипервариабельной області, як визначено в цьому описі.

Терміни "нумти, відносяться до системи нумерації, яку використовують для варіабельних доменів важкої ланцюга або варіабельних доменів легкої ланцюга в сукупності антитіл з Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). З використанням цієї системи нумерації, справжня лінійна амінокислотна послідовність може містити меншу кількість або додаткову кількість амінокислот, що відповідає вкорочення FR або CDR вариабельного домену або вбудовуванню в них. Наприклад, варіабельний домен важкої ланцюга може включати одну вставку представляє інтерес амінокислоти (залишок 52a за Кабат) після залишку 52 в H2 і вбудовані залишки (наприклад, залишки 82a, 82b, і 82c, і т. д. по Кабат) після залишку 82 FR важкої ланцюга. Нумерацію Кабат для залишків можна визначити для конкретного антитіла шляхом вирівнювання по ділянках гомології послідовності антитіла зі "стандартною" послідовністю з нумерацією за Кабат.

Систему нумерації Кабат зазвичай використовують при вказівці на залишок в вариабельном домені (приблизно залишки 1-107 легкого ланцюга і залишки 1-113 важкої ланцюга (наприклад, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "Систему нумерац�їна (наприклад, індекс EU, зазначений у Kabat et al., вище). "Індекс EU за Кабат" відноситься до нумерації залишків антитіла IgG1 людини EU. Якщо в цьому документі немає інших вказівок, вказівки на номери залишків у варіабельних доменів антитіл означають нумерацію залишків у відповідності з системою нумерації Кабат. Якщо в цьому документі немає інших вказівок, вказівки на номери залишків у константному домені антитіл означають нумерацію залишків у відповідності з системою нумерації EU. (наприклад, див. попередню заявку США No. 60/640323, фігури для нумерації EU).

Антитіло, отримане "дозріванням афінності" являє собою антитіло з одним або кількома змінами в одній один або кілька HVR, які призводять до підвищення афінності антитіла до антигену, порівняно з вихідним антитілом, яке не має цієї зміни(ий). Кращі антитіла, отримані "дозріванням афінності", мають наномолярную або навіть пикомолярную спорідненість до антигену-мішені. Антитіла, отримані дозріванням афінності, отримують способами, відомими в даній галузі. В Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) описано дозрівання афінності способом "перетасовки" VH - і VL-доменів. Випадковий мутагенез HVR та/або каркасних залишків описаний: BarHawkins et al., J. Mol. Товарbiol. 226:889-896 (1992).

"Блокуючу антитіло" або "антитіло-антагоніст" являє собою антитіло, яке інгібує або знижує біологічну активність антигену, який воно пов'язує. Кращі блокуючі антитіла або антитіла-антагоністи частково або повністю пригнічують біологічну активність антигену.

"Антитіло-агоніст", як використовують у цьому документі, уявляє собою антитіло, яке імітує щонайменше один з функціональних видів активності представляє інтерес поліпептиду.

"Залежне від виду антитіло", наприклад, антитіло ссавця проти IgE людини, являє собою антитіло, яке має більш високу аффинностью зв'язування з антигеном із зразка першого виду ссавця, щодо афінності зв'язування з гомологом вказаного антигену з зразка другого виду ссавця. Зазвичай залежить від виду антитіло "специфічно зв'язується з антигеном людини (тобто, має величиною афінності зв'язування (Kd) не більш ніж приблизно 1×10-7M, переважно не більш ніж приблизно 1×10-8і найбільш переважно не більш ніж приблизно 1×10-9M), але має аффинностью связиЀе приблизно в 50 разів, або щонайменше приблизно в 500 разів або щонайменше приблизно в 1000 разів слабкіше, ніж його афінність зв'язування з антигеном людини. Залежне від виду антитіло може бути будь-яким з різних типів антитіл, як розкрито вище, але, переважно, є гуманизированним антитілом або антитілом людини.

Термін"афінність зв'язування" зазвичай відноситься до сили всіх сумарних нековалентних взаємодій між окремою ділянкою зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і його зв'язує партнером (наприклад, антигеном). Якщо немає інших вказівок, використовують в цьому документі, "афінність зв'язування" відноситься до властивої афінності зв'язування, яка відображає взаємодію 1:1 між членами связивающейся пари (наприклад, антитілом і антигеном). Афінність молекули X до її партнера Y зазвичай можна уявити константою дисоціації (Kd). Афінність можна виміряти звичайними способами, відомими в даній галузі, включаючи способи, описані в цьому документі. Низкоаффинние зазвичай антитіла зв'язують антиген повільно, і мають тенденцію до легкої дисоціації, тоді як високоафінні антитіла зазвичай зв'язують антиген швидше і мають тенденцію залишатися довше з них можна використовувати для цілей цього винаходу. Конкретні ілюстративні варіанти здійснення описані далі.

Вираз"або краще", коли його використовують у цьому документі, при вказівці на афінність зв'язування, відноситься до більш сильного зв'язування між молекулою і зв'язує її партнером. "Або краще", коли його використовують у цьому документі, відноситься до більш сильного зв'язування, що характеризується більш низьким числовим значенням Kd. Наприклад, у разі антитіла, афінність до якого антигену становить 0,6 нМ або краще", афінність антитіла до антигену становить <0,6 нМ, тобто 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ і т. д., або будь-яку величину, яка менше ніж 0,6 нМ.

В одному варіанті "Kd" або "величину Kd" у відповідності з цим винаходом вимірюють з допомогою аналізу зв'язування міченого радіоактивною міткою антигену (RIA), проведеного з Fab-версією представляє інтерес антитіла і його антигеном, як описано в наступному аналізі, в якому вимірюють афінність зв'язування Fab з антигеном в розчині шляхом урівноваження Fab мінімальною концентрацією (125I)-міченого антигену в присутності серії титрів немеченного антигену, з наступною фіксацією пов'язаного антигену на планшеті, вкритому антитілом проти Fab (Chen et al., (1999) J. Мі 5 мкг/мл фіксуючого антитіла проти Fab (Cappel Labs) в 50 мМ розчині карбонату натрію (рН 9,6), а потім блокують з використанням 2% (мас./про.) бичачого сироваткового альбуміну в PBS протягом від двох до п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23°C). Не адсорбирующем планшеті (Nunc #269620), 100 пМ або 26 пМ [125I]-антигену змішують з серійними розведеннями представляє інтерес Fab (наприклад, у відповідності з антитілом проти VEGF, Fab-12, в Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Потім представляє інтерес Fab інкубують протягом ночі; однак, інкубацію можна продовжувати протягом тривалішого періоду (наприклад, 65 годин), щоб переконатися в тому, що рівновага досягнута. Після цього суміші переносять на фіксуючий планшет для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом 1 години). Потім розчин видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,1% Tween-20 в PBS. Після того, як планшети висихають, додають 150 мкл/лунка сцинтилятора (MicroScint-20; Packard), і проводять підрахунок в планшетах з використанням лічильника гамма-імпульсів (Packard) протягом 10 хвилин. Концентрації кожного з Fab, які забезпечують зв'язування, менше або дорівнює 20% від максимального зв'язування, вибирають для використання в конкурентних аналізах зв'язування. Згідно з іншим варіантом Kd або величину Kd вимірюють з використанням �чи BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C з чіпами CM5 з іммобілізованим на них антигеном при ~10 одиницях відповіді (RU). У короткому викладі, біосенсорні чіпи з карбоксиметилированного декстрану (CM5, BIAcore Inc.) активують гідрохлоридом N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)карбодіїміду (EDC) і N-гидроксисукцинимидом (NHS) в відповідності з інструкціями постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ ацетатом натрію, рн 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед ін'єкцією зі швидкістю потоку 5 мкл/хвилина для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (UA) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигену ін'еціруют 1 M етаноламін для блокування не вступили в реакцію груп. Для визначення показників кінетики, дворазові серійні розведення Fab (від 0,78 нМ до 500 нМ) ін'еціруют в PBS з 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C зі швидкістю потоку приблизно 25 мкл/хв. Константу асоціації (kon) і константу дисоціації (koff) обчислюють з використанням простої моделі зв'язування Ленгмюра "один до одного" (BIAcore Evaluation Software версії 3.2) за допомогою одночасного приведення у відповідність сенсограмм асоціації та дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) обчислюють як співвідношення koff/kon. См., наприклад, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Товарbiol. 293:865-881. Якщо константа асоціацією рос, зазначеним вище, тоді константу асоціації можна визначати з використанням способу гасіння флуоресценції, в якому вимірюють підвищення або зниження інтенсивності випромінювання флуоресценції (збудження = 295 нм; випущення = 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25°С 20 нМ антитіла проти антигену (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутності зростаючих концентрацій антигену при вимірюванні спектрофотометрі, такому як спектрофотометр з останавливаемой струменем (Aviv Instruments) або спектрофотометр SLM-Aminco серії 8000 (Thermo Spectronic) з перемішуваній кюветою.

"Швидкість зв'язування" або "швидкість асоціації" або "швидкість з'єднання" або "kon"відповідно до цього винаходу можна також визначати за допомогою вказаного способу поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, з використанням BIAcoreTM-2000 або BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), як описано вище.

Вираз "по суті подібний" або "по суті такий же", як використовують у цьому документі, означає досить високу ступінь схожості між двома числовими значеннями (як правило, одне пов'язане з антитілом щодо винаходу, а інше пов'язане з еталонним/порівняльним антитілом), так що спеціаліст у цій галузі може вважати відмінність мологического ознаки, вимірюваного зазначеними значеннями (наприклад, значеннями Kd). Відмінність між зазначеними двома значеннями переважно становить менше ніж приблизно 50%, переважно менш ніж приблизно 40%, переважно менш ніж приблизно 30%, переважно менш ніж приблизно 20%, переважно менш ніж приблизно 10% як функції від значення для еталонного/порівняльного антитіла.

Вираз "значимо знижений" або "значимо відрізняється", як використовують у цьому документі, означає значиму високу ступінь відмінності між двома числовими значеннями (як правило, одне пов'язане з антитілом щодо винаходу, а інше пов'язане з еталонним/порівняльним антитілом), так що спеціаліст у цій галузі може вважати відмінність між двома значеннями статистично значущим у контексті біологічної ознаки, вимірюваного зазначеними значеннями (наприклад, значеннями Kd, відповіддю HAMA). Відмінність між зазначеними двома значеннями переважно складає більш ніж приблизно 10%, переважно більш ніж приблизно 20%, переважно більш ніж приблизно 30%, переважно більш ніж приблизно 40%, переважно більш ніж приблизно 50%�ний антиген, з яким селективно зв'язується антитіло. Антиген-мішень може представляти собою поліпептид, вуглеводень, нуклеїнову кислоту, ліпід, гаптен або інше зустрічається в природі або синтетичне з'єднання. Переважно, антиген-мішень являє собою поліпептид.

"Акцепторная каркасна область людини" для цілей цього опису являє собою каркасну область, що містить аминокислотную послідовність каркасної області VL або VH, утвореної каркасної областю імуноглобуліну людини або консенсусною послідовністю каркасної області людини. Акцепторная каркасна область людину, "освічена" каркасною областю імуноглобуліну людини або консенсусною послідовністю каркасної області людини може містити саму їх аминокислотную послідовність, або вона може містити існували раніше зміни в амінокислотних послідовностях. Там, де присутні існували раніше амінокислотні зміни, бажано, щоб було не більше 5 і, переважно, 4 або менше, або 3 або менше, що існували раніше амінокислотних змін. Там, де присутні існували раніше амінокислотні зміни в 71H, 73H і 78H; наприклад, амінокислотні залишки в зазначених положеннях можуть представляти собою 71A, 73T і/або 78A. В одному варіанті здійснення, акцепторная каркасна область VL людини ідентична по послідовності каркасної області VL імуноглобуліну людини чи консенсусної послідовності каркасної області людини.

"Консенсусна послідовність каркасної області людини" являє собою каркасну область, яка представляє собою найбільш часто зустрічаються амінокислотні залишки при виборі каркасних послідовностей VL або VH імуноглобуліну людини. Зазвичай вибір послідовностей VL або VH імуноглобуліну людини здійснюють з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. Зазвичай підгрупа послідовностей являє собою підгрупу згідно Кабат. В одному варіанті здійснення, для VL, підгрупа являє собою підгрупу каппа I за Кабат. В одному варіанті здійснення, для VH, підгрупа являє собою підгрупи III за Кабат.

"Консенсусна каркасна область VH підгрупи III" включає консенсусну послідовність, утворену амінокислотними послідовностями варіабельних галузей важкої ланцюга підгрупи III за Кабат. пи III включає щонайменше частина або всі з кожної з наступних послідовностей: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:69)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:70)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:71)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:72).

"Консенсусна каркасна область VL підгрупи I" включає консенсусну послідовність, утворену амінокислотними послідовностями варіабельних галузей легкої ланцюга каппа підгрупи I за Кабат. В одному варіанті здійснення, амінокислотна послідовність консенсусної каркасної області VL підгрупи I включає щонайменше частина або всі з кожної з наступних послідовностей: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:65)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:66)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:67)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:68).

"Немодифицированная каркасна область людину" являє собою каркасну область людини, яка має таку ж аминокислотную послідовність, як і акцепторная каркасна область людини, наприклад, вона позбавлена заміни(замін) амінокислоти людини на амінокислоту, не людину в акцепторній каркасної області людини.

"Змінена гіперваріативна область" для цілей цього опису являє собою гипервариабельную область, що включає одну або декілька (наприклад від однієї до приблизно 16) аминокислотную заміну(замін).

Термін "немодифицированная гіперваріативна область" для цілей цього опису являє собою гипервариабельную область, що має такѰриабельную область, в якій відсутня одна або кілька амінокислотних замін.

Антитіло, "яке пов'язує" представляє інтерес антиген, наприклад, асоційований з пухлиною поліпептидний антиген-мішень, уявляє собою антитіло, яке зв'язує антиген з достатньою аффинностью, так що антитіло є прийнятним в якості лікарського засобу для наведення його на клітку або тканину, що експресують антиген, і яке не перехресно реагує з іншими білками в значній мірі. У таких варіантах здійснення ступінь зв'язування антитіла з білком-"не мішенню" буде становити менше 10% від зв'язування антитіла з його специфічним білком-мішенню, як визначають в аналізі сортування активованих флуоресценцією клітин (FACS) або з допомогою радиоиммунной преципітації (RIA). Що стосується зв'язування антитіла з молекулою-мішенню, терміни "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується з" або є "специфічним до" конкретного поліпептиду або эпитопу на конкретному полипептиде-мішені, означають зв'язування, яке піддається вимірюванню рівні відрізняється від неспецифічного взаємодії. Специфічне зв'язування можна виміряти, наприклад, шляхом визначення зв'язку�у з подібною структурою, яка не володіє активністю зв'язування. Наприклад, специфічне зв'язування можна визначити за конкуренції з відповідною молекулою, яка є схожою з мішенню, наприклад, з надлишком немеченой мішені. У цьому випадку на специфічне зв'язування вказує те, що зв'язування міченої мішені з зондом конкурентно інгібується надлишком немеченой мішені. Терміни "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується з" або є "специфічним до" конкретного поліпептиду або эпитопу на конкретній полипептиде-мішені, як використовують у цьому документі, може бути проілюстрований, наприклад, молекулою, що має Kd для мішені щонайменше приблизно 10-4M, альтернативно щонайменше приблизно 10-5M, альтернативно щонайменше приблизно 10-6M, альтернативно щонайменше приблизно 10-7M, альтернативно, щонайменше приблизно 10-8M, альтернативно щонайменше приблизно 10-9M, альтернативно щонайменше приблизно 10-10M, альтернативно щонайменше приблизно 10-11M, альтернативно щонайменше приблизно 10-12M, або більше. В одному варіанті здійснення, термін "эпитопом на конкретному полипептиде без зв'язування на суттєвому рівні з яким-небудь іншим поліпептидом або эпитопом поліпептиду.

Антитіло, яке "інгібує ріст пухлинних клітин, що експресують поліпептид CD79b" або "інгібуючу зростання" антитіло являє собою антитіло, яке призводить до піддається вимірюванню інгібування росту злоякісних клітин, що експресують або сверхэкспрессирующих відповідний поліпептид CD79b. Поліпептид CD79b може представляти собою трансмембранний поліпептид, экспрессированний на поверхні злоякісної клітини, або він може являти собою поліпептид, який продукується і секретується злоякісної кліткою. Кращі інгібують ріст антитіла проти CD79b інгібують ріст експресують CD79b пухлинних клітин більш ніж на 20%, переважно від приблизно 20% до приблизно 50%, і більш переважно більш ніж на 50% (наприклад, від приблизно 50% до приблизно 100%) порівняно з відповідним контролем, причому контролем зазвичай є пухлинні клітини, які не оброблені тестованим антитілом. В одному варіанті здійснення, інгібування росту можна виміряти при концентрації антитіла приблизно від 0,1 до 30 мкг/мл або приблизно від 0,5 нМ до 200 нМ в клітинній культурі, де інгібування росту визначають через 1-10 з�пределять різними способами, такими як способи, описані в розділі "Експериментальні приклади", нижче. Антитіло є інгібуючим зростанняin vivoякщо введення антитіла проти CD79b в концентрації від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг маси тіла призводить до зменшення розміру пухлини або проліферації пухлинних клітин протягом приблизно від 5 діб до 3 місяців з моменту першого введення антитіла, переважно протягом приблизно від 5 до 30 діб.

Антитіло, яке "індукує апоптоз" являє собою антитіло, яке індукує запрограмовану загибель клітин, як визначають по зв'язуванню аннексина V, фрагментації ДНК, зморщування клітини, розширення ендоплазматичної мережі, фрагментації клітини, та/або утворення мембранних везикул (званих апоптотическими тільцями). Зазвичай такий клітиною є клітина, сверхэкспрессирующая поліпептид CD79b. Переважно, клітина являє собою пухлинну клітину, наприклад, гематопоэтическую клітку, таку як B-клітина, T-клітина, базофил, эозинофил, нейтрофіл, моноцит, тромбоцит або еритроцит. Доступні різні способи оцінки клітинних подій, пов'язаних з апоптозом. Наприклад, транслокації фосфатидилсерина (PS) можна виміряти за�рагментацией ДНК можна оцінити по збільшенню числа гіподиплоїдних клітин. Переважно, антитіло, яке індукує апоптоз, уявляє собою антитіло, яке викликає індукцію зв'язування аннексина приблизно від 2 до 50 разів, переважно приблизно від 5 до 50 разів, і найбільш переважно приблизно від 10 до 50 разів перевищує зв'язування аннексина необробленими клітинами в аналізі зв'язування аннексина.

Антитіло, яке "викликає загибель клітин", уявляє собою антитіло, яке призводить до того, що живі клітини стають неживими. Клітина являє собою клітку, экспрессирующую поліпептид CD79b і є клітиною такого типу, яка специфічно экспрессирует або сверхэкспрессирует поліпептид CD79b. Така клітина може бути злоякісною або нормальною кліткою конкретного клітинного типу. Поліпептид CD79b може представляти собою трансмембранний поліпептид, экспрессируемий на поверхні злоякісної клітини, або може являє собою поліпептид, який продукується і секретується злоякісної кліткою. Клітина може представляти собою злоякісну клітину, наприклад, B-клітку або T-клітку. Загибель клітиниin vitroможна визначати у відсутності комплементу і ефекторних імунних клітин, щоб відрізнити ент-залежної цитотоксичність (CDC). Таким чином, аналіз загибелі клітини можна проводити з використанням інактивованої нагріванням сироватки (тобто, у відсутності комплементу) і у відсутності імунних ефекторних клітин. Для з'ясування того, антитіло здатне індукувати загибель клітини, можна оцінювати втрату цілісності мембрани, як оцінюють по захопленню йодиду пропидия (PI), трипана синього (див. Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) або 7AAD, щодо необроблених клітин. Переважними індукують загибель клітини антитілами є антитіла, які індукують захоплення PI в аналізі захоплення PI в клітинах BT474.

"Ефекторні функції" антитіла відносяться до таких видів біологічної активності, які є властивими Fc-області (Fc-області з нативною послідовністю або варіанти Fc-ділянки по амінокислотної послідовності) антитіла, і варіюють в залежності від изотипа антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: зв'язування C1q і комплемент-залежну цитотоксичність; зв'язування Fc-рецептора; антиілозалежну клітинно-опосредуемую цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, B-клітинного рецептора; BCR) і активацію B-клітин.

Термін "Fc-обючая Fc-області з нативною послідовністю і варіанти Fc-областей. Хоча межі Fc-галузі важкої ланцюга імуноглобуліну можуть варіювати, Fc-галузь важкої ланцюга IgG людини зазвичай визначають як відрізок від амінокислотного залишку в положенні Cys226, або від Pro230, до його C-кінця. C-кінцевий лізин (залишок 447 в системі нумерації EU) Fc-області може бути видалений, наприклад, в процесі отримання або очищення антитіла, або при рекомбинантном конструюванні нуклеїнової кислоти, кодує важку ланцюг антитіла. Відповідно, композиція інтактних антитіл може включати сукупності антитіл, у всіх з яких видалений залишок K447, сукупності антитіл, в яких не видалено залишок K447, і сукупності антитіл, що містять суміш антитіл, що містять та не містять залишок K447.

"Функціональна Fc-область" володіє "ефекторній функцією" Fc-області з нативною послідовністю. Приклади "ефекторних функцій" включають зв'язування C1q; CDC; зв'язування Fc-рецептора; ADCC; фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептора В-клітин; BCR) і т. д. Такі ефекторні функції зазвичай вимагають, щоб Fc-область була об'єднана зі зв'язуючим доменом (наприклад, варіабельний домен антитіла) і їх можна оцінити, використовуючи різні аналізи, як описано, напрминокислотную послідовність, ідентичну амінокислотної послідовності Fc-області, що зустрічається в природі. Fc-області людини з нативною послідовністю включають Fc-область IgG1 людини з нативною послідовністю (аллотипи не-A і A); Fc-область IgG2 людини з нативною послідовністю; Fc-область IgG3 людини з нативною послідовністю; Fc-область IgG4 людини з нативною послідовністю, а також їх зустрічаються в природі варіанти.

"Варіант Fc-області" включає аминокислотную послідовність, яка відрізняється від Fc-області з нативною послідовністю тим, що містить щонайменше одну модифікацію амінокислоти, переважно одну або кілька аминокислотную заміну(замін). Переважно, варіант Fc-область включає щонайменше одну аминокислотную заміну у порівнянні з Fc-областю з нативною послідовністю або з Fc-областю початкового поліпептиду, наприклад приблизно від однієї до приблизно десяти амінокислотних замін, і переважно приблизно від однієї до п'яти амінокислотних замін в Fc-області з нативною послідовністю або Fc-області вихідного поліпептиду. Варіант Fc-області в цьому документі має переважно за мего поліпептиду, і найбільш переважно він має гомологією з ними щонайменше приблизно 90%, більш переважно він має гомологією з ними щонайменше приблизно 95%.

"Антитілозалежна клітинно-опосредуемая цитотоксичність" або "ADCC" відноситься до форми цитотоксичності, при якій секретируемие Ig, пов'язані з Fc-рецепторами (FcR), що знаходяться на певних цитотоксичних клітинах (наприклад, природних кілерна (NK) клітинах, нейтрофілах та макрофагах), викликають специфічне для цих ефекторних цитотоксичних клітин зв'язування з несучою антиген клітиною-мішенню, а потім знищують клітини-мішені за допомогою цитотоксинів. Антитіла є "зброєю" цитотоксичних клітин, і вони абсолютно необхідні для такого знищення. Основні клітини для здійснення ADCC, NK-клітини, що експресують тільки FcγRIII, в той час як моноцити експресують FcγRI, FcγRII і FcγRIII. Експресія FcR на кровотворних клітинах представлена в таблиці 3 на сторінці 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Для оцінки активності представляє інтерес молекули відносно ADCC, можна проводити аналіз ADCCin vitro, такий як аналіз, описаний в патенті США No. 5500362 або 5821337. Підходять для таких аналізів ефекторні клітини або додатково, активність представляє інтерес молекули відносно ADCC можна оцінюватиin vivoнаприклад, у моделі на тваринах, такий як описано в Clynes et al.PNAS (USA)95:652-656 (1998).

Терміни "Fc-рецептор" або "FcR" позначають рецептор, який зв'язується з Fc-областю антитіла. Кращим FcR є FcR людини з нативною послідовністю. Більш того, кращим FcR є FcR, який пов'язує антитіло IgG (гамма-рецептор) і включає рецептори підкласів FcγRI, FcγRII і FcγRIII, в тому числі алельні варіанти та альтернативно-сплайсированние форми цих рецепторів. Рецептори FcγRII включають FcγRIIA ("активує рецептор") і FcγRIIB ("інгібуючий рецептор"), які володіють схожими амінокислотними послідовностями, що відрізняються, головним чином, своїми цитоплазматичними доменами. Активує рецептор FcγRIIA у своєму цитоплазматическом домені містить иммунорецепторний тирозин-зв'язуючий активує мотив (ITAM). Інгібуючий рецептор FcγRIIB у своєму цитоплазматическом домені містить иммунорецепторний тирозин-зв'язуючий інгібуючий мотив (ITIM), (див. огляд M. в Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR описані в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al.,Immunomethods 4:25-34 (1994); і de Haas et al.,J. Lab. Clin.Med. �єм. Термін також включає в себе неонатальний рецептор, FcRn, який відповідає за перенесення материнських IgG плоду (Guyer et al.,J. Immunol. 117:587 (1976) і Kim et al.,J. Immunol.24:249 (1994)).

Зв'язування з FcRn людиниin vivoі період напівжиття в сироватці для поліпептидів з високою аффинностью зв'язування FcRn людини можна аналізувати, наприклад, у трансгенних мишей або в трансфицированних клітинних лініях людини, що експресують FcRn людини, або у приматів, яким вводять поліпептиди з варіантом Fc-області. В WO 2000/42072 (Presta) описані варіанти антитіл з підвищеним або зниженим зв'язуванням з FcR. См. також, наприклад, Shields et al. J. Товарbiol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

"Ефекторні клітини людини" являють собою лейкоцити, які експресують один або кілька FcR і виконують ефекторні функції. Переважно, клітини експресують щонайменше FcγRIII і виконують ефекторну функцію ADCC. Приклади лейкоцитів людини, які здійснюють ADCC, включають периферичні мононуклеарні клітини крові (PBMC), природні киллерние (NK) клітини, моноцити, цитотоксичні Т-клітини і нейтрофіли; при цьому переважними є PBMC і NK-клітини. Ефекторні клітини можна виділяти з їх природних джерел, наприклад, з кр�мента. Активація класичного каскаду комплементу починається зі зв'язування першого компонента системи комплементу (C1q) з антитілами (відповідного підкласу), пов'язаними з пізнаваних їм антигеном. Для оцінки активації комплементу можна проводити аналіз CDC, наприклад, як описано в Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Варіанти поліпептидів із зміненими амінокислотними послідовностями Fc-області і підвищеною або зниженою здатністю зв'язувати C1q описані в патенті США No. 6194551B1 і WO1999/51642. См. також, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Термін "містить Fc-область антитіло" відноситься до антителу, яке включає Fc-область. C-кінцевий лізин (залишок 447 відповідно до системи нумерації EU) Fc-області може бути видалений, наприклад, під час очищення антитіла або шляхом рекомбінантного конструювання антитіла, кодованого нуклеїнової кислотою. Таким чином, композиція, що включає містить Fc-область антитіло, у відповідності з цим винаходом може включати антитіло, що містить K447, антитіло, з якого повністю видалений K447, або суміш антитіл, що містять та не містять залишок K447.

Термін "позаклітинний домен" поліпептиду CD79b або "ECD" відноситься до форми поліпептиду CD79b, яка по суті Ѐансмембранних та/або цитоплазмических доменів, і переважно він містить менше 0,5% таких доменів. Зрозуміло, що будь-які трансмембранні домени, ідентифіковані для поліпептидів CD79b по справжньому винаходу, ідентифікують у відповідності з критеріями, зазвичай використовуваними в даній області для ідентифікації гідрофобного домену такого типу. Точні межі трансмембранного домену можуть варіювати, але, найбільш ймовірно, не більш ніж приблизно на 5 амінокислот в будь-яку сторону від домену, як початково визначена в цьому документі. Таким чином, необов'язково позаклітинний домен поліпептиду CD79b може містити приблизно 5 або менше амінокислот з будь-якого боку кордону між трансмембранним доменом/позаклітинним доменом, як зазначено в прикладах або описі, і такі поліпептиди, що містять або не містять пов'язаного з ними сигнального пептиду, і кодують їх нуклеїнові кислоти передбачаються цим винаходом.

Приблизне положення "сигнальних пептидів" поліпептиду CD79b, описаний у цьому документі, може бути показано у цьому описі і/або на відповідних рисунках. Однак слід зазначити, що C-кінцева межа сигнального пептиду може варіювати, але найбільш імовірно, не болидентифицировано в цьому документі, де C-кінцева межа сигнального пептиду може бути визначена згідно з критеріями, які зазвичай використовують у даній галузі для ідентифікації такого типу елемента амінокислотної послідовності (див. наприклад, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) та von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Крім того, відомо, що в деяких випадках відщеплення сигнальної послідовності від секретованої поліпептиду не є повністю однаковим, що призводить до більш ніж одного виду секреції поліпептиду. Такі зрілі поліпептиди, в яких сигнальний пептид відщеплюється в межах не більш ніж приблизно 5 амінокислот з кожної зі сторін C-кінцевий кордону сигнального пептиду, як ідентифіковано в цьому документі, і кодують їх полінуклеотиди передбачаються цим винаходом.

Термін"варіант поліпептиду CD79b" означає поліпептид CD79b, переважно активний поліпептид CD79b, як описано в цьому документі, що володіє щонайменше приблизно 80% ідентичністю амінокислотної послідовності з повнорозмірним поліпептидом CD79b з нативною послідовністю, як описано в цьому документі, послідовність поліпептиду CD79b, в якій відсутня ом, або без нього, або будь-який інший фрагмент повнорозмірною послідовності поліпептиду CD79b, як описано в цьому документі (такий, як фрагменти, які кодуються нуклеїнової кислотою, яка являє собою тільки частину повної кодуючої послідовності повнорозмірного поліпептиду CD79b). Такі варіанти поліпептиду CD79b включають, наприклад, поліпептиди CD79b, де доданий або видалити один або кілька амінокислотних залишків на N - або C-наприкінці повнорозмірною нативної амінокислотної послідовності. Зазвичай варіант поліпептиду CD79b володіє щонайменше приблизно 80% ідентичністю амінокислотної послідовності, альтернативно, щонайменше приблизно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, або 99% ідентичністю амінокислотної послідовності з повнорозмірним поліпептидом CD79b з нативною послідовністю, як описано в цьому документі послідовністю поліпептиду CD79b, в якій відсутня сигнальний пептид, як описано в цьому документі, позаклітинним доменом поліпептиду CD79b з сигнальним пептидом або без нього, як описано в цьому документі, або будь-яким іншим конкретно певним фрагментом повнорозмірною послідовник�їй міру приблизно 10 амінокислот, альтернативно щонайменше приблизно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 амінокислот або більше. Необов'язково, варіанти поліпептидів CD79b містять не більше однієї консервативної амінокислотної заміни порівняно з поліпептидом CD79b з нативною послідовністю, альтернативно не більше 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 консервативних амінокислотних замін, порівняно з поліпептидом CD79b з нативною послідовністю.

"Процентну (%) ідентичність амінокислотних послідовностей" щодо послідовності пептиду або поліпептидів, тобто послідовностей поліпептидів CD79b, ідентифікованих в цьому документі, визначають як відсоток амінокислотних залишків у послідовності-кандидата, які ідентичні амінокислотним залишкам у конкретній послідовності пептиду або поліпептидів, тобто послідовності поліпептиду CD79b, після вирівнювання послідовностей та внесення пропусків, якщо необхідно, для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовностей, і не вважаючи які-небудь консервативні заміни частиною ідентичності посл�остей можна проводити різними способами, які відомі в цій галузі, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програмне забезпечення BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Фахівці в даній області можуть визначити відповідні параметри для проведення вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання протягом всієї довжини порівнюваних послідовностей. Однак для цілей, представлених в цьому документі, значення % ідентичності амінокислотних послідовностей отримують з використанням комп'ютерної програми для порівняння послідовностей ALIGN-2, де повний вихідний текст програми ALIGN-2 надано в таблиці 1 нижче. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей ALIGN-2 була складена в Genentech, Inc. і вихідний текст, представлений в таблиці 1 нижче, був представлений з користувацької документацією у U. S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, де він зареєстрований під U. S. Copyright Registration No. TXU510087. Програма ALIGN-2 є загальнодоступною через Genentech, Inc., South San Francisco, California або її можна скласти з вихідного тексту, представленого в таблиці 1 нижче. Програма ALIGN-2 повинна бути складена для застосування на операційній сиѾй ALIGN-2 і не змінюються.

У випадках, коли ALIGN-2 використовують для порівняння амінокислотних послідовностей, % ідентичність амінокислотних послідовностей для даної амінокислотної послідовності A до, з або проти даної амінокислотної послідовності B (що альтернативно може бути сформульоване як ця амінокислотна послідовність A, яка володіє певною % ідентичністю амінокислотної послідовності або містить % ідентичність амінокислотної послідовності, до, з або проти даної амінокислотної послідовності B), або обчислюють наступним чином:

100 помножити на приватне X/Y

де X являє собою число амінокислотних залишків, оцінених як ідентичні збігу програмою для вирівнювання послідовностей ALIGN-2 при вирівнюванні цією програмою A і B, і де Y являє собою загальну кількість амінокислотних залишків у B. Зрозуміло, що коли довжина амінокислотної послідовності A не дорівнює довжині амінокислотної послідовності B, % ідентичність амінокислотних послідовностей A до B не дорівнює % ідентичності амінокислотних послідовностей B до A.

"Варіант полинуклеотида CD79b" або "варіант послідовності нуклеїнової кислоти CD79b" озн�, �ак визначено в цьому документі, і яка має щонайменше приблизно 80% ідентичністю послідовності нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеїнової кислоти, кодує повнорозмірну послідовність поліпептиду CD79b з нативною послідовністю, ідентифікованого в цьому документі, повнорозмірну послідовність поліпептиду CD79b з нативною послідовністю, в якій відсутня сигнальний пептид, як описано в цьому документі, позаклітинний домен поліпептиду CD79b з сигнальним пептидом, чи без нього, як описано в цьому документі, або будь-який інший фрагмент повнорозмірною послідовності поліпептиду CD79b, як описано в цьому документі (такий, як фрагменти, які кодуються нуклеїнової кислотою, яка являє собою тільки частину повної кодуючої послідовності повнорозмірного поліпептиду CD79b). Як правило, такі варіанти полінуклеотидів CD79b мають принаймні приблизно 80% ідентичністю послідовності нуклеїнової кислоти, альтернативно щонайменше приблизно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичністю послідовності нуклеїнової кислоти з наступ.� послідовністю, як описано в цьому документі, повнорозмірну послідовність поліпептиду CD79b з нативною послідовністю, в якій відсутня сигнальний пептид, як описано в цьому документі, позаклітинний домен поліпептиду CD79b з сигнальним пептидом, чи без нього, як описано в цьому документі, або будь-який інший фрагмент повнорозмірною послідовності поліпептиду CD79b, як описано в цьому документі. Варіанти включають нативну нуклеотидну послідовність.

Як правило, довжина варіантів полінуклеотидів CD79b становить щонайменше 5 нуклеотидів, альтернативно вона становить щонайменше приблизно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 або 1000 нуклеотидів, де в цьому контексті термін "приблизно" означає зазначену довжину нуклеотидної послідовності плюс або мінус 10% від цієї зазначеної довжини.

"Процентну ідентичність (%) последоватеЀованних в цьому документі, визначають як відсоток нуклеотидів в послідовності-кандидата, які ідентичні нуклеотидам в представляє інтерес послідовності нуклеїнової кислоти CD79b, після вирівнювання послідовностей та внесення пропусків, якщо необхідно, для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовностей. Вирівнювання для цілей визначення процентної ідентичності послідовностей нуклеїнових кислот можна проводити різними способами, які знаходяться в межах спеціальних знань, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програмне забезпечення BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Однак для цілей, представлених в цьому документі, значення % ідентичності послідовностей нуклеїнових кислот отримують з використанням комп'ютерної програми для порівняння послідовностей ALIGN-2, де повний вихідний текст програми ALIGN-2 надано в таблиці 1 нижче. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей ALIGN-2 була складена в Genentech, Inc. і вихідний текст, представлений в таблиці 1 нижче, був представлений з користувацької документацією у U. S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, де він зареєстрований під U. S. C�віть з вихідного тексту, представленого в таблиці 1 нижче. Програма ALIGN-2 повинна бути складена для застосування на операційній системі UNIX, переважно цифровий UNIX V4.0D. Всі параметри порівняння послідовностей встановлені програмою ALIGN-2 і не змінюються.

У випадках, коли ALIGN-2 використовують для порівняння послідовностей нуклеїнових кислот, % ідентичність послідовностей нуклеїнових кислот для даної послідовності нуклеїнової кислоти C до, з, або проти даної послідовності нуклеїнової кислоти D (яка альтернативно може бути сформульована як дана послідовність нуклеїнової кислоти C, яка має або включає певну % ідентичність послідовності нуклеїнової кислоти до, з, або проти даної послідовності нуклеїнової кислоти D) обчислюють наступним чином:

100, помножене на приватне W/Z

де W-кількість нуклеотидів, оцінених як ідентичні збігу програмою для вирівнювання послідовностей ALIGN-2 при вирівнюванні цією програмою C і D, і де Z являє собою загальне число нуклеотидів в D. Зрозуміло, що коли довжина послідовності нуклеїнової кислоти C не дорівнює довжині послідовності нуклеїнової кислоти D, % ідентичності�ти нуклеїнової кислоти D щодо C. Якщо конкретно не вказано інше, всі значення % ідентичності послідовностей нуклеїнових кислот, що використовуються в цьому документі, отримані, як описано в попередньому абзаці з використанням комп'ютерної програми ALIGN-2.

В інших варіантах здійснення варіанти полінуклеотидів CD79b являють собою молекули нуклеїнових кислот, які кодують поліпептид CD79b і які здатні гибридизоваться переважно в жорстких умовах гібридизації і промивання з нуклеотидними послідовностями, кодирующими повнорозмірний поліпептид CD79b, як описано в цьому документі. Варіанти поліпептидів CD79b можуть представляти собою поліпептиди, які кодуються варіантами полінуклеотидів CD79b.

Термін "повнорозмірна кодує область", коли його використовують стосовно нуклеїнової кислоти, кодує поліпептид CD79b, відноситься до послідовності нуклеотидів, яка кодує повнорозмірний поліпептид CD79b по справжньому винаходу (який часто зображений ініціюючим кодоном і стоп-кодоном, включно, що додаються малюнках). Термін "повнорозмірна кодує область", коли його використовують стосовно нуклеїнової кислоти, депонованої в ATCC, відноситься до кодирующ�м кодоном і стоп-кодоном, включно, що додаються малюнках (ініціюючий кодон і стоп-кодон позначені жирним шрифтом та підкреслені на малюнках)).

"Виділений", при застосуванні для опису різних поліпептидів CD79b, описаних у цьому документі, означає поліпептид, який ідентифікований і відокремлений та/або виділений з компонента його природного оточення. Забруднюючі компоненти природного оточення являють собою матеріали, які, як правило, перешкоджають діагностичного і терапевтичного застосування поліпептиду, і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові або небелковие розчинені речовини. У кращих варіантах здійснення таких поліпептиди будуть очищати (1) до ступеню, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевий або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з обертовим склянкою, або (2) до гомогенності при SDS-PAGE в відновлюють або невосстанавливающих умовах з використанням кумасси синього або, переважно, фарбування сріблом. Такі виділені поліпептиди включають відповідні поліпептиди в рекомбінантних клітинахin situ,оскільки в цьому випадку буде відсутній за меншою �ть допомогою щонайменше однієї стадії очищення.

"Виділена" нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид CD79b, або нуклеїнова кислота, що кодує інший поліпептид, являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована і відділена щонайменше від одного забруднює молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона зазвичай асоційована у природному джерелі кодує поліпептид нуклеїнової кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид знаходиться в іншій формі або на інших умовах, ніж форма і умови, в яких вона зустрічається в природі. Таким чином, виділені молекули нуклеїнових кислот, що кодують поліпептид, що відрізняються від конкретної молекули нуклеїнової кислоти, кодує поліпептид, яка існує в природних клітинах. Однак виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, що містить молекули нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди, що містяться в клітинах, які зазвичай експресують поліпептид, де, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в положенні на хромосомі, відмінному від положення на хромосомі в природних клітинах.

Термін "послідовності контролю" відноситься до послідовності ДНК, необхідним для експресії функціонально свяпригодни для прокаріотів, включають, наприклад, промотор, необов'язково послідовність оператора і ділянку зв'язування рибосом. Відомо, що эукариотические клітини використовують промотори, сигнали полиаденилирования і энхансери.

Нуклеїнова кислота є "функціонально пов'язаної", коли вона знаходиться у функціональній зв'язку з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК для препоследовательности або секреторної лідерної послідовності функціонально пов'язана з ДНК поліпептиду, якщо вона експресуються в якості пребелка, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер є функціонально пов'язаним з кодує послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або ділянка зв'язування рибосом є функціонально пов'язаним з кодує послідовністю, якщо він розташований таким чином, щоб полегшити трансляцію. Як правило, "функціонально зв'язаний" означає, що пов'язані послідовності ДНК є суміжними, і, в разі секреторної лідерної послідовності, є суміжними і знаходяться в рамці зчитування. Однак энхансери не повинні бути суміжними. Зв'язування здійснюють шляхом лігування в соответствѽие елементи або линкери в відповідності з загальноприйнятою практикою.

"Жорсткість" реакцій гібридизації легко визначає фахівець в даній області, і, як правило, вона являє собою емпіричне обчислення, залежне від довжини зонда, температури промивання і концентрації солі. Як правило, для належного відпалу більш довгі зонди вимагають більш високих температур, в той час як більш короткі зонди вимагають більш низьких температур. Гібридизація, як правило, залежить від здатності денатуруючої ДНК до повторного відпалу, коли комплементарні ланцюги присутні в навколишньому середовищі при температурі, нижче їхні температури відпалу. Чим вищою є ступінь необхідної гомології між зондом і гибридизуемой послідовністю, тим вищою є відносна температура, яку можна використовувати. В результаті, з цього випливає, що більш високі відносні температури будуть забезпечувати тенденцію до більш жорстких умов реакції, в той час як більш низькі температури знижують жорсткість. Для додаткових деталей і роз'яснення жорсткості реакцій гібридизації, див. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Жорсткі умови" або "умови високої жорсткості", як визначено в цьому документі, можна визначе�хлорид натрію/0,0015 M цитрат натрію/0,1% додецилсульфат натрію при 50°С; (2) використовують у ході гібридизації денатурирующее засіб, таке як формамід, наприклад, 50% (про./про.) формамід з 0,1% бичачим сироватковим альбуміном/0,1% Ficoll/0,1% полівінілпіролідоном/50 мМ натрій-фосфатним буфером при рн 6,5 з 750 мМ хлоридом натрію, 75 мМ цитратом натрію при 42°C; або (3) проводять гібридизацію протягом ночі в розчині, в якому використовується 50% формамід, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрію), 50 мМ фосфат натрію (рн 6,8), 0,1% пірофосфат натрію, 5 x розчин Денхардта, опромінена ультразвуковим опроміненням ДНК сперми лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS і 10% сульфату декстрану при 42°C, з промиванням протягом 10 хвилин при 42°C 0,2 x SSC (хлорид натрію/цитрат натрію) з подальшим промиванням високої жорсткості протягом 10 хвилин, що складається з 0,1 x SSC, що містить EDTA, при 55°C.

"Умови помірної жорсткості" можна визначити, як описано в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, і вони включають застосування менш жорсткого розчину для промивання та умов гібридизації (наприклад, температури, іонної сили та %SDS), ніж розчин для промивання та умови гібридизації, описані вище. Прикладом помірно жорстких умов є інкубація протягом ночі при 37°C в розчині, що містить: 20% формамід, 5 x SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ трицитрат натр� ДНК сперми лосося, з подальшим промиванням фільтрів в 1 x SSC при приблизно 37-50°С. Фахівця буде зрозуміло, яким чином коригувати температуру, іонну силу і т. д., у разі необхідності пристосування до таких чинників, як довжина зонда і т. п.

Термін "мічений эпитопом", при застосуванні у цьому документі, належить до химерному поліпептиду, який містить поліпептид CD79b, або антитіло проти CD79b, злиті з "поліпептидом-міткою". Поліпептид-мітка має достатню кількість залишків для забезпечення епітопу, проти якого можна отримувати антитіло, але в той же час є досить коротким, щоб не перешкоджати активності поліпептиду, з яким він злитий. Також поліпептид-мітка переважно є абсолютно унікальним, так що антитіло по суті не вступає у перехресні реакції з іншими эпитопами. Відповідні поліпептиди-мітки, як правило, мають щонайменше шість амінокислотних залишків і, як правило, між приблизно 8 і 50 амінокислотних залишків (переважно, приблизно між 10 і 20 амінокислотних залишків).

"Активний" або "активність" для цілей, представлених в цьому документі, стосується формі(ам) поліпептиду CD79b, яка зберігає біологічного�сть відноситься до біологічної функції (або інгібіторної, або стимулюючої), забезпечуваною нативним або зустрічається в природі CD79b, відмінною від здатності індукувати утворення антитіла проти антигенного епітопу, яким володіє нативний або зустрічається в природі CD79b, і "імунологічна" активність відноситься до здатності індукувати утворення антитіла проти антигенного епітопу, яким володіє нативний або зустрічається в природі CD79b.

Термін "антагоніст" використовують у найбільш широкому сенсі, і він включає будь-яку молекулу, яка частково або повністю блокує, гальмує або нейтралізує біологічну активність нативного поліпептиду CD79b. Аналогічно, термін "агоніст" використовують у найбільш широкому сенсі, і він включає будь-яку молекулу, яка імітує біологічну активність нативного поліпептиду CD79b. Відповідні молекули агоністів і антагоністів конкретно включають антитіла-антагоністи або антитіла-агоністи, або фрагменти цих антитіл, фрагменти або варіанти амінокислотної послідовності нативних поліпептидів CD79b, пептиди, антисмисловие олигонуклеотиди, низькомолекулярні органічні молекули і т. д. Способи ідентифікації антагоністів або агоністів поліпептиду CD79b можуть включати контактированния одного або декількох видів біологічної активності, зазвичай асоційованих з поліпептидом CD79b.

"Очищений" означає, що молекула присутня в зразку в концентрації щонайменше 95% по масі, або щонайменше 98% по масі зразка, в якому вона міститься.

"Виділена" молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка відокремлена щонайменше від однієї іншої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона зазвичай асоційована, наприклад, в її природному оточенні. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, крім того, включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай експресують молекулу нуклеїнової кислоти, але молекула нуклеїнової кислоти знаходиться поза хромосоми або в області хромосоми, яка відрізняється від її природного розташування на хромосомі.

Термін "вектор", як використовують у цьому документі, відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної здійснювати транспорт інший нуклеїнової кислоти, з якою вона пов'язана. Одним типом вектора є "плазміда", яка відноситься до кільцевої дволанцюжкової петлі ДНК, в яку можна лігувати додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектора є фаговий вектор. Іншим типом вектора являетсѿособни до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний оріджін реплікації і эписомальние вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неэписомальние вектори ссавців) можуть вбудовуватися в геном клітини-господаря при введенні в клітку-господаря, і, тим самим, вони реплікуються разом з геномом хазяїна. Більш того, деякі вектори здатні направляти експресію генів, з якими вони функціонально пов'язані. Такі вектори називають в цьому документі "рекомбінантними экспрессирующими векторами" (або просто "рекомбінантними векторами"). Як правило, експресують вектори, що застосовуються в способах рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У цьому описі, терміни "плазміда" і "вектор" можуть бути використані як взаємозамінні, оскільки плазміда є найбільш часто використовуваною формою вектора.

Термін "полинуклеотид" або "нуклеїнова кислота", що використовуються у цьому документі взаємозамінні, відноситься до полімерів нуклеотидів будь-якої довжини, і включають ДНК і РНК. Нуклеотиди можуть представляти собою дезоксирибонуклеотиди, рибонуклеотиди, модифіковані нуклеотиди або підстави, та/або їх аналоги, чи будь-який субстрат, який може бути жати модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди та їх аналоги. До і після складання полімеру може відбуватися модифікація нуклеотидної структури, якщо вона відбувається. Послідовність нуклеотидів може перериватися ненуклеотидними компонентами. Крім того, полинуклеотид може бути модифікований після полімеризації, наприклад, конъюгацией із здійснюють мічення компонентом. Інші типи модифікацій включають, наприклад, "кепи", заміну одного або декількох зустрічаються в природі нуклеотидів аналогом, межнуклеотидние модифікації, наприклад, такі як модифікації незарядженими зв'язками (наприклад, метилфосфонатами, фосфотриэфирами, фосфоамидатами, карбаматами і т. д.) і зарядженими зв'язками (наприклад, фосфоротиоатами, фосфородитиоатами, і т. д.), модифікації виступаючими групами, наприклад, такими як білки (наприклад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пептиди, полі-L-лізин і т. д.), модифікації интеркаляторами (наприклад, акридином, псораленом, і т. д.), модифікації хелаторами (наприклад, металами, радіоактивними металами, бором, окислювальними металами і т. д.), модифікації алкілуючими сполуками, модифікації модифікованими зв'язками (наприклад, альфа-аномерні нуклеїнові кислоти тощо), а та�ие в сахарах, можуть бути замінені, наприклад, фосфонатними групами, фосфатними групами, вони можуть бути захищені стандартними захисними групами або активовані для утворення додаткових зв'язків з додатковими нуклеотидами, або вони можуть бути конъюгировани з твердими або напів-твердими підкладками. 5'- і 3'-кінцевий OH може бути фосфорилирован або заміщений або органічними амінами кэпирующими групами від 1 до 20 атомів вуглецю. Інші гидроксили також можуть бути перетворені в стандартні захисні групи. Полінуклеотиди також можуть містити аналогічні форми цукрів рибози або дезоксирибози, які, головним чином, відомі в цій галузі, включаючи, наприклад, 2'-O-метил-, 2'-O-аліл-, 2'-фтор - або 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги цукрів, альфа-аномерні цукру, эпимерние цукру, такі як арабіноза, ксилози або ликсози, цукру пиранози, цукру фуранози, седогептулози, ациклічні аналоги і абазические нуклеозидні аналоги, такі як метилрибозид. Одна або кілька фосфодиэфирних зв'язків можуть бути замінені альтернативними линкерними групами. Ці альтернативні линкерние групи включають, але не обмежуються ними, варіанти здійснення, де фосфат замінений на P(O)S ("тиоат"), P(S)S �яет H або замещенний або незамещенний алкіл (1-20 C), необов'язково містить просту ефірну зв'язок (-O-), арил, алкенів, циклоалкіл, циклоалкенил або аралдил. Не обов'язково, щоб всі зв'язки в полинуклеотиде були ідентичними. Представлене вище опис застосовно до всіх полинуклеотидам, вказаними в цьому документі, включаючи РНК і ДНК.

"Олигонуклеотид", як використовують у цьому документі, стосується, головним чином, до коротким, як правило, одноцепочечним, як правило, синтетичним полинуклеотидам довжиною, як правило, але не обов'язково, менше 200 нуклеотидів. Терміни "олигонуклеотид" і "полинуклеотид" не є взаємовиключними. Представлене вище опис полінуклеотидів в рівній мірі і повністю застосовно до олигонуклеотидам.

Терміни "злоякісна пухлина" і "злоякісний" відносяться до фізіологічного стану або описують фізіологічний стан у ссавців, яке, як правило, характеризується нерегульованим ростом клітин. Приклади злоякісної пухлини включають, але не обмежуються ними, гемопоетичні злоякісні пухлини або пов'язані з кров'ю злоякісні пухлини, такі як лімфома, лейкоз, мієлома або лімфоїдні злоякісні пухлини, а також злоякісні пухлини селі приклади злоякісної пухлини включають асоційовані з B-клітками злоякісні пухлини, включаючи наприклад, високодиференційовані, проміжні і низкодифференцированние лімфоми (включаючи B-клітинні лімфоми, наприклад, такі як B-клітинна лімфома асоційованої зі слизовою оболонкою лімфоїдної тканини і неходжскинская лімфома (НХЛ), лімфома з клітин мантійній зони, лімфома Беркітта, мелколимфоцитарная лімфома, лімфома маргінальної зони, дифузна крупноклеточная лімфома, фолікулярна лімфома і лімфома Ходжкіна, та T-клітинні лімфоми) та лейкози (включаючи вторинний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), такий як B-клітинний лейкоз (CD5+ B-лімфоцити), мієлоїдний лейкоз, такої як гострий мієлоїдний лейкоз, хронічний мієлоїдний лейкоз, лімфоїдний лейкоз, такої як гострий лімфобластний лейкоз (ALL) та мієлодисплазія), та інші гематологічні та/або асоційовані з B-клітками або T-клітинами злоякісні пухлини. Також включаються злоякісні пухлини допоміжних кровотворних клітин, включаючи поліморфноядерні лейкоцити, такі як базофіли, еозинофіли, нейтрофіли і моноцити, дендритні клітини, тромбоцити, еритроцити і природні киллерние клітини. Також включаються злоякісні B-клітинно-проліферативні порушення, вибрані з наступних: лімфома, �ктерная NHL, рефрактерна уповільнена NHL, хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), мелколимфоцитарная лімфома, лейкоз, волосатоклітинний лейкоз (HCL), гострий лімфоцитарний лейкоз (ALL) і лімфома з клітин мантійній зони. Джерела B-клітинних злоякісних пухлин включають наступні: B-клітинна лімфома маргінальної зони відбувається з B-клітин пам'яті в маргінальній зоні, фолікулярна лімфома і дифузна крупноклеточная B-лімфома відбуваються з центроцитов у світлій зоні гермінативних центрів, хронічний лімфоцитарний лейкоз і дрібноклітинний лімфоцитарний лейкоз відбуваються з B1-клітин (CD5+), лімфома з клітин мантійній зони відбувається з наївних B-клітин у мантійній зоні, і лімфома Беркітта відбувається центробластов в темній зоні гермінативних центрів. Тканини, які включають кровотворні клітини, звані в цьому документі "тканинами гемопоетичних клітин", включають тимус і кістковий мозок і периферичні лімфоїдні тканини, такі як селезінка, лімфатичні вузли, лімфоїдні тканини, асоційовані зі слизовою оболонкою, такі як асоційовані з кишечником лімфоїдні тканини, мигдалеподібні залози, пейєрові бляшки і апендикс і лімфоїдні тканини, асоційовані з іншими слизовими обол�скоклеточний рак, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легені, злоякісну пухлину очеревини, печеночноклеточний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, глиому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстого кишечника, рак ободової і прямої кишки, карциному ендометрію або матки, карциному слинної залози, рак нирки, рак печінки, рак передміхурової залози, рак жіночих зовнішніх статевих органів, рак щитовидної залози, карциному печінки, лейкоз та інші лімфопроліферативні порушення, і різні типи раку голови і шиї.

"B-клітинна злоякісна пухлина" у цьому документі включає неходжскинскую лімфому (NHL), у тому числі низкодифференцированную/фолікулярну NHL, мелколимфоцитарную NHL (SL), проміжно-диференційовану/фолікулярну NHL, проміжно-диференційовану дифузну NHL, високодифференцированную иммунобластную NHL, високодифференцированную лімфобластний NHL, високодифференцированную мелкоклеточную NHL з нерасщепленними ядрами, NHL з масивним ураженням, лімфому з клітин мантійній зони, асоційовану зі СНІД лімфому, і макро�колимфоцитарную лімфому (SLL), хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), повільну NHL, включаючи рецидивуючу повільну NHL і рефрактерную до ритуксимабу повільну NHL; лейкоз, у тому числі гострий лімфобластний лейкоз (ALL), хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), волосатоклітинний лейкоз, хронічний мієлобластний лейкоз; лімфому клітин мантійній зони; та інші гематологічні злоякісні пухлини. Такі злоякісні пухлини можна лікувати антитілами, спрямованими проти маркерів B-клітинної поверхні, таких як CD79b. У цьому документі передбачаються, що такі захворювання можна лікувати шляхом введення антитіла, спрямованого проти маркера B-клітинної поверхні, такого як CD79b, і воно включає введення некон'югованого ("голого") антитіла або антитіла, кон'югованого з цитотоксичним засобом, як описано в цьому документі. Також в цьому документі передбачається, що такі захворювання можна лікувати комбінованою терапією, що включає антитіло проти CD79b або кон'югат антитіла проти CD79b з лікарським засобом щодо винаходу у поєднанні з іншим антитілом або кон'югатом антитіла та лікарського засобу, іншим цитотоксичним засобом, променевою терапією або іншим способом Ђело проти CD79b щодо винаходу вводять в поєднанні з антитілом проти CD20, імуноглобуліном, або його зв'язує CD20 фрагментом, або разом, або послідовно. Антитіло проти CD20 може представляти собою "голе" антитіло або кон'югат антитіла і лікарського засобу. В одному з варіантів здійснення комбінованої терапії, антитіло проти CD79b являє собою антитіло по справжньому винаходу, а антитіло проти CD20 являє собою Rituxan® (рітуксімаб).

Як використовують у рамках цієї заявки, термін "неходжскинская лімфома" або "NHL" відноситься до злоякісної пухлини лімфатичної системи, відмінної від лімфом Ходжкіна. Лімфоми Ходжкіна можна відрізнити від неходжкінських лімфом, головним чином, за наявністю клітин Рід-Штернберга при лімфомах Ходжкіна і відсутності зазначених клітин при неходжскинских лімфомах. Приклади неходжскинских лімфом, які охоплює використовуваний у цій заявці термін, включають в себе будь-які лімфоми, які фахівець у цій галузі (наприклад, онколог або патолог) може визначити як неходжкинскую лімфому у відповідності з системами класифікації, відомими в даній галузі, такими як Переглянута європейсько-американська класифікація лімфом (REAL), як описано в Color Atlas of Clinical Hematology, (Third Edition), A. Victor Hoffbrand a�аничиваются ними, рецидивуючу або рефрактерную NHL, прикордонну низкодифференцированную NHL, NHL стадії III/IV, стійку до хіміотерапії NHL, лімфобластний лейкоз та/або лімфому попередників B-клітин, мелколимфоцитарную лімфому, B-клітинний хронічний лімфоцитарний лейкоз та/або пролимфоцитарний лейкоз та/або мелколимфоцитарную лімфому, B-клітинну пролимфоцитарную лімфому, иммуноцитому та/або лимфоплазматическую лімфому, B-клітинну лімфому маргінальної зони, лімфому маргінальної зони селезінки, экстранодальную MALT-лімфому маргінальної зони, волосатоклітинний лейкоз, плазмацитому та/або плазмаклеточную миелому, низкодифференцированную/фолікулярну лімфому, проміжно-диференційовану/фолікулярну NHL, лімфому з клітин мантійній зони, лімфому центрального фолікула (фолікулярну), проміжно-диференційовану дифузну NHL, дифузну крупноклеточную B-клітинну лімфому, NHL з агресивним перебігом (у тому числі прикордонну NHL з агресивним перебігом і рецидивуючу NHL з агресивним перебігом), NHL, рецидивировавшую після аутологічної трансплантації стовбурових клітин або стійку до неї, первинну медіастинальної крупноклеточную B-клітинну лімфому, первинну эффузионную лімфому, високод�елкоклеточную NHL з нерасщепленними ядрами, NHL з масивним ураженням, лімфому Беркітта, лімфобластний лейкоз та/або лімфому великих гранулярних попередників T-клітин (периферичних), фунгоидний мікоз та/або синдром Сезарі, лімфоми шкіри (шкірні), анапластическую крупноклеточную лімфому, ангиоцентричную лімфому.

"Порушення" являє собою будь-який стан, при якому може бути корисним лікування речовиною/молекулою або способом щодо винаходу. Воно включає хронічні і гострі порушення або захворювання, включаючи патологічні стани, які призводять ссавця до даного порушення. Неограничивающие приклади порушень, що підлягають лікуванню згідно з цим описом, включають злоякісні стани, такі як злоякісні і доброякісні пухлини; не лейкози та лімфоїдні злоякісні пухлини; нейрональні, гліальні, астроглиальние, гіпоталамічні порушення та порушення інших залоз, макрофагальние, епітеліальні, стромальні і бластоцельние порушення; і запальні, імунологічні та інші пов'язані з ангиогенезом порушення. Крім того, порушення включають стану, такі як B-клітинно-проліферативні порушення та/або B-клітинні пухлини, наприклад, лиL, рефрактерную NHL, рефрактерную повільну NHL, хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), мелколимфоцитарную лімфому, лейкоз, волосатоклітинний лейкоз (HCL), гострий лімфоцитарний лейкоз (ALL) і лімфому з клітин мантійній зони.

Терміни "клітинно-проліферативне порушення" і "проліферативне порушення" відносяться до порушень, які асоційовані з аномальною, в деякій мірі, клітинною проліферацією. В одному варіанті здійснення, клітинно-проліферативне порушення являє собою злоякісну пухлину.

"Пухлина", як використовують у цьому документі, відноситься до будь-якого неопластическому клітинного росту і проліферації, як злоякісних, так і доброякісних, і до будь-яких предзлокачественним і злоякісним клітинам і тканинам.

"Аутоімунне захворювання" в цьому документі являє собою захворювання або порушення, що виникає у власних тканинах індивідуума і спрямоване проти них, або окремий його ознака або його прояв, або стан, що виникає як його наслідок. При багатьох з цих аутоімунних і запальних порушень, може існувати ряд клінічних і лабораторних маркерів, включаючи, але не обмежуючись ними, гипергаммаглобулинемию, дамі або імунодепресивними засобами, і агрегати лімфоїдних клітин в уражених тканинах. Не обмежуючись будь-якої теорії, що стосується опосредуемого B-клітинами аутоімунного захворювання, вважають, що B-клітини демонструють патогенний ефект при аутоімунних захворюваннях людини через безліч механічних каскадів, включаючи продукцію аутоантитіл, утворення імунних комплексів, активацію дендритних клітин і T-клітин, синтез цитокінів, пряме вивільнення хемокінів, і забезпечення для вогнища ектопічного неолимфогенеза. Кожен з цих каскадів може брати участь у патології аутоімунних захворювань різного ступеня.

"Аутоімунне захворювання" може бути органоспецифическим захворюванням (тобто, імунна відповідь специфічно спрямований проти системи органів, такий як ендокринна система, гемопоетічна система, шкіра, серцево-легенева система, шлунково-кишкова та печінкова системи, ниркова система, щитовидна залоза, вуха, нервово-м'язова система, центральна нервова система тощо) або системним захворюванням, яке може вражати безліч систем органів (наприклад, системний червоний вовчак (SLE), ревматоїдний артрит, поліміозит, тощо). Переважно, такі захворювання включають аутоімунні ревмат�я як SLE і вовчаковий нефрит, поліміозит/дерматоміозит, кріоглобулінемія, синдром антифосфоліпідних антитіл, та псоріатичний артрит), аутоімунні шлунково-кишкові порушення і порушення печінки (наприклад, такі як запальні захворювання кишечнику (наприклад, виразковий коліт і хвороба Крона), аутоімунний гастрит і пернициозную анемію, аутоімунний гепатит, первинний біліарний цироз, первинний склерозуючий холангіт, і глютенова энтеропатию), васкуліт (наприклад, такий як ANCA-негативний васкуліт і ANCA-асоційований васкуліт, включаючи васкуліт Черджа-Строса, гранулематоз Вегенера і мікроскопічний полиангиит), аутоімунні неврологічні порушення (наприклад, такі як розсіяний склероз, опсоклонус-міоклонус синдром, міастенія, оптичний миелоневрит, хвороба Паркінсона, хвороба Альцгеймера і аутоімунні поліневропатії), ниркові порушення (наприклад, такі як гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, і хвороба Бергера), аутоімунні дерматологічні порушення (наприклад, такі як псоріаз, кропив'янка, уртикария, пемфігус звичайний, бульозний пемфигоид і шкірний червоний вовчак), гематологічні порушення (наприклад, такі як тромбоцитопенічна пурпура, тромботична тромбоцитопениче�унние хвороби слуху (наприклад, такі як хвороба внутрішнього вуха та втрата слуху), хвороба Бехчета, синдром Рейно, трансплантацію органів та аутоімунні ендокринні порушення (наприклад, такі, як пов'язані з діабетом аутоімунні захворювання, такі як інсулін-залежний цукровий діабет (IDDM), хвороба Аддісона та аутоімунне захворювання щитовидної залози (наприклад, хвороба Грэйвса і тиреоїдит)). Більш переважні такі захворювання включають, наприклад, ревматоїдний артрит, виразковий коліт, ANCA-асоційований васкуліт, вовчак, розсіяний склероз, синдром Шегрена, хвороба Грэйвса, IDDM, пернициозную анемію, тиреоїдит та гломерулонефрит.

Конкретні приклади інших аутоімунних захворювань, як визначено в цьому документі, які в деяких випадках охоплюють захворювання, наведені вище, включають, але не обмежуються ними, артрит (гострий і хронічний, ревматоїдний артрит, включаючи ювенільний ревматоїдний артрит з початком і стадії артриту, такі як ревматоїдний синовіт, артрит при подагрі або подагричний артрит, гострий імунологічний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, індукований колагеном типу II артрит, інфекційний артрит, артрит Лайма, проліферативний артр�іт, деформуючий артрит, первинний хронічний поліартрит, реактивний артрит, пов'язаний з менопаузою артрит, пов'язаний з виснаженням естрогенів артрит та анкілозуючий спондиліт/ревматоїдний спондиліт), аутоімунне лимфопролиферативное захворювання, запальні гиперпролиферативние захворювання шкіри, псоріаз, такий як бляшковий псоріаз, каплевидний псоріаз, пустульозний псоріаз, псоріаз нігтів, атопию, включаючи атопічні захворювання, такі як сінна лихоманка і синдром Джоба, дерматит, включаючи контактний дерматит, хронічний контактний дерматит, ексфоліативний дерматит, алергічний дерматит, алергічний контактний дерматит, уртикарию, герпетиформний дерматит, монетовидний дерматит, себорейний дерматит, неспецифічний дерматит, первинний подразнювальний контактний дерматит та атопічний дерматит, x-зчеплений гіпер-IgM синдром, алергічні внутрішньоочні запальні захворювання, кропив'янку, таку як хронічна алергічна кропив'янка і хронічна ідіопатична кропив'янка, включаючи хронічну аутоіммунну кропив'янку, поліміозит/дерматоміозит, ювенільний дерматоміозит, токсичний епідермальний некроліз, склеродермію (в тому числі системну склеродер�прогресуючий MS (PPMS) і ремитирующий MS (RRMS), прогресуюча системна склеродермія, атеросклероз, артеріосклероз, множинний склероз і атаксический склероз, оптичний миелоневрит (NMO), запальне захворювання кишечника (IBD) (наприклад, хвороба Крона, опосредуемие імунною системою захворювання шлунково-кишкового тракту, запалення шлунково-кишкового тракту, коліт, такий як виразковий коліт,colitis ulcerosa, мікроскопічний коліт, коллагенозний коліт, поліпозний коліт, некротизуючий ентероколіт і трансмуральний коліт, і аутоімунне запальне захворювання кишечника), запалення кишечника, гангренозную пиодермию, вузлувату еритему, первинний склерозуючий холангіт, респіраторний дистрес-синдром, в тому числі респіраторний дистрес-синдром у дорослих або гострий респіраторний дистрес-синдром (ARDS), менінгіт, запалення всієї або частині судинної оболонки ока, запалення райдужної оболонки ока, хоріоїдит, аутоімунне гематологічне порушення, реакцію "трансплантат проти господаря", ангіоневротичний набряк, такий як спадковий ангіоневротичний набряк, пошкодження черепно-мозкових нервів, наприклад, при менінгіті, герпес вагітних, пемфигоид вагітних, свербіж мошонки, аутоімунне передчасне на�такі як анафілаксія та алергічний та атопічний риніт, енцефаліт, такий як енцефаліт Расмуссена і лімбічний енцефаліт або енцефаліт стовбура головного мозку, увеїт, такий як передній увеїт, гострий передній увеїт, гранулематозний увеїт, негранулематозний аутоімунний увеїт, гломерулонефрит (ГН) з нефротичним синдромом та без нього, такої як гострий або хронічний гломерулонефрит, такий як первинний GN, опосредуемий імунною системою GN, мембранозний GN (мембранозна нефропатія), ідіопатичний мембранозний GN або ідіопатична мембранозна нефропатія, мембранний або мембранозно-проліферативний ГН (MPGN), у тому числі тип I, тип II, і швидко прогресуючий GN, проліферативний нефрит, аутоімунні множинне недостатність ендокринних залоз, баланіт, включаючи обмежений плазмоклеточний баланіт, баланопостсит, кольцевидную еритему, стійку дисхромическую еритему, поліморфну еритему, кільцеву гранулему, блискучий лишай, склеротичний і атрофічний лишай, простий хронічний лишай, шилоподібний лишай, плоский лишай, ламеллярний іхтіоз, эпидермолитический гіперкератоз, предзлокачественний кератоз, гангренозную пиодермию, алергічні стани та відповіді, харчову алергію, алергію на лікарські засоби, алергію на насекомию або атопічну екзему, астеатозную екзему, дисгидратическую екзему і везикулярную долонно-підошовну екзему, астму, таку якasthma bronchiale, бронхіальна астма та аутоімунна астма, стани, в які залучена інфільтрація T-клітин і хронічний запальний відповідь, імунні реакції проти чужорідних антигенів, таких як фетальні групи крові A-B-O в процесі вагітності, хронічне запальне захворювання легень, аутоімунний міокардит, порушення адгезії лейкоцитів, вовчак, включаючи вовчаковий нефрит, вовчаковий церебрит, дитячу вовчак, непочечную вовчак, внепочечную вовчак, дискоидную вовчак або дискоидную червоний вовчак, вовчак з алопецією, SLE, таку як шкірна SLE або підгострий шкірний SLE, неонатальний вовчаковий синдром (NLE), диссеминированную червоний вовчак, вовчак, ювенільний цукровий діабет (I типу), в тому числі дитячий IDDM, дорослий цукровий діабет (II типу), автоімунний діабет, ідіопатичний нецукровий діабет, діабетичну ретинопатію, діабетичну нефропатию, діабетичний коліт, діабетичне порушення великих артерій, імунна відповідь, асоційований з гострою та уповільненою гіперчутливістю, опосредуемой цитокінами і T-лімфоцитами, туберкульоз, саркоід�судин, такий як ревматична поліміалгія і гігантоклітинним артеріїт (Такаясу), васкуліт судин середнього калібру, такий як хвороба Кавасакі і вузликовий періартеріїт, иммуноваскулит, васкуліт в ЦНС, шкірний васкуліт, васкуліт при гіперчутливості, некротизуючий васкуліт, такий як фібриноїдний некротизуючий васкуліт і системний некротизуючий васкуліт, і ANCA-асоційований васкуліт, такий як синдром Черджа-Стросс (CSS), гранулематоз Вегенера і мікроскопічний полиангиит), скроневий артеріїт, апластичну анемію, аутоімунні апластичну анемію, Кумбс-позитивної анемію, анемію Диамонда-Блэкфана, гемолітичну анемію або імунну гемолітичну анемію, у тому числі аутоімунну гемолітичну анемію (AIHA), пернициозную анемію (anemia perniciosa), хвороба Аддісона, справжню еритроцитарну анемію або аплазії (PRCA), дефіцит фактора VIII, гемофілію A, аутоімунні нейтропенію, цитопенії, такі як панцитопенія, лейкопени, захворювання, у які залучений диапедез лейкоцитів, запальні порушення в ЦНС, хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, синдром множинного ураження органів, такий як вторинні синдроми при септицемії, травмі або геморагії, захворювання, опосреду�s, антифосфоліпідний синдром, неврит рухових нейронів, алергічний неврит, хвороба/синдром Бехчета, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стівенса-Джонсона, пемфигоид або пемфігус, такий як бульозний пемфигоид, рубцевий пемфигоид (пемфигоид слизових оболонок), шкірний пемфигоид, звичайний пемфігус, паранеопластичний пемфігус, листоподібний пемфігус, пемфігус слизової оболонки і еритематозний пемфігус, придбаний бульозний епідермоліз, запалення ока, переважно алергічне запалення ока, алергічний кон'юнктивіт, бульозні захворювання, пов'язане з лінійними IgA, аутоімунне запалення кон'юнктиви, аутоімунні полиэндокринопатии, хвороба або синдром Рейтера, термічне поверждение внаслідок аутоімунного стану, прееклампсія, імунокомплексне порушення, таке як імунокомплексний нефрит, опосредуемий антитілами нефрит, нейровоспалительние порушення, поліневропатії, хронічну невропатію, таку як IgM-поліневропатії або опосредуемая IgM невропатія, тромбоцитопенію (наприклад, така як розвивається у пацієнтів з інфарктом міокарда), у тому числі тромботическую тромбоцитопенічну п�нноопосредуемую або тромбоцитопенію, наприклад, ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру (ITP), у тому числі хронічну або гостру ITP, склерит, такий як ідіопатичний кератосклерит, эписклерит, аутоімунне захворювання яєчок і яєчників, у тому числі аутоімунний орхіт та оофорит, первинний гіпотиреоз, гіпопаратиреоз, аутоімунні ендокринні захворювання, в тому числі тиреоїдит, такий як аутоімунний тиреоїдит, хвороба Хашимото, або підгострий тиреоїдит (тиреоїдит Хашимото) або підгострий тириоидит, аутоімунне захворювання щитовидної залози, ідіопатичний гіпотиреоз, хвороба Грэйвса, очна хвороба Грэйвса (офтальмопатія або асоційована з щитовидною залозою офтальмопатія), полигландулярние синдроми, такі як аутоімунні полигландулярние синдроми, наприклад, типу I (або полигландулярние эндокринопатические синдроми), паранеопластические синдроми, в тому числі неврологічні паранеопластические синдроми, такі як міастенічний синдром Ламберта-Ітона або синдром Ітона-Ламберта, синдром м'язової скутості або "негнущегося індивіда", енцефаломієліт, такий як алергічний енцефаломієліт і експериментальний алергічний енцефаломієліт (EAE), міастенію, таку як асоційована з тимомой міастенія, ц�атию, многоочаговую моторну нейропатію, синдром Шихана, аутоімунний гепатит, хронічний гепатит, вовчаковий гепатит, гігантоклітинним гепатит, хронічний активний гепатит або аутоімунний хронічний активний гепатит, пневмоніт, такий як лімфоїдний інтерстиціальний пневмоніт (LIP), облітеруючий бронхіоліт (не залежний від трансплантата) в протилежність NSIP, синдром Гійєна-Барре, хвороба Бергера (IgA-нефропатию), ідіопатичну IgA-нефропатию, лінійний IgA-дерматоз, гострий фебрильний нейтрофільний дерматоз, субкорнеальний пустульозний дерматоз, транзиторний акантолитический дерматоз, цироз, такий як первинний біліарний цироз, пневмоцирроз, синдром аутоімунної ентеропатії, глютеиновую хвороба, целіакію, черевні афти (глютенова энтеропатию), рефрактерние афти, идиопатические афти, криоглобулинемию, таку як змішана кріоглобулінемія, бічний аміотрофічний склероз (ALS; хвороба Лу Герінга), хвороба коронарних артерій, аутоімунне захворювання вуха, таке як аутоімунне захворювання внутрішнього вуха (AIED), аутоімунні втрату слуху, полихондрит, такий як рефрактерний або рецидивуючий полихондрит, легенево-альвеолярний протеиноз, кератит, такий як синдром Когана/несиф�нна з оперізувальним лишаєм біль, амілоїдоз, незлокачественний лімфоцитоз, первинний лімфоцитоз, який включає моноклональний B-клітинний лімфоцитоз (наприклад, доброякісну моноклональную гаммапатию і моноклональную гаммапатию неясного значення, MGUS), периферичну нейропатію, паранеопластичний синдром, каналопатии, такі як епілепсія, мігрень, аритмія, м'язові порушення, глухота, сліпота, пароксизмальний параліч, і каналопатии ЦНС, аутизм, запальну міопатію, вогнищевий або сегментний або вогнищевий сегментний гломерулосклероз (FSGS), ендокринну офтальмопатию, увеоретинит, хоріоретиніт, аутоімунне гепатологічне порушення, фіброміалгию, множинне ендокринну недостатність, синдром Шмідта, адреналит, атрофію шлунка, пресенильную деменцію, демієлінізуючі захворювання, такі як аутоімунні демієлінізуючі захворювання і хронічна демієлінізуючих поліневропатія, синдром Дресслера, вогнищеву алопецію, тотальну алопецію, синдром CREST (кальциноз, синдром Рейно, порушення моторики стравоходу, склеродактилия і телеангіектазії), чоловіче і жіноче аутоімунне безпліддя, наприклад, внаслідок антитіл проти спарматозоидов, змішане захворювання сполучної тканини, хвороба ЧагаѼу, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, легеневу алергію птахоловів, алергічний гранулематозний ангіїт, доброякісний лімфоцитарний ангіїт, синдром Альпорта, альвеоліт, такий як алергічний альвеоліт і фіброзний альвеоліт, інтерстиціальне захворювання легенів, трансфузійної реакцію, лепру, малярію, паразитарні захворювання, такі як лейшманіоз, кипаносомиоз, bilharzia, аскариоз, аспергільоз, синдром Самптера, синдром Каплана, денге, ендокардит, эндомиокардиальний фіброз, дифузний інтерстиціальний фіброз легенів, інтерстиціальний фіброз легень, фиброзирующий медіастиніт, фіброз легенів, ідіопатичний фіброз легенів, кістозний фіброз, ендофтальміт, піднесену стійку еритему, гемолітичну хворобу новонароджених, еозинофільний фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелтен, филариоз, цикліт, такий як хронічний цикліт, гетерохронический цикліт, іридоцикліт (гострий або хронічний), або цикліт Фукса, пурпуру Геноха-Шенлейна, інфекцію вірусом імунодефіциту людини (HIV), SCID, синдром набутого імунодефіциту (СНІД), інфекцію эховирусом, сепсис (синдром системної запальної відповіді (SIRS)), эндотоксемию, панкреатит, тироксикоз, інфекцію парвовирусом, � Епштейна-Барр, паротит, синдром Еванса, аутоімунні недостатність статевих залоз, хорею Сиденгама, постстрептококовий нефрит, облітеруючий тромбоангиит, тиреотоксикоз, сухотка спинного мозку, хоріоїдит, гигантоклеточную поліміалгія, хронічний пневмоніт з гіперчутливістю, кон'юнктивіт, такий як весняний катар, сухий кератокон'юнктивіт та епідемічний кератокон'юнктивіт, ідіопатичний нефрітіческій синдром, нефропатию з мінімальними змінами, пошкодження доброякісний сімейний і при ішемії-реперфузії, реперфузию трансплантованого органу, аутоімунну реакцію в сітківці, запалення суглоба, бронхіт, хронічне обструктивне захворювання повітряних шляхів/легень, силікоз, афти, афтозний стоматит, артеріосклеротіческой порушення (судинну недостатність головного мозку), такі як артериосклеротическая енцефалопатія і артериосклеротическая ретинопатія, асперматогенез, аутоімунний гемоліз, хвороба Бека, криоглобулинемию, контрактура Дюпюітрена, факоанафилактический ендофтальміт, алергічний ентерит, вузлувату лепрозную еритему, ідіопатичний параліч лицьового нерва, синдром хронічної втоми, ревматичну лихоманку, хвороба Хеммена-Річа, сенскционний мононуклеоз, поперечний мієліт, первинну ідіопатичну микседему, нефроз,ophtalmia symphatica(симпатичну офтальмию), офтальмию новонароджених, оптичний неврит, гранулематозний орхіт, панкреатит, гострий полирадикулит, гангренозную пиодермию, тиреоїдит Кервена, придбану атрофію селезінки, незлокачественную лімфому, лимфофолликулярний тимус, вітіліго, синдром токсичного шоку, харчове отруєння, стану, утягують інфільтрацію T-клітин, дефіцит адгезії лейкоцитів, імунні відповіді, асоційовані з гострою та уповільненою гіперчутливістю, опосредуемой цитокінами і T-лімфоцитами, захворювання утягують диапедез лейкоцитів, синдром полиорганного поразки, опосредуемие комплексами антиген-антитіло захворювання, захворювання, спрямовані проти мембрани клубочків, аутоімунні поліневропатії, оофорит, первинну микседему, аутоімунний атрофічний гастрит, ревматичні захворювання, змішане захворювання сполучної тканини, нефротичний синдром, инсулит, полиэндокринную недостатність, аутоімунні полигландулярние синдроми, включаючи аутоімунний полигландулярний синдром I типу, ідіопатичний гіпопаратиреоз дорослих (AOIH), кардіоміопатію з дилятацией, приобреѹ холангіт, гнійний або негнійний синусит, гострий або хронічний синусит, синсут решітчастої кістки, лобової кістки, верхньої щелепи чи клиноподібної кістки, пов'язане з еозинофілами порушення, такі як еозинофілія, еозинофілія з інфільтрацією в легені, синдром еозинофілії-міалгії, синдром Леффлера, хронічну эозинофильную пневмонію, тропічну легеневу еозинофілію, бронхолегеневий аспергільоз, аспергиллому, або містять еозинофіли гранульоми, анафілаксію, серонегативний спондилоартрит, полиэндокринное аутоімунне захворювання, склерозуючий холангіт, хронічний шкірно-слизовий кандидоз склери і эписклери, синдром Брутона, транзиторну гаммаглобулинемию немовлят, синдром Віськотта-Олдріча, атаксію-телеангиэктазию, аутоімунні порушення, асоційовані з колагеновими захворюваннями, ревматизм, такий як хронічний артроревматизм, лімфаденіт, зниження відповіді кров'яного тиску, судинну дисфункцію, тканинне пошкодження, серцево-судинну ішемію, гіпералгезію, церебральну ішемію і захворювання, що супроводжує васкуляризацію, алергічні порушення, пов'язані з гіперчутливістю, гломерулонефрит, ішемічне реперфузійне порушення, реперфузійне поврежд�алительними компонентами, полиорганную недостатність, бульозні захворювання, кортикальний некроз нирок, гострий гнійний менінгіт або інші запальні порушення центральної нервової системи, очей і орбітальні запальні порушення, синдроми, асоційовані з трансфузией гранулоцитів, індуковану цитокінами токсичність, нарколепсію, гостре тяжке запалення, пієліт, эндартериальную гіперплазію, виразку шлунка, вальвулит і ендометріоз. У цьому документі передбачаються, що такі захворювання можна лікувати шляхом введення антитіла, спрямованого проти маркера B-клітинної поверхні, такого як CD79b, і воно включає введення некон'югованого ("голого") антитіла або антитіла, кон'югованого з цитотоксичним засобом, як описано в цьому документі. Також в цьому документі передбачається, що такі захворювання можна лікувати комбінованою терапією, що включає антитіло проти CD79b або кон'югат антитіла проти CD79b з лікарським засобом щодо винаходу у поєднанні з іншим антитілом або кон'югатом антитіла та лікарського засобу, іншим цитотоксичним засобом, променевою терапією або іншим способом лікування, які виконуються одночасно або послідовно.

"Проим або превентивних заходів, де метою є запобігти або уповільнити (зменшити) намічене патологічний стан або порушення. Індивіди, які потребують лікування, включають індивідів, які вже мають порушення, а також індивідів, які мають схильність до порушення, або індивідів у яких порушення підлягає профілактиці. Індивіда або ссавець успішно "лікують" від экспрессирующей поліпептид CD79b злоякісної пухлини, якщо після отримання терапевтичного кількості антитіла проти CD79b способами по справжньому винаходу, у пацієнта спостерігають помітне і/або піддається вимірюванню зниження або відсутність одного або декількох з наступних: зниження кількості злоякісних клітин або відсутність злоякісних клітин; зниження розміру пухлини; інгібування (тобто, уповільнення до деякої міри і переважно зупинка) інфільтрації злоякісних клітин в периферичні органи, включаючи поширення злоякісної пухлини в м'яку тканину і кістка; інгібування (тобто, уповільнення до деякої міри і переважно зупинка) метастазування пухлин; інгібування, до деякої міри, росту пухлини; та/або пом'якшення, до деякої міри, одного або декількох симптомів, ас�якості життя. В залежності від того, може чи антитіло проти CD79b запобігати зростання та/або знищувати існуючі злоякісні клітини, воно може бути цитостатичних та/або цитотоксичною. Зниження цих ознак або симптомів також може відчуватися пацієнтом.

Зазначені вище параметри для оцінки успішного лікування і поліпшення захворювання легко визначати загальноприйнятими способами, відомими терапевта. Для терапії злоякісної пухлини, ефективність можна визначати, наприклад, шляхом оцінки часу до прогресування захворювання (TTP) та/або визначення швидкості відповіді (RR). Метастазування можна визначати за допомогою визначення стадії захворювання і за допомогою сканування кісток і тестів рівня кальцію та інших ферментів для визначення поширення в кістку. Також для пошуку поширення в таз і лімфатичні вузли в даній області можна отримувати CT-зображення. Рентгенографію грудної клітки та вимірювання рівнів ферментів печінки відомими способами використовують для пошуку метастазів у легені та печінку, відповідно. Інші загальноприйняті способи моніторингу захворювання включають трансректальну ультразвукову ехографію (TRUS) і трансректальну пункційну біопсію (T�пособи визначення прогресування захворювання включають цитологічну оцінку сечі цистоскопией, моніторинг наявності крові в сечі, візуалізацію уротелиального тракту за допомогою ультразвукового дослідження або внутрішньовенну пієлографію, комп'ютерну томографію (КТ) і магнітно-резонансну томографію (MRI). Наявність віддалених метастазів можна оцінювати за допомогою CT живота, рентгенографії грудної клітини або радіонуклідної візуалізації скелета.

"Тривалий" введення ставиться до введення засобу(засобів) постійно в протилежність короткочасного режиму, щоб підтримувати початковий терапевтичний ефект (активність) протягом тривалого періоду часу. "Переривається" введення являє собою лікування, яке не проводиться без переривання, а замість цього є циклічним.

"Індивід" являє собою хребетна. У певних варіантах здійснення, хребетним є ссавець. Ссавці включають, але не обмежуються ними, сільськогосподарських тварин (таких як корови), спортивних тварин, домашніх тварин (таких як кішки, собаки і коні), приматів, мишей і щурів. У певних варіантах здійснення, ссавцем є людина.

"Ссавець" для цілей лікування, пом'якшення симптомів злоякісної пухлини відноситься до люб�вих, і тварин зоопарків, спортивних тварин, або домашніх тварин, таких як собаки, коні, кішки, корови, свині, кролики і т. д. Переважно, ссавець являє собою людину.

Введення "в поєднанні з" одним або декількома додатковими лікарськими засобами включає одночасне (спільне) і послідовне запровадження в будь-якому порядку.

Як використовують в цьому документі, "носії" включають фармацевтично прийнятні носії, эксципиенти або стабілізатори, які є нетоксичними для клітини або ссавця, що піддаються їх впливу, використовуваних дозах і концентраціях. Часто фізіологічно прийнятний носій являє собою водний pH-буферний розчин. Приклади фізіологічно прийнятних носіїв включають буфери, такі як фосфат, цитрат, і інші органічні кислоти; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту; низькомолекулярні (менш ніж приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включно�біт; солеобразующие протівоіони, такі як натрій; й/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як TWEEN®, поліетиленгліколь (PEG) або PLURONICS®.

Під "твердою фазою" або "твердою підкладкою" розуміють неводную матрицю, на яку антитіло проти CD79b може прикріплятися або зв'язуватися. Приклади твердої фази, охоплюються у цьому документі, включають тверду фазу, утворену частково або повністю зі скла (наприклад, скла з контрольованим розміром пор), полісахаридів (наприклад, агарози), полиакриламидов, полістиролу, полівінілового спирту і силіконів. У певних варіантах здійснення, залежно від контексту, тверда фаза може включати лунки планшета для аналізу; в інших варіантах здійснення, вона являє собою колонку для очищення (наприклад, колонки для афінної хроматографії). Також цей термін включає дисперсну тверду фазу з дискретних частинок, таку як тверда фаза, описана в патенті США No. 4275149.

"Липосома" являє собою невелику везикул, що складається з різних типів ліпідів, фосфоліпідів та/або поверхнево-активної речовини, які придатні для доставки лікарського засобу (такого як антитіло проти CD79b) млекоп�еских мембран.

"Низькомолекулярні" з'єднання або "низькомолекулярні" органічна сполука, як визначено в цьому документі, має молекулярну масу менше ніж приблизно 500 Дальтон.

"Індивід", "суб'єкт" або "пацієнт" являє собою хребетна. У певних варіантах здійснення, хребетна являє собою ссавець. Ссавці включають, але не обмежуються ними, сільськогосподарських тварин (таких як корови), спортивних тварин, домашніх тварин (таких як кішки, собаки і коні), приматів, мишей і щурів. У певних варіантах здійснення, ссавцем є людина.

Термін "фармацевтичний склад" відноситься до препарату, який має таку форму, щоб забезпечити ефективність біологічної активності активного інгредієнта, який не містить додаткових компонентів, які є неприйнятно токсичними для індивіда, якому складу будуть вводити. Такий склад може бути стерильним.

"Стерильний" склад є асептичним або не містить живих мікроорганізмів і їх спор.

"Ефективна кількість" антитіла, описаний у цьому документі, представляє собою кількість, достатню для здійснення конкретної по�сті від поставленої мети.

Термін "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості антитіла або іншого лікарського засобу, ефективного для лікування захворювання чи порушення у індивіда або ссавця. У разі злоякісної пухлини, терапевтично ефективна кількість лікарського засобу може знижувати кількість злоякісних клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати (тобто, уповільнювати до деякої міри і переважно зупиняти) інфільтрацію злоякісних клітин в периферичні органи; інгібувати (тобто, уповільнювати до деякої міри і переважно зупиняти) метастазування пухлини; інгібувати, до деякої міри, зростання пухлини; та/або пом'якшувати до деякої міри один або кілька симптомів, асоційованих зі злоякісною пухлиною. См. визначення "лікування" в цьому документі. В залежності від того, може чи лікарський засіб перешкоджати зростанню та/або знищувати існуючі злоякісні клітини, воно може бути цитостатичних та/або цитотоксичною. "Профілактично ефективна кількість" відноситься до кількості, ефективного, в необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу, для досягнення тѾльзуют у індивідів до захворювання або на його ранніх стадіях, профілактично ефективне кількість буде меншою, ніж терапевтично ефективна кількість.

"Інгібуючу зростання кількість" антитіла проти CD79b являє собою кількість, здатний інгібувати ріст клітини, особливо пухлинної, наприклад, злоякісної клітини, абоin vitroабоin vivo. "Інгібуючу зростання кількість" антитіла проти CD79b для цілей інгібування неопластичного клітинного росту можна визначати емпірично і загальноприйнятими способами.

"Цитотоксична кількість" антитіла проти CD79b являє собою кількість, здатне викликати руйнування клітини, особливо пухлинної, наприклад, злоякісної клітини, абоin vitroабоin vivo. "Цитотоксична кількість" антитіла проти CD79b для цілей інгібування неопластичного росту клітин можна визначати емпірично і загальноприйнятими способами.

"Экспрессирующая CD79b клітка" являє собою клітку, яка экспрессирует ендогенний або трансфицированний поліпептид CD79b або на клітинній поверхні, або в секретируемой формі. "Экспрессирующая CD79b злоякісна пухлина" являє собою злоякісну пухлину, що містить клітини, які мають поліпептид CD79b, представлений на клетя пухлина" необов'язково продукує достатні рівні поліпептиду CD79b на поверхні клітин, щоб антитіло проти CD79b могло зв'язатися з ним і надавати терапевтичний ефект щодо злоякісної пухлини. В іншому варіанті здійснення, "экспрессирующая CD79b злоякісна пухлина" необов'язково продукує і секретує достатні рівні поліпептиду CD79b, так щоб антитіло-антагоніст проти CD79b могло зв'язуватися з ним і мати терапевтичний ефект щодо злоякісної пухлини. Щодо останнього, антагоніст може представляти собою антисмислової олигонуклеотид, який знижує, інгібує або запобігає продукцію і секрецію секреції поліпептиду CD79b пухлинними клітинами. Злоякісна пухлина, яка "сверхэкспрессирует" поліпептид CD79b являє собою пухлину, яка має, або продукує і секретує, значно більш високі рівні поліпептиду CD79b на своїй клітинної поверхні, порівняно з незлоякісною кліткою тканини того ж типу. Така надекспресія може бути викликана ампліфікацією гена або підвищеної транскрипцією або трансляцією. Сверхэкспрессию поліпептиду CD79b можна визначати в аналізі для детекції або прогнозу шляхом оцінки підвищених рівнів білка CD79b, присутнього на поверхні клітини, або секреолученних проти виділеного поліпептиду CD79b, який можна отримувати з використанням технології рекомбінантних ДНК з виділення нуклеїнової кислоти, кодує поліпептид CD79b; аналізу FACS тощо). Альтернативно або додатково, можна вимірювати рівні кодує поліпептид CD79b нуклеїнової кислоти або мРНК в клітці, наприклад, за допомогою флуоресцентної гібридизаціїin situз використанням зонда на основі нуклеїнової кислоти, відповідного кодує CD79b нуклеїнової кислоти або комплементарної їй послідовності; (FISH; див. WO98/45479, опубліковану в жовтні 1998 року), Саузерн-блоттінг, Нозерн-блоттінг або способи полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), такі як кількісна ПЛР з детекцією в реальному часі (RT-PCR). Також можна досліджувати сверхэкспрессию поліпептиду CD79b шляхом вимірювання отделяющегося від клітини антигену в біологічній рідині, такий як сироватка, наприклад, з використанням аналізів на основі антитіл (див. також, наприклад, патент США No. 4933294, виданий 12 червня 1990 року; WO91/05264, опубліковану 18 квітня 1991 року; патент США 5401638, виданий 28 березня 1995 року; і Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Крім зазначених вище аналізів, фахівця в даній області доступні різні аналізиin vivo. Наприклад, можна впливати на клеткимер, радіоактивним ізотопом, і можна оцінювати зв'язування антитіла з клітинами пацієнта, наприклад, шляхом зовнішнього сканування на радіоактивність або шляхом аналізу біоптату, взятого у пацієнта, на якого раніше впливали антитілом.

Як використовують у цьому документі, термін "иммуноадгезин" означає подібні антителу молекули, які поєднують специфічність зв'язування гетерологічного білка ("адгезин") з ефекторними функціями константних доменів імуноглобулінів. Структурно иммуноадгезини містять аминокислотную послідовність з необхідної специфічність зв'язування, що відрізняється від ділянки розпізнавання антигену і ділянки зв'язування антитіла (тобто, є "гетерологичной"), злиту з послідовністю константного домену імуноглобуліну. Частина адгезина в молекулі иммуноадгезина, як правило, являє собою безперервну аминокислотную послідовність, що містить щонайменше ділянку зв'язування рецептора або ліганду. Послідовність константного домену імуноглобуліну в иммуноадгезине може бути отримана з будь-якого імуноглобуліну, такого як ізотипи Ід-1, Ід-2, IgG-3 або IgG-4, IgA (включаючи IgA-1 і IgA-2), IgE, IgD або IgM.

Слово "мітка", при використанні на� або непрямо з антитілом, з утворенням "міченого" антитіла. Мітка може бути піддається детекції (наприклад,,радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, у разі ферментної мітки, вона може каталізувати хімічне зміна сполуки або композиції субстрату, які піддаються детекції.

Термін "цитотоксична засіб", як використовують у цьому документі, відноситься до речовини, яка пригнічує функціонування клітин, або перешкоджає йому, та/або викликає руйнування клітин. Передбачають, що термін включає радіоактивні ізотопи (наприклад, At211, I131, I125, Y90Re186Re188, Sm153, Bi212, P32і радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичні засоби, наприклад, метотрексат, адріаміцін, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин C, хлорамбуцил, даунорубицин або інші интеркалирующие речовини, ферменти та їх фрагменти, такі як нуклеолитические ферменти, антибіотики і токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактерій, грибів, рослин чи тварин, включаючи їх фрагменти і/або варіанти, і різні протипухлинні засоби або засоби проти злока клітини засіб викликає руйнування пухлинних клітин.

"Токсин" являє собою будь-яка речовина, здатне чинити шкідливий ефект на зростання або проліферацію клітини.

"Хіміотерапевтичне засіб" являє собою хімічне з'єднання, корисне при лікуванні злоякісної пухлини, незалежно від механізму його дії. Класи хіміотерапевтичних засобів включають, але не обмежуються ними: алкілуючі засоби, антиметаболіти, отруйні для веретена поділу алкалоїди рослин, цитотоксичні/протипухлинні антибіотики, інгібітори топоізомеразу, антитіла, фотосенсибилизатори та інгібітори кіназ. Хіміотерапевтичні засоби включають сполуки, що використовуються в "спрямованої терапії" та в загальноприйнятій хіміотерапії. Приклади хіміотерапевтичних засобів включають: эрлотиниб (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), доцетаксел (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (фторурацил, 5-фторурацил, CAS No. 51-21-8), гемцитабін (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), цисплатин (цис-діамін,дихлорплатина(II), CAS No. 15663-27-1), карбоплатин (CAS No. 41575-94-4), паклітаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), трастузумаб (HERCEPTIN®, Genentech), темозоломід (4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8-пентазабицикло[4.3.0]нона-2,7,9-тріен-9-карбоксамид, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенилбут-1-енил)фенокси]-N,N-диметилэтан�х засобів включають: оксаліплатин (ELOXATIN®, Sanofi), бортезомиб (VELCADE®, Millennium Pharm.), сутент (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), летрозол (FEMARA®, Novartis), іматинібу мезилату (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (інгібітор Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (інгібітор Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (інгібітор PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (інгібітор PI3K, Novartis), XL-147 (інгібітор PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), фулвестрант (FASLODEX®, AstraZeneca), лейковорин (фолінова кислота), рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE®, Wyeth), лапатініб (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафарниб (SARASARTM, SCH 66336, Schering Plough), сорафеніб (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA®, AstraZeneca), іринотекан (CAMPTOSAR®, СРТ-11, Pfizer), типифарниб (ZARNESTRATMJohnson & Johnson), ABRAXANETM(не містить кремофор), сконструйований з альбуміном складу паклітакселу у вигляді наночастинок (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), вандетаниб (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), хлорамбуцил, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), темсиролимус (TORISEL®, Wyeth), пазопаниб (GlaxoSmithKline), канфосфамид (TELCYTA®, Telik), тиотепу і циклофосфамід (CYTOXANE®, NEOSAR®); алкилсульфонати, такі як бусульфан, импросульфан і пипосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленімін і метиламеламини, включаючи алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид і триметилоломеламин; ацетогенини (особливо буллатацин і буллатацинон)�ие аналоги на основі адозелезина, карзелезина і бизелезина); криптофицини (зокрема криптофицин 1 і криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включаючи його синтетичні аналоги, KW-2189 і CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотисті иприти, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксиду гідрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, іприт урацилу; нитрозомочевину, таку як кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустін, нимустин і ранимустин; антибіотики, такі як эндииновие антибіотики (наприклад, калихеамицин, особливо калихеамицин гамма1І і калихеамицин омегаІ1 (Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, динемицин A; бісфосфонати, такі як клодронат; эсперамицин; а також хромофорів на основі неокарциностатина і подібні хромопротеиновие хромофори на основі эндиинових антибіотиків), аклациномизини, актиноміцин, аутрамицин, азасерин, блеомицини, сактиномицин, карабицин, карміноміціна, карцинофилин, хромомицини, дактіноміцін, даунорубицин, декторубицин, 6-діазо-5-оксо-L-норлейцин, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин і дезоксидоксорубицин), епірубіцин, эзорубицин, идарубиц�цін, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринів, такі як флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тіогуанін; аналоги піримідинів, такі як анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромостанолона пропіонат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренальние засоби, такі як аміноглу-тетимід, мітотан, трілостан; кошти для заповнення фолієвої кислоти, такі як фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид глікозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; нітрат галію; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиди, такі як майтанзин і ансамитоцини; митогуазон; мітоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбвую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецени (особливо токсин T-2, верракурин A, роридин A і ангвидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабінозід ("Ara-C"); циклофосфамід; тиотепу; 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; етопозид (VP-16); ифосфамид; мітоксантрон; вінкристин; винорелбин (NAVELBINE®); новантрон; теніпозід; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; капецитабін (XELODA®, Roche); ибандронат; CPT-11; інгібітор топоізомеразу RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти і похідні будь-якого із зазначених вище.

Також у визначення "хіміотерапевтичне засіб" включені: (i) антигормональние засоби, які діють, регулюючи або інгібуючи дію гормону на пухлини, такі як антиестрогени і селективні модулятори рецепторів естрогену (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (в тому числі ПРЕДНІЗОЛОН®; тамоксифену цитрат), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і FARESTON® (торемифина цитрат); (ii) інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, який регулируцетат), AROMASIN® (екземестан; Pfizer), форместан, фадрозол, RIVISOR® (ворозол), FEMARA® (летрозол; Novartis), і ARIМIDEX® (анастрозол; AstraZeneca); (iii) антиандрогени, такі як флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид і гозерелін; а також троксацитабин (1,3-диоксолановий нуклеозидний аналог цитозина); (iv) інгібітори протеїнкіназ, такі як інгібітори MEK (WO 2007/044515); (v) інгібітори кіназ ліпідів; (vi) антисмисловие олигонуклеотиди, зокрема олигонуклеотиди, які інгібують експресію генів каскадів передачі сигналу, залучених у змінену проліферацію клітин, наприклад, PKC-альфа, Впс і H-Ras, такі як облимерсен (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) рібозіми, такі як інгібітори експресії VEGF (наприклад, ANGIOZYME®) і інгібітори експресії HER2; (viii) вакцини, такі як вакцини для генної терапії, наприклад, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® і VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; інгібітори топоізомеразу 1, такі як LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) пробні засоби, такі як бевацізумаб (AVASTIN®, Genentech); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти і похідні будь-якого із зазначених вище.

Також у визначення "хіміотерапевтичне засіб" включені антитіла, такі як алемтузумаб (Campath), бевацізумаб (АВАСТИН®, Genentech); цетуксимаб (ERBITUX®, Imclone); панитумумаб (VECTIBIX®, Amgen), рітуксімаб (RITUXAN®, Genentech/Biogen Ideс), перту�уповноважується кошти, гемтузумаб озогамицин (MYLOTARG®, Wyeth).

"Інгібуючу зростання засіб", при застосуванні у цьому документі, належить до з'єднанню або композиції, які інгібують ріст клітини, особливо экспрессирующей CD79b злоякісної клітини, абоin vitroабоin vivo. Таким чином, інгібуючу зростання засіб може представляти собою засіб, який значно знижує процентну кількість експресують CD79b клітин у S-фазі. Приклади інгібують ріст коштів включають засоби, які блокують прогресування клітинного циклу (у місці, відмінному від S-фази), такі як засоби, які індукують зупинку в G1-фази і зупинку у M-фазі. Класичні блокатори M-фази містять алкалоїди барвінку (вінкристин та вінбластин), таксани та інгібітори топоізомеразу II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубицин, етопозид і блеомицин. Ті кошти, які викликають зупинку в G1-фазі, також залучають зупинку в S-фазі, наприклад, алкілуючі ДНК засоби, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил і ara-C. Додаткову інформацію можна знайти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia,�венної пухлини, отримані з тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), одержаний з європейського тиса, являє собою напівсинтетичний аналог паклітакселу (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Паклітаксел і доцетаксел забезпечують складання мікротрубочок з димерів тубуліну і стабілізує мікротрубочки, перешкоджаючи деполімеризації, що призводить до блокування мітозу в клітинах.

"Доксорубіцин" являє собою антрациклиновий антибіотик. Повна хімічна назва доксорубіцину являє собою (8S-цис)-10-[(3-аміно-2,3 та 6-тридезокси-α-L-ликсогексапиранозил)оксі]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион.

Термін "цитокін" є загальним терміном для білків, що вивільняються однієї популяцією клітин, які впливають на іншу клітину як міжклітинних медіаторів. Прикладами таких цитокінів є лімфокіни, монокини і традиційні поліпептидні гормони. Цитокіни включають гормони росту, такі як гормон росту людини, гормон росту людини з N-метионилом та бичачий гормон росту; паратиреоидний гормон; тироксин; інсулін; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновие гормони, такі як фолікулостимулюючий гормон (FSH), тиреоидстимули�плацентарний лактоген; фактор некрозу пухлин-α та-β; інгібуючу речовина Мюллера; гонадотропін-асоційований пептид миші; інгібін; активін; судинно-ендотеліальний фактор росту; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); фактори росту нервів, такі як NGF-β; фактор росту тромбоцитів; трансформуючі фактори росту (TGF), такі як TGF-α і TGF-β; інсуліноподібний фактор росту-I-II; еритропоетин (EPO); остеоиндуктивние фактори; інтерферони, такі як інтерферон-α-β та-γ; колонієстимулюючі фактори (CSF), такі як макрофагальний CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальний CSF (GM-CSF); і гранулоцитарний CSF (G-CSF); інтерлейкіни (IL), такі як IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; фактор некрозу пухлин, такий як TNF-α або TNF-β; та інші поліпептидні фактори, в тому числі LIF та kit-ліганд (KL). Як використовують у цьому документі, термін цитокін включає білки з природних джерел або з рекомбінантних клітинних культур і біологічно активні еквіваленти цитокінів з нативною послідовністю.

Термін "вкладиш в упаковку" використовують для позначення інструкцій, зазвичай включаються в комерційні упаковки терапевтичних продуктів, які містять інформацію про показання, застосування, дозування, введення, протипоказання, та/або �іт" відноситься до з'єднання, утворюється при метаболічному процесі або реакції кон'югату антитіло-лікарський засіб всередині клітини (ADC). Метаболічний процес, або реакція може представляти собою ферментативний процес, такий як протеолітичну розщеплення пептидного лінкера в ADC, або гідроліз функціональної групи, такий як гидразон, складний ефір або амід. Внутрішньоклітинні метаболіти включають, але не обмежуються ними, антитіла і вільний лікарський засіб, яке зазнали внутрішньоклітинний розщеплення після проникнення, дифузії, захоплювання або транспорту в клітку.

Терміни "внутрішньоклітинно розщеплений" і "внутрішньоклітинний розщеплення" відносяться до метаболическому процесу або реакції всередині клітини на конъюгате антитіло-лікарський засіб (ADC), за допомогою якого руйнується ковалентний зв'язок, тобто лінкер, між групою лікарського засобу (D) і антитілом (Ab), викликаючи дисоціацію вільного лікарського засобу від антитіла всередині клітини. Розщеплені групи ADC, таким чином, є внутрішньоклітинними метаболітами.

Термін "біодоступність" відноситься до системної доступності (тобто, рівнями в крові/плазмі) кількості даного лікарського засобу, введеного пацієнт�повідомляє на міру часу (швидкості), так і загального колиества (ступеня) лікарського засобу, яке досягає

загального кровотоку.

Термін "цитотоксическая активність" відноситься до ефекту знищення клітин, цитостатическому або інгібуючої зростання ефекту ADC або внутрішньоклітинного метаболіту ADC. Цитотоксическая активність може бути виражена як значення IC50, яке являє собою концентрацію (молярную або масову) на одиницю обсягу, при яких виживає половина клітин.

Термін "алкіл", як використовують у цьому документі, відноситься до насиченого лінійному або розгалуженому одновалентному вуглеводневого радикалу з одного до дванадцяти атомів вуглецю (C1-C12), де алкильний радикал необов'язково може бути заміщений незалежно одним або декількома заступниками, описаними нижче. В іншому варіанті здійснення, алкильний радикал має від одного до восьми атомів вуглецю (C1-C8), або від одного до шести атомів вуглецю (C1-C6). Приклади алкільних груп включають, але не обмежуються ними, метил (Me, -CH3), етил (Et, -CH2CH3), 1-пропіл (n-Pr, н-пропіл, -CH2CH2CH3), 2-пропіл (i-Pr, ізопропіл, -CH(CH3)2), 1-бутил (n-Bu, н-бутил, -CH2ил, -CH(CH3)CH2CH3), 2-метил-2-пропіл (t-Bu, трет-бутил, -C(CH3)3), 1-пентил (н-пентил, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-пентил (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-пентил (-CH(CH2CH3)2), 2-метил-2-бутил (-C(CH3)2CH2CH3), 3-метил-2-бутил (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-метил-1-бутил (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-метил-1-бутил (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-гексил (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-гексил (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-гексил (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-метил-2-пентил (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-метил-2-пентил (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-метил-2-пентил (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-метил-3-пентил (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-метил-3-пентил (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-диметил-2-бутил (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-диметил-2-бутил (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-гептил, 1-октил і т. п.

Термін "алкенів" відноситься до лінійного або розгалуженому одновалентному вуглеводневого радикалу від двох до восьми атомів вуглецю (C2-C8) за меншою мл необов'язково може бути заміщений незалежно одним або декількома заступниками, наведені в цьому документі, і включає радикали, що мають "ціс"- і "транс"-орієнтацію, або альтернативно "E" і "Z"-орієнтацію. Приклади включають, але не обмежуються ними, этиленил або вініл (-CH=CH2), аліл (-CH2CH=CH2) і т. п.

Термін "алкинил" відноситься до лінійного або розгалуженому одновалентному вуглеводневого радикалу від двох до восьми атомів вуглецю (C2-C8) щонайменше з однією ділянкою ненасиченості, тобто, вуглець-вуглецевого sp-потрійний зв'язком, де алкинильний радикал необов'язково може бути незалежно заміщений одним або декількома заступниками, описаних у цьому документі. Приклади включають, але не обмежуються ними, этинил (-C≡CH), пропинил (пропаргил, -CH2C≡CH) тощо

Терміни "карбоцикл", "карбоциклил", "карбоциклическое кільце" і "циклоалкіл" відносяться до одновалентному неароматическому, насиченому або частково ненасищенному кільцю, має від 3 до 12 атомів вуглецю (C3-C12) у вигляді моноциклического кільця, або від 7 до 12 атомів вуглецю у вигляді біциклічних кільця. Біциклічні карбоцикли, що мають від 7 до 12 атомів, можна уявити, наприклад, як систему біцикло[4,5], [5,5], [5,6] або [6,6], і біциклічні карбоцикли, які мають 9 илиикло[2.2.1]гептан, біцикло[2.2.2]октан і біцикло[3.2.2]нонан. Приклади моноциклических карбоциклов включають, але не обмежуються ними, циклопропіл, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогексадиенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, циклоундецил, циклододецил і т. п.

"Арил" означає одновалентний ароматичний вуглеводневий радикал з 6-20 атомів вуглецю (C6-C20), утворене видаленням одного атома водню від одного атома вуглецю вихідної ароматичної кільцевої системи. Деякі арильние групи подають до ілюстративних структурах як "Ar". Арил включає біциклічні радикали, що містять ароматичне кільце, конденсований з насиченим частково ненасиченим або ароматичним карбоциклическим кільцем. Типові арильние групи включають, але не обмежуються ними, радикали, утворені з бензолу (фенила), заміщених бензолів, нафталіну, антрацену, біфенілу, инденила, инданила, 1,2-дигидронафталина, 1,2,3,4-тетрагидронафтила і т. п. Арильние групи необов'язково заміщені незалежно одним або декількома заступниками, описаних у цьому документі.

�меняемо і вони відносяться до насиченого або частково ненасищенному (тобто, має одну або декілька подвійних та/або потрійних зв'язків в кільці) карбоциклическому радикалу від 3 до 20 атомів в кільці, в якому щонайменше один атом кільця являє собою гетероатом, вибраний з азоту, кисню, фосфору і сірки, а решта атоми кільця являють собою C, де один або декілька атомів кільця необов'язково заміщені незалежно одним або декількома заступниками, описаними нижче. Гетероцикл може представляти собою моноцикл, який має від 3 до 7 членів у кільці (від 2 до 6 атомів вуглецю і від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з N, O, P, S), або бицикл, має від 7 до 10 членів у кільці (від 4 до 9 атомів вуглецю і від 1 до 6 гетероатомів, вибраних з N, O, P, S), наприклад: система біцикло[4,5], [5,5], [5,6], або [6,6]. Гетероцикли описані в Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), зокрема, глави 1, 3, 4, 6, 7 і 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, з 1950 по даний час), зокрема томи 13, 14, 16, 19, 28; J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Гетероциклил" також включає радикали, де гетероциклічні радикали є конденсованим з насиченим, частково ненасиченим або ароматичним кільцем карбоциклическим або гетероциклическим кільцем. Приклади гетероциклічних колЂрагидропиранил, дигидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперидино, морфолино, тиоморфолино, тиоксанил, піперазиніл, гомопиперазинил, азетидинил, оксетанил, тиэтанил, гомопиперидинил, оксепанил, тиэпанил, оксазепинил, диазепинил, тиазепинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, индолинил, 2H-пиранил, 4H-пиранил, диоксанил, 1,3-диоксоланил, пиразолинил, дитианил, дитиоланил, дигидропиранил, дигидротиенил, дигидрофуранил, пиразолидинилимидазолинил, имидазолидинил, 3-азабіцикло[3.1.0]гексанил, 3-азабіцикло[4.1.0]гептанил, азабіцикло[2.2.2]гексанил, 3H-индолилхинолизинил і N-пиридильние з'єднання сечовини. Також в обсяг цього визначення включені спирогруппи. Прикладами гетероциклической групи, де 2 атома вуглецю кільця заміщені оксогруппами (=O), є пиримидинонил і 1,1-диоксотиоморфолинил. Гетероциклічні групи, описані в цьому документі, необов'язково заміщені незалежно одним або декількома заступниками, описаних у цьому документі.

Термін "гетероарил" відноситься до одновалентному ароматичного радикалу 5-, 6 - або 7-членних кілець, і включає конденсовані кільцеві системи (щонайменше одна з яких є ароматичною) з 5-20 атомів, що містять один або кілька гетероатомів, нез�ример, 2-гидроксипиридинил), имидазолил, имидазопиридинил, пиримидинил (включаючи, наприклад, 4-гидроксипиримидинил), пиразолил, триазоло, пиразинил, тетразолил, фурил, тиенил, изоксазолил, тіазоліл, оксазолил, изотиазолил, пирролил, хинолинил, изохинолинил, індол, бензимидазолил, бензофураніл, циннолинил, индазолил, индолизинил, фталазинил, пиридазинил, триазинил, изоиндолил, птеридинил, пуринил, оксадиазолил, триазоло, тиадиазолил, тиадиазолил, фуразанил, бензофуразанил, бензотиофенил, бензотиазолил, бензоксазолил, хиназолинил, хиноксалинил, нафтиридинил і фуропиридинил. Гетероарильние групи необов'язково заміщені незалежно одним або декількома заступниками, описаних у цьому документі.

Гетероциклічні або гетероарильние групи можуть бути зв'язаними атомами вуглецю (вуглець-пов'язані), або азоту (азот-пов'язані), коли це можливо. Як неограничивающего прикладу, пов'язані атомами вуглецю гетероцикли або гетероарили пов'язані у 2, 3, 4, 5 або 6 положенні піридину, 3, 4, 5 або 6 положенні пиридазина, 2, 4, 5 або 6 положенні піримідину, 2, 3, 5 або 6 положенні пиразина, 2, 3, 4 або 5 положенні фурану, тетрагидрофурана, тиофурана, тіофену, пиррола або тетрагидропиррола, 2, 4 або 5 поло� азиридина, 2, 3 або 4 положенні азетидина, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 положенні хіноліну або 1, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 положенні ізохіноліну.

Як неограничивающего прикладу, пов'язані азотом гетероцикли або гетероарили пов'язані в 1 положенні азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, імідазолу, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, піразолу, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, піперазину, індолу, индолина, 1H-индазола, 2 становищі изоиндола або изоиндолина, 4 положенні морфоліну, і 9 положенні карбазола або β-карболина.

"Алкилен" відноситься до насиченого розгалуженому або неразветвленному або циклічним вуглеводневого радикалу з 1-18 атомів вуглецю, який має два центри у вигляді одновалентних радикалів, утворені видаленням двох атомів водню з одного або з двох різних атомів вуглецю вихідного алкана. Типові алкиленовие радикали включають, але не обмежуються ними: метилен (-CH2-) 1,2-етил (-CH2CH2-), 1,3-пропіл (-CH2CH2CH2-), 1,4-бутил (-CH2CH2CH2CH2-) і т. п.

"C1-C10алкилен" являє собою неразветвленную насичену вуглеводневу групу формули -(CH2)1-10. Приклади C1-C1O

"Алкенилен" відноситься до ненасищенному розгалуженому або неразветвленному або циклічним вуглеводневого радикалу з 2-18 атомів вуглецю, який має два центри у вигляді одновалентних радикалів, утворених видаленням двох атомів водню від одного або двох різних атомів вуглецю вихідного алкена. Типові алкениленовие радикали включають, але не обмежуються ними: 1,2-етилен (-CH=CH-).

"Алкинилен" відноситься до ненасищенному розгалуженому або неразветвленному або циклічним вуглеводневого радикалу з 2-18 атомів вуглецю, який має два центри у вигляді одновалентних радикалів, утворених видаленням двох атомів водню від одного або двох різних атомів вуглецю вихідного алкина. Типові алкиниленовие радикали включають, але не обмежуються ними: ацетилен (-C≡C-), пропаргил (-CH2C≡C-), і 4-пентинил (-CH2CH2CH2C≡C-).

"Арилен" являє собою арильную групу, яка має два ковалентні зв'язки і може знаходитися в орто-, мета - або пара-конфігурації, як показано на таких структурах:

в яких фенильная група може бути незамещенной або заміщена допомогою аж до чотирьох груп, включаючи, але не обмежуючись ними', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2і-CN; де кожен R' незалежно обраний H, C1-C8алкила і аріла.

"Арилалкил" відноситься до ациклическому алкильному радикалу, в якому один з атомів водню, пов'язаних з атомом вуглецю, як правило, кінцевим або sp3-атомом вуглецю, заміщений арильним радикалом. Типові арилалкильние групи включають, але не обмежуються ними, бензил, 2-фенилэтан-1-іл, 2-фенилэтен-1-іл, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-іл, 2-нафтилэтен-1-іл, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан-1-іл і т. п. Арилалкильная група містить від 6 до 20 атомів вуглецю, наприклад, алкильная група, включаючи алканильную, алкенильную або алкинильную групи, арилалкильной групи має від 1 до 6 атомів вуглецю, а арильная група має від 5 до 14 атомів вуглецю.

"Гетероарилалкил" відноситься до ациклическому алкильному радикалу, в якому один з атомів водню, пов'язаних з атомом вуглецю, як правило, кінцевим або sp3-атомом вуглецю, заміщений гетероарильним радикалом. Типові гетероарилалкильние групи включають, але не обмежуються ними, 2-бензимидазолилметил, 2-фурилэтил і т. п. Гетероарилалкильная група містить від 6 до 20 атомів вуглецю, наприклад, алкильная гр�ів вуглецю, а гетероарильная група має від 5 до 14 атомів вуглецю і від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, O, P, S. Гетероарильная група гетероарилалкильной групи може представляти собою моноцикл, який має від 3 до 7 членів у кільці (від 2 до 6 атомів вуглецю) або бицикл, має від 7 до 10 членів у кільці (від 4 до 9 атомів вуглецю і від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, O, P, S), наприклад: систему біцикло[4,5], [5,5], [5,6], або [6,6].

Термін "проліки", як використовують у цій заявці, відноситься до форми попередника або похідного з'єднання по винаходу, яка може бути менш цитотоксичною для клітин порівняно з вихідним з'єднанням або лікарський засобом і може бути ферментативно або гідролітично активована або перетворена у більш активну вихідну форму. См., наприклад, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Біохімічний Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) і Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Проліки з цього винаходу включають, але не обмежуються ними, що містять фосфат проліки, що містять тиофосфат проліки, що містять сульфат проліки, що містять пептид проліки, проліки з модифікованими D-амінокислотами, глік�етамид проліки, містять необов'язково замещенний фенилацетамид проліки, проліки з 5-фторцитозином та інші проліки з 5-фторуридином, які можуть перетворюватися в більш активну цитотоксична вільний лікарський засіб. Приклади цитотоксичних лікарських засобів, які можуть бути перетворені у форму проліки для застосування у цьому винаході, включають, але не обмежуються ними, з'єднання по винаходу і хіміотерапевтичні засоби, такі як описані вище.

"Метаболіт" являє собою продукт, що утворюється при метаболізмі в організмі певного з'єднання або його солі. Метаболіти з'єднання можна ідентифікувати з використанням загальноприйнятих способів, відомих в даній галузі, та їх активність можна визначати з використанням тестів, таких як тести, описані в цьому документі. Такі продукти можуть утворюватися, наприклад, в результаті окислення, відновлення, гідролізу, амидации, дезамидации, етерифікації, деэтерификации, ферментативного розщеплення і т. п., введеного з'єднання. Таким чином, винахід включає метаболіти сполук щодо винаходу, в тому числі сполук, утворених шляхом процесу, що включає контактвания його метаболічного продукту.

"Липосома" являє собою невелику везикул, що складається з різних типів ліпідів, фосфоліпідів та/або поверхнево-активної речовини, які придатні для доставки лікарського засобу ссавцю. Компоненти ліпосоми зазвичай утворюють двошарову структуру, схожу з розміщенням ліпідів біологічних мембран.

"Лінкер" належить до хімічної групи, що містить ковалентную зв'язок або ланцюг з атомів, які ковалентно пов'язують антитіло з групою лікарського засобу. У різних варіантах здійснення, линкери включають двухвалентний радикал, такий як алкилдиил, арилдиил, гетероарилдиил, групи, такі як: -(CR2)nO(CR2)n-, повторювані елементи алкилокси (наприклад, полиэтиленокси, PEG, полиметиленокси) і алкиламино (наприклад, полиэтиленамино, JeffamineTM); і складні ефіри та аміди двоосновний кислот, включаючи сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат і капроамид.

Термін "хиральний" відноситься до молекул, які мають властивість розбіжності з аналогами, є їх дзеркальним відображенням, а термін "ахиральний" відноситься до молекул, які збігаються з їх аналогами, є їх дзеркальними відображеннями.

Термін "стложением атомів або груп у просторі.

"Диастереомер" відноситься до стереоизомеру з двома або більше хіральними центрами, молекули якого не є дзеркальними відображеннями один одного. Диастереомери володіють різними фізичними властивостями, наприклад температурою плавлення, температура кипіння, спектральними властивостями і реакційною здатністю. Суміші діастереомерів можна розділяти аналітичними способами високого дозволу, такими як електрофорез і хроматографія.

"Энантиомери" відносяться до двох стереоизомерам сполуки, які не є співпадаючими дзеркальними відображеннями один одного.

Стереохімічні визначення та позначення, що використовуються в цьому документі, головним чином, відповідають S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; і Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Багато органічні сполуки існують в оптично активних формах, тобто, вони володіють здатністю до обертання площини плоскополяризованного світла. При описі оптично активного з'єднання, приставки D і L, R і S, використовують для позначення абсолютної конфігурації молекули в області її хіральним центру(ів). Приставки d і l (+) і (-) використовують для позначення ознака�щающим. З'єднання з приставкою (+) або d є правовращающим. Для даної хімічної структури ці стереоізомери є ідентичними, за винятком того, що вони є дзеркальними відображеннями один одного. Конкретний стереоизомер також може бути позначений як енантіомер, а суміш таких ізомерів часто називають энантиомерной сумішшю. Суміш енантіомерів 50:50 називають рацемической сумішшю або рацематом, яка може зустрічатися, коли відсутня стереоселекция або стереоспецифичность в хімічній реакції або процесі. Терміни "рацемическая суміш" і "рацемат" відносяться до еквімолярної суміші двох энантиомерних сполук, позбавленої оптичної активності.

Термін "таутомер" або "таутомерная форма" відноситься до структурних ізомеру з різною енергією, які є взаимопревращающимися з низьким енергетичним бар'єром. Наприклад, протонні таутомери (також відомі як прототропние таутомери) включають взаємоперетворення шляхом міграції протона, такі як кето-енольная і имин-енаминовая ізомеризації. Валентні таутомери включають взаємоперетворення шляхом реорганізації декількох електронів зв'язку.

Вираз "фармацевтично прийнятна сіль", як використовують в насто винаходу. Ілюстративні солі включають, але не обмежуються ними, сульфати, цитрати, ацетати, оксалати, хлориди, броміди, йодиди, нітрати, бисульфати, фосфати, кислі фосфати, изоникотинати, лактати, саліцилати, кислі цитрати, тартрати, олеати, таннати, пантотенати, битартрати, аскорбати, сукцинати, малеати, гентизинати, фумарати, глюконати, глюкуронати, сахарати, форміат, бензоати, глутамати, метансульфонати "мезилати", этансульфонати, бензолсульфонати, п-толуолсульфонати і памоати (тобто, 1,1'-метилен-біс(2-гідрокси-3-нафтоат)). Фармацевтично прийнятна сіль може включати іншу молекулу, таку як іон ацетату, іон сукцинату або інший протиіонів. Протиіонів може являти собою будь-яку органічну або неорганічну групу, яка стабілізує заряд на вихідному з'єднанні. Більш того, фармацевтично прийнятна сіль може мати більше одного зарядженого атома в її структурі. У випадках, коли безліч заряджених атомів є частиною фармацевтично прийнятною солі, може існувати безліч протиіонів. Таким чином, фармацевтично прийнятна сіль може мати один або кілька заряджених атомів та/або один або кілька протиіонів.

Якщо з'єднання з винаходу є�вим в даній області, наприклад, обробкою вільного основи неорганічної кислотою, такий як хлористоводнева кислота, бромистоводородная кислота, сірчана кислота, азотна кислота, метансульфоновая кислота, фосфорна кислота і т. п., або органічною кислотою, такий як оцтова кислота, трифторуксусная кислота малеїнова кислота, янтарна кислота, мигдальна кислота фумарова кислота, малоновая кислота, піровиноградна кислота, щавлева кислота, гліколева кислота, саліцилова кислота, пиранозидильная кислота, така як глюкуронова кислота або галактуронова кислота, альфа-гидроксикислота, така як лимонна кислота або виннокаменная кислота, амінокислоти, така як аспарагінова кислота або глутамінова кислота, ароматична кислота, така як бензойна кислота або корична кислота, сульфоновая кислота, така як п-толуолсульфоновая кислота або этансульфоновая кислота, або подібні з ними.

Якщо з'єднання з винаходу є кислотою, необхідну фармацевтично прийнятну сіль можна отримувати будь-яким підходящим способом, наприклад, обробкою вільної кислоти неорганічних або органічних підставою, таким як амін (первинний, вторинний або третинний), гідроксид щелочногей включають, але не обмежуються ними, органічні солі, утворені з амінокислот, таких як гліцин і аргінін, амоніаку, первинних, вторинних та третинних амінів та циклічних амінів, таких як пиперидин, морфолин і піперазин, та неорганічні солі, утворені з натрію, кальцію, калію, магнію, марганцю, заліза, міді, цинку, алюмінію і літію.

Вираз "фармацевтично прийнятний" вказує на те, що речовина або композиція повинні бути сумісні хімічно та/або токсикологічного з іншими інгредієнтами, що містяться в складі, та/або з ссавцям, подвергаемим лікування ними.

"Сольват" відноситься до асоціації або комплексу однієї або кількох молекул розчинника і з'єднання по винаходу. Приклади розчинників, які утворюють сольвати, включають, але не обмежуються ними, воду, ізопропанол, етанол, метанол, DMSO, етилацетат, оцтову кислоту і етаноламін. Термін "гідрат" відноситься до комплексу, де молекулою розчинника є вода.

Термін "захисна група" відноситься до заступника, який зазвичай використовують для блокування або захисту конкретної функціональної групи в ході реакції інших функціональних груп на з'єднанні. Наприклад, "захисна група для аміно" представляє�єднання. Відповідні захисні групи аміно включають ацетил, трифторацетил, тре-бутоксикарбонил (BOC), бензилоксикарбонил (CBZ) і 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Аналогічно, "захисна група гідрокси" відноситься до заступника гидроксигруппи, який блокує або захищає функціональну гидроксигруппу. Відповідні захисні групи включають ацетил і силил. "Захисна група карбокси" відноситься до заступника карбоксигруппи, який блокує або захищає функціональну групу карбокси. Найпоширеніші захисні групи карбокси включають фенилсульфонилэтил, цианоэтил, 2-(триметилсилил)етил, 2-(триметилсилил)этоксиметил, 2-(п-толуолсульфонил)етил, 2-(п-нитрофенилсульфенил)етил, 2-(дифенилфосфино)етил, нитроэтил і т. п. Для загального опису захисних груп і їх застосування, див. T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

"Йде група" відноситься до функціональної групи, яка може бути заміщена іншою функціональною групою. Певні йдуть групи добре відомі в даній галузі, та їх приклади включають, але не обмежуються ними, галогенид (наприклад, хлорид, бромід, йодид), метансульфонил (мезил), п-толуолсульфонил (тозил), трифторметилсульфонил (трифлат) і трифторметилсульфонат.

�ін (ілюстративний дипептид в розщеплюваному протеази линкере)

Цитрулін = 2-аміно-5-уреидопентановая кислота

PAB = п-аминобензилоксикарбонил (приклад "самоотщепляющегося" линкерного компонента)

Me-Val-Cit = N-метил-валін-цитрулін (де пептидний зв'язок лінкера модифікована для запобігання її розщеплення катепсином B)

MC(PEG)6-OH = малеимидокапроилполиэтиленгликоль (може бути пов'язаний із залишками цистеїну антитіла).

ЦИТОТОКСИЧНІ ЛІКАРСЬКІ ЗАСОБИ:

MMAE = монометилауристатин E (MW 718)

MMAF = варіант ауристатина E (MMAE) з фенилаланином на с-кінці лікарського засобу (MW 731,5)

MMAF-DMAEA = MMAF з DMAEA (диметиламиноэтиламин) в амідній зв'язку з С-кінцевим фенилаланином (MW 801,5)

MMAF-TEG = MMAF з тетраэтиленгликолем, етерифіковані фенилаланином

MMAF-NtBu = N-трет-бутил, пов'язаний як аміду з C-кінцем MMAF

DM1 = N(2')-деацетил-N(2')-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзин

DM3 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-1-оксопентил)майтанзин

DM4 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)майтанзин

Інші скорочення є наступними: AE являє собою ауристатин E, Boc являє собоюN-(трет-бутоксикарбонил), cit являє собою цитрулін, dap являє собою долапроин, DCC являє собою 1,3-дициклогексилкарбодіімід, DCM являє соб�яет собою диэтилфосфорилцианидат, DIAD являє собою диизопропилазодикарбоксилат, DIEA являє собоюN,N-диизопропилэтиламин, dil являє собою долаизолейцин, DMA являє собою диметилацетамид, DMAP являє собою 4-диметиламинопиридин, DME являє собою диметиловий ефір етиленгліколю (або 1,2-диметоксиэтан), DMF являє собоюN,N-диметилформамід, DMSO являє собою диметилсульфоксид, doe являє собою долафенин, dov являє собоюN,N-диметилвалин, DTNB являє собою 5,5'-дитио-біс(2-нитробензойную кислоту), DTPA являє собою диэтилентриаминпентауксусную кислоту, DTT являє собою дитиотреитол, EDCI являє собою 1-(3-диметиламінопропіл)-3-этилкарбодиимида гідрохлорид, EEDQ являє собою 2-етокси-1-етоксикарбоніл-1,2-дигидрохинолин, ES-MS являє собою электрораспилительную мас-спектрометрію, EtOAc являє собою етилацетат, Fmoc являє собою N-(9-флуоренилметоксикарбонил), gly являє собою гліцин, HATU являє собою гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-іл)-N,N,N',N'-тетраметилурония, HOBt являє собою 1-гидроксибензотриазол, ВЕРХ являє собою високоефективну рідинну хроматографію, ile являє собою ізолейцин, lys пред�здійснює собою 4-анизилдифенилметил (або 4-метокситритил), nor являє собою (1S, 2R)-(+)-норєфедрин, PBS являє собою фосфатно-сольовий буфер (pH 7,4), PEG являє собою поліетиленгліколь, Ph являє собою феніл, Pnp являє собою п-нітрофеніл, MC являє собою 6-малеимидокапроил, phe являє собою L-фенілаланін, PyBrop являє собою гексафторфосфат бром-трис-пирролидинофосфония, SEC являє собою эксклюзионную хроматографію, Su являє собою сукцинімід, TFA являє собою трифторуксусную кислоту, TLC являє собою тонкошарову хроматографію, UV являє собою ультрафіолет, і val являє собою валін.

"Вільний залишок амінокислоти цистеїну" відноситься до амінокислотним залишком цистеїну, який вбудований в початкове антитіло, має тиольную функціональну групу (-SH) і не є спареним допомогою внутрішньомолекулярного або міжмолекулярної дисульфидного містка.

Термін "величина реакційної здатності тіольної групи" являє собою кількісну характеристику реакційної здатності вільних залишків амінокислоти цистеїну. Величина реакційної здатності тіольної групи являє собою відсоток вільних залишків амінокислоти цистеїну в антителе з вбудованими ванну до максимальної величини, складовою 1. Наприклад, вільний залишок амінокислоти цистеїну на антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну, яка реагує з 100% виходом з реакційно-здатною до тіольної групи реагентом, таким як біотин-малеимидний реагент, з утворенням міченого біотином антитіла, має величину реакційної здатності тіольної групи, що становить 1,0. Інший залишок амінокислоти цистеїну, вбудований в той же або інший початковий антитіло, який реагує з реакційно-здатною до тіольної групи реагентом з виходом 80%, має величину реакційної здатності тіольної групи, що становить 0,8. Інший залишок амінокислоти цистеїну, вбудований в той же або інший початковий антитіло, який зовсім не реагує з реакційно-здатною до тіольної групи реагентом, має величину реакційної здатності тіольної групи, що становить 0. Визначення величини реакційної здатності тіольної групи для конкретного залишку цистеїну можна проводити аналізом ELISA, мас-спектрометрією, рідинною хроматографією, радиоавтографией або іншими кількісними аналітичними тестами.

"Початкове антитіло" являє собою антитіло, що містить аминокислотную послідовність, в кот� антитіло може містити нативну послідовність або послідовність дикого типу. Початкове антитіло може мати заздалегідь існуючі модифікації амінокислотної послідовності (такі як вставки, делеції та/або заміни) відносно іншої нативної форми, форми дикого типу або модифікованої форми антитіла. Початкове антитіло може бути спрямоване проти представляє інтерес антигену-мішені, наприклад, біологічно значущого поліпептиду. Також передбачаються антитіла, спрямовані проти неполипептидних антигенів (таких як асоційовані з пухлиною гликолипидние антигени; див. US 5091178).

III. Композиції і способи винаходу

Винахід відноситься до антитілам проти CD79b або їх функзобретение відноситься до антителу, яке пов'язується, переважно специфічно, з будь-яким з описаних вище або нижче поліпептидів. Необов'язково, антитіло являє собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, включаючи Fab-, Fab'-, F(ab')2- і Fv-фрагмент, диатело, однодоменное антитіло, химерное антитіло, гуманізоване антитіло, одноцепочечное антитіло або антитіло, який конкурентно інгібує зв'язування антитіла проти поліпептиду CD79b з відповідним йому антигенним эпитопом. Антитіла по справжньому винаходу необов'язково можуть бути конъюгировани з інгібуючим зростання засобом або цитотоксичним засобом, таким як токсин, включаючи, наприклад, ауристатин, майтанзиноид, похідне долостатина або калихеамицин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолитический фермент або подібні з ними. Антитіла по справжньому винаходу необов'язково можна продукувати у клітках CHO або бактеріальних клітинах, і переважно вони індукують загибель клітини, з якої вони зв'язуються. Для цілей детекції, антитіла по справжньому винаходу можна мітити піддається детекції міткою, пов'язувати з твердою підкладкою або подібні з ними.

В одному аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу прот�а) є по суті такою ж, як і одновалентна афінність антитіла миші (наприклад, афінність антитіла миші проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти) або химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти), що містить послідовність вариабельного домену легкого ланцюга і важкої ланцюга, як показано на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), що складається або по суті складається з них.

В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де одновалентна афінність антитіла до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти) є нижчими, наприклад, щонайменше в 1, 2 або 3 рази нижче, ніж одновалентна афінність антитіла миші (наприклад, афінність антитіла миші проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти) або химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти), що містить послідовність вариабельного домену легкого ланцюга і важкої ланцюга, як представлено на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), що складається або по суті складається з них.

В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де одновалентна афінність антитіла до CD79b (наприклад, афінність антитіла протиь антитіла миші (наприклад, афінність антитіла миші проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти) або химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти), що містить послідовність вариабельного домену легкого ланцюга і важкої ланцюга, як показано на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), що складається або по суті складається з них.

В одному аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді фрагмента IgG) є по суті такою ж, як і афінність антитіла миші (наприклад, афінність антитіла миші проти CD79b у вигляді фрагмента IgG) або химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла проти CD79b у вигляді фрагмента IgG) у двовалентній формі, що містить послідовність вариабельного домену легкого ланцюга і важкої ланцюга, як показано на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), що складається або по суті складається з них.

В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді фрагмента IgG) є нижчими, наприклад, п� у вигляді фрагмента IgG) або химерного антитіла (наприклад афінність химерного антитіла проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти) в його двовалентній формі, містить послідовність вариабельного домену легкого ланцюга і важкої ланцюга, як показано на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), що складається або по суті складається з них.

В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді фрагмента IgG) перевищує, наприклад, щонайменше в 1, 2 або 3 рази перевищує, афінність антитіла миші (наприклад, афінність антитіла миші проти CD79b у вигляді фрагмента IgG) або химерного антитіла (наприклад афінність химерного антитіла проти CD79b у вигляді Fab-фрагменти) в його двовалентній формі, що містить послідовність вариабельного домену легкого ланцюга і важкої ланцюга, як представлено на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), що складається або по суті складається з них.

В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить 2,0 нМ. В наступному аспекті, винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (нап�ся до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить 1 нМ або вище. В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить 1,5 нМ або вище. В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить 2 нМ або вище. В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить 2,5 нМ або вище. В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить 3 нМ або вище. В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить від 1 нМ і 3 нМ. У другвалентной формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) між складає 1,5 нМ і 2,5 нМ. В іншому аспекті винахід відноситься до гуманизированному антителу проти CD79b, де афінність антитіла в його двовалентній формі до CD79b (наприклад, афінність антитіла проти CD79b у вигляді IgG) становить між 1,75 нМ і 2,25 нМ.

В одному аспекті одновалентна афінність антитіла миші проти CD79b є по суті такою ж, як афінність зв'язування Fab-фрагмент, що містить послідовності варіабельних доменів SEQ ID NO:10 (фігура 7) і SEQ ID NO:14 (фігури 8A-B). В іншому аспекті одновалентна афінність антитіла миші проти CD79b є по суті такою ж, як афінність зв'язування Fab-фрагмент, що містить послідовності варіабельних доменів антитіла, отриманого з гібридом, депонованих в ATCC як PTA-7712 11 липня 2006 року, або химерного антитіла, що містить вариабельние домени антитіла, отриманого з гібридом, депонованих в ATCC як PTA-7712 11 липня 2006 року.

Як встановлено в даній області, афінність зв'язування ліганду з його рецептором можна визначати з використанням будь-якого з безлічі аналізів, і виражати з допомогою різних кількісних величин. Таким чином, в одному варіанті здійснення, аффін мінімізованими ефектами авідності). Як правило, і бажано, афінність зв'язування вимірюютьin vitro, або в бесклеточних умовах, або пов'язаних з клітинами умовах. Як описано більш докладно в цьому документі, кратність відмінності афінності зв'язування можна кількісно визначати в значеннях відношення величини одновалентной афінності зв'язування гуманизированного антитіла (наприклад, у Fab-формі) і величини одновалентной афінності зв'язування еталонного/порівняльного антитіла (наприклад, у Fab-формі) (наприклад, антитіла миші, що має донорні послідовності гипервариабельних областей), де величини афінності зв'язування визначають в подібних умовах аналізу. Таким чином, в одному варіанті здійснення, кратну різницю в афінності зв'язування визначають як відношення значень Kd гуманизированного антитіла до Fab-формі і зазначеного еталонного/порівняльного Fab-антитіла. Наприклад, в одному варіанті здійснення, якщо антитіло щодо винаходу (A) володіє аффинностью, яка в 3 рази нижче" афінності еталонного антитіла (M), тоді, якщо величина Kd для A становить 3x, величина Kd для M становить 1x, і ставлення Kd A до Kd M становить 3:1. Навпаки, в одному варіанті здійснення, якщо антитіло щодо винаходу для C становить 1x, величина Kd для R становить 3x, і ставлення Kd C до Kd R становить 1:3. Для отримання показників афінності зв'язування можна використовувати будь-який з безлічі аналізів, відомих у цій галузі, включаючи аналізи, описані в цьому документі, в тому числі, наприклад, Biacore, радиоиммунний аналіз (RIA) і ELISA.

В одному аспекті передбачається антитіло, яке пов'язується з CD79b, де антитіло містить: (a) щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість HVR, вибраних з групи, що складається з:

(i) HVR-L1, містить послідовність A1-A15, де A1-A16 являє собою KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(ii) HVR-L2, що містить послідовність B1-B7, де B1-B7 являє собою LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(iii) HVR-L3, містить послідовність C1-C9, де C1-C9 являє собою WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61)

(iv) HVR-H1, містить послідовність D1-D10, де D1-D10 являє собою GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(v) HVR-H2, що містить послідовність E1-E18, де E1-E18 являє собою GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO:63) і

(vi) HVR-H3, що містить послідовність F1-F6, де F1-F10 являє собою ARNLYL (SEQ ID NO:64).

В одному варіанті здійснення, HVR-L1 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:59. В одному варіанті здійснення, HVR-L2 антитіла щодо винаходу містить послід�ь SEQ ID NO:61. В одному варіанті здійснення, HVR-H1 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:62. В одному варіанті здійснення, HVR-H2 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:63. В одному варіанті здійснення, HVR-H3 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:64. В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу, що містить ці послідовності (в поєднанні, як описано в цьому документі), являє собою гуманізоване антитіло або антитіло людини.

В одному аспекті передбачається антитіло, яке пов'язується з CD79b, де антитіло містить:

(a) щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість HVR, вибраних з групи, що складається з:

(i) HVR-L1, містить послідовність A1-A15, де A1-A16 являє собою KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(ii) HVR-L2, що містить послідовність B1-B7, де B1-B7 являє собою LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(iii) HVR-L3, містить послідовність C1-C9, де C1-C9 являє собою WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61)

(iv) HVR-H1, містить послідовність D1-D10, де D1-D10 являє собою GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(v) HVR-H2, що містить послідовність E1-E18 де E1-E18 являє собою GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO:63) і

(vi) HVR-H3, що містить послідовність F1-F6, де F1-F1�отримає модифікацію щонайменше одного залишку послідовності, представленої в SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 або 64. В одному варіанті здійснення, HVR-L1 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:59. В одному варіанті здійснення, HVR-L2 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:60. В одному варіанті здійснення, HVR-L3 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:61. В одному варіанті здійснення, HVR-H1 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:62. В одному варіанті здійснення, HVR-H2 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:63. В одному варіанті здійснення, HVR-H3 антитіла щодо винаходу містить послідовність SEQ ID NO:64. В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу, що містить ці послідовності (в поєднанні, як описано в цьому документі), являє собою гуманізоване антитіло або антитіло людини.

В одному аспекті винахід відноситься до антителу, який містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість HVR, де кожна HVR містить послідовність, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 і 64, складається або по суті складається з неї, і де SEQ ID NO:59 відповідає HVR-L1, SEQ ID NO:60 відповідає HVR-L2, SEQ ID NO:61 відповідає HVR-L3, SEQ ID NO:62 відповідає HVR-H1, SEQ ID NO:63 соо HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, де кожна, в цьому порядку, містить SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 64.

Варіанти HVR в антителе щодо винаходу можуть мати модифікації одного або декількох залишків у HVR. В одному варіанті здійснення, варіант HVR-L3 містить 1-2 (1 або 2) заміни у будь-якому поєднанні з наступних положень: C1 (F) і C8 (F). Літера(и) в дужках після кожного положення вказує на ілюстративну заміну (тобто, заміщення) амінокислоти; як буде зрозуміло фахівця в даній області, придатність інших амінокислот в якості амінокислот для заміни в контексті, описаному в цьому документі, можна оцінювати з використанням звичайних способів, відомих в даній сфері та/або описаних у цьому документі. В одному варіанті здійснення, C1 у варіанті HVR-L3 являє собою F. В одному варіанті здійснення, C8 у варіанті HVR-L3 являє собою F. В одному варіанті здійснення антитіло щодо винаходу містить варіант HVR-L3, де C1 являє собою F і C8 являє собою F.

В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить варіант HVR-L3, де C1 являє собою F. В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить варіант HVR-L3, де C8 являє собою F. В деяких варіантах які�т, в цьому порядку, послідовність, представлену в SEQ ID NO: 59, 60, 62, 63 і 64. В деяких варіантах здійснення, ці антитіла далі містять консенсусну послідовність каркасної галузі важкої ланцюга підгрупи III людини. В одному варіанті здійснення цих антитіл, консенсусна послідовність каркасної області містить заміну в положенні 71, 73 і/або 78. В деяких варіантах здійснення цих антитіл, положення 71 являє собою A, положення 73 являє собою T і/або положення 78 являє собою A. В одному з варіантів здійснення цих антитіл, ці антитіла далі містять консенсусну послідовність каркасної галузі легкої ланцюга κI людини.

В одному аспекті винахід відноситься до антителу, що містить послідовність HVR, представлену на фігурі 9 (SEQ ID NO:18).

Лікарський засіб для застосування у індивіда-господаря переважно викликає невеликий иммунногенний відповідь, чи не викликає його, проти кошти у зазначеного індивіда. В одному варіанті здійснення, винахід відноситься до такого засобу. Наприклад, в одному варіанті здійснення, винахід відноситься до гуманизированному антителу, яке викликає і/або як очікується викликає відповідь а послідовність SEQ ID NO: 10 та 14 у індивіда-господаря. В іншому прикладі, винахід відноситься до гуманизированному антителу, яке викликає і/або імовірно викликає мінімальний відповідь антитіл людини проти антитіл миші (HAMA), або не викликає його. В одному прикладі, антитіло щодо винаходу викликає відповідь проти антитіл миші, який знаходиться на клінічно-прийнятному рівні або нижче.

Гуманізоване антитіло щодо винаходу може містити одну або декілька послідовностей негипервариабельних областей (наприклад, каркасних областей) людини або консенсусних послідовностей негипервариабельних областей людини в його вариабельном домені важкого чи легкого ланцюга. В деяких варіантах здійснення, у послідовностях негипервариабельних областей (наприклад, каркасних областей) людини або консенсусних послідовностях негипервариабельних областей людини є одна або кілька додаткових модифікацій. В одному варіанті здійснення, варіабельний домен важкої ланцюга антитіла щодо винаходу містить консенсусну послідовність каркасної області людини, яка в одному варіанті здійснення являє собою консенсусну послідовність каркасної області підгрупи III. �ркасной області підгрупи III, модифіковану щонайменше в одному амінокислотному положенні. Наприклад, в одному варіанті здійснення, варіант консенсусної послідовності каркасної області підгрупи III може містити заміну в одному чи кількох положень 71, 73 і/або 78. В одному варіанті здійснення, зазначена заміна являє собою R71A, N73T та/або L78A, в будь-якому їх поєднанні.

Як відомо в цій галузі, і як більш докладно описано в цьому документі нижче, аминокислотное положення/межа, що визначають гипервариабельную область антитіла, можуть варіювати, залежно від контексту і різних визначень, відомих у цій галузі (як описано нижче). Деякі положення в вариабельном домен можна розглядати як гібридні гипервариабельние положення в тому відношенні, що ці положення можна вважати відносяться до гипервариабельной області при одному наборі критеріїв, і вважати не відносяться до гипервариабельной області при іншому наборі критеріїв. Одна або кілька із цих положень також можуть перебувати у видовжених гипервариабельних областях (як більш докладно визначено нижче). Винахід відноситься до антитілам, що містить модифікації в цих гібридних гипервариабельних п�пропозицій 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 та 101-102 в вариабельном домені важкої ланцюга. В одному варіанті здійснення, ці гібридні гипервариабельние положення включають одне або декілька положень 24-29, 35-36, 46-49, 56 і 97 в вариабельном домені легкого ланцюга. В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить варіант консенсусної послідовності каркасної області людини, модифікований в одному або декількох гібридних гипервариабельних положеннях.

В одному аспекті антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен важкої ланцюга, що містить варіант консенсусної послідовності каркасної області підгрупи III людини, модифікований в одному чи кількох положень 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 і 101.

В одному аспекті антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен легкої ланцюга, що містить варіант консенсусної послідовності каркасної області підгрупи I капа людини, модифікований в одному чи кількох положень 24, 27-29, 56 та 97.

В одному аспекті антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен важкої ланцюга, що містить варіант консенсусної послідовності каркасної області підгрупи III, модифікований в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або всіх положень 26-иант консенсусної послідовності каркасної області підгрупи III, модифікований в положенні 71, 73 і/або 78. В одному варіанті здійснення, зазначена заміна являє собою R71A, N73T та/або L78A.

В одному аспекті антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен легкої ланцюга, що містить варіант консенсусної послідовності каркасної області підгрупи I капа людини, модифікований в 1, 2, 3, 4, 5 або всіх положень 24, 27-29, 56 та 97.

Антитіло щодо винаходу може містити будь-які відповідні послідовності каркасної галузі легкої ланцюга людини чи консенсусні послідовності каркасної галузі легкої ланцюга людини, за умови, що антитіло володіє необхідними біологічними характеристиками (наприклад, необхідної аффинностью зв'язування). В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить принаймні частина послідовності каркасної галузі легкої ланцюга K людини (або всю її). В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить принаймні частина консенсусної каркасної області K підгрупи I людини (або все).

В одному аспекті антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен важкої і/або легкого ланцюга, що містить послідовність каркасної області, представлену в SEQ ID NO:9 (фігура 7) та/або 1�в CD79b, конъюгированное з цитотоксичним засобом. В одному аспекті гуманізоване антитіло проти CD79b, конъюгированное з цитотоксичним засобом, інгібує прогресію пухлини в ксенотрансплантатах.

В одному аспекті як гуманізоване антитіло, так і химерное антитіло, є одновалентними. В одному варіанті здійснення, як гуманізоване, так і химерное антитіло, що містить одну Fab-область, пов'язану з Fc-областю. В одному варіанті здійснення, еталонне химерное антитіло містить послідовності варіабельних доменів, представлені на фігурі 7 (SEQ ID NO:10) і фігурах 8A-B (SEQ ID NO:14), пов'язані з Fc-областю людини. В одному варіанті здійснення, Fc-область людини являє собою Fc-область IgG (наприклад, IgG1, 2, 3 або 4).

В одному аспекті винахід відноситься до антителу, що містить варіабельний домен важкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-HC, HVR2-HC і/або HVR3-HC, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:31-33). В одному варіанті здійснення, варіабельний домен містить послідовність F1-HC, FR2-HC, FR3-HC і/або FR4-HC, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:27-30). В одному варіанті здійснення, антитіло містить послідовність CH1 і/або Fc, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:34-35). В одному варіативності�льность HVR1-HC, HVR2-HC і/або HVR3-HC (фігура 13, SEQ ID NO:31-33), і послідовність FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC і/або FR4-HC (фігура 13, SEQ ID NO:27-30). В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен важкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-HC, HVR2-HC і/або HVR3-HC (фігура 13, SEQ ID NO:31-33), і послідовність CH1 і/або Fc, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:34-35). В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен важкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-HC, HVR2-HC і/або HVR3-HC (фігура 13, SEQ ID NO:31-33), і послідовність FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC і/або FR4-HC (фігура 13, SEQ ID NO:27-30), і CH1 і/або Fc (фігура 13, SEQ ID NO:34-35).

В одному аспекті винахід відноситься до антителу, що містить варіабельний домен легкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-LC, HVR2-LC і/або HVR3-LC, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:23-25). В одному варіанті здійснення, варіабельний домен містить послідовність FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC і/або FR4-LC, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:19-22). В одному варіанті здійснення, антитіло містить послідовність CL1, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:26). В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен легкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-LC, HVR2-LC і/або HVR3-LC (SEQ ID NO:23-25), і ія, антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен легкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-LC, HVR2-LC і/або HVR3-LC (SEQ ID NO:23-25), і послідовність CL1 (SEQ ID NO:26), представлені на фігурі 13. В одному варіанті здійснення, антитіло щодо винаходу містить варіабельний домен легкої ланцюга, що містить послідовність HVR1-LC, HVR2-LC і/або HVR3-LC (SEQ ID NO:23-26), і послідовність FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC і/або FR4-LC (SEQ ID NO:19-22), представлені на фігурі 13, і послідовність CL1, представлену на фігурі 13 (SEQ ID NO:26).

В одному аспекті антитіла щодо винаходу включають антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну, де одна чи кілька амінокислот вихідного антитіла замінені вільним залишком амінокислоти цистеїну, як описано в WO2006/034488; US 2007/0092940 (включених в цей документ у якості посилань в повному обсязі). Таким чином можна конструювати, тобто піддавати мутації, будь-яку форму антитіла проти CD79b. Наприклад, вихідний Fab-фрагмент антитіла можна змінювати способами інженерії, щоб він утворював Fab з вбудованими в нього залишками цистеїну, що позначається в цьому документі як "тво-Fab". Аналогічно, вихідний моноклональне антитіло можна змінювати способами інженерії так, щоб воно утворювало "тво-Mab". �ма як у тво-Mab мутація в одній ділянці призводить до двом вбудованим способами інженерії залишками цистеїну, внаслідок диммер структури антитіла IgG. Антитіла проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну щодо винаходу включають моноклональні антитіла, гуманізовані або химерні моноклональні антитіла, і антиген-зв'язувальні фрагменти антитіл, злиті поліпептиди і аналоги, які переважно пов'язують асоційовані з кліткою поліпептиди CD79b. Антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну альтернативно може включати антитіло, що містить цистеїн у стані, описаному в даному документі, антителе або Fab, завдяки конструюванню послідовності та/або селекції антитіла, без обов'язкового зміни вихідного антитіла, таких як конструювання та селекція антитіл за допомогою фагового дисплею або конструюванняde novoпослідовностей каркасної області та константних областей легкого ланцюга і/або важкої ланцюга. Антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну містить один або кілька вільних залишків амінокислоти цистеїну, що мають величину реакційної здатності тіольної групи в діапазоні від 0,6 до 1,0; від 0,7 до 1,0 або від 0,8 до 1,0. Вільний залишок амінокислоти цистеїну являє собою залишок цистеїну, який вбудований способами інженерії в исхпригодни для приєднання до них цитотоксичних та/або візуалізуючих сполук в ділянці вбудованого цистеїну через, наприклад, малеимид або галоацетил. Нуклеофильная реакційна здатність тіольної функціональної групи залишку Cys щодо малеимидной групи приблизно в 1000 разів вище, ніж у функціональної групи будь-якої іншої амінокислоти в білку, такий як аміногрупа залишків лізину або N-кінцева аміногрупа. Специфічні до тіольної групи функціональні групи в йодоацетильних і малеимидних реагентах можуть реагувати з аміногрупами, проте потрібні більш високе значення рн (>9,0) і більш тривалий час реакції (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).

В одному аспекті, антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну щодо винаходу містить вбудований способами інженерії цистеїн в будь-якому з наступних положень, де положення пронумерована згідно Кабат в легкій ланцюга (див. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) і згідно нумерації EU у важкої ланцюга (включаючи Fc-область) (див. Kabat et al. (1991), вища), де константний ділянку легкого ланцюга, зазначений підкресленням на фігурі 17A і 18A, починається в положенні 109 (нумерація за Кабат), а константний ділянку важкої ланцюга, зазначений підкресленням на фігурах 17B і 18B, починається в положенні 118 (ну�окислот повнорозмірною легкого ланцюга і важкої ланцюга, представлених на фігурах 17-18. Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу, антитіло проти CD79b містить вбудований в нього цистеїн в LC-V205C (номер за Кабат: Val 205; номер по послідовності 210 на фігурі 18A, змінений способами інженерії на Cys в цьому положенні). Вбудований цистеїн в легкій ланцюга вказано напівжирним шрифтом з подвійним підкресленням на фігурі 18A. Відповідно до одного варіанту здійснення, антитіло проти CD79b містить вбудований цистеїн в HC-A118C (номер EU: Ala 118; номер по Кабат 114; номер по послідовності 118 на фігурі 17B, змінений способами інженерії на Cys в цьому положенні). Вбудований цистеїн в важкої ланцюга показаний напівжирним шрифтом з подвійним підкресленням на фігурі 17B. Відповідно до одного з варіантів здійснення, антитіло проти CD79b містить вбудований цистеїн в Fc-S400C (номер EU: Ser 400; номер по Кабат 396; номер по послідовності 400 на фігурі 17-18B, змінений на Cys в цьому положенні). В інших варіантах здійснення, вбудований цистеїн важкої ланцюга (включаючи Fc-область) знаходиться в будь-якому з наступних положень (відповідно до нумерації по Кабат з нумерацією EU, зазначеної в дужках): 5, 23, 84, 112, 114 (118 при нумерації EU), 116 (120 при нумерації EU), 278 (282 при нумерації EU), 371 (375 при нумерації EU) або 396 (400 прла проти CD79b щодо винаходу являють собою: V5, A23C, A84C, S112C, A114C (A118C при нумерації EU), T116C (T120C при нумерації EU), V278C (V282C при нумерації EU), S371C (S375C при нумерації EU) або S396C (S400C при нумерації EU). Таким чином, зміни амінокислот у цих положеннях для вихідного химерного антитіла проти CD79b щодо винаходу являють собою: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (A118C при нумерації EU), T116C (T120C при нумерації EU), V278C (V282C при нумерації EU), S371C (S375C при нумерації EU) або S396C (S400C при нумерації EU). В інших варіантах здійснення, вбудований цистеїн легкої ланцюга знаходиться в будь-якому з наступних положень (відповідно до нумерації по Кабат): 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Таким чином, зміни амінокислот у цих положеннях для вихідного гуманизированного антитіла проти CD79b щодо винаходу являють собою: V15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C або V205C. Таким чином, зміни амінокислот у цих положеннях для вихідного химерного антитіла проти CD79b щодо винаходу являють собою: I15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C або V205C.

В одному аспекті винахід включає антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну, який містить один або кілька вільних залишків амінокислоти цистеїну, де антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну зв'язується з поліпептидом CD79b і отримано шляхом процесу, �де початкове антитіло містить щонайменше одну послідовність HVR, обрану з:

(a) HVR-L1, містить послідовність A1-A15, де A1-A16 являє собою KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(b) HVR-L2, що містить послідовність B1-B7, де B1-B7 являє собою LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(c) HVR-L3, містить послідовність C1-C9, де C1-C9 являє собою WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61) або FQGTHFPFT (SEQ ID NO:79)

(d) HVR-H1, містить послідовність D1-D10, де D1-D10 являє собою GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(e) HVR-H2, що містить послідовність E1-E18, де E1-E18 являє собою GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO:63) і

(f) HVR-H3, що містить послідовність F1-F6, де F1-F10 являє собою ARNLYL (SEQ ID NO:64).

У певному аспекті, винахід відноситься до антителу проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну, який містить аминокислотную послідовність, яка має щонайменше приблизно 80% ідентичність амінокислотної послідовності, альтернативно щонайменше приблизно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичність амінокислотної послідовності з антитілом з вбудованими в нього залишками цистеїну, має повнорозмірну аминокислотную послідовність, як описано в цьому документі, або антитілом з вбудованими в нього залишками цистеїну, мають аминокислотн, �зобретение відноситься до виділеного антителу проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну, який містить аминокислотную послідовність, яка кодується нуклеотидної послідовністю, яка гибридизуется з молекулою, комплементарної ДНК, що кодує (a) антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну, має повнорозмірну аминокислотную послідовність, як описано в цьому документі, (b) антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну, має аминокислотную послідовність, позбавлену сигнального пептиду, як описано в цьому документі, (c) позаклітинний домен трансмембранного білка антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в цьому документі, (d) аминокислотную послідовність, кодовану будь послідовностей нуклеїнових кислот, описаних у цьому документі або (e) будь-якій іншій конкретно визначений фрагмент повнорозмірною амінокислотної послідовності антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну, як описано в цьому документі.

У конкретному аспекті, винахід відноситься до виділеного антителу проти CD79b з вбудованими в нього залишками цой послідовністю, яка кодує таку аминокислотную послідовність, як описано в цьому документі. Способи його отримання також описані в цьому документі, причому ці способи включають культивування клітини-господаря, що містить вектор, який містить відповідну кодує молекулу нуклеїнової кислоти в умовах, відповідних для експресії антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну, і виділення антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з клітинної культури.

Інший аспект винаходу відноситься до виділеного антителу проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну, в якому трансмембранний домен або видалений, або инактивирован. Способи його отримання також описані в цьому документі, причому ці способи включають культивування клітини-господаря, що містить вектор, який містить відповідну кодує молекулу нуклеїнової кислоти в умовах, відповідних для експресії антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну, і виділення антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з клітинної культури.

В інших аспектах, винахід відноситься до виділених химерним антитілам проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну, що включає ною поліпептидом (не CD79b). Приклади таких химерних молекул включають будь-який з описаних у цьому документі антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну, злите з гетерологічних поліпептидом, наприклад, таким як послідовність эпитопной мітки або Fc-область імуноглобуліну.

Антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну може представляти собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, химерное антитіло, гуманізоване антитіло, одноцепочечное антитіло або антитіло, який конкурентно інгібує зв'язування антитіла проти поліпептиду CD79b з відповідним йому антигенним эпитопом. Антитіла по справжньому винаходу необов'язково можуть бути конъюгировани з інгібуючим зростання засобом або цитотоксичним засобом, таким як токсин, включаючи, наприклад, ауристатин, майтанзиноид, похідне долостатина або калихеамицин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолитический фермент або подібні з ними. Антитіла по справжньому винаходу необов'язково можна продукувати у клітках CHO або бактеріальних клітинах і переважно вони інгібують ріст або проліферацію клітини, з якої вони зв'язуються, або індукують її загибель. Для діагностичних цілей, антитіла по справжньому і� інших аспектах цього винаходу, винахід відноситься до векторів, що містять ДНК, що кодує одну з описаних у цьому документі антитіл проти CD79b і антитіл проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну. Також передбачаються клітини-господарі, що містять будь-такий вектор. В якості прикладу, клітини-господарі можуть представляти собою клітини CHO, клітиниE. coli, або клітини дріжджів. Також передбачається процес продукції будь-якого з описаних у цьому документі поліпептидів, і він включає культивування клітин-господарів в умовах, відповідних для експресії необхідного поліпептиду, і виділення необхідного поліпептиду з клітинної культури.

Антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну можуть бути придатні для лікування злоякісної пухлини і включають антитіла, специфічні до рецепторів клітинної поверхні і трансмембранним рецепторів, і асоційованим з пухлиною антигенів (TAA). Такі антитіла можна використовувати у вигляді простих антитіл (некон'югованих з лікарським засобом або групою мітки) або у вигляді кон'югатів антитіло-лікарський засіб (ADC). Антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну щодо винаходу можна сайт-специфічний і ефективно пов'язувати з реакційно-здатною до �кциональний линкерний реагент, реагент мітки для уловлювання, реагент флуорофора, або проміжне з'єднання лікарський засіб-лінкер. Антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну можна мітити піддається детекції міткою, иммобилизовивать на твердофазної підкладці і/або конъюгировать з групою лікарського засобу. Реакційна здатність тіольної групи може бути загальною для будь-якого антитіла, де можна проводити заміну амінокислот реактивними амінокислоти цистеїну в межах легкої ланцюга, вибраних з діапазонів амінокислотних залишків: L10-L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L210; і в межах важкої ланцюга, вибраних з діапазонів амінокислотних залишків: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H111-H121, і в Fc-області в діапазонах, вибраних з H270-H280, H366-H376, H391-401, де нумерація амінокислотних положень починається в 1 положенні відповідно до системи нумерації Кабат (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) і далі продовжується, як описано в WO2006034488; US 2007/0092940. Реакційна здатність тіольної групи також може бути загальною для певних доменів антитіла, таких як константний домен легкого ланцюга (CL) і константние домени важкої ланцюга, CH1, CH2 і CH3. Заміни цистеїном, що призводять до величина�елой ланцюга α, δ, ε, γ і μ інтактних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, відповідно, включаючи підкласи IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA і IgA2. Такі антитіла та їх застосування описані в WO2006/034488; US 2007/0092940.

Антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну з винаходу переважно зберігають антиген-зв'язуючу здатність їх аналогів, що представляють вихідне антитіло дикого типу. Таким чином, антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну здатні зв'язуватися, переважно специфічно, з антигенами. Такі антигени включають, наприклад, асоційовані з пухлиною антигени (TAA), білки рецепторів клітинної поверхні і інші молекули клітинної поверхні, трансмембранні білки, білки передачі сигналу, регуляторні фактори виживання клітин, регуляторні фактори клітинної проліферації, молекули, асоційовані з розвитком і диференціюванням тканини (наприклад, про яких відомо або припускають, що вони беруть участь у них функціонально), лімфокіни, цитокіни, молекули, залучені в регуляцію клітинного циклу, молекули, залучені в утворення судин, і молекули, асоційовані з ангиогенезом (наприклад, про яких відомо або припускають, що вони беруть участь у ньому). Асоційований з пухлиною антиген може пре�а проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну щодо винаходу зберігають антиген-зв'язуючу здатність їх аналогів, представляють собою вихідне антитіло CD79b. Таким чином, антитіла проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну щодо винаходу здатні зв'язуватися, переважно специфічно, з антигенами CD79b, включаючи ізоформи CD79b бета і/або альфа, в тому числі, коли такі антигени експресуються на поверхні клітин, включаючи, але не обмежуючись ними, B-клітини.

В одному аспекті антитіла щодо винаходу можна конъюгировать з будь-якою групою мітки, яка може бути ковалентно пов'язана з антитілом через реакційно-здатною групу, активовану групу або реакційно-здатною тиольную групи цистеїну (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). Приєднана мітка може виконувати функції: (i) забезпечення піддається детекції сигналу; (ii) взаємодії з другою міткою для модифікації піддається детекції сигналу, забезпечуваного першою або другою міткою, наприклад, для отримання FRET (резонансного переносу енергії флуоресценції); (iii) стабілізації взаємодій або підвищення афінності зв'язування з антигеном або лігандом; (iv) впливу на рухливість, наприклад электрофоретическеских параметрів, або (v) забезпечення групи для уловлювання, модулювання афінності до лігандами, зв'язування антитіло/антиген або утворення комплексів з іонами.

Мічені антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну можуть бути придатні для діагностичних аналізів, наприклад, для детекції експресії представляє інтерес антигену в конкретних клітинах, тканинах або сироватці. Для діагностичних застосувань, антитіло, як правило, мітять піддається детекції групою. Доступно безліч міток, які, загалом, можна розділити на наступні категорії:

Радіоізотопи (радіонукліди), такі як3H,11C,14C,18F,32P,35S,64Cu,68Ga,86Y,99Tc,111In,123I,124I,125I,131I,133Xe,177Lu,211At або213Bi. Мічені радіоізотопом антитіла придатні в експериментах з націленої на рецептори візуалізацією. Антитіло можна мітити реагентами лігандів, які зв'язуються, утворюють хелати чи інші комплекси з радіоізотопного металом, де реагент є реакційно-здатною до тіольної групи вбудованого цистеїну антитіла, з використанням способів, описаних у Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Хеallas, TX). Радіонукліди можна налаштовувати за допомогою утворення комплексів з кон'югатами антитіло-лікарський засіб щодо винаходу (Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146).

Линкерние реагенти, такі як DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), можна отримувати шляхом реакції аминобензил-DOTA з 4-малеимидомасляной кислотою (Fluka), активованої изопропилхлорформиатом (Aldrich), з наступним способом Axworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1802-1807). DOTA-малеимидние реагенти реагують з вільними залишками амінокислоти цистеїну антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну і забезпечують утворює комплекс з металом ліганд на антителе (Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Хелатирующие линкерние реагенти для мічення, такі як DOTA-NHS (моно-N-гидроксисукцинимидний складний ефір 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоти), комерційно доступні (Macrocyclics, Dallas, TX). Націлена на рецептор візуалізація за допомогою мічених радіонуклідом антитіл може забезпечити маркер для активації каскаду шляхом детекції та кількісного визначення поступового накопичення антитіл в пухлинної тканини (Albert et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1207-1210). Кон'юговані радіоактивні метали можуть залишатися всередині клітини після лизосомально�ції, описані в: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Methods 65: 147-157; Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al. (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al. (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al. (1995) Nucl. Med. Товарbiol. 22:387-90; Camera et al. (1993) Nucl. Med. Товарbiol. 20:955-62; Kukis et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al. (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al. (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al. (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al. (2003) J. Nucl. Med. 44: 1105-1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al. (2004) J. Nucl. Med. 45: 129-137; DeNardo et al. (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al. (2003) Cancer Biotherapy & RadioPharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al. (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al. (1993) Nucl. Med. Товарbiol. 20:65-74; Roselli et al. (1999) Cancer Biotherapy & RadioPharmaceuticals, 14:209-20.

Флуоресцентні мітки включають мітки, такі як хелати рідкоземельних елементів (хелати європію), типи флуоресцеїну, включаючи FITC, 5-карбоксифлуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин; типи родаміну, включаючи ТАМРА; дансил; лиссамин; цианини; фикоэритрини; техаський червоний; і їх аналоги. Флуоресцентні мітки можна конъюгировать з антитілами з використанням способів, описаних, наприклад, у Current Protocols in Immunology, вище. Реагенти флуоресцентних барвників і флуоресцентних міток включають реагенти, коториЃбстратние мітки є доступними або описані (US 4275149). Фермент, як правило, каталізує хімічне зміна хромогенного субстрату, яке можна виміряти з використанням різних способів. Наприклад, фермент може каталізувати зміна кольору субстрату, яке можна виміряти спектрофотометрично. Альтернативно фермент може змінювати флуоресценцію чи хемілюмінесценцію субстрату. Способи кількісного визначення зміни флуоресценції описані вище. Хемілюмінесцентний субстрат стає електронно-збуджених при хімічної реакції і він може випускати світло, який можна виміряти (з використанням, наприклад, хемилюминометра) або він стає донором енергії акцептору флуоресценції. Приклади ферментних міток включають люциферази (наприклад, люциферазу світляка і бактеріальну люциферазу; US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндиони, малатдегидрогеназу, мочевиназу, пероксидазу, таку як пероксидаза хрону (HRP), лужну фосфатазу (AP), β-галактозидазу, глюкоамилазу, лізоцим, оксидази сахаридів (наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу і глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклічні оксидази (такі як уриказа і ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу і т. п. Способи ферментів кон'югації з антит Academic Press, New York, 73:147-166.

Приклади поєднань фермент-субстрат включають, наприклад:

(i) Пероксидаза хрону (HRP) з пероксидом водню в якості субстрату, де пероксид водню окислює попередник барвника (наприклад, ортофенилендиамин (OPD) або гідрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB));

(ii) лужна фосфатаза (AP) з пара-нитрофенилфосфатом як хромогенного субстрату;

(iii) β-D-галактозидаза (β-D-Gal) з хромогенним субстратом (наприклад, п-нітрофеніл-β-D-галактозид) або флуорогенним субстратом 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидом.

Фахівцям в даній області доступні інші численні поєднання фермент-субстрат. Для загального огляду, див. US 4275149 і US 4318980.

Мітку можна непрямо конъюгировать з бічним ланцюгом амінокислоти, активованої бічній ланцюгом амінокислоти, антитілом з вбудованими в нього залишками цистеїну і т. п. Наприклад, антитіло можна конъюгировать з біотином, а будь-яку з трьох широких категорій міток, згаданих вище, можна конъюгировать з авидином або стрептавидином, або навпаки. Біотин зв'язується селективно з стрептавидином і, таким чином, мітка може бути конъюгирована з антитілом таким непрямим чином. Альтернативно для досягнення непрямий кон'югації медін з різних типів позначок, згаданих вище, кон'югують з варіантом поліпептиду проти гаптену (наприклад, антитілом проти дигоксину). Таким чином, можна досягати непрямий кон'югації мітки з варіантом поліпептиду (Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).

Антитіло по справжньому винаходу можна використовувати в будь-якому відомому способі аналізу, такому як ELISA, конкурентні аналізи зв'язування, прямі і непрямі сендвіч-аналізи, аналізи иммунопреципитации (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).

Детектується мітка може бути придатна для локалізації, візуалізації та кількісного визначення зв'язування або розпізнавання. Мічені антитіла щодо винаходу можуть здійснювати детекцію рецепторів клітинної поверхні. Іншим застосуванням мічених піддається детекції міткою антитіл є спосіб імунного уловлювання на гранулах, що включає кон'югацію гранул з флуоресцентно меченним антитілом і детекцію флуоресцентного сигналу при зв'язуванні ліганда. У подібних способи детекції зв'язування використовується ефект поверхневого плазмонного резонансу (SPR) для вимірювання та детекції взаємодій антитіло-антиген.

Детектирующие мітки, такі як флуоресцентні барвники і хемилюмиеспечивают піддається детекції сигнал, і, як правило, застосовуються для мічення антитіл, переважно з наступними властивостями: (i) меченное антитіло має продукувати дуже високий сигнал при низькому фоні, так щоб можна було селективно виявити невеликі кількості антитіл як у бесклеточних, так і в клітинних аналізах; і (ii) меченное антитіло повинно бути фотостабильним, щоб можна було спостерігати, піддавати моніторингу і реєструвати флуоресцентний сигнал без істотного знебарвлення світлом. Для застосувань, які залучають зв'язування на клітинній поверхні міченого антитіла з мембранами або клітинними поверхнями, особливо живих клітин, мітки переважно (iii) мають хорошу розчинністю у воді для досягнення ефективної концентрації кон'югату та чутливості деткции і (iv) є нетоксичними для живих клітин, щоб не порушувати нормальні метаболічні процеси клітин або не викликати передчасну загибель клітин.

Пряме кількісне визначення інтенсивності флуоресценції клітин і підрахунок випадків флуоресцентного мічення, наприклад, для зв'язування з клітинною поверхнею кон'югатів пептид-барвник, можна проводити на системі (FMAT® HTS 8100 System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.), яка автом�cell - and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). Застосування мічених антитіл також включають аналізи зв'язування рецепторів клітинної поверхні, імунні аналізи уловлювання, пов'язані з флуоресценцією иммуносорбентние аналізи (FLISA), аналізи розщеплення каспазой (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907), аналізи апоптозу (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) і аналізи цитотоксичності. Технологію микрообъемного флуорометрического аналізу можна використовувати для ідентифікації позитивної або негативної регуляції за допомогою молекули, яка націлена на клітинну поверхню (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).

Мічені антитіла щодо винаходу придатні в якості біомаркерів для візуалізації та зондів в різних способах і технологіях біомедичної та молекулярної візуалізації, таких як: (i) MRI (магнітно-резонансна томографія); (ii) MicroCT (комп'ютерна томографія); (iii) SPECT (однофотонная емісійна комп'ютерна томографія); (iv) PET (позитронна емісійна томографія), Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) біолюмінесценції; (vi) флпри якому антитіла, мічені радіоактивними речовинами, вводять тварині або пацієнту-людині і роблять знімок областей організму, в яких локалізується антитіло (US 6528624). Біомаркери для візуалізації можна об'єктивно вимірювати і використовувати в якості показника нормальних біологічних процесів, патогенних процесів або фармакологічних відповідей на терапевтичне втручання. Біомаркери можуть бути декількох типів: біомаркери типу 0 являють собою природні маркери захворювання і вони прямо корелюють з відомими клінічними показниками, наприклад оцінкою допомогою MRI запалення синовіальної оболонки при ревматоїдному артриті; маркери типу I дають інформацію про ефект втручання у відповідності з механізмом дії, навіть хоча цей механізм не може бути асоційованим з клінічними наслідками; маркери типу II функціонують в якості заступників кінцевих результатів, де зміна биомаркера або сигнал биомаркера пророкує клінічну користь для "підтвердження" спрямованого відповіді, такі як виміряна за допомогою CT ерозія кістки при ревматоїдному артриті. Маркери для візуалізації, таким чином, можуть надати фармакодинамическую (PD) терапевтичну інформації�ii) фармакокінетичні дані про виведення і часу напівжиття. Переваги біомаркерів для візуалізаціїin vivoщодо лабораторних маркерів включають: неінвазивне введення, що піддається кількісному вимірюванню оцінку організму, повторювані дозування і оцінку, тобто оцінку в кілька моментів часу, і потенційно переносяться ефекти від доклінічних (невеликі тварини) до клінічних (осіб) результати. Для деяких застосувань, біологічна візуалізація замінює або мінімізує ряд експериментів на тварин у доклінічних дослідженнях.

Способи мічення пептидів добре відомі. См. Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al. (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin і New York; Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, FIa.); De Leon-Rodriguez et al. (2004) Chem.Eur. J. 10: 1149-1155; Lewis et al. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 110-115; Mier et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16: 240-237.

Пептиди і білки, мічені двома групами, флуоресцентним репонции (FRET). Репортерние групи, як правило, являють собою флуоресцентні барвники, які збуджуються під дією світла при певній довжині хвилі переносять енергію на групу акцептора, або тушителя, з відповідним зсувом Стокса для випускання при максимальній яскравості. Флуоресцентні барвники включають молекули з великими ароматичними групами, такими як флуоресцеин і родамін, і їх похідні. Флуоресцентний репортер може частково або в значній мірі тушкуватися групою тушителя в інтактному пептиді. При розщепленні пептиду пептидазой або протеази, можна вимірювати піддається детекції збільшення флуоресценції (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248: 18-34).

Мічені антитіла щодо винаходу також можна використовувати в якості засобу для афінної очистки. У цьому процесі, меченое антитіло мобілізують на твердій фазі, такий як смола Sephadex або фільтрувальний папір, з використанням способів, добре відомих в даній області. Иммобилизованное антитіло контактують із зразком, містять антиген, що підлягає очищенню, а потім підкладку промивають відповідним розчинником, який видаляє по суті весь матеріал в зразку, за винятком омивають іншим відповідним розчинником, таким як глициновий буфер, pH 5,0, який вивільняє антиген від варіанту поліпептиду.

Реагенти для мічення, як правило, мають реакційної функціональною групою, яка може реагувати (i) прямо з тіольної групою цистеїну в антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну з утворенням міченого антитіла, (ii) з линкерним реагентом з утворенням проміжного з'єднання лінкер-мітка, або (iii) з линкерним антитілом з утворенням міченого антитіла. Реактивні функціональні групи реагентів для мічення включають: малеимид, галоацетил, сукцинимидильний складний ефір йодацетамида (наприклад, NHS, N-гидроксисукцинимид), изотиоцианат, сульфонилхлорид, 2,6-дихлортриазинил, пентафторфениловий складний ефір і фосфорамидит, хоча можна також використовувати інші функціональні групи.

Ілюстративна реактивна функціональна група являє собою N-гидроксисукцинимидильний складний ефір (NHS) заступника карбоксильної групи піддається детекції мітці, наприклад, біотин або флуоресцентний барвник. Складний ефір NHS і мітки можна попередньо отримувати, виділяти, очищати і/або охарактеризовувати, або його можна утворюватиin situі піддавати реакції з нуклеофільної диимидного реагенту, наприклад, дициклогексилкарбодиимидного, диизопропилкарбодиимидного або уранового реагенту, наприклад TSTU (O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторбората, HBTU (O-бензотриазол-1-іл)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата) або HATU (O-(7-азабензотриазол-1-іл)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата), активатора, такого як 1-гидроксибензотриазол (HOBt), і N-гидроксисукцинимида з отриманням складного ефіру NHS і мітки. У деяких випадках, мітку й антитіло можна пов'язувати допомогою активаціїin situмітки та реакції з антитілом з утворенням кон'югату мітка-антитіло за одну стадію. Інші активуючі і зв'язують реагенти включають TBTU (2-(1H-бензотриазо-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат), TFFH (N,N',N",N'"-тетраметилурония 2-фторгексафторфосфат), PyBOP (бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфония гексафторфосфат, EEDQ (2-етокси-1-етоксикарбоніл-1,2-дигидрохинолин), DCC (дициклогексилкарбодіімід); DIPCDI (диизопропилкарбодиимид), MSNT (1-(мезитилен-2-сульфоніл)-3-нітро-1H-1,2,4-триазол, і арилсульфонилгалогениди, наприклад, триизопропилбензолсульфонилхлорид.

З'єднання альбумін-зв'язуючий пептид-Fab щодо винаходу:

В одному аспекті антитіло щодо винаходу є злитим з альбумін-связив�ств короткоживучих молекул. Альбумін являє собою найбільш поширений білок в плазмі. Зв'язують сироватковий альбумін пептиди (ABP) можуть змінювати фармакодинаміку злитих з активним доменом білків, включаючи зміну захоплення, проникнення і дифузії в тканини. Ці фармакодинамічні параметри можна модулювати шляхом спеціального вибору відповідних зв'язують сироватковий альбумін пептидних послідовностей (US 20040001827). Ряд альбумін-зв'язуючих пептидів був ідентифікований скринінгом фагового дисплею (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Protrins" J Товарbiol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). З'єднання по винаходу включають послідовність ABP, описані: (i) Dennis et al. (2002) J Товарbiol Chem. 277:35035-35043 в таблицях III і IV, стор 35038; (ii) US 20040001827 в SEQ ID NO:9-22; і (iii) WO 01/45746 на сторінках 12-13, всі з яких включені в справжній документ в якості посилань. Альбумін-зв'язуючий пептид(ABP)-Fab конструюють злиттям альбумін-зв'язуючого пептиду з C-кінцем важкої ланцюга Fab в стехіометричному співвідношенні 1:1 (1 ABP/1 Fab). Було показано, що зв'язування цих ABP-Fab з альбуміном підвищує час напівжиття антитіла більш ніж в 25 разів у кроликів і мишей. Таким чином, описані вище реактивні залишки Cys можна вбудовувати в ці ABP-Fab і використ�иями на тваринin vivo.

Ілюстративні послідовності альбумін-зв'язуючих пептидів включають, але не обмежуються ними, амінокислотні послідовності, наведені в SEQ ID NO:80-84:

CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDFSEQ ID NO:80
QRLMEDICLPRWGCLWEDDFSEQ ID NO:81
QRLIEDICLPRWGCLWEDDFSEQ ID NO:82
RLIEDICLPRWGCLWEDDSEQ ID NO:83
DICLPRWGCLWSEQ ID NO:84

Кон'югати антитіло-лікарський засіб

В іншому аспекті винахід відноситься до иммуноконъюгатам, або конъюгатам антитіло-лікарський засіб (ADC), що містить антитіло, конъюгированное з цитотоксичним засобом, таким як хіміотерапевтичне засіб, лікарський засіб, інгібуючу зростання засіб, токсин (наприклад, ферментативно активний токсин бактерій, грибів, рослин чи тварин, або його фрагменти), або радіоактивний ізотоп (тобто, радиоконъюгат). В іншому аспекті винаходу, крім того, передбачаються способи застосування иммуноконъю�е з цитотоксичним засобом або піддається детекції з'єднанням.

В одному аспекті антитіло проти CD79b щодо винаходу пов'язується з тим же эпитопом CD79b, який зв'язується іншим антитілом проти CD79b. В іншому варіанті здійснення, антитіло проти CD79b щодо винаходу пов'язується з тим же эпитопом на CD79b, який зв'язується Fab-фрагмент моноклонального антитіла, отриманого з гібридом, депонованих в ATCC як PTA-7712 11 липня 2006 року, моноклональним антитілом, що містить вариабельние домени SEQ ID NO:10 (фігура 7) і SEQ ID NO:14 (фігури 8A-B) або химерною антитілом, що містить або вариабельние домени антитіла, отриманого з гібридом PTA-7712, депонованих в ATCC 11 липня 2006 року, і константние домени з IgG1, або вариабельние домени моноклонального антитіла, які містять послідовності SEQ ID NO:10 (фігура 7) і SEQ ID NO:14 (фігури 8A-B). В іншому варіанті здійснення, антитіло проти CD79b щодо винаходу пов'язується з тим же эпитопом на CD79b, який зв'язується іншим антитілом проти CD79b (тобто, CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT 107-2 (AbD Serotec, каталожний #MCA2209), антитілом проти CD79b людини (BD Biosciences, каталожний #557592; San Jose, CA)).

В іншому аспекті антитіло проти CD79b щодо винаходу зв'язується з эпитопом на CD79b, відмінним від епітопу, зв'язаного іншим анти�а CD79b, відмінним від епітопу, зв'язаного Fab-фрагмент моноклонального антитіла, отриманого з гібридом, депонованих в ATCC як PTA-7712 11 липня 2006 року, моноклонального антитіла, що містить вариабельние домени SEQ ID NO:10 (фігура 7) і SEQ ID NO:14 (фігури 8A-B), або химерного антитіла, що містить або вариабельние домени антитіла, отриманого з гібридом PTA-7712, депонованих в ATCC 11 липня 2006 року, і константние домени з IgG1, або вариабельние домени моноклонального антитіла, що містить послідовності SEQ ID NO:10 (фігура 7) і SEQ ID NO:14 (фігури 8A-B). В іншому варіанті здійснення, антитіло проти CD79b щодо винаходу пов'язує епітоп на CD79b, відмінний від епітопи на CD79b, зв'язаного іншим антитілом проти CD79b (тобто, CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT 107-2 (AbD Serotec, каталожний #MCA2209), антитілом проти CD79b людини (BD Biosciences, каталожний #557592; San Jose, CA)).

В іншому аспекті антитіло проти CD79b щодо винаходу відрізняється від (тобто, не є ним) Fab-фрагменти моноклонального антитіла, отриманого з гібридом, депонованих в ATCC як PTA-7712 11 липня 2006 року, моноклонального антитіла, що містить вариабельние домени SEQ ID NO:10 (фігура 7) і SEQ ID NO:14 (фігури 8A-B), або химерного антитіла, що містить або варіатор�и з IgG1, або вариабельние домени моноклонального антитіла, що містить послідовності SEQ ID NO:10 (фігура 7) і SEQ ID NO:14 (фігури 8A-B). В іншому варіанті здійснення, антитіло проти CD79b щодо винаходу відрізняється від (тобто, не є ним) Fab-фрагменти іншого антитіла проти CD79b (тобто, CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec каталожний #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec, каталожний #MCA2209), антитілом проти CD79b людини (BD Biosciences, каталожний #557592; San Jose, CA)).

В одному аспекті антитіло щодо винаходу специфічно зв'язується з CD79b першого виду тварин, і не специфічно зв'язується з CD79b другого виду тварин. В одному варіанті здійснення, першим видом тварин є людина та/або примат (наприклад, яванська макака), а другим видом тварин є вид мишачих (наприклад, миша) та/або собачих. В одному варіанті здійснення, першим видом тварин є людина. В одному варіанті здійснення, першим видом тварин є примат, наприклад яванський макак. В одному варіанті здійснення, другим видом тварини є вид мишачих, наприклад мишу. В одному варіанті здійснення, другим видом тварин є вид собачих.

В одному аспекті винахід відноситься до композицій, що містять одне або декілька аним.

В одному аспекті винахід відноситься до нуклеїнових кислот, кодирующим антитіло проти CD79b щодо винаходу.

В одному аспекті винахід відноситься до векторів, що містить нуклеїнову кислоту по винаходу.

В одному аспекті винахід відноситься до клітин-господарів, що містить нуклеїнову кислоту або вектор щодо винаходу. Вектор може представляти собою вектор будь-якого типу, наприклад, рекомбінантний вектор, такий як экспрессирующий вектор. Можна використовувати будь-які з безлічі клітин-господарів. В одному варіанті здійснення, клітиною-господарем є прокариотическая клітка, наприклад,E. coli. В одному варіанті здійснення, клітиною-господарем є эукариотическая клітка, наприклад, клітина ссавців, така як клітина яєчника китайського хом'яка (СНО).

В одному аспекті винахід відноситься до способів одержання антитіла щодо винаходу. Наприклад, винахід відноситься до способу отримання антитіла проти CD79b (яке, як зазначено в цьому документі, включає повнорозмірне антитіло і його фрагменти), причому зазначений спосіб включає експресію у відповідній клітині-хазяїні рекомбінантного вектора по винаходу, що кодує зазначене антитіло (або його фрагмент�єр; і до композиції, що міститься в контейнері, де композиція містить одне або кілька антитіл проти CD79b щодо винаходу. В одному варіанті здійснення, композиція містить нуклеїнову кислоту по винаходу. В одному варіанті здійснення, композиція, що містить антитіло, додатково містить носій, який в деяких варіантах здійснення є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення, виріб щодо винаходу додатково включає інструкції по введенню композиції (наприклад, антитіла) індивіду.

В одному аспекті винахід відноситься до набору, містить перший контейнер, що містить композицію, що містить одне або кілька CD79b антитіл щодо винаходу; і другий контейнер, що містить буфер. В одному варіанті здійснення, буфер є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення, композиція, що містить антитіло-антагоніст додатково містить носій, який в деяких варіантах здійснення є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення, набір додатково включає інструкції по введенню композиції (наприклад, антитіла) індивіду.

В одному аспекті винахід відноситься до застосування антителеского лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення. В одному варіанті здійснення, злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення обрані з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецидивуючої вялотекущей NHL, рефрактерної NHL, рефрактерної вялотекущей NHL, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волосатоклеточного лейкозу (HCL), гострого лімфоцитарного лейкозу (ALL) та лімфоми з клітин мантійній зони.

В одному аспекті винахід відноситься до застосування нуклеїнової кислоти по винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення. В одному варіанті здійснення, злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення обрані з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецидивуючої вялотекущей NHL, рефрактерної NHL, рефрактерної вялотекущей NHL, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волохатий�пекте винахід відноситься до застосування экспрессирующего вектора по винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення. В одному варіанті здійснення, злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення обрані з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецидивуючої вялотекущей NHL, рефрактерної NHL, рефрактерної вялотекущей NHL, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волосатоклеточного лейкозу (HCL), гострого лімфоцитарного лейкозу (ALL) та лімфоми з клітин мантійній зони.

В одному аспекті винахід відноситься до застосування клітини-господаря щодо винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення. В одному варіанті здійснення, злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення обрані з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецидивуючої вялотекущей NHL, рефрактерної NHL, рефрактерної вялотекущей NHL, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волосатоклет� винахід відноситься до застосування виробу щодо винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення. В одному варіанті здійснення, злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення обрані з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецидивуючої вялотекущей NHL, рефрактерної NHL, рефрактерної вялотекущей NHL, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волосатоклеточного лейкозу (HCL), гострого лімфоцитарного лейкозу (ALL) та лімфоми з клітин мантійній зони.

В одному аспекті винахід відноситься до застосування набору винаходу для виготовлення лікарського засобу для терапевтичного та/або профілактичного лікування захворювання, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення. В одному варіанті здійснення, злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинно-проліферативне порушення обрані з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецидивуючої вялотекущей NHL, рефрактерної NHL, рефрактерної вялотекущей NHL, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волосатоклеточного л�ок в ток відноситься до способу інгібування росту клітини, яка экспрессирует CD79b, причому зазначений спосіб включає контактування зазначеної клітини з антитілом щодо винаходу, тим самим викликаючи інгібування росту зазначеної клітини. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу медикаментозного лікування ссавця, має злоякісну пухлину, яка містить клітку, яка экспрессирует CD79b, причому зазначений спосіб включає введення вказаною ссавцю терапевтично ефективного кількості антитіла щодо винаходу, тим самим ефективно здійснюючи лікування зазначеного ссавця. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу лікування або профілактики клітинно-проліферативного порушення, асоційованого з підвищеною експресією CD79b, причому зазначений спосіб включає введення індивіду, нужденному в такому лікуванні, ефективного кількість антитіла за винаходи. В одному варіанті здійснення, зазначене проліферативне порушення являє собою злоякісну пухлину. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу інгібування росту клітини, де зростання зазначеної клітини щонайменше частково залежить від ефекту CD79b на посилення росту, причому зазначений спосіб включає контактування клітини з ефективним кількістю антитіла щодо винаходу, тим самим інгібуючи зростання зазначеної клітини. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу медикаментозного лікування пухлини у ссавця, де зростання зазначеної пухлини щонайменше частково залежить від ефекту CD79b на посилення росту, причому зазначений спосіб включає контактування клітини з ефективним кількістю антитіла щодо винаходу, тим самим ефективно здійснюючи лікування зазначеної пухлини. В одному варіанті здійснення, антитіло до�щим зростання засобом.

В одному аспекті винахід відноситься до способу лікування злоякісної пухлини, що включає введення пацієнту фармацевтичного складу, що містить иммуноконъюгат, описаний у цьому документі, прийнятний розчинник, носій або эксципиент. В одному варіанті здійснення, злоякісна пухлина обрана з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецидивуючої вялотекущей NHL, рефрактерної NHL, рефрактерної вялотекущей NHL, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волосатоклеточного лейкозу (HCL), гострого лімфоцитарного лейкозу (ALL) та лімфоми з клітин мантійній зони. В одному варіанті здійснення, пацієнту вводять цитотоксична засіб у поєднанні з з'єднанням кон'югату антитіло-лікарський засіб.

В одному аспекті винахід відноситься до способу інгібування проліферації B-клітин, що включає вплив на клітину иммуноконъюгатом, що містить антитіло щодо винаходу, в умовах, що дозволяють зв'язування иммуноконъюгата з CD79b. В одному варіанті здійснення, проліферація B-клітин обрана з лімфоми, неходжкінської лімфоми (НХЛ), агресивної NHL, рецидивуючої агресивної NHL, рецид�LL), мелколимфоцитарной лімфоми, лейкемії, волосатоклеточного лейкозу (HCL), гострого лімфоцитарного лейкозу (ALL) та лімфоми з клітин мантійній зони. В одному варіанті здійснення, B-клітина являє собою ксенотрансплантати. В одному варіанті здійснення, вплив відбуваєтьсяin vitro. В одному варіанті здійснення, вплив відбуваєтьсяin vivo.

В одному аспекті винахід відноситься до способу визначення наявності CD79b в зразку, імовірно містить CD79b, причому зазначений спосіб включає вплив на вказаний зразок антитілом щодо винаходу, і визначення зв'язування зазначеного антитіла з CD79b у зазначеному зразку, де зв'язування зазначеного антитіла з CD79b у зазначеному зразку вказує на наявність зазначеного білка в зазначеному зразку. В одному варіанті здійснення, зразок являє собою біологічний зразок. У наступному варіанті здійснення, біологічний зразок містить B-клітини. В одному варіанті здійснення, біологічний зразок являє собою зразок від ссавця, страждає або імовірно страждає B-клітинним порушенням і/або B-клітинно-проліферативним порушенням, включаючи, але не обмежуючись ними, лімфому, неходжскинскую лимфоЀную повільну NHL, хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), мелколимфоцитарную лімфому, лейкоз, волосатоклітинний лейкоз (HCL), гострий лімфоцитарний лейкоз (ALL) і лімфому з клітин мантійній зони.

В одному аспекті винахід відноситься до способу діагностики клітинно-проліферативного порушення, асоційованого із збільшенням кількості клітин, таких як B-клітини, що експресують CD79b, причому спосіб включає конактирование досліджуваних клітин в біологічному зразку з будь-яким із зазначених вище антитіл; визначення рівня антитіл, пов'язаних з досліджуваними клітинами в зразку, шляхом детекції зв'язування антитіла з CD79b; і порівняння з рівнем антитіла, що зв'язався з клітинами в контрольному зразку, де рівень зв'язався антитіла нормалізують щодо кількості клітин, що експресують CD79b, в тестованому та контрольному зразках, і де більш високий рівень зв'язався антитіла в тестованому зразку порівняно з контрольним зразком вказує на наявність клітинно-проліферативного порушення, пов'язаного з клітинами, экспрессирующими CD79b.

В одному аспекті винахід відноситься до способу детекції розчинної CD79b в крові або сироватці, причому спосіб включає контактування досліджуваного обра�єм, з антитілом проти CD79b по винаходу і детекцію підвищення вмісту розчинного CD79b в тестованому зразку щодо контрольного зразка крові або сироватки від здорового ссавця. В одному варіанті здійснення, спосіб детекції придатний як способу діагностики B-клітинно-проліферативного порушення, асоційованого із збільшенням вмісту розчинного CD79b в крові або сироватці ссавця.

В одному аспекті винахід відноситься до способу зв'язування антитіла з винаходу з клітиною, яка экспрессирует CD79b, причому зазначений спосіб включає контактування зазначеної клітини з антитілом щодо винаходу. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення, антитіло конъюгировано з інгібуючим зростання засобом.

Способи винаходу можна застосовувати для впливу на будь-яке підходяще патологічний стан, наприклад, на клітини і/або тканини, асоційовані з експресією CD79b. В одному варіанті здійснення, клітини, на які спрямований спосіб за винаходом, являють собою гемопоетичні клітини. Наприклад, гемопоетічна клітина може представляти собою клітку, обрану з групЂе здійснення, клітина, на яку спрямований спосіб за винаходом, являє собою B-клітку або T-клітку. В одному варіанті здійснення, клітинка, на яку спрямований спосіб за винаходом, являє собою злоякісну клітину. Наприклад, злоякісна клітина може представляти собою клітку, обрану з групи, що складається з клітини лімфоми, клітини лейкозу або клітини мієломи.

Способи винаходу, крім того, можуть включати додаткові стадії лікування. Наприклад, в одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає стадію, де клітку-мішень та/або тканину-мішень (наприклад, злоякісну клітину) піддають радіаційного опромінення або дії хіміотерапевтичного засобу.

Як описано в цьому документі, CD79b являє собою компонент передачі сигналу B-клітинного рецептора. Таким чином, в одному варіанті здійснення способів винаходу, клітинка, на яку здійснюється націлювання (наприклад, злоякісна клітина) являє собою клітку, в якій експресується CD79b, порівняно з клітиною, яка не экспрессирует CD79b. У наступному варіанті здійснення, клітина-мішень являє собою злоякісну клітину, в якій експресія CD79b усиле�осіб щодо винаходу викликає загибель клітини-мішені.

В інших аспектах цього винаходу, винахід відноситься до векторів, що містять ДНК, що кодує одну з антитіл, описаних у цьому документі. Також передбачається клітина-господар, що містить будь-такий вектор. В якості прикладу, клітини-господарі можуть представляти собою клітини CHO, клітиниE. coliабо клітини дріжджів. Крім того, передбачається процес продукції антитіл, описаних у цьому документі, та він включає культивування клітин-господарів в умовах, відповідних для експресії необхідного антитіла і виділення потрібного антитіла з клітинної культури.

В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить антитіло проти CD79b, як описано в цьому документі, в поєднанні з носієм. Необов'язково, носієм є фармацевтично прийнятний носій.

Інший аспект цього винаходу відноситься до застосування антитіла проти поліпептиду CD79b, як описано в цьому документі, для виготовлення лікарського засобу, придатного для лікування стану, яке відповідає на антитіло проти поліпептиду CD79b.

Інший аспект винаходу відноситься до композиції, що містить суміш сполук антитіло-лікарський засіб формули I, р�чи приблизно від 3 до приблизно 4.

Інший аспект винаходу відноситься до фармацевтичної композиції, що включає з'єднання ADC формули I, суміш сполук ADC формули I, або їх фармацевтично прийнятну сіль або сольват, і фармацевтично прийнятний розчинник, носій або эксципиент.

Інший аспект відноситься до фармацевтичного поєднанню, що включає з'єднання ADC формули I і друге з'єднання, що володіє властивостями, спрямованими проти злоякісної пухлини, або іншими терапевтичними ефектами.

Інший аспект відноситься до способу знищення або інгібування проліферації пухлинних клітин або злоякісних клітин, що включає обробку клітин такою кількістю кон'югату антитіло-лікарський засіб формули I, або його фармацевтично прийнятною солі або сольвата, яке є ефективним для знищення або інгібування проліферації пухлинних клітин або злоякісних клітин.

Інший аспект відноситься до способу лікування злоякісної пухлини, що включає введення пацієнту терапевтично ефективного кількості фармацевтичної композиції, що включає ADC формули I.

Інший аспект відноситься до виробів, тобто до наборів, що містять кон'югат антитіло-лікарський коштів до способу отримання з'єднання кон'югату антитіла-лікарський засіб формули I, включає стадії: (a) проведення реакції групи вбудованого цистеїну антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з линкерним реагентом з утворенням проміжного з'єднання антитіло-лінкер Ab-L; і (b) проведення реакції Ab-L з активованою групою лікарського засобу D; тим самим отримуючи кон'югат антитіло-лікарський засіб; або включає стадії: (c) проведення реакції нуклеофільної групи в групі лікарського засобу з линкерним реагентом з утворенням проміжного з'єднання лікарський засіб-лінкер D-L; і (d) проведення реакції D-L з групою вбудованого цистеїну в антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну; тим самим отримуючи кон'югат антитіло-лікарський засіб.

Один аспект винаходу відноситься до аналізу для детекції злоякісних клітин, що включає: (a) вплив на клітини кон'югату антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну і лікарського засобу; і (b) визначення ступеня зв'язування з'єднання кон'югату антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу з клітинами.

A. Антитіла проти CD79b

В одному варіанті здійснення, даний винахід відноситься до Ўстративние антитіла включають поліклональні, моноклональні, гуманізовані, биспецифические антитіла і гетероконъюгати антитіл.

1. Поліклональні антитіла

Поліклональні антитіла переважно індукують у тварин багаторазовими підшкірними (sc) або внутрибрюшинними (ip) ін'єкціями відповідного антигену і ад'юванта. Може бути підходящою кон'югація відповідного антигену (особливо коли використовують синтетичні пептиди) з білком, який є иммуногенним у видів, що підлягають імунізації. Наприклад, антиген можна конъюгировать з гемоцианином лімфи равлики (KLH), сироватковим альбуміном, бичачим тиреоглобулином, або інгібітором трипсину сої, з використанням бифункционального або утворює похідне агента, наприклад, складного ефіру малеимидобензоилсульфосукцинимида (кон'югація через залишки цистеїну), N-гидроксисукцинимида (через залишки лізину), глутаральдегід, бурштинового ангідриду, SOCl2, або R1N=C=NR, де R і R1є відмінними алкільних групами.

Тварин імунізують проти антигену, імуногенних кон'югатів або похідних комбінуванням, наприклад, 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югату (для кроликів або мишей, відповідно) з 3 обсягами повного ад'юванта Фрей�цію від 1/5 до 1/10 від вихідного кількості пептиду або кон'югату в повному адъюванте Фрейнда допомогою підшкірної ін'єкції в кілька областей. Через від семи до 14 діб, у тварин проводять забір крові та сироватку аналізують щодо титру антитіл. Тваринам проводять повторні імунізації до досягнення титрами плато. Кон'югати також можна отримувати в рекомбінантної клітинній культурі в якості білкових злитих молекул. Також, для посилення імунної відповіді відповідним чином використовують викликають агрегацію засоби, такі як галун.

2.Моноклональні Антитіла

Моноклональні антитіла можна отримувати з використанням способу гібридом, вперше описаного Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975), або їх можна отримувати способами рекомбінантних ДНК (патент США No. 4816567).

У способі гібридом, миша або іншого відповідного тварини-господаря, такого як хом'як, імунізують, як описано вище, для отримання лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які специфічно зв'язуються з білком, використовуваним для імунізації. Альтернативно лімфоцити можна імунізуватиin vitro. Після імунізації лімфоцити виділяють, а потім піддають злиття з мієломної клітинною лінією з використанням відповідного засобу, що викликає злиття клітин, такого як поліетиленгліколь, з отриманням гибридомних клітин (Goding, Мощивают відповідної культуральному середовищі, яка переважно містить одне або кілька речовин, які інгібують зростання або виживання неслитих вихідних клітин мієломи (також званих партнерами по злиттю). Наприклад, якщо вихідні клітини мієломи позбавлені ферменту гіпоксантин-гуанін-фосфорибозил-трансферази (HGPRT або HPRT), селективна культуральна середовище для гібридом, як правило, включає речовини гіпоксантин, аминоптерин і тимидин (середа HAT), які перешкоджають росту клітин, дефіцитних за HGPRT.

Кращі миеломние клітини-партнери представляють собою клітини, які ефективно піддаються злиття, які підтримують стабільно високий рівень продукції антитіл відібраними антителопродуцирующими клітинами і є чутливими до селективному середовищі, яка здійснює селекцію проти неслитих вихідних клітин. Переважними миеломними клітинними лініями є лінії мієломи мишей, такі як лінії, отримані з пухлин мишей MOPC-21 і MPC-11, доступні в Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, і клітини SP-2 і похідні, наприклад, X63-Ag8-653, доступні в American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Також для продукції моноклональних антитіл людини описані миеломние клітинні лінії людини і лінії гетеромиел�/p>

Культуральне середовище, в якому вирощують гибридомние клітини, оцінюють на продукцію моноклональних антитіл, спрямованих проти антигену. Переважно, специфічність зв'язування моноклональних антитіл, що продукуються гибридомними клітинами, визначають за допомогою иммунопреципитации або аналізу зв'язуванняin vitro, такого як радиоиммунний аналіз (RIA) або твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA).

Афінність зв'язування моноклонального антитіла можна визначати, наприклад, за допомогою аналізу Скэтчарда, описаного в Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Після ідентифікації гибридомних клітин, які продукують антитіла до необхідної специфічністю, аффинностью та/або активністю, клони можна субклонировать способами лімітуючих розведень і вирощувати стандартними способами (Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Відповідні для цієї мети культуральні середовища включають, наприклад, середу D-MEM або RPMI-1640. Крім того, гибридомние клітини можна вирощуватиin vivoу тварин як асцитних пухлин, наприклад, за допомогою ін'єкції клітин мишам.

Моноклональні антитіла, секретируемие субклонами, відповідним способом виділяють з культурального середовища, асцитної рідин та си�ример, хроматографія з використанням системи білок A або білок G-сефароза) або іонообмінна хроматографія, хроматографія з гидроксилапатитом, гель-електрофорез, діаліз і т. д.

ДНК, що кодує моноклональні антитіла, легко виділяють і секвенируют з використанням загальноприйнятих способів (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні специфічно зв'язуватися з генами, кодирующими важкі і легкі ланцюги антитіл миші). Гибридомние клітини служать в якості пріоритетного джерела такої ДНК. Для забезпечення синтезу моноклональних антитіл в рекомбінантних клітинах-хазяїнах, після виділення ДНК можна вбудовувати в експресують вектори, які потім трансфицируют в клітини-господарі, такі як клітиниE. coliклітини COS мавпи, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) або клітини мієломи, які в іншому випадку не продукують білок антитіла. Оглядові статті з рекомбінантної експресії в бактеріях ДНК, що кодує антитіло, включають Skerra et al.,Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) і Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

У наступному варіанті здійснення, моноклональні антитіла або фрагменти антитіл можна виділяти з фагових бібліотек антитіл, створених з використанням способів, опиѲиделение антитіл миші і людини, відповідно, з використанням фагових бібліотек. У більш пізніх публікаціях описано продукція високоафінних (нМ-порядок) антитіл людини за допомогою перестановки ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а також комбінаторної інфекції та рекомбінаціїin vivoв якості стратегії для конструювання дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et al.,Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким чином, ці способи є прийнятні альтернативи традиційним способам гибридомних моноклональних антитіл для виділення моноклональних антитіл.

Також ДНК, яка кодує антитіло, що можна модифікувати для одержання химерних або злитих поліпептидів антитіл, наприклад, за допомогою заміни послідовностями константного домену важкої і легкої ланцюга (CHі CL) людини гомологічними послідовностями миші (патент США No. 4816567; Morrison et al.,Proc. Natl Acad. Sci USA, 81:6851 (1984)), або злиття кодує імуноглобулін послідовності зі всієї кодує послідовністю для поліпептиду, не є імуноглобуліном, або її частиною (гетерологичний поліпептид). Послідовностями поліпептидів, які не є імуноглобулінами, замінюють константние домени антитіла, або ними зам�про антитіла, містить один антиген-зв'язуючий центр зі специфічністю до одного антигену та іншої антиген-зв'язуючий центр зі специфічністю до іншого антигену.

3.Антитіла людини і гуманізовані антитіла

Антитіла проти CD79b, крім того, можуть включати гуманізовані антитіла або антитіла людини. "Гуманізовані" форми антитіл не людини (наприклад, миші) являють собою химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їх фрагменти (такі як Fv, Fab, Fab', F(ab')2або інші антиген-зв'язувальні підпослідовності антитіл), які містять мінімальну послідовність, утворену з імуноглобуліну не людини. Гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципиентное антитіло), в яких залишки з визначальною комплементарність області (CDR) реципієнта замінені залишками CDR не відноситься до людини виду (донорное антитіло), такого як миша, щур або кролик, мають необхідну специфічність, афінність і ємність. У деяких випадках, залишки каркасної області Fv імуноглобуліну людини замінюють відповідними залишками не людини. Гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не зустрічаються ниованное антитіло буде містити по суті всі щонайменше з одного, і як правило, двох, варіабельних доменів, у яких всі або по суті всі з областей CDR відповідають CDR імуноглобуліну не людини, і всі або по суті всі з областей FR являють собою області FR консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло також в оптимальному випадку буде містити щонайменше частина константного ділянки (Fc) імуноглобуліну, як правило, константного ділянки імуноглобуліну людини [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Товарbiol. 2:593-596 (1992)].

Способи гуманізації антитіл, які не є людськими, описані в даній області. Як правило, гуманізоване антитіло володіє одним або декількома вбудованими в нього амінокислотними залишками з джерела, який не є людським. Такі не є людськими амінокислотні залишки часто називають "імпортними" залишками, які, як правило, взяті із "імпортної" змінної області. Гуманізацію, головним чином, можна проводити у відповідності зі способом Winter і колег [Jones et al.,Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536 (1988)], за допомогою заміни CDR або послідовностями CDR щури відпо�вляют собою химерні антитіла (патент США No. 4816567), де по суті менше цілої змінної області людини заміщено відповідною послідовністю виду, що не відноситься до людини. На практиці, гуманізовані антитіла, як правило, являють собою антитіла людини, в яких деякі залишки CDR і можливо деякі залишки FR замінені залишками з аналогічних ділянок антитіл гризунів.

Вибір варіабельних доменів людини, як легких, так і важких ланцюгів, для використання при отриманні гуманізованих антитіл є дуже важливим для зниження антигенності та відповіді HAMA (антитіла людини проти антитіл миші), коли антитіло призначене для терапевтичного застосування у людини. Зниження або усунення відповіді HAMA є суттєвим аспектом клінічної розробки відповідних лікарських засобів. См., наприклад, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135: 1530; Sears et al., J. Товарbiol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147: 1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Як описано в цьому документі, винахід відноситься до антитілам, які є гуманизированними, так щоб відповідь HAMA знижувався або усувався. Варіанти цих антитіл, крім того, мо�щодо описані нижче. Згідно так званому способом "найкращої відповідності", послідовність вариабельного домену антитіла гризуна аналізують щодо цілої бібліотеки відомих послідовностей варіабельних доменів людини. Ідентифікують послідовність V-домену людини, яка є найбільш подібною з послідовністю гризуна, і каркасну область (FR) людини в ній беруть для гуманизированного антитіла (Sims et al.,J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al.,J. Mol. Товарbiol., 196:901 (1987)). В іншому способі використовують конкретну каркасну область, отриману з консенсусної послідовності всіх антитіл людини з конкретною підгрупи легких або важких ланцюгів. Одну і ту ж каркасну область можна використовувати для декількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:4285 (1992); Presta et al.,J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Наприклад, амінокислотна послідовність з антитіла, як описано в цьому документі, може служити в якості початкової (вихідної) послідовності для забезпечення різноманітності послідовності(їй) каркасної області та/або гипервариабельной послідовності(їй). Обрану послідовність каркасної області, з якою пов'язують вихідну гипервая акцепторні каркасні області можуть бути, чи можуть бути утворені з, імуноглобуліну людини (його VL - та/або VH-областей), переважно акцепторие каркасні області взято, або утворені, з консенсусної послідовності каркасної області людини, такий як каркасні області, які, як показано, володіють мінімальної иммуногенностью у пацієнтів-людей, або не мають їй.

Коли акцептор утворений з імуноглобуліну людини, необов'язково можна вибирати послідовність каркасної області людини, яка відібрана на основі її гомології з донорною послідовністю каркасної області шляхом вирівнювання донорної послідовності каркасної області з різними послідовностями каркасної області людини в колекції послідовностей каркасних областей людини, і найбільш гомологичную послідовність каркасної області можна вибирати в якості акцептора.

В одному варіанті здійснення, консенсусна каркасна область людину, описана в цьому документі, взята, або утворена, з консенсусних послідовностей каркасної області VH підгрупи III і/або VL каппа підгрупи I.

Таким чином, акцепторная каркасна область VH людини може містити одну, дві, три або всі з следQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:70),

FR3, що містить RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:73), де X1являє собою A R, X2являє собою T або N, X3являє собою A або L,

FR4, що містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:72).

Приклади консенсусних каркасних областей VH включають:

консенсусну каркасну область VH підгрупи I людини без CDR за Кабат (SEQ ID NO:36);

консенсусну каркасну область VH підгрупи I людини без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:37-39);

консенсусну каркасну область VH підгрупи II людину без CDR за Кабат (SEQ ID NO:40);

консенсусну каркасну область VH підгрупи II людину без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:41-43);

консенсусну каркасну область VH підгрупи III людини без CDR за Кабат (SEQ ID NO:44);

консенсусну каркасну область VH підгрупи III людини без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:45-47);

акцепторную каркасну область VH людини без CDR за Кабат (SEQ ID NO:48);

акцепторную каркасну область VH людини без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO:49-50);

акцепоторную каркасну область 2 VH людини без CDR за Кабат (SEQ ID NO:51); або

акцепоторную каркасну область 2 VH людини без подовжених гипервариабельних областей (SEQ ID NO: всі з наступних послідовностей каркасних областей:

FR1, що містить EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:69),

FR2, що містить WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:70),

FR3, що містить RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:71),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:74),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:75),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO:76), або

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO:77)

FR4, що містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:72).

Акцепторная каркасна область VL людини може містити одну, дві, три або всі з наступних послідовностей каркасних областей:

FR1, що містить DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:65),

FR2, що містить WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:66),

FR3, що містить GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:67),

FR4, що містить FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:68).

Приклади консенсусних каркасних областей VL включають:

консенсусну каркасну область VL каппа підгрупи I людини (SEQ ID NO:55);

консенсусну каркасну область VL каппа підгрупи II людини (SEQ ID NO:56);

консенсусну каркасну область VL каппа підгрупи III людини (SEQ ID NO:57); або

консенсусну каркасну область VL каппа підгрупи IV людини (SEQ ID NO:58)

Хоча послідовність акцептора може бути ідентична обраної послідовності каркасної області людини, незалежно від того, взята вона з імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної області людини, даний винахід передбачає, послідовності імуноглобуліну людини чи консенсусної послідовності каркасної області людини. Ці раніше існуючі заміни переважно є мінімальними, як правило, складаючи лише чотири, три, два чи один відмінності в амінокислотах щодо послідовності імуноглобуліну людини чи консенсусної послідовності каркасної області.

Залишки гипервариабельной області антитіла, що не є антитілом людини, включають в акцепторні каркасні області VL та/або VH людини. Наприклад, можна включати залишки, які відповідають залишкам CDR за Кабат, залишкам гипервариабельних петель по Chothia, залишкам Abm та/або контактним залишкам. Необов'язково, включають наступні залишки подовженою гипервариабельной області: 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 або 49-65 (H2) і 93-102, 94-102 або 95-102 (H3).

Хоча "включення" залишків гипервариабельной області розглянуто в цьому документі, буде зрозуміло, що його можна забезпечувати різними способами, наприклад, нуклеїнову кислоту, що кодує необхідну аминокислотную послідовність, можна отримувати мутацією нуклеїнової кислоти, кодує послідовність вариабельного домену миші, так щоб його залишки каркасної області замінювалися залишками акцепторної каркасної області людини, або мутацією нуклеїнової кислотѰ замінювалися залишками, не є людськими, або синтезом нуклеїнової кислоти, кодує необхідну послідовність, і т. д.

У прикладах цього опису, отримували варіанти з пересадженою гипервариабельной областю шляхом мутагенезу способом Kunkel нуклеїнової кислоти, кодує акцепторні послідовності людини, з використанням окремого олигонуклеотида для кожної гипервариабельной області. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Відповідні зміни можна вносити в каркасну область та/або гипервариабельную область з використанням загальноприйнятих способів, для корекції і відновлення належних взаємодій гіперваріативна область-антиген.

Фаговий (фагмидний) дисплей (також званий в цьому документі фаговим дисплеєм в деяких контекстах) можна використовувати в якості зручного і швидкого способу отримання та скринінгу безлічі різноманітних потенційних варіантів антитіл в бібліотеці, отриманої рандомізацією послідовності. Однак спеціалісту доступні і інші способи отримання і скринінгу змінених антитіл.

Технологія фагового (фагмидного) дисплея забезпечує потужний інструмент для отримання і селекції нових білків, які зв'язуються з лииблиотеки варіантів білків, які можна швидко сортувати по тим послідовності, які зв'язуються з молекулою-мішенню з високою аффинностью. Нуклеїнові кислоти, що кодують варіанти поліпептидів, як правило, піддають злиття з послідовністю нуклеїнової кислоти, кодує білок вірусної оболонки, такий як білок гена III або білок гена VIII. Були розроблені одновалентні системи фагмидного дисплея, де послідовність нуклеїнової кислоти, кодує білок або поліпептид, піддають злиття з послідовністю нуклеїнової кислоти, кодує частина білка гена III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). У одновалентной системі фагмидного дисплея, злитий ген експресується на низьких рівнях і також експресуються білки гена III дикого типу, так що інфекційність частинок зберігається. Способи створення пептидних бібліотек та скринінгу цих бібліотек описані в багатьох патенти (наприклад, патент США No. 5723286, патент США No. 5432018, патент США No. 5580717, патент США No. 5427908 і патент США No. 5498530).

Бібліотеки антитіл або антиген-зв'язуючих поліпептидів отримують різними способами, включаючи зміну окремого гена вбудовуванням випадкових послідовностей ДНК або клонир�м фагового (фагмидного) дисплея описані в патентах США No. 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 і 5658727. Потім бібліотеку піддають скринінгу на експресію антитіл або антиген-зв'язуючих білків з необхідними характеристиками.

Способи заміни вибраних амінокислот у матричній нуклеїнової кислоти добре відомі в даній області, і деякі з них описані в цьому документі. Наприклад, залишки гипервариабельной області можна замінювати з використанням способу Kunkel. См., наприклад, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).

Послідовність олігонуклеотидів включає один або декілька з сконструйованих наборів кодонов для залишків гипервариабельной області, що підлягають зміні. Набір кодонов являє собою набір різних нуклеотидних триплетних послідовностей, що використовуються для кодування необхідних варіантів амінокислот. Набори кодонов можуть бути представлені з використанням символів для позначення конкретних нуклеотидів або эквимолярних сумішей нуклеотидів, як наведено нижче, згідно з кодом IUB.

КОДИ IUB

G Гуанін

A Аденін

T Тимін

C Цитозин

R (A або G)

Y (C або T)

M (A або C)

K (G або T)

S (C або G)

W (A або T)

H (A або C або T)

B (C або G або T)

V (A або C або G)

D (A або G або T) H

N (A або C або G і�обой A або G або C; і K може представляти собою G або T. Цей набір кодонов може відповідати 18 різних кодоном і може кодувати амінокислоти: Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly і Cys.

Набори олігонуклеотидів або праймерів можна синтезувати з використанням стандартних способів. Можна синтезувати набір олігонуклеотидів, наприклад, за допомогою твердофазного синтезу, що містить послідовності, які відповідають усім можливим поєднанням нуклеотидних триплетів, що забезпечуються набором кодонов і які кодують необхідну групу амінокислот. Синтез олігонуклеотидів з певною "вирожденностью" нуклеотидів у певних положеннях добре відомий в даній області. Такі набори нуклеотидів, які мають певні набори кодонов, можна синтезувати з використанням комерційних пристроїв для синтезу нуклеїнових кислот (доступних, наприклад, від Applied Biosystems, Foster City, CA), або їх можна отримувати комерційно (наприклад, від Life Technologies, Rockville, MD). Таким чином, набір синтезованих олігонуклеотидів, що мають конкретний набір кодонов, як правило, включає безліч олігонуклеотидів з різними послідовностями, причому відмінності визначаються набором кодонов по всій послідовності. Ол�цію з матричної нуклеїнової кислотою вариабельного домену, а також можуть включати ділянки для ферментів рестрикції для цілей клонування.

В одному способі послідовності нуклеїнових кислот, що кодують амінокислоти варіантів, можна створювати олигонуклеотид-опосредуемим мутагенезом. Цей спосіб добре відомий в даній області, як описано Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504(1987). У короткому викладі, послідовності нуклеїнових кислот, що кодують амінокислоти варіантів, створюють допомогою гібридизації набору олігонуклеотидів, що кодують необхідні набори кодонов, з ДНК-матрицею, де матриця являє собою одноцепочечную форму плазміди, що містить послідовність матричної нуклеїнової кислоти вариабельного ділянки. Після гібридизації використовують ДНК полімеразу для синтезу цілої другий ланцюга, комплементарної матриці, яка таким чином, включає олигонуклеотидний праймер, і містить набори кодонов, забезпечуються набором олігонуклеотидів.

Як правило, використовують олигонуклеотиди довжиною щонайменше 25 нуклеотидів. Оптимальний олигонуклеотид має від 12 до 15 нуклеотидів, які повністю комплементарни матриці з будь-якого боку від нуклеотиду(ів), що кодує мутацію(і). Це забезпечує належну гібридизацію олиЕпособов, відомих у цій галузі, таких як способи, описані Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).

ДНК-матрицю отримують або за допомогою векторів, які утворені з векторів бактеріофага M13 (придатними є комерційно доступні вектори M13mpl8 і M13mpl9), або за допомогою векторів, які містять оріджін реплікації одноцепочечного фага, як описано Viera et al., Meth. Enzymol, 153:3 (1987). Таким чином, ДНК, яка підлягає мутації, можна вбудовувати в один з цих векторів для отримання одноланцюгової матриці. Отримання одноланцюгової матриці описано в розділах 4.21-4.41 Sambrook et al., вище.

Для зміни нативної послідовності ДНК, олигонуклеотид гибридизуют з одноланцюговою матрицею у відповідних умовах гібридизації. Потім додають фермент для полімеризації ДНК, зазвичай ДНК-полімеразу T7 або фрагмент Кленова ДНК полімерази I, для синтезу ланцюга, комплементарної матриці, з використанням олигонуклеотида в якості праймера для синтезу. Таким чином, утворюється гетеродуплексная молекула, так що один ланцюг ДНК кодує мутантную форму гена 1, а інша ланцюг (вихідна матриця) кодує нативну немодифіковану послідовність гена 1. Потім цю гетеродуплексную молекулу трансформують у відповідну кл� агарозние планшети і піддають скринінгу з використанням олигонуклеотидного праймера, радіоактивно міченого 32-фосфатом для ідентифікації бактеріальних колоній, які містять мутантную ДНК.

Описаний вище спосіб можна модифікувати так, щоб утворювалася гомодуплексная молекула, де обидві ланцюга плазміди містять мутацію(і). Модифікації є наступними: одноцепочечний олигонуклеотид піддають відпалу з одноланцюговою матрицею, як описано вище. Суміш трьох дезоксирибонуклеотидов, дезоксирибоаденозина (dATP), дезоксирибогуанозина (dGTP) і дезоксириботимидина (dTT), комбінують з модифікованим тиодезоксирибоцитозином, званим dCTP-(aS) (який можна отримати в Amersham). Цю суміш додають у комплекс матриця-олигонуклеотид. При додаванні ДНК-полімерази до цієї суміші, що утворюється ланцюг ДНК, ідентична матриці, за винятком мутантних підстав. Крім того, ця нова ланцюг ДНК містить dCTP-(aS) замість dCTP, який служить для захисту його від рестрикційного розщеплення ендонуклеазою. Після розрізання матричної ланцюга двухцепочечного гетеродуплекса відповідним ферментом рестрикції, матричну ланцюг можна розщеплювати нуклеазой ExoIII або іншої підходящої нуклеазой позаду області, яка містить ділянку(ділянки), що підлягає мутагенезу. Потім реакцію зупиняють, �одуплексную ДНК з використанням ДНК-полімерази в присутності всіх чотирьох дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, ATP і ДНК-лігази. Потім цю гомодуплексную молекулу можна трансформувати у відповідну клітину-господаря.

Як зазначено раніше, послідовність олігонуклеотидів в наборі має довжиною, достатньою для гібридизації з матричної нуклеїнової кислотою, а також може, але не обов'язково, містити ділянки рестрикції. ДНК-матрицю можна отримувати за допомогою векторів, які утворені або з векторів бактеріофага M13, або з векторів, які містять оріджін реплікації одноцепочечного фага, як описано Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Таким чином, ДНК, яка підлягає мутації, повинна бути вбудована в один з цих векторів для отримання одноланцюгової матриці. Отримання одноланцюгової матриці описано в розділах 4.21-4.41 Sambrook et al., вище.

Згідно з іншим способом, можна відновлювати зв'язування антигену в процесі гуманізації антитіл за допомогою селекції репарированних гипервариабельних областей (див. заявку No. 11/061841, подану 18 лютого 2005 року). Спосіб включає вбудовування гипервариабельних областей, які не є людськими, в акцепторную каркасну область і, крім того, внесення однієї або декількох амінокислотних замін в одну або кілька гипервариабельних областей без модификац�отних замін може супроводжуватися модифікаціями в послідовності акцепторної каркасної області.

Згідно з іншим способом, бібліотеку можна створювати шляхом надання наборів вищерозташованих і нижчерозташованими олігонуклеотидів, причому кожен набір має безліч олігонуклеотидів з різними послідовностями, причому різні послідовності визначаються наборами кодонов, представленими в послідовності олігонуклеотидів. Набори вищерозташованих і нижчерозташованими олігонуклеотидів, разом з послідовністю матричної нуклеїнової кислоти вариабельного домену, можна використовувати в полімеразної ланцюгової реакції для створення "бібліотеки" продуктів ПЛР. Продукти ПЛР можуть називатися "касетами нуклеїнових кислот", оскільки їх можна піддавати злиття з іншими спорідненими або неспорідненими послідовностями нуклеїнових кислот, наприклад, для білків вірусної оболонки та доменів дімерізаціі, з використанням загальноприйнятих методів молекулярної біології.

Послідовність праймерів для ПЛР включає один або кілька сконструйованих наборів кодонов для доступних для розчинника і високо різноманітних положень гипервариабельной області. Як описано вище, набір кодонов являє собою набір різних послідовно� селекції антитіла, які відповідають необхідним критеріям, оскільки їх відбирають через відповідні стадії скринінгу/селекції, можна виділяти і клонувати з використанням стандартних рекомбінантних способів.

Крім того, важливо, щоб антитіла були гуманізувати зі збереженням високої афінності до антигену та інших позитивних біологічних властивостей. Для досягнення цієї мети, згідно з переважним способом, гуманізовані антитіла отримують за допомогою процесу аналізу вихідних послідовностей і різних передбачуваних гуманізованих продуктів з використанням тривимірних моделей вихідних і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів є широко доступними і відомі фахівцям в даній області. Доступними є комп'ютерні програми, які ілюструють і виводять на екран можливі тривимірні конформаційні структури вибраних послідовностей імуноглобулінів-кандидатів. Дослідження цих виведених на екран даних дозволяє проводити аналіз можливої ролі залишків у функціонуванні передбачуваних послідовностей імуноглобулінів, тобто, аналіз залишків, які впливають на здатність иммуноглоб�нтной та імпортної послідовностей таким чином, щоб були досягнуті необхідні властивості антитіл, такі як підвищена спорідненість до антигену(ам)-мішені. Як правило, залишки гипервариабельной області надають безпосереднє і найбільш значний вплив на зв'язування антигену.

Передбачено різні форми гуманізованих антитіл проти CD79b. Наприклад, гуманізоване антитіло може представляти собою фрагмент антитіла, такий як Fab, який необов'язково конъюгирован з одним або кількома цитотоксичним засобом(ами) для отримання иммуноконъюгата. Альтернативно гуманізоване антитіло може представляти собою интактное антитіло, таке як интактное антитіло IgG1.

В якості альтернативи гуманізації, можна отримати антитіла людини. Наприклад, в даний час можливим є отримання трансгенних тварин (наприклад, мишей), які здатні, при імунізації, продукувати повний набір антитіл людини у відсутності продукції ендогенних імуноглобулінів. Наприклад, було описано, що гомозиготная делеція гена ділянки сполуки важких ланцюгів імуноглобулінів (JH) у химерних мишей і мутантних мишей зародкової лінії призводить до повного інгібування продукції ендогенних антитіл. Перенесення системи ген�іі антитіл людини при антигенній стимуляції. См., наприклад, Jakobovits et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al.,Nature,362:255-258 (1993); Bruggermann et al.,Year in Immuno., 7:33 (1993); і патенти США No. 5545806, 5569825, 5591669 (всі GenPharm), 5545807; WO 97/17852.

Альтернативно для отримання антитіл людини і фрагментів антитілin vitroможна використовувати технологію фагового дисплею (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)), з наборів генів варіабельних (V) доменів імуноглобулінів неиммунизированних донорів. У відповідності з цим способом, гени V домену антитіл клонують в рамці зчитування головного або другорядного гена оболонки ниткоподібного бактеріофага, такого як M13 або fd, і вони експонуються в якості функціональних фрагментів антитіл на поверхні частки фага. Внаслідок того, що ниткоподібних частка містить одноцепочечную копію ДНК генома фага, селекція на основі функціональних властивостей антитіла також призведе до селекції гена, що кодує антитіло, яке виявляє такі властивості. Таким чином, фаг імітує деякі з властивостей B-клітини. Фаговий дисплей можна проводити в різних формах, розглянутих наприклад, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплею можна використовувати кілька джерел сегментів V-генів. Clackson et al.,Naбиблиотеки V-генів, отриманої з селезенок імунізованих мишей. Можна сконструювати набір V-генів з неиммунизированних донорів-людей і можна виділяти антитіла проти широкого набору антигенів (у тому числі проти власних антигенів), головним чином, у відповідності зі способами, описаними Marks et al.,J. Mol. Товарbiol. 222:581-597 (1991), або Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См., також, патенти США No. 5565332 і 5573905.

Як розглянуто вище, антитіла людини також можна отримувати за допомогою активованих B-клітинin vitro(див. патенти США 5567610 і 5229275).

4.Фрагменти антитіл

У деяких випадках переважним є використання фрагментів антитіл, замість цілих антитіл. Менший розмір фрагментів дозволяє швидке виведення, і може забезпечити кращий доступ до солідних пухлин.

Для отримання фрагментів антитіл були розроблені різні способи. Традиційно, ці фрагменти отримували шляхом протеолітичного розщеплення інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto et al.,Journal of Біохімічний and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); і Brennan et al.,Science, 229:81 (1985)). Однак ці фрагменти в даний час можна отримувати безпосередньо за допомогою рекомбінантних клітин-господарів. Fab-, Fv - і scFv-фрагменти антитіл можуть бути экспрессирова�нтов. Фрагменти антитіл можна виділяти з фагових бібліотек антитіл, описаних вище. Альтернативно фрагменти Fab'-SH можна виділяти безпосередньо зE. coliі хімічно пов'язувати з отриманням фрагментів F(ab')2(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Згідно з іншим підходом фрагменти F(ab')2можна виділяти безпосередньо з рекомбінантної культури клітин-господарів. Fab - і F(ab')2-фрагмент з підвищеним часом напівжиттяin vivo,містить залишки зв'язує рецептор порятунку епітопу, описаний в патенті США No. 5869046. Інші способи отримання фрагментів антитіл будуть очевидні кваліфікованого фахівця. В інших варіантах здійснення переважний для вибору антитіло являє собою одноцепочечний Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185; патент США No. 5571894; і патент США No. 5587458. Fv і sFv є єдиними типами з інтактними антиген-зв'язуючими ділянками, які позбавлені константних ділянок; таким чином, вони підходять для зниження неспецифічного зв'язування в ході застосуванняin vivo. Можна конструювати злиті з sFv білки з отриманням ефекторних білка або на N-, або на С - кінці sFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, вище. Фрагмент антитіла також може представляти собою "лінійне анти�і чи биспецифическими.

5.Биспецифические антитіла

Биспецифические антитіла являють собою антитіла, які мають специфічність зв'язування щонайменше двох різних епітопів. Ілюстративні биспецифические антитіла можуть зв'язуватися з двома різними эпитопами поліпептиду CD79b, описаного в цьому документі. Інші такі антитіла можуть поєднувати в собі зазначений вище ділянка зв'язування CD79b і ділянку(ки) зв'язування інших білків. Альтернативно плече проти CD79b можна комбінувати з плечем, яке пов'язується з критичної молекулою на лейкоцит, такий як молекула T-клітинного рецептора (наприклад CD3), або Fc-рецептори для IgG (FcγR), такі як FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) і FcγRIII (CD16), так щоб зосередити і локалізувати механізми клітинної захисту на експресують CD79b клітинах. Биспецифические антитіла можна також використовувати для локалізації цитотоксичних засобів в клітинах, які експресують CD79b. Ці антитіла мають CD79b-зв'язуючою плечем і плечем, яке пов'язує цитотоксична засіб (наприклад, сапорин, антитіло проти інтерферону-α, алкалоїд барвінку, A-ланцюг рицину, метотрексат або гаптен з радіоактивним ізотопом). Биспецифические антитіла можна отримувати як інта�специфічне антитіло проти ErbB2/FcγRIII, і в патенті США No. 5837234 описано биспецифическое антитіло проти ErbB2/FcγRI. Биспецифическое антитіло проти ErbB2/Fcα представлено в WO98/02463. У патенті США No. 5821337 описано биспецифическое антитіло проти ErbB2/CD3.

Способи отримання биспецифических антитіл відомі в даній області. Загальноприйнятий спосіб отримання інтактних биспецифических антитіл заснований на спільній експресії двох пар важка ланцюг-легка ланцюг імуноглобулінів, де два ланцюги володіють різною специфічністю (Millstein et al.,Nature,305:537-539 (1983)). Внаслідок випадкового складання важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, такі гибридоми (квадроми) потенційно продукують суміш з 10 різних молекул антитіл, з яких тільки одна має правильної биспецифичной структурою. Очищення правильних молекул, яку зазвичай проводять за допомогою стадій афінної хроматографії, є досить трудомісткою і вихід продукту є низьким. Аналогічні способи описані в WO 93/08829, і в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Згідно з іншим підходом проводять злиття варіабельних доменів антитіла до необхідної специфічність зв'язування (ділянками зв'язування антитіло-антиген) з послідовностями константних доменів імуноглобулінів. �ирной області, CH2 і CH3. Бажано, щоб принаймні один з компонентів, призначених для злиття, володів першим константним доменом важкої ланцюга (CH1), що містить ділянку, необхідний для зв'язування легкого ланцюга. ДНК, що кодує призначені для злиття компоненти важких ланцюгів імуноглобулінів і, якщо бажано, легкої ланцюга імуноглобуліну, вбудовують в окремі експресують вектори, і котрансфицируют у відповідний організм-господар. Це забезпечує значну гнучкість при регулюванні співвідношень трьох поліпептидних фрагментів один з одним у варіантах здійснення, де нерівні співвідношення трьох поліпептидних ланцюгів в конструкції забезпечує оптимальний вихід необхідного биспецифического антитіла. Однак можливим є вбудовування двох або всіх трьох поліпептидних ланцюгів в один экспрессирующий вектор, якщо експресія щонайменше двох поліпептидних ланцюгів у рівних співвідношеннях призводить до високого виходу продукту або якщо співвідношення не мають суттєвого впливу на необхідне поєднання ланцюгів.

У кращому варіанті здійснення цього підходу, биспецифические антитіла складаються з важкої ланцюга гібридного імуноглобуліну з одладающей іншою специфічністю зв'язування) на іншому плечі. Було виявлено, що така асиметрична структура полегшує поділ необхідного биспецифического з'єднання і небажаних поєднань ланцюгів імуноглобулінів, оскільки наявність легкого ланцюга імуноглобуліну тільки в одній половині биспецифичной молекули забезпечує легкий спосіб поділу. Цей підхід описаний в WO 94/04690. Для більш докладного опису отримання биспецифических антитіл див., наприклад, Suresh et al.,Methods in Enzymology,121:210 (1986).

Згідно з іншим підходом, описаному в патенті США No. 5731168, для максимального збільшення процентного кількості гетеродимеров, які виділяють з рекомбінантних клітинних культур можна сконструювати область контакту між парою молекул антитіл. Бажана область контакту містить щонайменше частина CH3-домену константного домену антитіла. У цьому способі, одну або кілька невеликих бічних ланцюгів амінокислот з області контакту першої молекули антитіла замінюють на більш великі бічні ланцюга (наприклад, тирозин або триптофан). В області контакту другої молекули антитіла створюють компенсуючі "порожнини" ідентичного або схожого з великої бічній ланцюгом(ями) розміру допомогою заміни великих бічних ланцюгів аминда гетеродимера порівняно з іншими небажаними кінцевими продуктами, такими як гомодимери.

Биспецифические антитіла включають поперечно-зшиті антитіла або "гетероконъюгати" антитіл. Наприклад, одне з антитіл в гетероконъюгате може бути пов'язано з авидином, а інше з біотином. Такі антитіла, наприклад, були запропоновані для націлювання клітин імунної системи проти небажаних клітин (патент США No. 4676980), і для лікування ВІЛ-інфекції (WO 91/00360, WO 92/200373, і EP 03089). Гетероконъюгати антитіл можна отримувати з використанням будь-якого підходящого способу поперечного зшивання. Відповідні засоби для поперечного зшивання добре відомі в цій галузі, і описані в патенті США No. 4676980, спільно з рядом способів поперечного зшивання.

Способи отримання биспецифических антитіл з фрагментів антитіл також описані в літературі. Наприклад, биспецифические антитіла можна отримувати з використанням утворення хімічних зв'язків. У Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) описаний спосіб, де інтактні антитіла протеолітичних розщеплюють з отриманням F(ab')2-фрагментів. Ці фрагменти відновлюють у присутності речовини, що утворює комплекси з дитиолами, арсенита натрію, для стабілізації сусідніх дитиолов і запобігання утворення міжмолекулярного дисульфіду. Потім порно перетворюють у Fab'-тиол відновленням меркаптоэтиламином і змішують з эквимолярним кількістю іншого похідного Fab'-TNB з отриманням биспецифического антитіла. Отримані биспецифические антитіла можна використовувати в якості засобів для селективної іммобілізації ферментів.

Останні досягнення спростили пряме виділенняE. coliфрагментів Fab'-SH, які можна хімічно пов'язувати з отриманням биспецифических антитіл. У Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) описано отримання повністю гуманізованою молекули F(ab')2биспецифического антитіла. Здійснювали секреціюE. coliкожного Fab'-фрагмента окремо і їх піддавали прямим хімічному з'єднаннюin vitroз утворенням биспецифического антитіла. Биспецифическое антитіло, отримане таким чином, володіло здатністю зв'язуватися з клітинами, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, і нормальними T-клітинами людини, а також запускати літичну активність цитотоксичних лімфоцитів людини проти мішеней, що представляють собою рак молочної залози людини.

Також були описані різні способи одержання і виділення фрагментів биспецифических антитіл безпосередньо з рекомбінантної клітинної культури. Наприклад, були отримані биспецифические антитіла з використанням лейцинових блискавок. Kositelny et al.,J. Immunol.,148(5):1547-1553 (1992). Пептиди лейциновой блискавки бел�танавливали в шарнірної області з отриманням мономерів, а потім повторно окисляли з отриманням гетеродимеров антитіл. Цей спосіб також можна використовувати для отримання гомодимеров антитіл. Спосіб "димерів антитіл", описаний Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:6444-6448 (1993) забезпечує альтернативний механізм отримання биспецифических фрагментів антитіл. Фрагменти містять VH, пов'язаний з VLза допомогою лінкера, який є занадто коротким для можливості утворення пари між двома доменами однієї і тієї ж ланцюга. Таким чином, домени VHі VLодного фрагмента змушені утворювати пару з комплементарними доменами VLі VHіншого фрагмента, таким чином, формуючи два антиген-зв'язуючих центру. Також описана інша стратегія для отримання фрагментів биспецифических антитіл з використанням димерів одноланцюгових Fv (sFv). См. Gruber et al.,J. Immunol, 152: 5368 (1994).

Також передбачені антитіла більш ніж з двома валентностями. Наприклад, можна отримувати триспецифичние антитіла. Tutt et al.J. Immunol. 147: 60 (1991).

6. Гетероконъюгати антитіл

Гетероконъюгати антитіл також належать до обсягу цього винаходу. Гетероконъюгати антитіл складаються з двох ковалентно пов'язаних антитіл. Такі антитіла, н і для лікування ВІЛ-інфекції [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Передбачається, що антитіла можна отримуватиin vitroз використанням відомих способів хімії синтетичних білків, включаючи способи, утягують поперечно-зшиваючі агенти. Наприклад, иммунотоксини можна конструювати з використанням реакції дисульфидного обміну або за допомогою освіти тиоэфирной зв'язку. Приклади відповідних реагентів для цієї мети включають иминотиолат і метил-4-меркаптобутиримидат і реагенти, описані, наприклад, у патенті США No. 4676980.

7.Полівалентні антитіла

Поливалентное антитіло може интернализовиваться (і/або катаболизироваться) швидше, ніж двовалентне антитіло, кліткою, экспрессирующей антиген, з яким антитіла зв'язуються. Антитіла по справжньому винаходу можуть представляти собою полівалентні антитіла (які можуть відноситися до класу, відмінному від класу IgM) з трьома або більше антиген-зв'язуючими ділянками (наприклад, четирехвалентние антитіла), які можна легко отримувати допомогою рекомбінантної експресії нуклеїнової кислоти, кодує поліпептидні ланцюги антитіла. Поливалентное антитіло може містити домен дімерізаціі і три або більше антиген-зв'язуючих ділянок. Бажаний домен димЌ Fc-область і три або більше антиген-зв'язуючої ділянки з боку N-кінця Fc-ділянки. Переважний поливалентное антитіло, представлене в цьому документі, що містить або складається із них) від трьох до восьми, однак переважно чотири, антиген-зв'язуючої ділянки. Поливалентное антитіло містить щонайменше одну полипептидную ланцюг (і переважно дві поліпептидні ланцюги), де полипептидная ланцюг(і) містить два або більше варіабельних доменів. Наприклад, полипептидная ланцюг(і) може містити VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, де VD1 являє собою перший варіабельний домен, VD2 являє собою другий варіабельний домен, Fc являє собою одну полипептидуную ланцюг Fc-ділянки, X1 і X2 являють собою амінокислоту або поліпептид, і n дорівнює 0 або 1. Наприклад, полипептидная ланцюг(і) може містити: ланцюг VH-CH1-рухливий лінкер-VH-CH1-Fc-ділянка; або ланцюг VH-CH1-VH-CH1-Fc-ділянка. Поливалентное антитіло, представлене в цьому документі, переважно додатково містить щонайменше два (і переважно чотири) поліпептиду вариабельного домену легкого ланцюга. Поливалентное антитіло, представлене в цьому документі, наприклад, може містити від двох до восьми поліпептидів вариабельного домену легкого ланцюга. Підлогу�єп легкого ланцюга і, необов'язково, додатково містять CL-домен.

8.Зміна ефекторних функцій з допомогою методів генної інженерії

Може бути бажаною модифікація антитіла щодо винаходу стосовно ефекторній функції, наприклад, щоб посилити антигензависимую клітинно-опосредуемую цитотоксичність (ADCC) та/або комплемент-залежну цитотоксичність (CDC) антитіла. Цього можна досягти внесенням однієї або декількох амінокислотних замін в Fc-ділянка антитіла. Альтернативно, або додатково, в Fc-ділянку можна вносити залишок(і) цистеїну, забезпечуючи, таким чином, формування дисульфидной зв'язку між ланцюгами в цій ділянці. Отримане таким чином гомодимерное антитіло може володіти покращеною здатністю до інтерналізації та/або посиленим комплемент-залежним знищенням клітин і підвищеної антитілозалежної клітинної цитотоксичність (ADCC). См. Caron et al.,J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) і Shopes, B. J. Immunol.148:2918-2922 (1992). Гомодимерние антитіла з підвищеною протипухлинною активністю також можна отримувати з використанням гетеробифункциональних поперечносшитих линкеров, як описано в Wolff et al.Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно можна сконструювати антитіло, яке має дублі�му і ADCC. См. Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Для збільшення часу напівжиття антитіла в сироватці, можна вбудовувати в антитіло (особливо під фрагмент антитіла) зв'язує рецептор порятунку епітоп, як описано, наприклад, у патенті США 5739277. Як використовують у рамках цієї заявки, термін "зв'язує рецептор порятунку епітоп" відноситься до эпитопу Fc-ділянки молекули IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3або IgG4), який відповідає за підвищення періоду напіврозпаду в сироватці молекули IgGin vivo.

9.Иммуноконъюгати

Винахід відноситься до иммуноконъюгатам (взаємозамінні позначуваних як "кон'югати антитіло-лікарський засіб" або "ADC"), що містить антитіло, конъюгированное з цитотоксичним засобом, таким як хіміотерапевтичне засіб, інгібуючу зростання засіб, токсин (наприклад, ферментативно активний токсин бактерій, грибів, рослин чи тварин, або його фрагменти), або радіоактивний ізотоп (тобто, радиоконъюгат).

У певних варіантах здійснення, иммуноконъюгат містить антитіло і хіміотерапевтичне засіб або інший токсин. Хіміотерапевтичні засоби, що підходять для отримання таких иммуноконъюгатов, описані вище. Ферментативесвязивющие активні фрагменти дифтерійного токсину, A-ланцюг екзотоксину (зPseudomonas aeruginosa), A-ланцюг рицину, A-ланцюг абрина, A-ланцюг модецина, альфа-сарцин, білкиAleurites fordiiбілки-диантани, білкиPhytolaca americana(PAPI, PAPII і PAP-S), інгібіторmomordica charantia, курцин, кротин, інгібіторsapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин і трихотецени. Для отримання радиоконъюгированних антитіл доступні різні радіонукліди. Їх приклади включають212Bi,131I,131In,90Y186Re. Кон'югати антитіла та цитотоксичного засобу можна отримувати з використанням безлічі біфункціональних зв'язують білки речовин, таких як N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропіонат (SPDP), иминотиолан (IT), біфункціональні похідні имидоэфиров (такі як диметиладипимидат HCL), активні складні ефіри (такі як дисукцинимидилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегид), біс-азидосоединения (такі як біс(п-азидобензоил)гександиамин), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п-диазонийбензоил)етилендіамін), діїзоцианата (такі як 2,6-диизоцианат толуолу), і вторинні активні сполуки фтору (1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Наприклад, иммунотоксин на основі рицину можна отримувати, як описано в Vitetta et al.Science 238: 1098 (1987). Мечиллюстративний хелатуючий агент для кон'югації радионуклеотида з антитілом. См. WO94/11026.

Також в цьому документі передбачаються кон'югати антитіл і одного або декількох низькомолекулярних токсинів, таких як калихеамицин, пептиди ауристатина, такі як монометилауристатин (MMAE) (синтетичний аналог доластатина), майтанзиноиди, такі як DM1, трихотен і CC1065, і похідні цих токсинів, які володіють активністю токсинів.

Ілюстративні иммуноконъюгати - кон'югати антитіло-лікарський засіб

Иммуноконъюгат (або "кон'югат антитіло-лікарський засіб" ("ADC")) по винаходу може мати формулу I, нижче, де антитіло конъюгировано (тобто, ковалентно пов'язано) з однією або кількома групами лікарського засобу (D) через необов'язковий лінкер (L). ADC можуть включати кон'югати тво-MAb і лікарського засобу ("TDC").

Ab-(L-D)p(I)

Таким чином, антитіло може бути конъюгировано з лікарським засобом або прямо, або через лінкер. У формулі I, p являє собою середню кількість груп лікарського засобу на антитіла, яке може варіювати, наприклад, від близько 1 до близько 20 груп лікарського засобу на антитіло. Винахід відноситься до композиції, що містить суміш сполук антитіло-лікарський засіб з'єднання формули I, де середня навантаження лікарським засобом на антитіло становить приблизно від 2 до приблизно 5, або приблизно від 3 до приблизно 4.

a. Ілюстративні линкери

Лінкер може містити один або кілька линкерних компонентів. Ілюстративні линкерние компоненти включають 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропаноил ("MP"), валін-цитрулін ("val-cit" або "vc"), аланін-фенілаланін ("ala-phe"), п-аминобензилоксикарбонил ("БАВАРІЯ"), і линкерние компоненти, одержувані конъюгацией з линкерними реагентами: N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат ("SMCC", також позначається в цьому документі як "МСС"), і N-сукцинимидил-(4-йодоацетил)аминобензоат ("SIAB"). У цій області відомі різні линкерние компоненти, деякі з яких описані нижче.

Лінкер може представляти собою "розщеплює лінкер", що полегшує вивільнення лікарського засобу в клітці. Наприклад, можна використовувати чутливий до дії кислот лінкер (наприклад, гидразон), чутливий до протеазам (наприклад, чутливої шкіри Research 52: 127-131 (1992); патент США No. 5208020).

У певних варіантах здійснення, лінкер є таким, як показано в наступній формулою II:

-Aa-Ww-Yy-(II)

де A являє собою подовжуючий елемент, і a представляє собою ціле число від 0 до 1; W являє собою амінокислотний елемент, і w представляє собою ціле число від 0 до 12; Y являє собою спейсерний елемент, і y дорівнює 0, 1 або 2; Ab, D і p є такими, як визначено вище формули I. Ілюстративні варіанти здійснення таких линкеров описані в US 2005-0238649 A1, який включений в цей документ у якості посилання в повному обсязі.

В деяких варіантах здійснення, линкерний компонент може містити подовжуючий елемент", який пов'язує антитіло з іншим линкерним компонентом або з групою лікарського засобу. Ілюстративні подовжують елементи представлені нижче (де хвилястою лінією зазначені ділянки ковалентного приєднання до антителу):

В деяких варіантах здійснення, линкерний компонент може містити амінокислотний елемен� самим полегшуючи вивільнення лікарського засобу з иммуноконъюгата під впливом внутрішньоклітинних протеаз, таких як лізосомальні ферменти. См., наприклад, Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778-784. Ілюстративні амінокислотні елементи включають, але не обмежуються ними, дипептид, трипептид, тетрапептид і пентапептид. Ілюстративні дипептиди включають: валін-цитрулін (vc або val-cit), аланін-фенілаланін (af або ala-phe); фенілаланін-лізин (fk або phe-lys); або N-метил-валін-цитрулін (Me-val-cit). Ілюстративні трипептиди включають: гліцин-валін-цитрулін (gly-val-cit) і гліцин-гліцин-гліцин (gly-gly-gly). Амінокислотний елемент може містити амінокислотні залишки, які зустрічаються у природі, а також мінорні амінокислоти і не зустрічаються в природі аналоги амінокислот, такі як цитрулін. Амінокислотні елементи можна конструювати і оптимізувати щодо їх селективності для ферментативного розщеплення конкретним ферментом, наприклад, асоційованої з пухлиною протеази, катепсином B, C і D, або плазміну протеази.

В деяких варіантах здійснення, линкерний компонент може містити спейсерний" елемент, який пов'язує антитіло з групою лікарського засобу, або прямо, або за допомогою удлиняющего елемента та/або амінокислотного елемента. Спейсерний елемент може бути "самоотщепляющимся" або "нпредставляет собою елемент, у якому частина спейсерної елемента або весь спейсерний елемент залишається зв'язаним з групою лікарського засобу при ферментативному (наприклад, протеолитическом) розщепленні ADC. Приклади не здатних до самостійного відщеплювання спейсерних елементи включають, але не обмежуються ними, глициновий спейсерний елемент і гліцин-глициновий спейсерний елемент. Також передбачаються інші поєднання пептидних спейсерів, чутливі до специфічному до послідовності ферментативному розщепленню. Наприклад, ферментативне розщеплення ADC, що містить гліцин-глициновий спейсерний елемент, асоційованої з пухлинними клітинами протеази, може призводити до від'єднання групи гліцин-гліцин-лікарський засіб від іншої частини ADC. В одному з таких варіантів здійснення, групу гліцин-гліцин-лікарського засобу потім піддають окремої стадії гідролізу в пухлинної клітці, таким чином, отщепляя гліцин-глициновий спейсерний елемент від групи лікарського засобу.

"Самоотщепляющийся" спейсерний елемент дозволяє вивільнення групи лікарського засобу без окремої стадії гідролізу. У певних варіантах здійснення, спейсерний элементвязивают з амінокислотним елементом через амідну зв'язок, і отримують карбамат, метилкарбамат або карбонат між бензиловим спиртом і цитотоксичним засобом. См., наприклад, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: 1087-1103. В одному варіанті здійснення, спейсерний елемент являє собою п-аминобензилоксикарбонил (PAB). У певних варіантах здійснення, фениленовую частина п-аминобензильного елемента заміщають допомогою Qm, де Q являє собою-C1-C8алкіл, -O-(C1-C8алкіл), -галоген, -нітро або-ціано; і m являє собою ціле число в діапазоні 0-4. Приклади самоотщепляющихся спейсерних елементів, крім того, включають, але не обмежуються ними, ароматичні сполуки, які є електронно схожими з п-аминобензиловим спиртом (див., наприклад, US 2005/0256030 A1), такі як похідні 2-аминоимидазол-5-метанолу (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) та орто - або пара-аминобензилацетали. Можна використовувати спейсери, які піддаються циклізації при гідролізі амідній зв'язку, такі як заміщені і незамещенние аміди 4-аміномасляної кислоти (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223); відповідним чином заміщені біцикло[2.2.1] і біцикло[2.2.2] кільцеві системи (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc, 1972, 94, 5815); і аміди 2-аминофенилпропионовой кислоти (Amsberry, et al., J. Oret al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) також є прикладом самоотщепляющихся спейсерів, придатних для ADC.

В одному варіанті здійснення, спейсерний елемент являє собою розгалужений біс(гідроксиметил)стирольний (BHMS) елемент, зображений нижче, який можна використовувати для включення і вивільнення великої кількості лікарських засобів.

де Q являє собою-C1-C8алкіл, -O-(C1-C8алкіл), -галоген, -нітро або-ціано; m являє собою ціле число в діапазоні 0-4; n-0 або 1; p знаходиться в діапазоні від 1 до 20.

В іншому варіанті здійснення, лінкер L може представляти собою лінкер дендритної типу для ковалентного приєднання більш однієї групи лікарського засобу допомогою ветвящейся багатофункціональної линкерной групи до антителу (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Дендритні линкери можуть підвищувати молярне співвідношення лікарського засобу і антитіла, тобто навантаження, яка пов'язана з ефективністю ADC. Таким чином, коли антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну володіє тільки однією реактивної тіольної групою цистеїну, �ві компоненти та їх поєднання представлені нижче в контексті ADC формули II:

Линкерние компоненти, включаючи подовжуючі, спейсерние і амінокислотні елементи, можна синтезувати способами, відомими в даній галузі, такими як способи, описані в US 2005-0238649 A1.

b. Ілюстративні групи лікарського засобу

(1) Майтанзин і майтанзиноиди

В деяких варіантах здійснення, иммуноконъюгат містить антитіло, конъюгированное з однією або декількома молекулами майтанзиноида. Майтанзиноиди являють собою інгібітори мітозу, які діють, інгібуючи полімеризацію тубуліну. Майтанзин вперше був виділений з східно-африканського чагарникуMaytenus serrata(патент США No. 3896111). Згодом було відкрито, що певні мікроорганізми також продукують майтанзиноиди, такі як майтанзинол і C-3 складні ефіри майтанзинола (патент США No. 4151042). Синтетичний майтанзинол і його похідні та аналоги описані, наприклад, у патентах США No. 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 і 4371533.

Майтанзиноидние групи лікарського засобу є привабливими групами лекарстолучения ферментацією або хімічною модифікацією або перетворенням в похідне продуктів ферментації, (ii) піддаються перетворенню в похідні з допомогою функціональних груп, придатних для кон'югації через дисульфідні і недисульфидние линкери з антитілами, (iii) є стабільними в плазмі, та (iv) є ефективними проти різних пухлинних клітинних ліній.

З'єднання майтанзина, які підходять для застосування в якості майтанзиноидних груп лікарського засобу, добре відомі в цій галузі і їх можна виділяти з природних джерел у відповідності з відомими способами або отримувати з використанням методів генетичної інженерії та ферментації (US 6790952; US 2005/0170475; Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7973). Майтанзинол і аналоги майтанзинола також можна отримувати синтетично відомими способами.

Ілюстративні майтанзиноидние групи лікарського засобу включають групи, що мають модифіковане ароматичне кільце, таке як: C-19-дехлор (патент США No. 4256746) (отримується відновленням з допомогою алюмогідріда літію ансамитоцина P2); C-20-гідрокси (або C-20-деметил) +/-C-19-дехлор (патенти США No. 4361650 і 4307016) (отримується деметилированием з використаннямStreptomycesабоActinomycesабо дехлорированием з використанням LAH); і C-20-деметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США No. 4294757) (полујллюстративние майтанзиноидние групи лікарських засобів також включають групи, мають модифікації, такі як: C-9-SH (патент США No. 4424219) (отримується реакцією майтанзинола з H2S або P2S5); C-14-алкоксиметил(деметокси/CH2OR)(US 4331598); C-14-гідроксиметил або ацилоксиметил (CH2OH або CH2OAc) (патент США No. 4450254) (отримується від Nocardia); C-15-гідрокси/ацилокси (US 4364866) (отримується перетворенням майтанзинола допомогоюStreptomyces); C-15-метокси (патенти США No. 4313946 і 4315929) (виділяється зTrewia nudlflora); C-18-N-деметил (патенти США No. 4362663 і 4322348) (отримується деметилированием майтанзинола допомогою Streptomyces); і 4,5-дезокси (US 4371533) (отримується відновленням майтанзинола трихлоридом титану/LAH).

Відомо, що багато положень сполук майтанзина є придатними як положень для зв'язування, в залежності від типу зв'язку. Наприклад, для утворення складноефірний зв'язку, підходять положення C-3, що має гідроксильну групу, положення C-14, модифіковане гидроксиметилом, положення C-15, модифіковане гідроксильної групи та положення C-20, що має гідроксильну групу (US 5208020; US RE39151; US 6913748; US 7368565; US 2006/0167245; US 2007/0037972).

Майтанзиноидние групи лікарського засобу включають групи, що мають структуру:

де хвилястою чи� на ADC. R може незалежно представляти собою H або C1-C6алкіл. Алкиленовая ланцюг, що зв'язує амідну групу з атомом сірки, може представляти собою метанил, этанил або пропив, тобто, m дорівнює 1, 2 або 3 (US 633410; US 5208020; US 7276497; Chari et al. (1992) Cancer Res. 52: 127-131; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 8618-8623).

Для сполук з винаходу передбачаються всі стереоізомери майтанзиноидной групи лікарського засобу, тобто будь-яке поєднання R - і S-конфігурацій в хіральних углеродах в D. В одному варіанті здійснення, майтанзиноидная група лікарського засобу має таку стереохимию:

Ілюстративні варіанти здійснення майтанзиноидних груп лікарського засобу включають: DM1; DM3 і DM4, що мають структури:

де хвилястою лінією зазначено ковалентное приєднання атома сірки лікарського засобу до линкеру (L) кон'югату антитіло-лікарський засіб. (WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1).

Інші ілюстративні кон'югати антитіло-майтанзиноидное лікарський засіб мають наступні структури і скорочення (де Ab являє собою антитіло і p дорівнює від 1 до приблизно рівні ч�юстративние кон'югати антитіло-лікарський засіб, де DM1 пов'язаний через лінкер BMPEO з тіольної групою антитіла, мають наступну структуру та скорочення:

де Ab являє собою антитіло; n 0, 1 або 2; p одно 1, 2, 3 або 4.

Иммуноконъюгати, містять майтанзиноиди, способи їх отримання, і їх терапевтичне застосування описані, наприклад, в Erickson, et al. (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; патенти США No. 5208020, 5416064, US 2005/0276812 A1, і патенті Європи EP 0 425 235 B1, описи яких включені в справжній документ в якості посилань в повному обсязі.

Кон'югати антитіло-майтанзиноид отримують хімічним зв'язуванням антитіла з молекулою майтанзиноида без істотного зниження біологічної активності або антитіла, або молекули майтанзиноида. См., наприклад, патент США No. 5208020 (опис якого включено в цей документ у якості посилання в повному обсязі). Майтанзиноиди можна синтезувати відомими способами або виділяти з природних джерел. Відповідні майтанзиноиди описані, наприклад, у патенті США No. 5208020 і в інших патентах і непатентних публікаціях, зазначених у цьому документі вище, такі як майтанзинол і аналоги майтанзинола, модифіковані в ароматичному кільці або в інших положеннях молекули майтанзиноЕтвует безліч линкерних груп, відомих у цій галузі, включаючи, наприклад, линкерние групи, описані в патенті США No. 5208020 або в патенті EP 0 425 235 B1; Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); і US 2005/016993 A1, описи яких включені в справжній документ в якості посилань в повному обсязі. Кон'югати антитіло-майтанзиноид, містять линкерний компонент SMCC, можна отримувати, як описано в US 2005/0276812 A1, "Antibody-drug conjugates and Methods". Линкери містять дисульфідні групи, прості тиоэфирние групи, нестійкі до дії кислот групи, фотолабильние групи, нестійкі до пептидазам групи, або нестійкі до эстеразе групи, як описано в зазначених вище патентах. Додаткові линкери описані і проілюстровані у цьому документі.

Кон'югати антитіл і майтанзиноида можна отримувати з використанням безлічі біфункціональних коштів для приєднання білків, таких як N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропіонат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), біфункціональні похідні складних имидоэфиров (такі як диметиладипимидат HCl), активні складні ефіри (такі як дисукцинимидилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегид), біс-азидосоединения (такі як біс(п-азидобензоил)гександиамин), процианат), і біс-активні сполуки фтору (1,5-дифтор-2,4-динитробензол). У певних варіантах здійснення, зв'язуючий агент являє собою N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропіонат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978) або N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), що забезпечують дисульфідні зв'язки.

Лінкер можна пов'язувати з молекулою майтанзиноида в різних положеннях, залежно від типу зв'язку. Наприклад, сложноэфирную зв'язок можна утворювати за допомогою реакції з гідроксильної групою з використанням загальноприйнятих способів приєднання. Реакція може протікати в положенні С-3, що має гідроксильну групу, положенні C-14, модифікованому гидроксиметилом, положенні C-15, модифікованому гідроксильної групою, та положенні C-20, що має гідроксильну групу. В одному варіанті здійснення, зв'язок утворюється в положенні С-3 майтанзинола або аналога майтанзинола.

(2) Ауристатини і доластатини

В деяких варіантах здійснення, иммуноконъюгат містить антитіло, конъюгированное з доластатином або з пептидним аналогом або похідним доластатина, наприклад, ауристатином (патенти США No. 5635483; 5780588). Було показано, що доластатини і ауристатини порушують динаивностью проти злоякісної пухлини (патент США No.5663149) і протигрибковою активністю (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Групу лікарського засобу у вигляді доластатина або ауристатина можна пов'язувати з антитілом через N(аміно)-кінець або C(карбоксильний)-кінець пептидної групи лікарського засобу (WO 02/088172).

Ілюстративні варіанти здійснення ауристатина включають зв'язуються через N-кінець групи лікарського засобу у вигляді монометилауристатина DE і DF (US2005/0238649, описаний в Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представлений 28 березня 2004 року, опис якого включено в цей документ у якості посилання в повному обсязі).

Це група лікарського засобу може бути обрана з формул DEі DF, нижче:

де хвилястою лінією DEі DFвказано ділянку ковалентного зв'язування з антитілом або з групою антитіло-линкерний компонент, і незалежно в кожному положенні:

R2обраний H і C1-C8алкила;

R3обраний H, C1-C8алкила, C3-C8карбоцикла, аріла, C1-C8алкиларила, C1-C8алкіл-(C3-C8карбоцикла), C3-C8гетероциклу і C1-C8алкіл-(C3-C8гетероциклу);

R4-C8алкіл-(C3-C8карбоцикла), C3-C8гетероциклу і C1-C8алкіл-(C3-C8гетероциклу);

R5обраний H і метилу;

або R4і R5разом утворюють карбоциклическое кільце і мають формулу -(CRaRb)n-, де Raі Rbнезалежно обрані з H, C1-C8алкила і C3-C8карбоцикла і n обраний з 2, 3, 4, 5 і 6;

R6обраний H і C1-C8алкила;

R7обраний H, C1-C8алкила, C3-C8карбоцикла, аріла, C1-C8алкиларила, C1-C8алкіл-(C3-C8карбоцикла), C3-C8гетероциклу і C1-C8алкіл-(C3-C8гетероциклу);

кожен R8незалежно обраний H, OH, C1-C8алкила, C3-C8карбоцикла і O-(C1-C8алкила);

R9обраний H і C1-C8алкила;

R10обраний з аріла або C3-C8гетероциклу;

Z являє собою O, S, NH або NR12, де R12являє собою C1-C8алкіл;

R11обраний H, C1-C20алкила, аріла, C3-C8гетероциклу, -(R13O)m-R14, або -(R13O)m-CH(R15)2; m пре�14 являє собою H або C1-C8алкіл;

кожен зустрічається R15незалежно являє собою H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H або -(CH2)n-SO3-C1-C8алкіл;

кожен зустрічається R16незалежно являє собою H, C1-C8алкіл або -(CH2)n-COOH;

R18обраний C(R8)2-C(R8)2-аріла, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8гетероциклу)- C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8карбоцикла);

n представляє собою ціле число в діапазоні від 0 до 6.

В одному варіанті здійснення, R3, R4і R7незалежно являють собою ізопропіл або втор-бутил і R5являє собою-H або метил. В ілюстративному варіанті здійснення, кожен з R3і R4являє собою ізопропіл, R5являє собою-H, R7являє собою втор-бутил.

В іншому варіанті здійснення, кожен з R2і R6являє собою метил, і R9являє собою-H.

В іншому варіанті здійснення, кожен зустрічається R8являє собою OCH3.

В ілюстративному являє собою метил, R5являє собою-H, R7являє собою втор-бутил, кожен зустрічається R8являє собою OCH3і R9являє собою-H.

В одному варіанті здійснення, Z є-O - або-NH-.

В одному варіанті здійснення, R10являє собою арил.

В ілюстративному варіанті здійснення, R10являє собою-феніл.

В ілюстративному варіанті здійснення, коли Z є-O-R11являє собою-H, метил або трет-бутил.

В одному варіанті здійснення, коли Z являє собою-NH, R11являє собою-CH(R15)2, де R15являє собою -(CH2)n-N(R16)2і R16являє собою-C1-C8алкіл або -(CH2)n-COOH.

В іншому варіанті здійснення, коли Z являє собою-NH, R11являє собою-CH(R15)2, де R15являє собою -(CH2)n-SO3H.

Ілюстративний варіант здійснення ауристатина формули DEявляє собою MMAE, де хвилястою лінією зазначено ковалентное приєднання до линкеру (L) кон'югату антитіло-лікарський засіб:

Інші ілюстративні варіанти здійснення включають з'єднання монометилвалина, мають карбокси-модифікації фенілаланіну на с-кінці пентапептидной групи лікарського засобу у вигляді ауристатина (WO 2007/008848), і з'єднання монометилвалина, мають модифікації бічного ланцюга фенілаланіну на с-кінці пентапептидной групи лікарського засобу у вигляді ауристатина (WO 2007/008603).

Інші групи лікарського засобу включають наступні похідні MMAF, де хвилястою лінією зазначено ковалентное приєднання до линкеру (L) кон'югату антитіло-лікарський засіб:

і

В одному аспекті, з групою лікарського засобу можна пов'язувати гідрофільні групи, включаючи, але не обмежуючись ними, складні ефіри триэтиленгликоля (TEG), як показано вище, R11. Без зв'язку з якою-небудь конкретною теорією, м

Ілюстративні варіанти здійснення ADC формули I, містять ауристатин/доластатин або їх похідні, описані в US 2005-0238649 і Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17, 114-124, які включені в справжній документ в якості посилань в повному обсязі. Ілюстративні варіанти здійснення ADC формули I, містять MMAE або MMAF і різні линкерние компоненти, мають наступні структури і скорочення (де "Ab" являє собою антитіло, p дорівнює від 1 до приблизно 8, "Val-Cit" або "vc" являє собою дипептид валін-цитрулін, і "S" являє собою атом сірки. Слід зазначити, що в певних описах структури пов'язаного через сірку ADC в цьому документі, антитіло представлено як "Ab-S", тільки для того, щоб вказати на ознака наявності зв'язку через сірку, але не для того, щоб вказати на те, що конкретний атом сірки несе кілька груп лінкер-лікарський засіб. Ліва дужка у представлених нижче структурах також може бути поміщена зліва від атома сірки, між Ab і S, що є еквівалентним описом ADC щодо винаходу, описаного в цьому документі.

Ілюстративні варіанти здійснення ADC формули I, містять MMAF і різні чи�MAF, пов'язаний з антитілом через лінкер, який не є протеолітичних отщепляемим, володіють активністю, порівнянної з иммуноконъюгатами, що містять MMAF, пов'язаний з антитілом допомогою протеолітичних отщепляемого лінкера. См., Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124. У таких випадках, вважають, що вивільнення лікарського засобу забезпечується деградацією антитіла в клітці. Там же.

Як правило, групи лікарського засобу на основі пептидів можна отримувати освітою пептидного зв'язку між двома амінокислотами та/або пептидними фрагментами. Такі пептидні зв'язки можна отримувати, наприклад, способом рідинного синтезу (див. E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), який добре відомий в області хімії пептидів. Групи лікарського засобу у вигляді ауристатина/доластатина можна одержувати згідно із способів: US 2005-0238649 A1; патенту США No.5635483; патенту США No.5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; і Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784.

Зокрема, групи лікарського засобу у вигляді ауристатина/доластатина формули DF, такі як MMAF і його похідні, можна отримувати з використ�ристатина/доластатина формули DE, такі як MMAE і його похідні, можна отримувати з використанням способів, описаних в Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784. Групи лікарський засіб-лінкер MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, і MC-vc-PAB-MMAE можна зручним чином синтезувати загальноприйнятими способами, наприклад, як описано в Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, і публікації патентної заявки No. US 2005/0238649 A1, а потім конъюгировать становлять інтерес з антитілом.

(3) Калихеамицин

В інших варіантах здійснення, иммуноконъюгат містить антитіло, конъюгированное з однією або декількома молекулами калихеамицина. Антибіотики сімейства калихеамицина здатні утворювати двухцепочечниє розриви ДНК при субпикомолярних концентраціях. Для отримання кон'югатів сімейства калихеамицина, див. патенти США No. 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (всі видані American Cyanamid Company). Структурні аналоги калихеамицина, які можна використовувати, включають, але не обмежуються ними, γ1I, α2I, α3I, N-ацетил-γ1I, PSAG і θI1(Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) і згадані вище патенти США, видані American Cyanamid). Іншим протипухлинною лікарським засобом, з кіт QFA, мають внутрішньоклітинним дією, і вони легко проходять через плазматическую мембрану. Таким чином, клітинний захват цих речовин за допомогою опосредуемой антитілом інтерналізації значно підвищує їх цитотоксичні ефекти.

c. Інші цитотоксичні засоби

Інші протипухлинні засоби, які можна конъюгировать з антитілом, включають BCNU, стрептозоцин, вінкристин і 5-фторурацил, сімейство засобів, сукупно відомих як комплекс LL-E33288, описаний в патентах США No. 5053394, 5770710, а також эсперамицини (патент США No. 5877296).

Ферментативно активні токсини і їх фрагменти, які можна використовувати, включають A-ланцюг дифтерійного токсину, несвязивающие активні фрагменти дифтерійного токсину, A-ланцюг екзотоксину (зPseudomonas aeruginosa), A-ланцюг рицину, A-ланцюг абрина, A-ланцюг модецина, альфа-сарцин, білкиAleurites fordiiбілки-диантани, білкиPhytolaca americana(PAPI, PAPII і PAP-S), інгібіторmomordica charantia, курцин, кротин, інгібіторsapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин і трихотецени. См., наприклад, WO 93/21232, опублікований 28 жовтня, 1993.

Крім того, даний винахід відноситься до иммуноконъюгату, утвореному між антитілом і з'єднанням �а; ДНКаза).

У певних варіантах здійснення, иммуноконъюгат може містити радіоактивний атом. Для продукції радіоактивних кон'югованих антитіл доступні різні радіоактивні ізотопи. Їх приклади включають At211, I131, I125, Y90Re186Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212і радіоактивні ізотопи Lu. У разі застосування иммуноконъюгата для детекції, він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфических досліджень, наприклад tc99mабо I123, або спиновую мітку для отримання зображення ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (також відомого як магнітно-резонансна томографія, МРТ), таку як також йод-123, йод-131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.

Радіоактивні або інші мітки можна вбудовувати в кон'югат відомими способами. Наприклад, пептид може бути біологічно синтезованим або його можна синтезувати допомогою хімічного синтезу амінокислот з використанням відповідних попередників амінокислот, що включають, наприклад, фтор-19 замість водню. Мітки, такі як tc99mабо I123Re186Re188і In111можна приєднувати через залишок цист 49-57) можна використовувати для вбудовування йоду-123. У "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) докладно описані інші способи.

У певних варіантах здійснення, иммуноконъюгат може містити антитіло, конъюгированное з активує проліки ферментом, який перетворює проліки (наприклад, пептидильное хіміотерапевтичне засіб див. WO 81/01145) в активний лікарський засіб, такий як лікарський засіб проти злоякісної пухлини. Такі иммуноконъюгати придатні антитілозалежної опосредуемой ферментом терапії проліками ("ADEPT"). Ферменти, які можна конъюгировать з антитілом, включають, але не обмежуються ними, лужні фосфатази, які придатні для перетворення містять фосфат проліків у вільні лікарські засоби; арилсульфатази, які придатні для перетворення містять сульфат проліків у вільні лікарські засоби; цитозиндезаминазу, яка придатна для перетворення нетоксичного 5-фторцитозина на лікарський засіб проти злоякісної пухлини, 5-фторурацил; протеази, такі як протеазаSerratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидази і катепсіни (такі як катепсіни B і L), які придатні для перетворення містять пептид проліків у вільні�здобудуть заступники у вигляді D-амінокислот; що розщеплюють вуглеводи, ферменти, такі як β-галактозидаза і нейраминидаза, які придатні для перетворення гликозилированних проліків у вільні лікарські засоби; β-лактамаза, яка придатна для перетворення лікарських засобів, перетворених в похідне з β-лактамами у вільні лікарські засоби; і пенициллинамидази, такі як амидаза пеніциліну V і амидаза пеніциліну G, які придатні для перетворення лікарських засобів, перетворених в похідні за їх атомів азоту аміногруп з допомогою феноксиацетильной або фенилацетильной груп, відповідно, у вільні лікарські засоби. Ферменти можна ковалентно пов'язувати з антитілами способами рекомбінантних ДНК, добре відомими в даній галузі. См., наприклад, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).

d. Навантаження лікарським засобом

Навантаженні лікарським засобом відповідає p, середнє число груп лікарського засобу на антитіло в молекулі формули I. Навантаження лікарським засобом може знаходитися в діапазоні від 1 до 20 груп лікарського засобу (D) на антитіло. ADC формули I включають колекції антитіл, кон'югованих з числом груп лікарського засобу в діапазоні від 1 до 2ь охарактеризовано загальноприйнятими способами, такими як мас-спектрометрія, аналіз ELISA та ВЕРХ. Кількісний розподіл ADC в значеннях p також може бути визначено. У деяких випадках, розділення, очищення та охарактеризацию гомогенного ADC, де p являє собою певне значення для ADC з іншого навантаженням лікарським засобом, можна проводити способами, такими як звернуто-фазова ВЕРХ або електрофорез. Фармацевтичні склади кон'югатів антитіло-лікарський засіб формули I, таким чином, можуть представляти собою гетерогенну суміш таких кон'югатів, у яких антитіла пов'язані з 1, 2, 3, 4 чи більше групами лікарського засобу.

Для деяких кон'югатів антитіло-лікарський засіб p може бути обмежено кількістю ділянок на антителе. Наприклад, коли зв'язування здійснюється через тиольную групи цистеїну, в якості ілюстративного варіанту здійснення, представленого вище, антитіло може мати тільки одну або кілька тиольних груп цистеїну, або воно може мати тільки одну або кілька досить реакційно-здатних тиольних груп, через які може бути приєднаний лінкер. У певних варіантах здійснення, більш високе навантаження лікарським засобом, наприклад p > �лених кон'югатів антитіло-лікарський засіб. У певних варіантах здійснення, навантаження лікарським засобом для ADC щодо винаходу знаходиться в діапазоні від 1 до приблизно 8; приблизно від 2 до приблизно 6; або приблизно від 3 до 5. Дійсно, було показано, що для певних ADC оптимальне співвідношення груп лікарського засобу до антителу може становити менше 8, і воно може становити приблизно від 2 до 5. См. US 2005-0238649 A1.

У певних варіантах здійснення, в ході реакції кон'югації відбувається кон'югація меншої кількості груп лікарського засобу, ніж теоретичне кількість. Антитіло може містити, наприклад, залишки лізину, які не реагують з проміжним з'єднанням лікарський засіб-лінкер або линкерним реагентом, як розглянуто нижче. Як правило, антитіла не містять множини вільних і реакційно-здатних тиольних груп цистеїну, які можуть бути пов'язані з групою лікарського засобу; дійсно, більшість тиольних залишків цистеїну у антитіла існують в якості дисульфідних містків. У певних варіантах здійснення, антитіло можна відновлювати відновником, таким як дитиотреитол (DTT)але-здатних тиольних груп цистеїну. У певних варіантах здійснення, антитіло піддають денатурирующим умов для виявлення реакційно-здатних нуклеофільних груп, таких як лізин або цистеїн.

Навантаження (відношення лікарський засіб/антитіло) ADC можна визначати різними способами, наприклад, шляхом: (i) обмеження молярного надлишку проміжного з'єднання лікарський засіб-лінкер або линкерного реагенту щодо антитіла, (ii) обмеження часу або температури реакції кон'югації, і (iii) часткових або обмежують відновлюють умов для модифікації тіольної групи цистеїну.

Слід розуміти, що коли більше однієї нуклеофільної групи реагує з проміжним з'єднанням лікарський засіб-лінкер або линкерним реагентом, з наступною реакцією з реагентом лікарського засобу, тоді отриманий продукт являє собою суміш сполук ADC з однією або кількома розподіленими групами лікарського засобу, пов'язаними з антитілом. Середнє число груп лікарського засобу на антитіло в суміші можна обчислити за допомогою подвійного аналізу ELISA з антитілами, які є специфічними до антителу і специфічними до лікарського засобу. Відділення�хроматографії гідрофобної взаємодії (див., наприклад, McDonagh et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7): 299-307; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, KJ., et al. "Effect of drug loading on the phatmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S. C, et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). У певних варіантах здійснення, з суміші кон'югатів можна виділяти гомогенний ADC з одним значенням навантаження шляхом електрофорезу або хроматографії.

e. Деякі способи отримання иммуноконъюгатов

ADC формули I можна отримувати різними способами з використанням реакцій, умов та реагентів органічної хімії, відомих фахівців у даній області, включаючи: (1) реакцію нуклеофільної групи антитіла з двовалентних линкерним реагентом з утворенням Ab-L через ковалентную зв'язок, з наступною реакцією з групою лікарського засобу D; і (2) реакцію нуклеофільної групи в групі лікарського засобу з двовалентних линкерним реагентом, з утворенням D-L, через ковалентную зв'язок, з наступною реакцією з нуклеофільної групою антитіла. Ілюстративні способи отримання ADC формули I останнім �леофильние групи на антитіла включають, але не обмежуються ними: (i) N-кінцеві аміногрупи, (ii) аміногрупи бічних ланцюгів, наприклад, лізину, (iii) тиольние групи бічних ланцюгів, наприклад, цистеїн, та (iv) гидроксили або аміногрупи цукрів, де антитіло є гликозилированним. Аміно, тиольная і гидроксильная групи є нуклеофільними і здатні вступати в реакцію з утворенням ковалентних зв'язків з электрофильними групами на линкерних групах і линкерних реагентах, включаючи: (i) активні складні ефіри, такі як складні ефіри NHS, складні ефіри HOBt, галогенформиати і галогенангидриди; (ii) алкіл - і бензилгалогениди, такі як галогенацетамиди; (iii) групи альдегідів, кетонів, карбоксильні і малеимидние групи. Певні антитіла володіють піддаються відновленню дисульфидами між ланцюгами, тобто цистеїновими містками. Реакційну здатність антитіла для кон'югації з линкерними реагентами можна забезпечувати за допомогою обробки відновником, таким як DTT (дитиотреитол) або трикарбонилэтилфосфин (TCEP), так щоб антитіло повністю або частково відновлювалося. Кожен цистеиновий місток, таким чином, може утворювати, теоретично, два реакційно-здатних тиольних нуклеофила. Дополнительниие нуклеофи�изина з 2-иминотиоланом (реагентом Трота), приводить до перетворення аміна в тиол. Реакційно-здатні тиольние групи можна вносити в антитіло шляхом вбудовування одного, двох, трьох, чотирьох або більше залишків цистеїну (наприклад, шляхом отримання варіантів антитіл, що містять один або кілька ненативних амінокислотних залишку цистеїну).

Кон'югати антитіло-лікарський засіб щодо винаходу можна також отримувати реакцією між электрофильной групою на антителе, такий як карбонільна група альдегіду або кетону, з нуклеофільної групою на линкерном реагенте або лікарському засобі. Відповідні нуклеофільне групи на линкерном реагенте включають, але не обмежуються ними, гідразид, оксим, аміно, гідразин, тиосемикарбазон, гідразину карбоксилат і арилгидразид. В одному варіанті здійснення, антитіло модифікують внесенням електрофільних груп, які здатні реагувати з нуклеофільними замісниками на линкерном реагенте або лікарському засобі. В іншому варіанті здійснення, цукру гликозилированних антитіл можна окислювати, наприклад, окислюючими реагентами на основі перйодатов, з утворенням груп альдегідів або кетонів, які можуть реагувати з аміногрупою линкерних реагентів або груп � можна відновлювати, наприклад, боргидридними реагентами, з утворенням стабільних зв'язків через амін. В одному варіанті здійснення, реакція вуглеводної частини глікозильованого антитіла або з галактозооксидазой, або з метаперйодатом натрію, може призводити до карбонільним групам (груп альдегідів і кетонів) в антителе, які можуть вступати в реакції з відповідними групами на лікарський засіб (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В іншому варіанті здійснення, антитіла, що містять N-кінцеві залишки серину або треоніна можуть реагувати з метаперйодатом натрію, що призводить до утворення альдегіду замість першої амінокислоти (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Такий альдегід можна піддавати реакції з групою лікарського засобу або нуклеофилом лінкера.

Нуклеофільне групи на групі лікарського засобу включають, але не обмежуються ними: аміногрупу, тиольную, гідроксильну групи, групи гідразиду, оксима, гідразину, тиосемикарбазона, гідразину карбоксилата і арилгидразида, здатні вступати в реакції з утворенням ковалентних зв'язків з электрофильними групами на линкерних групах і линкерних реагентах, включають: (i) активні складні ефіри, такі як складні ефіри NHS, (iii) альдегіди, кетони, карбоксильні і малеимидние групи.

З'єднання по винаходу повністю передбачають, але не обмежуються ними, ADC, отримані з наступними поперечно-сшивающими реагентами: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC і сульфо-SMPB і SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), які є комерційно доступними (наприклад, від Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U. S. A; див. сторінки 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog).

Иммуноконъюгати, містять антитіло і цитотоксична засіб, також можна отримувати з використанням різних біфункціональних коштів для приєднання білків, таких як N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропіонат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), біфункціональні похідні складних имидоэфиров (такі як диметиладипимидат HCl), активні складні ефіри (такі як дисукцинимидилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегид), біс-азидосоединения (такі як біс(п-азидобензоил)гександиамин), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п-диазонийбензоил)етилендіамін), діїзоцианата (такі як 2,6-диизоцианат толуолу), і біс-активні сполуки фтору (1,5-дифтор-2,глеродом-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) є ілюстративним хелатуючого агента для кон'югації радіонукліда з антитілом. См. WO94/11026.

Альтернативно злитий білок, що містить антитіло і цитотоксична засіб, можна отримувати, наприклад, рекомбінантними способами або пептидним синтезом. Рекомбінантна молекула ДНК може містити ділянки, що кодують частина антитіла і частина цитотоксичного засобу кон'югату, які розташовані поруч один з одним або розділені ділянкою, кодирующим линкерний пептид, який не порушує необхідні властивості кон'югату. В іншому варіанті здійснення, антитіло можна конъюгировать з "рецептором" (таким як стрептавидин) для застосування в попередньому націлення на пухлину, де кон'югат антитіло-рецептор вводять пацієнтові, з подальшим видаленням не зв'язався кон'югату з кровотоку з використанням засобу для виведення, а потім введенням "ліганду" (наприклад, авидина), який конъюгирован з цитотоксичним засобом (наприклад, радіонуклідом).

Ілюстративні иммуноконъюгати - кон'югати тво-антитіло-лікарський засіб

a. Отримання антитіл проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну

ДНК, що кодує аминокислотную послідовність варіанти антитіл проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну і вихідних антитіл протиприродного джерела (у разі зустрічаються в природі варіантів амінокислотної послідовності), отримання за допомогою сайт-спрямованого (чи олигонуклеотид-опосредуемого) мутагенезу (Carter (1985) et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443; Ho et al. (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Liu et al. (1998) J. Товарbiol. Chem. 273:20252-20260), мутагенез допомогою ПЛР (Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al. (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; і Valletta et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733), і касетний мутагенез (Wells et al. (1985) Gene 34:315-323) раніше отриманої ДНК, що кодує поліпептид. Протоколи мутагенезу, набори, реагенти є комерційно доступними, наприклад, QuikChange® Multi Site-Direct Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Поодинокі мутації також вносять шляхом олигонуклеотид-спрямованого мутагенезу з використанням дволанцюжкової плазмідної ДНК у якості матриці з допомогою мутагенезу на основі ПЛР (Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M. J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500). Варіанти рекомбінантних антитіл також можна конструювати шляхом маніпуляції з ферментами рестрикції або за допомогою ПЛР з вікон подовженням з синтетичними олигонуклеотидами. Мутагенні праймери кодують кодон цистеїну для заміни(замін). Для отримання ДНК, що кодує такі мутантні антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну, можна вико� Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing і Wiley-Interscience, New York, N. Y., 1993).

Для отримання антитіл людини проти CD79b і фрагментів антитілin vitroз наборів генів варіабельних (V) доменів імуноглобулінів неиммунизированних донорів можна використовувати технологію фагового дисплею (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)). У відповідності з цим способом, гени V домену антитіл клонують в рамці зчитування головного або другорядного гена оболонки ниткоподібного бактеріофага, такого як M13 або fd, і вони експонуються в якості функціональних фрагментів антитіл на поверхні частки фага. Внаслідок того, що ниткоподібних частка містить одноцепочечную копію ДНК генома фага, селекція на основі функціональних властивостей антитіла також призведе до селекції гена, що кодує антитіло, яке виявляє такі властивості. Таким чином, фаг імітує деякі з властивостей B-клітини (Johnson et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571; Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Товарbiol. 222:581-597; Griffith et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; US 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275).

Антитіла проти CD79b можна хімічно синтезувати з використанням відомих способів синтезу олигопептидов або їх можна отримувати і очищати з використанням рекомбінантної технології. Відповідну аминокислотную після�посібники (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W. H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154). Синтез білкаin vitroможна проводити з використанням засобів або за допомогою автоматики. Автоматизований твердофазний синтез можна проводити, наприклад, з використанням захищених за допомогою t-BOC або Fmoc амінокислот і з застосуванням an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) з використанням інструкцій виробника. Різні частини антитіла проти CD79b або поліпептиду CD79b можна хімічно синтезувати окремо і поєднувати з використанням хімічних або ферментативних методів для отримання необхідного антитіла проти CD79b або поліпептиду CD79b.

Для отримання фрагментів антитіл були розроблені різні способи. Традиційно, ці фрагменти отримували шляхом протеолітичного розщеплення інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto et al.(1992) Journal of Біохімічний and Biophysical Methods 24:107-117; і Brennan et al. (1985)Science, 229:81) чи можна отримувати безпосередньо за допомогою рекомбінантних клітин-господарів. Fab-, Fv - і scFv - фрагменти антитіл проти CD79b можуть бути экспрессировани і секретированиE. coliтаким чином, забезпечуючи простий спосіб отримання великих кількостей цих фрагментів. Фрагменти антитіл можна виділяти з фагових бібліо�скі пов'язувати з отриманням фрагментів F(ab')2(Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167), або їх можна виділяти безпосередньо з рекомбінантної культури клітин-господарів. Антитіло проти CD79b може представляти собою одноцепочечний Fv-фрагмент (scFv) (WO 93/16185; патент США No. 5571894; і патент США No. 5587458). Фрагмент антитіла проти CD79b також може представляти собою "лінійне антитіло" (US 5641870). Такі лінійні фрагменти антитіл можуть бути моноспецифическими або биспецифическими.

Представлене нижче опис відноситься, головним чином, до продукції антитіл проти CD79b шляхом культивування клітин, трансформованих або трансфицированних вектором, що містить кодує антитіло проти CD79b нуклеїнову кислоту. ДНК, що кодує антитіла проти CD79b, можна отримувати з бібліотеки кДНК, отриманої з тканини, імовірно володіє мРНК антитіла проти CD79b і экспрессирующей її на піддається детекції рівні. Таким чином, ДНК антитіла проти CD79b людини або поліпептиду CD79b зручним чином можна отримувати з бібліотеки кДНК, отриманої з тканини людини. Ген, що кодує антитіло проти CD79b, також можна отримувати з геномної бібліотеки або відомими способами синтезу (наприклад, автоматизованим синтезом нуклеїнових кислот).

Способи конструирован�їна, які є реакційно-здатними до електрофільним функціональним групам. Крім того, ці способи забезпечують з'єднання кон'югатів антитіл, такі як з'єднання кон'югатів антитіло-лікарський засіб (ADC) з молекулами лікарського засобу у певних, передбачених, селективних ділянках. Реакційно-здатні залишки цистеїну на поверхні антитіла дозволяють специфічну кон'югацію з групою лікарського засобу через тиольную реакційно-здатною групу, таку як малеимид або галоацетил. Нуклеофильная реакційна здатність тіольної фунациональной групи залишку Cys до малеимидной групі приблизно в 1000 разів перевищує реакційну здатність до будь-якої іншої функціональної групи амінокислоти в білку, такий як аміногрупа залишків лізину або N-кінцева аміногрупа. Специфічна до тіольної групи функціональна група в йодоацетильних і малеимидних реагентах може реагувати з аміногрупами, однак потрібні більш високі значення pH (>9,0) і більш тривалий час реакції (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London). Кількість вільних тиольних груп в білку можна оцінювати стандартним аналізом Елмана. Імуноглобулін M являє соими дисульфідними зв'язками, зв'язуючими субодиниці разом. У білках, таких як ці, потрібне відновлення дисульфідних зв'язків таким реагентом, як дитиотреитол (DTT) або селенол (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-156) для утворення реакційно-здатною вільної тіольної групи. Цей підхід може призводити до втрати третинної структури антитіла і специфічності зв'язування антигену.

Аналіз PHESELECTOR (фаговий ELISA для селекції реакційно-здатних тиольних груп) дозволяє детекцію реакційно-здатних груп цистеїну в антитіл в фаговом форматі ELISA, тим самим полегшуючи конструювання антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну (Junutula, J. R. et al. (2008) J Immunol Methods 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940). Антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну наносять на поверхні лунок з подальшою інкубацією з фаговими частками, додаванням міченого HRP вторинного антитіла і детекцією поглинання. Мутантні білки, експоновані на фаге, можна піддавати скринінгу швидким, надійним і високопродуктивним чином. Можна отримувати бібліотеки антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну і валити їх селекції зв'язування з використанням того ж підходу для ідентифікації відповідного включення реакційно-здатних ділянок св мутантних білків з цистеїном, експонованих на фаге, афінного реагентом або репортерной групою, яка також є реакційно-здатною до тіольної групи.

Аналіз PHESELECTOR дозволяє скринінг реакційно-здатних тиольних груп в антитіл. Прикладом є ідентифікація варіанти A121C цим способом. Можна проводити ефективний пошук по цілій молекулі Fab в цілях ідентифікації більшої кількості варіантів тво-Fab з реакційно-здатними тіольними групами. Для ідентифікації та кількісного визначення доступності розчинника до амінокислотним залишкам полипептиде використовували параметр, який представляє собою відносну доступність поверхні. Доступність поверхні може бути виражена в площі поверхні (Å2), яка може контактувати з молекулою розчинника, наприклад, води. Простір, займаний водою, становить приблизно сферу з радіусом 1,4 Å. Вільно доступним або ліцензованим є програмне забезпечення (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, або через інтернет: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) в якості пакету програм CCP4 Suite для кристалографії, в якому використовуються алгоритми для обчислення доступності поверхні кожної амінокислоти в белк�a. Cryst. D50:760-763). Два ілюстративних модуля програмного забезпечення, які проводять обчислення доступності поверхні, являють собою "AREAIMOL" і "SURFACE", на основі алгоритмів B. Lee and F. M. Richards (1971) J. Mol. Товарbiol. 55:379-400. AREAIMOL визначає доступну для розчинника поверхня білка в якості місця розташування зондової сфери (відповідної молекули розчинника), по мірі того, як вона перекочується по ван-дер-ваальсовой поверхні білка. AREAIMOL обчислює площу поверхні, доступну для розчинника, шляхом створення точок поверхні приблизно на кожному атомі розширеної сфери (на відстані від центра атома, що дорівнює сумі радіусів атома і зонда), і усуненням тих точок, які лежать в еквівалентних сферах, асоційованих з сусідніми атомами. AREAIMOL знаходить доступну для розчинника площа атомів у файлі координат PDB, і узагальнює доступну площу для залишку, ланцюги або цілої молекули. Доступні площі (або різниці площ) для окремих атомів, що можуть бути записані у файл результатів pseudo-PDB. AREAIMOL передбачає один радіус для кожного елемента, і розпізнає тільки обмежене число різних елементів.

AREAIMOL і SURFACE видають абсолютну доступність, тобто число квадратних Ангстрем (Å). Відносить�ті полипептиде. Стандартний стан являє собою трипептид Gly-X-Gly, де X являє собою представляє інтерес амінокислоту, і стандартний стан має представляти собою "подовжену" конформацію, тобто подібну конформації в бета-ланцюгах. Подовжена конформація максимізує доступність X. Обчислена доступна площа ділиться на доступну площу в стандартному стані трипептиду Gly-X-Gly і надається частка, яка являє собою відносну доступність. Процентна доступність являє собою відносну доступність, помножену на 100. Інший ілюстративний алгоритм для обчислення доступності поверхні заснований на модулі SOLV програми xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel), яка обчислює відносну доступність амінокислотного залишку для сфери води на основі рентгенівських координат поліпептиду. Відносну доступність поверхні для кожної амінокислоти в антителе можна обчислювати з використанням доступної інформації про кристалічній структурі (Eigenbrot et al. (1993) J Mol. Товарbiol. 229: 969-995).

ДНК, що кодує антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну, легко виділяти і секвенувати з використанням загальноприйнятих способів (наприклад, з використанням олігонуклеотидних�етки гибридоми служать в якості джерела такої ДНК. Після виділення ДНК можна поміщати в експресують вектори, які потім трансфицируют в клітини-господарі, такі як клітиниE. coli,клітини COS мавпи, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), або інші клітини-господарі ссавців, такі як клітини мієломи (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310), які в іншому випадку не продукують білок антитіла, забезпечуючи синтез моноклональних антитіл в рекомбінантних клітинах-хазяїнах.

Після конструювання і селекції, антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну, наприклад тво-Fab, з вбудованими в них високо реакційно-здатними неспаренними залишками Cys, можна одержувати "вільні залишки амінокислоти цистеїну" шляхом: (i) експресії в бактеріальній системі, наприклад,E. coli(Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262; Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151-188) або клітинної культуральної системи ссавців (WO 01/00245), наприклад, у клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО); і (ii) очищення з використанням загальноприйнятих способів очищення білків (Lowman et al. (1991) J. Товарbiol. Chem. 266(17): 10982-10988).

Вбудовані тиольние групи Cys реагують з электрофильними линкерними реагентами і проміжними сполуками лікарський засіб-лінкер з утворенням кон'югатів антитіла з вбудованими в нього остаўстатки Cys в антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну, і залишки Cys, присутні у вихідних антитіл, які утворюють пари і утворюють межцепочечние і внутрицепочечние дисульфідні зв'язки, не володіють якими-небудь реакційно-здатними тіольними групами (поки їх не обробити відновником) та не реагують з электрофильними линкерними реагентами або проміжними сполуками лікарський засіб-лінкер. Знову вбудований залишок Cys, може залишатися неспареним, і здатний реагувати, тобто утворювати кон'югат, з електрофільним линкерним реагентом або проміжним з'єднанням лікарський засіб-лінкер, таким як лікарський засіб-малеимид. Ілюстративні проміжні сполуки лікарський засіб-лінкер включають: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE і MC-vc-PAB-MMAF. Структурні положення вбудованих залишків Cys важкої і легкої ланцюгів пронумеровані відповідно до системи нумерації по послідовності. Ця система нумерації по послідовності корелює з системою нумерації Кабат (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), починаючи з N-кінця, і відрізняється від системи нумерації Кабат (нижній ряд) вставками, зазначеними допомогою a, b, c. З використанням системи нумерації Кабат, справжня лінійна амін�оти, відповідні вкорочення або вставці в FR або CDR вариабельного домену. Змінені ділянки важкої ланцюга з вбудованими залишками цистеїну вказані з допомогою схем нумерації по послідовності і нумерації по Кабат.

В одному варіанті здійснення, антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну отримано шляхом процесу, що включає:

(a) заміну одного або декількох амінокислотних залишків вихідного антитіла проти CD79b цистеїном;

(b) визначення реакційної здатності тіольної групи в антителе проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну шляхом реакції антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з реакційно-здатною до тіольної групи реагентом.

Антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну може бути більш реакційно-здатною, ніж вихідне антитіло, до реакційно-здатного до тіольної групи реагенту.

Вільні амінокислотні залишки цистеїну можуть бути розташовані у важкій або легкої ланцюгах, або в константних або варіабельних доменів. Фрагменти антитіл, наприклад Fab, також можна конструювати з однією або кількома амінокислоти цистеїну, замінюють амінокислоти фрагмента антитіла, з утворенням фрагментів антитіл Ѿлучения (виготовлення) антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну, включає:

(a) вбудовування одного або декількох залишків амінокислоти цистеїну у вихідне антитіло проти CD79b для отримання антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну;

(b) визначення реакційної здатності тіольної групи в антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну до реакційно-здатного до тіольної групи реагенту;

де антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну є більш реакційно-здатною, ніж вихідне антитіло з реакційно-здатною до тіольної групи реагентом.

Стадія (a) способу отримання антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну може включати:

(i) мутагенез послідовності нуклеїнової кислоти, кодує антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну;

(ii) експресію антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну;

(iii) виділення і очищення антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну.

Стадія (b) способу отримання антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну може включати експресію антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну на вірусній частці, обраної з фаговой або фагмидной частинки.

Стадія (b) способу отримання антитіла з вбудованими в нього залишками�-здатним до тіольної групи афінних реагентом з отриманням афінно міченого антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну; і

(ii) вимір зв'язування афінно міченого антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з уловлює носієм.

Інший варіант здійснення винаходу відноситься до способу скринінгу антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну з високо реакційно-здатними неспаренними амінокислоти цистеїну щодо реакційної здатності тіольної групи, що включає:

(a) вбудовування одного або декількох залишків амінокислоти цистеїну у вихідне антитіло для отримання антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну;

(b) реакцію антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з реакційно-здатною до тіольної групи афінних реагентом з утворенням афінно міченого антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну;

(c) вимір зв'язування афінно міченого антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з уловлює носієм;

(d) визначення реакційної здатності тіольної групи в антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну до реакційно-здатного до тіольної групи реагенту.

Стадія (a) способу скринінгу антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну може включати:

(i) мутагенез послідовності нуклеїнової ки�мі в нього залишками цистеїну; і

(iii) виділення і очищення антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну.

Стадія (b) способу отримання антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну може включати експресію антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну на вірусній частці, обраної з фаговой або фагмидной частинки.

Стадія (b) способу отримання антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну також може включати:

(i) реакцію антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з реакційно-здатною до тіольної групи афінних реагентом з отриманням афінно міченого антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну;

(ii) вимір зв'язування афінно міченого антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну з уловлює носієм.

b. Варіанти IgG проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну

Цистеїн вбудовували в ділянку 118 важкої ланцюга (нумерація EU) (еквівалентний положення 118 важкої ланцюга, нумерація по послідовності) інтактних химерних вихідних моноклональних антитіл проти CD79b або в ділянку 205 легкого ланцюга (нумерація за Кабат) (еквівалентний положення 210 в легкій ланцюга, нумерація по послідовності) інтактних химерних вихідних моноклональних антитіл �оенними в них залишками цистеїну з цистеїном в положенні 118 важкої ланцюга (нумерація EU) представляли собою: (a) thio-hu2F2.D7-HC (A118C) з послідовністю важкої ланцюга (SEQ ID NO:85) і послідовністю легкого ланцюга (SEQ ID NO:86), фігура 17.

Отримані антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну з цистеїном в положенні 205 легкого ланцюга (нумерація за Кабат) представляли собою: (a) thio-hu2F2.D7-LC (V205C) з послідовністю важкої ланцюга (SEQ ID NO:87) і послідовністю легкого ланцюга (SEQ ID NO:88), фігура 18.

Ці моноклональні антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну экспрессировали в клітинах CHO (яєчника китайського хом'яка) шляхом тимчасової ферментації в середовищі, що містить 1 мМ цистеїн.

Відповідно до одного варіанту здійснення, гуманізовані антитіла 2F2 проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну містять одну або декілька з наступних послідовностей важкої ланцюга з вільним залишком амінокислоти цистеїну (SEQ ID NO:91-99, таблиця 2).

Таблиця 2:
Порівняння нумерації важкої ланцюга по послідовності, за Кабат і за EU для варіантів гуманизированного антитіла 2F2 проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну
ПОСЛІДОВНІСТЬНУМЕРАЦІЯ ПО ПОСЛІДОВНОСТІНУМЕРАЦІЯ ЗА КабатНУМЕРАЦІЯ EUV591
LRLSCCASGYTA23CA23C92
MNSLRCEDTAVA88CA84C93
TLVTVCSASTKS112CS112C94
VTVSSCSTKGPA114CA114CA118C95
VSSASCKGPSVT116CT116CT120C96
WYVDGCEVHNAV278CV278CV282C97
KGFYPCDIAVES371CS371CS375CS400C99

Відповідно до одного варіанту здійснення, химерні антитіла 2F2 проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну містять одну або декілька з наступних послідовностей важкої ланцюга з вільним залишком амінокислоти цистеїну (SEQ ID NO:100-108, таблиця 3).

Таблиця 3:
Порівняння нумерації важкої ланцюга по послідовності, за Кабат і за EU для варіантів антитіла ch2F2 проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну
ПОСЛІДОВНІСТЬНУМЕРАЦІЯ ПО ПОСЛІДОВНОСТІНУМЕРАЦІЯ ЗА КАБАТНУМЕРАЦІЯ EUSEQ ID NO:
QVQLCQPGAEQ5CQ5C100
VKLSCCASGYTK23CK23C101
LSSLTCEDSAVS8owspan="1">TSVTVCLASTKS112CS112C103
VTVSSCSTKGPA114CA114CA118C104
VSSASCKGPSVT116CT116CT120C105
WYVDGCEVHNAV278CV278CV282C106
KGFYPCDIAVES371CS371CS375C107
PPVLDCDGSFFS396CS396CS400C108

Відповідно до одного варіанту здійснення, гуманізовані антитіла 2F2 проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну містять одну або декілька з наступних послідовностей легкої ланцюга з вільним залишком аминок�rowspan="1">Таблиця 4:
Порівняння нумерації легкої ланцюга ланцюга по послідовності і за Кабат для варіантів гуманизированного антитіла 2F2 проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїнуПОСЛІДОВНІСТЬНУМЕРАЦІЯ ПО ПОСЛІДОВНОСТІНУМЕРАЦІЯ ЗА КАБАТSEQ ID NO:SLSASCGDRVTV15CV15C109EIKRTCAAPSVV115CV110C110TVAAPCVFIFPS119CS114C111FIFPPCDEQLKS126CS121C112DEQLKCGTASVS132CS127C113VTEQDCKDSTYS173CS168C114115

Відповідно до одного варіанту здійснення, химерні антитіла 2F2 проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну містять одну або декілька з наступних послідовностей легкої ланцюга з вільним залишком амінокислоти цистеїну (SEQ ID NO:116-122, таблиця 5).

Таблиця 5:
Порівняння нумерації легкої ланцюга по послідовності і за Кабат для варіантів антитіла 2F2 проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну
ПОСЛІДОВНІСТЬНУМЕРАЦІЯ ПО ПОСЛІДОВНОСТІНУМЕРАЦІЯ ЗА КАБАТSEQ ID NO:
TLSVTCGQPASI15CI15C116
EIKRTCAAPSVV115CV110C117
TVAAPCVFIFPS119CS114C118
FIFPPCDEQLKS126CS132CS127C120
VTEQDCKDSTYS173CS168C121
GLSSPCTKSFNV210CV205C122

c. Мічені антитіла проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну

Антитіла проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну щодо винаходу можна сайт-специфічний і ефективно пов'язувати з реакційно-здатною до тіольної групи реагентом. Реакційно-здатний до тіольної групи реагент може представляти собою багатофункціональний линкерний реагент, реагент мітки для уловлювання, тобто мічений реагент (наприклад, реагент біотин-лінкер), придатний для детекції мітку (наприклад, реагент флуорофора), реагент для твердофазної іммобілізації (наприклад, SEPHAROSETM, полістирол або скло), або проміжне з'єднання лікарський засіб-лінкер. Одним прикладом реакційно-здатного до тіольної групи реагенту є N-этилмалеимид (NEM). В ілюстративному варіанті здійснення, реакція тво-Fab з реагентом біотин-лінкер призводить до біо�роенного залишку цистеїну. Реакція тво-Fab з багатофункціональним линкерним реагентом призводить до тво-Fab з функционализированним лінкером, який можна далі піддавати реакції з реагентом групи лікарського засобу або іншої міткою. Реакція тво-Fab з проміжним з'єднанням лікарський засіб-лінкер призводить до конъюгату тво-Fab і лікарського засобу.

Ілюстративні методи, описані в цьому документі, можна застосовувати, головним чином, для ідентифікації і продукції антитіл, і, в більш загальному сенсі, інших білків з використанням стадій конструювання та скринінгу, описаних у цьому документі.

Такий підхід можна застосовувати для кон'югації інших реакційно-здатних до тіольної групи реагентів, в яких реакційно-здатне група являє собою, наприклад, малеимид, йодоацетамид, пиридилдисульфид або інший реакцинно-здатний до тіольної групи партнер для кон'югації (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). Реакційно-здатний до тіольної групи реагент може являти собою групу лікарського средствизуализации або метал для променевої терапії, пептидильную або непептидильную мітку або придатний для детекції мітку, або модифікуючий виведення засіб, таке як різні ізомери поліетиленгліколю, пептид, який зв'язується з третім компонентом, або інше вуглеводне або липофильное засіб.

d. Застосування антитіл проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну

Антитіла проти CD79b з вбудованими в них залишками цистеїну та їх кон'югати можна застосовувати в якості терапевтичних та/або діагностичних засобів. Крім того, даний винахід відноситься до способів профілактики, управління перебігом, лікування або пом'якшення одного або декількох симптомів, асоційованих зі зв'язаним з B-клітками порушенням. Зокрема, даний винахід відноситься до способів профілактики, управління перебігом, лікування або пом'якшення одного або декількох симптомів, асоційованих з клітинно-проліферативним порушенням, таким як злоякісна пухлина, наприклад, лімфома, негоджкінська лімфома (НХЛ), агресивна NHL, рецидивуюча агресивна NHL, рецидивуюча уповільнена NHL, рефрактерна NHL, рефрактерна уповільнена NHL, хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), мелколимфоцитарная лімфома, лейкоз, волосатоклітинний ле�е відноситься до способів діагностики пов'язаного з CD79b порушення або схильності до розвитку такого порушення, а також до способів ідентифікації антитіл і антиген-зв'язуючих фрагментів антитіл, які переважно пов'язують асоційовані з B-клітками поліпептиди CD79b.

Інший варіант здійснення цього винаходу відноситься до застосування антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну для одержання лікарського засобу, придатного для лікування стану, яка відповідальна за пов'язане з B-клітками порушення.

e. Кон'югати антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу (кон'югати тво-антитіло-лікарський засіб (TDC))

Інший аспект винаходу являє собою з'єднання кон'югату антитіло-лікарський засіб, що містить антитіло проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну (Ab), і групу лікарського засобу ауристатина (D), де антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну пов'язане через один або кілька вільних залишків амінокислоти цистеїну линкерной групою (L) D; причому з'єднання має формулу I:

Ab-(L-D)p(I)

де p 1, 2, 3, або 4; і де антитіло з встроеннѽих залишків вихідного антитіла проти CD79b одним або декількома вільними залишками амінокислоти цистеїну.

Інший аспект винаходу відноситься до композиції, що містить суміш сполук антитіло-лікарський засіб формули I, де середня навантаження лікарським засобом на антитіло становить приблизно від 2 до приблизно 5, або приблизно від 3 до приблизно 4.

На фігурах 17-18 представлені варіанти здійснення кон'югатів антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу (ADC), де група лікарського засобу, що представляє собою ауристатин, пов'язана з вбудованою групою цистеїну в: легкого ланцюга (LC-ADC) або важкої ланцюга (HC-ADC).

Потенційні переваги кон'югатів антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу включають підвищену безпеку (більш високий терапевтичний індекс), поліпшені параметри PK, збереження внутрицепочечних дисульфідних зв'язків антитіла, які можуть стабілізувати кон'югат і зберігати його активну зв'язує конформацію, певні ділянки кон'югації лікарського засобу, і те, що отримання кон'югатів антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу шляхом кон'югації антитіла з вбудованими в них залишками цис

"Лінкер", "Линкерний элемаент" або "з'єднання" означає хімічну групу, яка містить ковалентную зв'язок або ланцюг з атомів, які ковалентно пов'язують антитіло з групою лікарського засобу. У різних варіантах здійснення, лінкер позначають як L. "Лінкер" (L) являє собою бифункциональную або багатофункціональну групу, яку можна використовувати для зв'язування однієї або декількох груп лікарського засобу (D) і елемента антитіла (Ab) з утворенням кон'югатів антитіло-лікарський засіб (ADC) формули I. Кон'югати антитіло-лікарський засіб (ADC) можна зручним чином отримувати з використанням лінкера, має реакційно-здатною функціональну групу для зв'язування з лікарським засобом і з антитілом. Тиольная група цистеїну в антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну (Ab) може утворювати зв'язок з электрофильной функціональною групою линкерного реагенту, групою лікарського засобу або проміжним з'єднанням лікарський засіб-лінкер.

В одному аспекті лінкер має реакційно-здатною ділянкою, який володіє электрофильной групою, яка є реакційно-здатною до нуклеофільного цистеїну, присутстпе на линкере і утворює ковалентную зв'язок з лінкером. Відповідні электрофильние групи включають, але не обмежуються ними, малеимидную і галоацетамидную групи.

Линкери включають двухвалентний радикал, такий як алкилдиил, арилен, гетероарилен, такі групи, як -(CR2)nO(CR2)n-, повторювані елементи з алкилокси (наприклад, полиэтиленокси, PEG, полиметиленокси) і алкиламино (наприклад, полиэтиленамино, JeffamineTM); і складні ефіри та аміди двоосновний кислот, включаючи сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат і капроамид.

Антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну реагують з линкерними реагентами або проміжними сполуками лікарський засіб-лінкер з электрофильними функціональними групами, такими як малеимид або α-галокарбонил, у відповідності зі способом кон'югації на сторінці 766 Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, і згідно з протоколом приклад 6.

Лінкер може складатися з одного або декількох линкерних компонентів. Ілюстративні линкерние компоненти включають 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропаноил ("MP"), валін-цитрулін ("val-cit" або "vc"), аланін-фенілаланін ("ala-phe" або "af"), п-аминобензилоксикарбонил ("БАВАРІЯ"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)ц�якості одного або кількох повторюваних елементів ("EO" або "PEO"). Додаткові линкерние компоненти відомі в даній області і деякі з них описані в цьому документі.

В одному варіанті здійснення, лінкер L в ADC має формулу:

-Aa-Ww-Yy-

де:

-A - являє собою подовжуючий елемент, ковалентно зв'язаний з тіольної групою цистеїну в антителе (Ab);

a дорівнює 0 або 1;

кожен-W - незалежно являє собою амінокислотний елемент;

w незалежно представляє собою ціле число в діапазоні від 0 до 12;

-Y - являє собою спейсерний елемент, ковалентно зв'язаний з групою лікарського засобу;

y дорівнює 0, 1 або 2.

Подовжуючий елемент

Подовжуючий елемент (-A), коли він присутній, здатний зв'язувати елемент антитіла з амінокислотним елементом (-W). В цьому відношенні, антитіло (Ab) володіє функціональною групою, яка може утворювати зв'язок з функціональною групою удлиняющего елемента. Відповідні функціональні групи, які можуть бути присутніми на антителе, або природним чином, або за допомогою хімічного маніпулювання, включають, але не обмежуються ними, сульфгидрил (-SH), аміно, гідроксил, карбокси, аномерних гідроксильну групу вуглеводу і карльние групи можна отримувати відновленням внутримолекулярной дисульфидной зв'язку антитіла. Альтернативно сульфгідрильні групи можна отримувати реакцією аміногрупи лізину в антителе з використанням 2-иминотиолана (реагент Трота) або іншого утворює сульфгидрил реагенту. В одному варіанті здійснення, антитіло (Ab) має вільної тіольної групою цистеїну, яка може утворювати зв'язок з электрофильной функціональною групою удлиняющего елемента. Ілюстративні подовжують елементи в конъюгатах формули I представлені з допомогою формул II і III, де Ab-, -W -, Y-, -D, w і y є такими, як визначено вище, і R17являє собою двухвалентний радикал, вибраний з (CH2)r, C3-C8карбоциклила, O-(CH2)r, арилена, (CH2)r-арилена, -арилен-(CH2)r-, (CH2)r-(C3-C8карбоциклила), (C3-C8карбоциклил)-(CH2)r, C3-C8гетероциклила, (CH2)r-(C3-C8гетероциклила), -(C3-C8гетероциклил)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-, -(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, -2CH2O)r-CH2- і -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-; де Rbявляє собою H, C1-C6алкіл, феніл або бензил; і r незалежно представляє собою ціле число в діапазоні 1-10.

Арилен включає двовалентні ароматичні вуглеводневі радикали з 6-20 атомів вуглецю, утворені видаленням двох атомів водню з ароматичною кільцевої системи. Типові групи ариленов включають, але не обмежуються ними, радикали, утворені з бензолу, заміщеного бензолу, нафталіну, антрацену, біфенілу і т. п.

Гетероциклильние групи включають кільцеву систему, в якій один або декілька атомів кільця являють собою гетероатом, наприклад азот, кисень і сірку. Гетероциклильний радикал містить від 1 до 20 атомів вуглецю і від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, O, P, S. Гетероцикл може представляти собою моноцикл, який має від 3 до 7 членів у кільці (від 2 до 6 атомів вуглецю і від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, O, P, S) або бицикл, має від 7 до 10 членів у кільці (від 4 до 9 атомів вуглецю і від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, O, P, S), наприклад: систему біцикло[4,5], [5,5], [5,6] або [6,6]. Гетероцикли описані в Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, �ремя), зокрема в томах 13, 14, 16, 19, 28; J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.

Приклади гетероциклів включають, як неограничивающего прикладу, пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (піперіділ), тіазоліл, тетрагидротиофенил, тетрагидротиофенил з окислений сірої, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофураніл, тианафталенил, індол, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, біс-тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, біс-тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6H-1,2,5-тиадиазинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксатинил, 2H-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3H-індол, 1H-индазолил, пуринил, 4H-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4Ah-карбазолил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имзолидинил, бензотриазолил, бензизоксазолил, оксиндолил, бензоксазолинил і изатиноил.

Карбоциклильние групи включають насичене або ненасичених кільце, яке має від 3 до 7 атомів вуглецю в якості моноцикла або від 7 до 12 атомів вуглецю в якості бицикла. Моноциклические карбоцикли мають від 3 до 6 атомів в кільці, більш конкретно 5 або 6 атомів в кільці. Біциклічні карбоцикли мають від 7 до 12 атомів в кільці, наприклад, розташовуються по порядку як системи біцикло[4,5], [5,5], [5,6] або [6,6], або 9 або 10 атомів в кільці, розташовуються по порядку як системи біцикло [5,6] або [6,6]. Приклади моноциклических карбоциклов включають циклопропіл, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогептил і циклооктил.

Слід розуміти, для всіх ілюстративних варіантів здійснення ADC формули I, таких як II-VI, що навіть коли явно не вказано, пов'язані з антитілом від 1 до 4 груп лікарського засобу (p=1-4), в залежності від кількості вбудованих залишків цистеїну.

Ілюстративний подовжуючий елемент формули II утворений з малеимидо-капроила (MC), де R17являє собою -(CH17являє собою -(CH2)2-:

Інший ілюстративний подовжуючий елемент формули II являє собою подовжуючий елемент, де R17являє собою -(CH2CH2O)r-CH2- і r дорівнює 2:

Інший ілюстративний подовжуючий елемент формули II являє собою подовжуючий елемент, де R17являє собою -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, де Rbявляє собою H і кожен r дорівнює 2:

Ілюстративний подовжуючий елемент формули III являє собою подовжуючий елемент, де R17являє собою -(CH2)5:

В іншому варіанті здійснення подовжуючий елемент пов'язаний з антитілом проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну через дисульфідні зв'язки між атомом сірки, зі вбудованим в нього цистеїном в антителе і атомом сірки удлиняющего елемента. Репрезентативний подовжуючий елемент цього варіанту здійснення представлений допомогою формули IV, де R17, Ab-, -W -, Y-, -D, w і y є такими, як визначено вище.

17-, Ab-, -W -, Y-, -D, w і y є такими, як визначено вище:

В іншому варіанті здійснення, лінкер може представляти собою лінкер дендритної типу для ковалентного приєднання більш однієї групи лікарського засобу допомогою ветвящейся багатофункціональної линкерной групи до антителу (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Дендритні линкери можуть підвищувати молярне співвідношення лікарського засобу і антитіла, тобто навантаження, яка пов'язана з ефективністю ADC. Таким чином, коли антитіло з встроєна�лікарського засобу можна пов'язувати із дендритних через лінкер.

Амінокислотний елемент

Лінкер може містити амінокислотні залишки. Амінокислотний елемент (-Ww-), коли він присутній, пов'язує антитіло (Ab) з групою лікарського засобу (D) в конъюгате антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу (ADC) щодо винаходу.

-Ww- представляє собою дипептидний, трипептидний, тетрапептидний, пентапептидний, гексапептидний, гептапептидний, октапептидний, нонапептидний, декапептидний, ундекапептидний або додекапептидний елемент. Амінокислотні залишки, які складають амінокислотний елемент, включають зустрічаються в природі амінокислотні залишки, а також мінорні амінокислоти і не зустрічаються в природі аналоги амінокислот, такі як цитрулін. Кожен елемент-W - незалежно має формулу, наведену нижче в квадратних дужках, і w являє собою ціле число в діапазоні від 0 до 12:

де R19являє собою водень, метил, ізопропіл, изобутил, втор-бутил, бензил, п-гидроксибензил, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH22, - (CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-пиридилметил-, 3-пиридилметил-, 4-пиридилметил-, феніл, циклогексил,

або

Коли R19є відмінним від водню, атом вуглецю, з яким пов'язаний R19є хіральні. Кожен атом вуглецю, з яким пов'язаний R19незалежно знаходиться в (S) - (R)-конфігурацію, або являє собою рацемічну суміш. Амінокислотні елементи, таким чином, можуть бути енантіомерно чистими, рацемическими або диастереомерними.

Ілюстративні амінокислотні елементи-Ww- включають дипептид, трипептид, тетрапептид або пентапептид. Ілюстративні дипептиди включають: валін-цитрулін (vc або val-cit), аланін-фенілаланін (af або ala-phe). Ілюстративні трипептиди включають: гліцин-валін-цитрулін (gly-val-cit) і гліцин-гліцин-гліцин (gly-gly-gly). Амінокислотні залишки, які містять компонент у вигляді амінокислотного лінкера, включають зустрічаються в природі амінокислотні залишки, а також мінорні амінокислоти і не вст�але розщеплюватися одним або декількома ферментами, включаючи асоційовану з пухлиною протеазу, вивільняючи групу лікарського засобу (-D), яка в одному варіанті здійснення протонируетсяin vivoпри вивільненні з утворенням лікарського засобу (D). Компоненти у вигляді амінокислотних линкеров можна конструювати і оптимізувати за їх селективності до ферментативному розщепленню конкретними ферментами, наприклад, асоційованої з пухлиною протеази, катепсином B, C і D або плазміну протеази.

Спейсерний елемент

Спейсерний елемент (-Yy-), коли він присутній (y = 1 або 2), пов'язує амінокислотний елемент (-Ww- з групою лікарського засобу (D), коли амінокислотний елемент присутній (w=1-12). Альтернативно, спейсерний елемент, що пов'язує подовжуючий елемент з групою лікарського засобу, коли амінокислотний елемент відсутній. Спейсерний елемент також пов'язує групу лікарського засобу з елементом антитіла, коли як амінокислотний елемент, так і подовжуючий елемент, відсутні (w, y = 0). Спейсерние елементи являють собою елементи двох основних типів: самоотщепляющийся і не здатний до самостійного відщеплювання. Не здатний до самостійного відщеплювання спейсерний эя пов'язаними з групою лікарського засобу після відщеплення, зокрема ферментативного, амінокислотного елемента від кон'югату антитіло-лікарський засіб або групи лікарський засіб-лінкер. Коли ADC, що містить гліцин-глициновий спейсерний елемент або глициновий спейсерний елемент зазнає ферментативне розщеплення асоційованої з пухлинними клітинами протеази, асоційованої з клітинами злоякісної пухлини протеази або асоційованої з лімфоцитами протеази, група гліцин-гліцин-лікарський засіб або група гліцин-лікарський засіб відщеплюється від Ab-A3-Ww-. В одному варіанті здійснення, відбувається незалежна реакція гідролізу в клітині-мішені, расщепляющая зв'язок гліцин-група лікарського засобу і що вивільняє лікарський засіб.

В іншому варіанті здійснення, -Yy- являє собою п-аминобензилкарбамоильний (PAB) елемент, фениленовая частина якого заміщена Qm, де Q являє собою-C1-C8алкіл, -O-(C1-C8алкіл), -галоген, -нітро або-ціано; і m являє собою ціле число в діапазоні 0-4.

Ілюстративні варіанти здійснення не здатного до самостійного відщеплювання спейсерної елемента (-Y) являють собою: -Gly-Gly-; -Gly-; -Ala-P, � яких спейсерний елемент відсутній (y=0), або їх фармацевтично прийнятна сіль або сольват.

Альтернативно ADC, що містить самоотщепляющийся спейсерний елемент, може вивільняти-D. В одному варіанті здійснення, -Y - являє собою групу РАВ, яка пов'язана із-Ww- через атом азоту аміногрупи в групі PAB, і пов'язана прямо з-D через карбонат, карбамат або просту ефірну групу, де ADC має ілюстративну структуру:

де Q являє собою-C1-C8алкіл, -O-(C1-C8алкіл), -галоген, -нітро або-ціано; m являє собою ціле число в діапазоні 0-4; p знаходиться в діапазоні від 1 до 4.

Інші приклади самоотщепляющихся спейсерів включають, але не обмежуються ними, ароматичні сполуки, які є електронно схожими з групою PAB, такий як похідні 2-аминоимидазол-5-метанолу (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), гетероциклічні аналоги PAB (US 2005/0256030), бета-глюкуронід (WO 2007/011968), і орто - або пара-аминобензилацетали. Можна використовувати спейсери, які піддаються циклізації при гідролізі амідній зв'язку, такі як заміщені і незамещенние аміди 4-аміномасляної кислоти (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223), відповідним про�пропіонової кислоти (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867). Усунення містять амін лікарських засобів, які заміщені за глицину (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27: 1447), також є прикладом самоотщепляющегося спейсера, придатного ADC.

Ілюстративні спейсерние елементи (-Yy-) відповідають формулам X-XII:

Дендритні линкери

В іншому варіанті здійснення, лінкер L може представляти собою лінкер дендритної типу для ковалентного приєднання більш однієї групи лікарського засобу допомогою ветвящейся багатофункціональної линкерной групи до антителу (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Дендритні линкери можуть підвищувати молярне співвідношення лікарського засобу і антитіла, тобто навантаження, яка пов'язана з ефективністю ADC. Таким чином, коли антитіло з вбудованими в нього залишками цистеїну володіє тільки однією реактивної тіольної групою цистеїну, безліч груп лікарського засобу можна пов'язувати із дендритних через лінкер. Ілюстративні варіанти здійснення розгалужених дендритних линкеров включають 2,6-біс(гідроксиметил)-п-крезольний і 2,4,6-трис(гідроксиметил)фенольний дендрімерние елемент одному варіанті здійснення, спейсерний елемент являє собою розгалужений біс(гідроксиметил)стирол (BHMS), який можна використовувати для включення і вивільнення великої кількості лікарських засобів, що мають структуру:

містить 2-(4-аминобензилиден)пропан-1,3-диольний дендримерний елемент (WO 2004/043493; de Groot et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494), де Q являє собою-C1-C8алкіл, -O-(C1-C8алкіл), -галоген, -нітро або-ціано; m являє собою ціле число в діапазоні 0-4; n дорівнює 0 або 1; p знаходиться в діапазоні від 1 до 4.

Ілюстративні варіанти здійснення з'єднань кон'югату антитіло-лікарський засіб формули I включають XIIIa (MC), XIIIb (val-cit), XIIIc (MC-val-cit) і XIIId (MC-val-cit-РАВ):

Інші ілюстративні варіанти здійснення з'єднань кон'югату антитіло-лікарський засіб формули Ia включають XIVa-e:

де X являє собою

або

Y являє собою

абоЯк правило, линкери пептидного типу можна отримувати шляхом утворення пептидного зв'язку між двома або кількома амінокислотами та/або пептидними фрагментами. Такі пептидні зв'язки можуть бути отримані, наприклад, у відповідності зі способом рідкофазного синтезу (E. Schroder and K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press), який добре відомий в області хімії пептидів. Линкерние проміжні сполуки можна отримувати будь-яким поєднанням або послідовністю реакцій, що включають сп�ть використані реакційно-здатні функціональні групи, які за своїми властивостями є электрофильними, нуклеофільними або вільними. Реакційно-здатні функціональні групи включають, але не обмежуються ними, карбоксили, гидроксили, пара-нитрофенилкарбонат, изотиоцианат і йдуть групи, такі як O-мезил, O-тозил, -Cl, -Br, -I або малеимид.

Наприклад, заряджений заступник, такий як сульфонат (-SO-3) або амоній, може підвищувати розчинність у воді реагенту і полегшувати реакцію зв'язування линкерного реагенту з антитілом або групою лікарського засобу, або полегшувати реакцію зв'язування Ab-L (проміжне з'єднання антитіло-лінкер) з D, або D-L (проміжне з'єднання лікарський засіб-лінкер) з Ab, в залежності від способу синтезу, використовуваного для одержання ADC.

Линкерние реагенти

Кон'югати антитіл і ауристатина можна отримувати з використанням безлічі біфункціональних линкерних реагентів, таких як N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропіонат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), біфункціональні похідні складних имидоэфиров (такі як диметиладипимидат HCl), активні складні ефіри (такі як дисукцинимидилсуберат), альдегіди (такі як глуе як біс-(п-диазонийбензоил)етилендіамін), діїзоцианата (такі як толуол 2,6-диизоцианат), і біс-активні сполуки фтору (1,5-дифтор-2,4-динитробензол).

Кон'югати антитіло-лікарський засіб також можна отримувати за допомогою наступних линкерних реагентів: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, і сульфо-SMPB, і SVSB (сукцинимидил-(4 - винилсульфон)бензоат), і включаючи біс-малеимидние реагенти: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-біс-малеимидодиэтиленгликоль (BM(PEO)2), і 1,11-біс-малеимидотриэтиленгликоль (BM(PEO)3), які є комерційно доступними від Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, і інших постачальників реагентів. Біс-малеимидние реагенти дозволяють приєднання тіольної групи антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну до тиол-містить групі лікарського засобу, мітку або линкерному проміжного з'єднання, послідовно або одночасно. Інші функціональні групи, крім малеіміду, які є реакційно-здатними до тіольної групи антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну, групі лікарського засобу, мітку або линкерному проміжного з'єднання включають йодацетамид, бромацетамид, винилпиридин, дисульфід, пии також можна отримувати за допомогою інших комерційних джерел, таких як Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), або синтезувати у відповідності зі способами, описаними в Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Walker, M. A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7: 180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; WO 04/032828.

Подовжуючі елементи формули (IIIa) можна вбудовувати в лінкер шляхом реакції наступних линкерних реагентів з N-кінцем амінокислотного елементи:

де n-ціле число в діапазоні 1-10, і T являє собою-H або-SO3Na;

де n-ціле число в діапазоні 0-3;

і

Подовжуючі елементи можна вбудовувати в лінкер шляхом реакції наступних біфункціональних реагентів з N-кінцем амінокислотного елементи:

де X являє собою Br чи I.

Подовжуючі елементи формули також можна вбудовувати в лінкер шляхом реакції наступних біфункціональних реагентів з N-кінцем амінокислотного елементи:

Ілюстративний дипептидний линкерний реа�самоотщепляющийся спейсер, має структуру:

Ілюстративний дипептидний линкерний реагент phe-lys(Mtr, моно-4-метокситритил), має малеимидний подовжуючий елемент і самоотщепляющийся спейсерний елемент РАВ, можна отримувати відповідно до Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60, і він має структуру:

Отримання кон'югатів антитіла проти CD79b з вбудованими в нього залишками цистеїну та лікарського засобу

ADC формули I можна отримувати кількома способами, з використанням реакцій, умов та реагентів органічної хімії, відомих фахівців у даній області, включаючи: (1) реакцію групи цистеїну в антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну з линкерним реагентом з утворенням проміжного з'єднання антитіло-лінкер Ab-L, через ковалентную зв'язок, з наступною реакцією з активованою групою лікарського засобу D; і (2) реакцією нуклеофільної групи в групі лікарського засобу з линкерним реагентом, з утворенням проміжного з'єднання лікарський засіб-лінкер D-L, через ковалентную зв'язок, з наступною реакцією з групою цистеїну в антителе з вбудованими в нього залишками цистеїну. Для отримання кон'югатів а�і з вбудованими в них залишками цистеїну, групами лікарського засобу і линкерами.

Тиольние групи цистеїну антитіла є нуклеофільними і здатні вступати в реакції з утворенням ковалентних зв'язків з электрофильними групами на линкерних реагентах і проміжних з'єднаннях лікарський засіб-лінкер, включаючи: (i) активні складні ефіри, такі як складні ефіри NHS, складні ефіри HOBt, галогенформиати і галогенангидриди; (ii) алкіл - і бензилгалогениди, такі як галогенацетамиди; (iii) групи альдегідів, кетонів, карбоксильні і малеимидние групи, та (iv) дисульфиди, включаючи пиридильние дисульфиди, шляхом сульфідного обміну. Нуклеофільне групи на групі лікарського засобу включають, але не обмежуються ними: аміногрупу, тиольную, гідроксильну групи, групи гідразиду, оксима, гідразину, тиосемикарбазона, карбоксилата гідразину та арилгидразида, здатні вступати в реакції з утворенням ковалентних зв'язків з электрофильними групами на линкерних групах і линкерних реагентах.

Реакційну здатність антитіла для кон'югації з линкерними реагентами можна забезпечувати за допомогою обробки відновником, таким як DTT (дитиотреитол, реагент Клеланда) або TCEP (гідрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фочечних і внутрицепочечних дисульфідних зв'язків (приклад 5). Наприклад, інтактні моноклональні антитіла з вбудованими в них залишками цистеїну (тво-Mab), экспрессированние в клітинах CHO, відновлюють за допомогою приблизно 50-кратного молярного надлишку TCEP протягом 3 год при 37°С для відновлення дисульфідних зв'язків в аддуктах цистеїну, які можуть утворюватися знову між вбудованими залишками цистеїну і цистеїном, присутніх в культуральному середовищі. Відновлене тво-Mab розбавляють і поміщають в колонку HiTrap S 10 мМ ацетате натрію pH 5, і элюируют допомогою PBS, що містить 0,3 M хлорид натрію. Дисульфідні зв'язки між залишками цистеїну вихідного Mab повторно встановлюють з допомогою розведеного (200 нМ) водного сульфату міді (CuSO4) при кімнатній температурі протягом ночі. Альтернативно дегидроаскорбиновая кислота (DHAA) є ефективним окислювачем для повторного відновлення внутрицепочечних дисульфідних груп антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну після відновного розщеплення адуктів цистеїну. Також можна використовувати інші окислювачі, тобто речовини, агенти, та умови окислення, які відомі в даній області. Також є ефективним окислення навколишнім повітрям. На цій стадії мягЎ і зберігаються тиольние групи знову вбудованих залишків цистеїну. Приблизно 10-кратний надлишок проміжного з'єднання лікарський засіб-лінкер, наприклад MC-vc-PAB-MMAE, додавали, перемішували і дозволяли стояти протягом приблизно однієї години при кімнатній температурі для забезпечення кон'югації і освіти кон'югату антитіло проти CD79b-лікарський засіб. Суміш для кон'югації фільтрували і поміщали в колонку HiTrap S і элюировали з неї для видалення надлишку проміжного з'єднання лікарський засіб-лінкер та інших домішок.

На фігурі 16 представлений загальний процес отримання антитіла з вбудованими в нього залишками цистеїну, экспрессированного з клітинної культури, для кон'югації. Коли клітинна культуральна середовище містить цистеїн, можуть утворюватися дисульфідні адукти знову між вбудованою амінокислотою цистеїну і цистеїном з середовища. Ці адукти цистеїну, представлені в якості колу в ілюстративному тво-Mab (ліворуч) на фігурі 16, необхідно відновлювати для отримання антитіл з вбудованими в них залишками цистеїну, реакційно-здатними для кон'югації. Адукти цистеїну, ймовірно разом з різними межцепочечними дисульфідними зв'язками, піддають відновного розщепленню з отриманням чекаю спареними залишками цистеїну повторно утворюються в умовах часткового окислення з сульфатом міді, DHAA, або під впливом навколишнього кисню. Знову вбудовані, сконструйовані і неспарені залишки цистеїну залишаються доступними для реакції з линкерними реагентами або проміжними сполуками лікарський засіб-лінкер з утворенням кон'югатів антитіла щодо винаходу. Тво-Mab, экспрессированние в клітинних лініях ссавців, призводять до конъюгату знаходиться зовні аддукту Cys з вбудованим Cys через утворення зв'язку S-S-. Таким чином, очищені тво-Mab обробляють шляхом процесів відновлення і повторного окислення, як описано в прикладі 5 з отриманням реакційно-здатних тво-Mab. Ці тво-Mab використовують у конъюгате з містять малеимид цитотоксичними лікарськими засобами, флуорофорами та іншими позначками.

10. Иммунолипосоми

Антитіла проти CD79b, описані в цьому документі, також можна виготовляти у вигляді иммунолипосом. "Липосома" являє собою невелику везикул, що складається з різних типів ліпідів, фосфоліпідів та/або поверхнево-активної речовини, які підходять для доставки лікарського засобу ссавцю. Компоненти ліпосоми зазвичай утворюють двошарову структуру, схожу з розміщенням ліпідів біологічно�в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); патенти США No. 4485045 і 4544545; і WO97/38731, опублікованій 23 жовтня 1997 року. Ліпосоми з посиленим часом циркуляції описані в патенті США No. 5013556.

Особливо відповідні ліпосоми можна отримувати способом звернуто-фазового випарювання з ліпідною композицією, що містить фосфатидилхолін, холестерин і похідне фосфатидилэтаноламина з PEG (PEG-PE). Ліпосоми екструдують через фільтри з певним розміром пір з отриманням ліпосоми з необхідним діаметром. Fab'-фрагменти антитіла по справжньому винаходу можна конъюгировать з ліпосомами, як описано в Martin et al., J. Товарbiol. Chem. 257:286-288 (1982) за допомогою реакції дисульфидного обміну. У липосоме необов'язково міститься хіміотерапевтичне засіб. См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989).

B. Певні способи отримання антитіл

1. Скринінг антитіла проти CD79b з необхідними властивостями

Способи отримання антитіл, які зв'язуються з поліпептидами CD79b, описані вище. Якщо бажано, можна відбирати антитіла з певними біологічними характеристиками.

Ефекти антитіла проти CD79b щодо винаходу на інгібування росту можна оцінювати за допомогою способів, відомих в данно трансфекції гена CD79b. Наприклад, відповідні клітинні лінії пухлин і клітини, трансфицированние CD79b, можна обробляти моноклональним антитілом проти клітини по винаходу в різних концентраціях протягом декількох діб (наприклад, 2-7 діб) і забарвлювати кристалічним фіолетовим або MTT або аналізувати яким-небудь іншим колориметричним способом аналізу. Інший спосіб визначення проліферації являє собою порівняння захоплення3H-тимидина обробленими клітинами в присутності та відсутності антитіла проти клітини по винаходу. Після обробки антитілом клітки збирають і визначають величину радіоактивності отриманої ДНК, в сцинтиляційному лічильнику. Відповідні позитивні контролі включають обробку обраної клітинної лінії інгібуючим зростання антитілом, щодо якого відомо, що воно інгібує ріст цієї клітинної лінії. Інгібування росту пухлинних клітинin vivoможна визначати різними способами, відомими в даній галузі. Клітка пухлини може представляти собою клітку, яка сверхэкспрессирует поліпептид CD79b. Антитіло проти CD79b інгібує клітинну проліферацію экспрессирующей CD79b пухлинної клітиниin vitroабоin vivoприблизительеще більш переважно приблизно на 50-100% або 70-100%, в одному варіанті здійснення, при концентрації антитіла приблизно від 0,5 до 30 мкг/мл Інгібування росту можна визначати при концентрації антитіло приблизно від 0,5 до 30 мкг/мл або приблизно від 0,5 нМ до 200 нМ в клітинній культурі, де інгібування росту визначають через 1-10 діб після впливу на пухлинні клітини антитіла. Антитіло є інгібуючим зростанняin vivoякщо введення антитіла проти CD79b в кількості від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг маси тіла призводить до зниження розміру пухлини і до зниження проліферації пухлинних клітин в межах приблизно від 5 діб до 3 місяців після першого введення антитіла, переважно в межах приблизно від 5 до 30 діб.

Для селекції антитіла проти CD79b, яке викликають загибель клітин, можна оцінювати втрату цілісності мембрани, як зазначено, наприклад, через захоплення йодиду пропидия (PI), трипанового синього або 7AAD, відносно контролю. Аналіз захоплення PI можна проводити у відсутності комплементу і ефекторних імунних клітин. Експресують поліпептид CD79b клітини пухлини інкубують з середовищем окремо або з середовищем, що містить відповідне моноклональне антитіло проти CD79b (наі поділяють на аликвоти в накриті сіткою 35-мм пробірки 12×75 (1 мл на пробірку, 3 пробірки на оброблювану групу) для видалення клітинних грудок. Потім у пробірки додають PI (10 мкг/мл). Зразки можна аналізувати з використанням проточного цитометра FACSCANTMта програмного забезпечення FACSCONVERTTMCellQuest (Becton Dickinson). Антитіла проти CD79b, які призводять до статистично достовірного рівня клітинної загибелі, визначеної за захоплення PI, можна відбирати в якості індукують клітинну загибель антитіл проти CD79b.

Для скринінгу антитіл, які зв'язуються з эпитопом на полипептиде CD79b, связиваемом становлять інтерес антитілом, можна проводити загальноприйнятий аналіз перехресного блокування, такий як описано в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Цей аналіз можна використовувати для визначення наявності зв'язування антитіла з тією ж ділянкою або эпитопом, з яким зв'язується відоме антитіло проти CD79b з цього винаходу. Альтернативно, або додатково, можна проводити картування епітопів способами, відомими в даній галузі.Наприклад, для виявлення контактних залишків у послідовність антитіла можна вносити мутації, наприклад, скануванням аланіном. Мутантное антитіло спочатку тестують на зв'язування з п� різним ділянкам поліпептиду CD79b, можна використовувати в способах конкурентного аналізу з досліджуваними антитілами або з тестованим антитілом і антитілом з охарактеризованним або відомим эпитопом.

2. Деякі способи скринінгу билиотек

Антитіла проти CD79b щодо винаходу можна отримувати з використанням комбінаторних бібліотек для скринінгу антитіл з необхідною активністю або видами активності. Наприклад, в цій області відомі різні способи створення бібліотек фагового дисплею та скринінгу таких бібліотек щодо антитіл, які володіють необхідними характеристиками зв'язування. Такі способи описані, головним чином, в Hoogenboom et al. (2001), Methods in Molecular Biology 178:1-37 (o'brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ), і в певних варіантах здійснення, Lee et al. (2004) J. Mol. Товарbiol. 340:1073-1093.

По суті, клони синтетичних антитіл піддають селекції допомогою бібліотек фагового дисплею, які містять фаг, який експонує різні фрагменти змінної області (Fv) антитіла, злиті з білком оболонки фага. Такі фаговие бібліотеки сортують за допомогою афінної хроматографії проти необхідного антигену. Клони, що експресують Fv-фрагменти, здатні зв'язуватися з необхідним антигеном, адсорбуються на антиген і, таким�тримання можна далі підвищувати допомогою додаткових циклів адсорбції/элюирования антигену. Шляхом розробки відповідного способу скринінгу за допомогою антигену для селекції представляє інтерес клону фага з подальшим конструюванням клону інтактного антитіла проти CD79b з використанням послідовностей Fv із представляє інтерес фагового клону і відповідних послідовностей константною області (Fc), описаних у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda, MD (1991), vols. 1-3, можна отримувати будь-які з антитіл проти CD79b щодо винаходу.

У певних варіантах здійснення, антиген-зв'язуючий домен антитіла утворений з двох варіабельних (V) областей приблизно з 110 амінокислот, за однією з легкою (VL) і важкої (VH) ланцюгів, в обох з яких присутні три гипервариабельние петлі (HVR) або визначають комплементарність області (CDR). Вариабельние домени можуть функціонально експонуватися на фаге, або як одноланцюгових Fv-фрагментів (scFv), в яких VH і VL ковалентно зв'язані через короткий рухливий пептид, або як Fab-фрагментів, в яких вони обидві є злитими з константним доменом і взаємодіють нековалентно, як описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Як використовують у цьому документі, фаговие клони, що кодують scFv, і ф можна окремо клонувати полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і піддавати випадкової рекомбінації в фагових бібліотеках, в яких потім проводять пошук антиген-зв'язуючих клонів, як описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). Бібліотеки з імунізованих джерел забезпечують високоафінні антитіла до иммуногену без необхідності конструювання гібридом. Альтернативно, можна клонувати наївний репертуар для забезпечення одного джерела антитіл людини до широкого діапазону невласних, а також власних антигенів без імунізації, як описано Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). На закінчення, бібліотеки з наївним репертуаром також можна отримувати синтетично шляхом клонування не підданих реаранжировке сегментів V-генів з стовбурових клітин і використання праймерів для ПЛР, що містять випадкову послідовність, для кодування високо варіабельних областей CDR3 і для проведення реаранжировкиin vitro,як описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Товарbiol, 227: 381-388 (1992).

У певних варіантах здійснення використовують ниткоподібні фаги для експонування фрагментів антитіл шляхом злиття з минорним білком оболонки pIII. Фрагменти антитіл можуть бути експоновані у вигляді одноланцюгових Fv-фрагментів, в яких VH - і VL-домени пов'язані на одного поліпептидного ланцюга рухомим полипептидним спейсером, наприклад, як опі�а секретується в периплазму бактеріальної клітини-господаря, де збирається структура Fab-білок оболонки, яка експонується на поверхні фага шляхом витіснення деяких з білків оболонки дикого типу, наприклад, як описано в Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

Як правило, нуклеїнові кислоти, що кодують фрагменти гена антитіла, отримують з імунних клітин, отриманих від людини або тварин. Якщо є бажаною бібліотека, зміщена в бік клонів, спрямованих проти CD79b, індивіда імунізують за допомогою CD79b для забезпечення антитільної відповіді, і виділяють клітини селезінки та/або циркулюючі B-клітини, і інші лімфоцити периферичної крові (PBL) для конструювання бібліотеки. У кращому варіанті здійснення, отримують бібліотеки фрагментів гена антитіла людини, зміщену в бік клонів, спрямованих проти CD79b, шляхом забезпечення відповіді антитіл проти CD79b у трансгенної миші, володіє функціональним набором генів імуноглобулінів людини (і позбавленою функціональної ендогенної системи продукції антитіл), так що імунізація за допомогою CD79b призводить до виникнення B-клітин, що продукують антитіла людини проти CD79b. Створення продукують антитіла людини трансгенних мишей описано нижче.

Днием відповідного способу скринінгу для виділення B-клітин, експресують специфічне до CD79b мембраносвязанное антитіло, наприклад, шляхом поділу клітин з використанням афінної хроматографії з CD79b або адсорбції клітин на мічений флюорохромом CD79b з подальшою активованої флуоресценцією сортуванням клітин (FACS).

Альтернативно застосування клітин селезінки і/або B-клітин або інших PBL від неиммунизированного донора забезпечує краще уявлення можливого репертуару антитіл, а також дозволяє конструювання бібліотеки антитіл з використанням будь-якого виду тварин (людини або не відноситься до людини), в якому CD79b не є антигенним. Для бібліотек, що включають конструювання генів антитілin vitroзбирають стовбурові клітини індивіда для отримання нуклеїнових кислот, що кодують не піддані реаранжировке сегменти генів антитіл. Представляють інтерес імунні клітини можна отримувати з різних видів тварин, таких як людина, миша, щур, види зайцеподібні, вовчих, собачих, котячих, свиней, великої рогатої худоби, коней і птахів і т. д.

Нуклеїнову кислоту, що кодує вариабельние сегменти генів (включаючи сегменти VH і VL) виділяють із представляють інтерес клітин і амплифицируют. У разі подвергнуѷ лімфоцитів з подальшою полімеразної ланцюговою реакцією (ПЛР) з праймерами, співпадаючими з 5'- і 3'-кінцями підданих реаранжировке генів VH і VL, як описано в Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), тим самим отримуючи різноманітні репертуари V-генів для експресії. V-гени можна амплифицировать з кДНК і геномної ДНК з допомогою зворотних праймерів на 5'-кінці екзона, що кодує зрілий V-домен, і прямих праймерів, розташованих в J-сегменті, як описано в Orlandi et al. (1989) та Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Однак для ампліфікації з кДНК, зворотні праймери також можуть розташовуватися в лидерном екзоні, як описано в Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), а прямі праймери можуть розташовуватися в константною області, як описано в Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Для максимального підвищення комплементарності, праймери можна включати вирожденность, як описано в Orlandi et al. (1989) або Sastry et al. (1989). У певних варіантах здійснення, розмаїття бібліотеки максимально збільшують з використанням праймерів ПЛР, спрямованих на кожне сімейство V-генів для ампліфікації всіх доступних розташування VH і VL, присутніх у зразку нуклеїнової кислоти імунних клітин, наприклад, як описано в способі Marks et al., J. Mol. Товарbiol., 222: 581-597 (1991) або як описано в способі Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Для клонування � якості мітки на одному кінці, як описано в Orlandi et al. (1989), або шляхом подальшої ампліфікації за допомогою ПЛР з праймером з міткою, як описано в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Репертуари підданих синтетичної реаранжировке V-генів можна отримуватиin vitroз сегментів V-генів. Більшість із сегментів VH-генів людини були клоновані і отсеквеніровани (як описано в Tomlinson et al., J. Mol. Товарbiol, 227: 776-798 (1992)), і картировани (описано в Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); ці клоновані сегменти (включаючи всі головні конформації петлі H1 і H2) можна використовувати для отримання різноманітних репертуарів VH-генів з допомогою праймерів для ПЛР, що кодують петлі H3 з різноманітною послідовністю і довжиною, як описано в Hoogenboom and Winter, J. Mol. Товарbiol., 227: 381-388 (1992). Також можна отримувати репертуари VH, де все розмаїття послідовності сфокусовано в довгій петлі H3 з єдиної довжиною, як описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Сегменти Vκ і Vλ людини були клоновані і отсеквеніровани (описано в Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) і їх можна використовувати для отримання синтетичних репертуарів легких ланцюгів. Синтетичні репертуари V-генів, на основі низки збірок VH і VL, і довжин L3 і H3, кодують антитіла зі значним структурним різноманіттям. Пос�ro у відповідності зі способами Hoogenboom and Winter, J. Mol. Товарbiol, 227: 381-388 (1992).

Репертуари фрагментів антитіл можна конструювати, комбінуючи репертуари генів VH і VL різними шляхами. Кожен репертуар можна створювати в окремих векторах, і вектори піддавати рекомбінаціїin vitroнаприклад, як описано в Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), абоin vivoшляхом комбінаторної інфекції, наприклад, за допомогою системи loxP, описаної в Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). У підході рекомбінаціїin vivoвикористовується двухцепочечная структура Fab-фрагментів для подолання обмеження розміру бібліотеки, визначається ефективністю трансформаціїE. coli. Наївні репертуари VH і VL клонують окремо, один в плазміду, а інший в фаговий вектор. Потім дві бібліотеки комбінують допомогою інфекції фагом містять фагмиду бактерій, так що кожна клітина містить відмінне поєднання, і розмір бібліотеки обмежується лише числом присутніх клітин (приблизно 1012клонів). Обидва вектора містять сигнали рекомбінаціїin vivo,так що гени VH і VL рекомбінують в один реплікон і спільно упаковуються в фаговие віріони. Ці величезні бібліотеки забезпечують великі кількості різноманітних антитіл нировать послідовно в один вектор, наприклад, як описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), або об'єднувати допомогою ПЛР, а потім клонувати, наприклад як описано в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Складання допомогою ПЛР також можна використовувати для зв'язування ДНК VH і VL з ДНК, що кодує рухливий пептидний спейсер, з утворенням репертуарів одноланцюгових Fv (scFv). В іншому способі використовують "збірку за допомогою ПЛР у клітинах" для об'єднання генів VH і VL у лімфоцитах за допомогою ПЛР, а потім клонування репертуарів пов'язаних генів, як описано в Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Антитіла, що продукуються наївними бібліотеками (або природними або синтетичними) можуть мати помірну аффінність (Kd-1приблизно від 106до 107M-1), однак дозрівання афінності також можна імітуватиin vitroза допомогою конструювання і повторної селекції з вторинних бібліотек, як описано в Winter et al. (1994), вище. Наприклад, мутацію можна вносити випадковим чиномin vitroз використанням полімерази зі зниженою точністю (описано Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) в способі Hawkins et al., J. Mol. Товарbiol., 226: 889-896 (1992) або в способі Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Крім того, дозрівання афінності можна проводити шляхом внесення�учайную послідовність, охоплює представляє інтерес CDR, обраних окремих клонах Fv, і скринінгом на клони з найбільш високою аффинностью. В WO 9607754 (опублікованій 14 березня 1996 року) описаний спосіб індукції мутагенезу визначальною комплементарність галузі легкої ланцюга імуноглобуліну для створення бібліотеки генів легкого ланцюга. Іншим ефективним підходом є рекомбінація VH - або VL-доменів, відібраних за допомогою фагового дисплею, з репертуарами зустрічаються в природі варіантів V-доменів, отриманими з неиммунизированних донорів, і скринінг на найбільш високу афінність в декількох раундах повторної перетасовки ланцюгів, як описано в Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Цей спосіб дозволяє продукцію антитіл і фрагментів антитіл з аффинностью приблизно 10-9M або менше.

Скринінг бібліотек можна проводити різними способами, відомими в даній галузі. Наприклад, CD79b можна використовувати для нанесення на лунки адсорбційних планшетів, експресувати на клітинах-хазяїнах, фіксованих на адсорбційних планшетах або використовувати для сортування клітин, або конъюгировать з біотином для уловлювання покритими стрептавидином гранулами, або використовувати будь-якому способі пэннинга библиот�умовах, підходять для зв'язування щонайменше частини фагових частинок з адсорбентом. Зазвичай вибирають, умови, включаючи pH, іонну силу, температуру і т. п., що імітують фізіологічні умови. Фаги, пов'язані з твердою фазою, промивають, а потім элюируют кислотою, наприклад, як описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), або лугом, наприклад, як описано в Marks et al., J. Mol. Товарbiol., 222: 581-597 (1991), або за допомогою конкуренції з антигеном CD79b, наприклад у спосіб, схожий зі способом конкуренції з антигеном в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). За один раунд селекції фаги можна збагачувати в 20-1000 раз. Більш того, збагачені фаги можна вирощувати в бактеріальної культури і піддавати подальшим раундів селекції.

Ефективність селекції залежить від безлічі факторів, включаючи кінетику дисоціації при промиванні, і можливість одночасної зустрічі безлічі фрагментів антитіл на одному фаге з антигеном. Антитіла з швидкою кінетикою дисоціації (і слабкою аффинностью зв'язування) можна затримувати з використанням короткого промивання, полівалентного фагового дисплею і високою щільністю нанесення антигену на тверду фазу. Висока щільність не тільки стабілізує фаг при полівалентних взаємодіях, але також спо�і (і високою аффинностью зв'язування) можна забезпечувати, використовуючи тривалі промивання і одновалентний фаговий дисплей, як описано в Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) і в WO 92/09690, і низьку щільність нанесення антигену, як описано в Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Селекцію між фаговими антитілами з різною аффинностью до CD79b можна проводити навіть при афінності, яка відрізняється трохи. Однак, випадкова мутація обраного антитіла (наприклад, як відбувається в деяких способах дозрівання афінності) може призвести до виникнення багатьох мутантів, більшість з яких зв'язуються з антигеном, і деякі з яких володіють більш високою аффинностью. При обмеженні CD79b, рідкісний високоаффинний фаг може бути конкурентно усунутий. Для збереження всіх мутантів з більш високою аффинностью, фаги можна інкубувати з надлишком биотинилированного CD79b, але з биотинилированним CD79b в концентрації з більш низькою молярностью, ніж передбачувана молярна афінність, постійна для CD79b. Потім зв'язують з високою аффинностью фаги можна вловлювати покритими стрептавидином парамагнитними гранулами. Таке "рівноважний уловлювання" дозволяє селекцію антитіл згідно їх афінності зв'язування, з чутливістю, яка дозволяє виділення мутантних ожна змінювати умови, використовуються для промивання фагів, пов'язаних з твердою фазою, для розрізнення на основі кінетики дисоціації.

Клони, спрямовані проти CD79b, можна відбирати на основі активності. У певних варіантах здійснення, винахід відноситься до антитілам проти CD79b, які зв'язуються з живими клітинами, які природним чином експресують CD79b. В одному варіанті здійснення, винахід відноситься до антитілам проти CD79b, які блокують зв'язування між лігандом CD79b і CD79b, але не блокують зв'язування між лігандом CD79b і другим білком. Клони Fv, що відповідають таким антитілам проти CD79b, можна піддавати селекції за допомогою (1) виділення клонів, спрямованих проти CD79b, з фаговой бібліотеки, як описано вище, і необов'язково розмноження виділеної популяції фагових клонів шляхом вирощування популяції у відповідному бактеріальному господаря; (2) селекції CD79b і другого білка, проти якого є бажаною блокуюча і неблокирующая активність, відповідно; (3) адсорбції фагових клонів, спрямованих проти CD79b, іммобілізований на CD79b; (4) застосування надлишку другого білка для элюирования будь-яких небажаних клонів, які розпізнають зв'язують CD79b детермінанти, до�ів, які залишаються адсорбованими після стадії (4). Необов'язково, клони з необхідними блокуючими/неблокирующими властивостями можна далі збагачувати шляхом повторення процесів селекції, описаних у цьому документі, один чи кілька разів.

ДНК, що кодує утворені з гибридоми моноклональні антитіла або клони Fv фагового дисплею щодо винаходу, легко виділяти і секвенувати з використанням загальноприйнятих способів (наприклад з використанням олігонуклеотидних праймерів, сконструйованих для специфічної ампліфікації представляють інтерес кодуючих ділянок важкої і легкої ланцюгів з гибридоми або ДНК-матриці фага). Після виділення ДНК можна поміщати в експресують вектори, які потім трансфицируют в клітини-господарі, такі як клітиниE. coliклітини COS мавпи, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), або клітини мієломи, які в іншому випадку не продукують білок імуноглобуліну, забезпечуючи синтез необхідних моноклональних антитіл в рекомбінантних клітинах-хазяїнах. Оглядові статті з рекомбінантної експресії в бактеріях ДНК, що кодує антитіло, включають Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) і Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

ДНК, що кодує клони Fv щодо винаходу можногкой ланцюга (наприклад, відповідні послідовності ДНК можна отримувати відповідно до Kabat et al., вище) з утворенням клонів, що кодують повнорозмірні або неповні важкі та/або легкі ланцюги. Буде зрозуміло, що для цієї мети можна використовувати константние області будь-якого изотипа, включаючи константние області IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, і що такі константние області можна отримувати від людини або будь-якого виду тварин. Клон Fv, утворений з ДНК вариабельного домену одного виду тварин (такого як людина), а потім злитий з ДНК константною галузі іншого виду тварин з утворенням кодуючої послідовності(їй) "гібридної" повнорозмірною важкої ланцюга і/або легкого ланцюга, включений до визначення "химерного" і "гібридного" антитіла, як використовують у цьому документі. У певних варіантах здійснення, клон Fv, утворений з ДНК змінної області людини, є злитим з ДНК константною області людини з освітою кодуючої послідовності(їй) для повнорозмірної або неповної важкої і/або легкої ланцюгів.

ДНК, що кодує антитіло проти CD79b, що відбувається з гибридоми, також можна модифікувати, наприклад, шляхом заміни кодуючої послідовності константними доменами важкої і Епособе Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). ДНК, що кодує відбувається з гибридоми або Fv-клону антитіло або фрагмент, далі можна модифікувати ковалентним зв'язуванням з кодує послідовністю імуноглобуліну всій кодуючої послідовності не є імуноглобуліном поліпептиду, або її частини. Таким чином, отримують "химерні" або "гібридні" антитіла, які мають специфічність зв'язування походять з Fv-клону або клону гибридоми антитіл щодо винаходу.

C. Антитілозалежна опосредуемая ферментом пролекарственная терапія (ADEPT)

Антитіла по справжньому винаходу можна також використовувати в ADEPT шляхом кон'югації антитіла з активує проліки ферментом, який перетворює проліки (наприклад, пептидильное хіміотерапевтичне засіб див. WO81/01145) в активний лікарський засіб проти злоякісної пухлини. См., наприклад, WO 88/07378 і патент США No. 4975278.

Ферментний компонент иммуноконъюгата, підходящий для ADEPT, включає будь-фермент, здатний діяти на проліки таким чином, щоб перетворювати його в більш активну цитотоксичну форму.

Ферменти, які є придатними у способі з цього винаходу, включають, але не �е лікарські засоби; арилсульфатазу, підходящу для перетворення сульфат-містять проліків у вільні лікарські засоби; цитозиндезаминазу, підходящу для перетворення нетоксичного 5-фторцитозина на лікарський засіб проти злоякісної пухлини, 5-фторурацил; протеази, такі як протеазаserratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидази і катепсіни (такі як катепсіни B і L), які придатні для перетворення пептид-містять проліків у вільні лікарські засоби; D-аланилкарбоксипептидази, підходящі для перетворення проліків, які містять заступники у вигляді D-амінокислот; розщеплюють вуглевод ферменти, такі як β-галактозидаза і нейраминидаза, підходящі для перетворення гликозилированних проліків у вільні лікарські засоби; β-лактамазу, що підходить для перетворення лікарських засобів, перетворених в похідне з β-лактамами, вільні лікарські засоби; і пенициллинамидази, такі як амидаза пеніциліну V або амидаза пеніциліну G, підходящі для перетворення лікарських засобів, перетворених в похідне за їх азотам аміногруп допомогою феноксиацетильной або фенилацетильной груп, відповідно, у вільні лекарственими", можна використовувати для перетворення проліків щодо винаходу у вільні активні лікарські засоби (див., наприклад, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Кон'югати антитіло-абзим можна отримувати, як описано в цьому документі, для доставки абзима в популяції пухлинних клітин.

Ферменти з цього винаходу можна ковалентно пов'язувати з антитілами проти CD79b способами, відомими в даній галузі, такими як застосування гетеробифункциональних реагентів для зшивання, розглянутих вище. Альтернативно злиті білки, що містять щонайменше антиген-зв'язує область антитіла щодо винаходу, пов'язану щонайменше з функціонально активною частиною ферменту щодо винаходу, можна конструювати з використанням способів рекомбінантних ДНК, добре відомих в даній області (див., наприклад, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).

D. Антитіло проти CD79b

На додаток до антитілам проти CD79b, описаний у цьому документі, передбачається, що можна отримувати варіанти антитіл проти CD79b. Варіанти антитіл проти CD79b можна отримувати за допомогою внесення відповідних нуклеотидних змін до кодує ДНК, та/або за допомогою синтезу необхідного антитіла або поліпептиду. Фахівці в данн CD79b, наприклад, вони можуть змінювати кількість та розташування ділянок глікозилювання або змінювати характеристики заякоривания на мембрані.

Зміни антитіл проти CD79b, описаних у цьому документі, можна проводити, наприклад, з використанням будь-якого із способів і посібників для консервативних і неконсервативних мутацій, зазначених, наприклад, у патенті США No. 5364934. Зміна може представляти собою заміну, делецию або вставку одного або декількох кодонов, що кодують антитіло або пептид, які призводять до зміни амінокислотної послідовності порівняно з нативним антитілом або поліпептидом. Необов'язково зміна являє собою заміну щонайменше однієї амінокислоти інший амінокислотою в одному або декількох доменах антитіл проти CD79b. Інформацію про те, який амінокислотний залишок може бути вставлений, заміщений або видалений без несприятливого впливу на необхідну активність, можна знайти за допомогою порівняння послідовності антитіла проти CD79b з послідовністю гомологічною відомої білкової молекули і мінімізації кількості замін амінокислотної послідовності в ділянках високої гомології. Амінокислотні заміни можуть бути результатом�й як заміна лейцину серином, тобто, вони можуть являти собою консервативні амінокислотні заміни. Розмір вставок, делецій або замін необов'язково може перебувати в діапазоні приблизно від 1 до 5 амінокислот. Допустиме зміна можна визначати систематичним проведенням вставок, делецій або замін амінокислот в послідовності і тестуванням отриманих варіантів щодо активності, що проявляється повнорозмірною або зрілої нативної послідовністю.

У цьому документі передбачені фрагменти антитіл проти CD79b. Такі фрагменти можуть бути вкорочені з N-кінця або C-кінця, або вони можуть бути позбавлені внутрішніх залишків, наприклад, порівняно з повнорозмірним нативним антитілом або білком. Такі фрагменти позбавлені амінокислотних залишків, які не є необхідними для необхідної біологічної активності антитіл проти CD79b.

Фрагменти антитіл проти CD79b можна отримувати будь-яким з безлічі загальноприйнятих способів. Необхідні пептидні фрагменти можна хімічно синтезувати. Альтернативний підхід залучає отримання антитіла або поліпептидних фрагментів ферментативним розщепленням, наприклад, шляхом обробки білка ферментом, про який відомо, що він розщеплює білки і ферменти рестрикції і виділення потрібного фрагменту. Інший відповідний спосіб залучає виділення і ампліфікацію фрагмента ДНК, що кодує необхідну антитіло або поліпептидний фрагмент, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). В якості 5' і 3'-праймерів в ПЛР використовують олигонуклеотиди, які визначають кінці фрагмента ДНК. Переважно фрагменти антитіл проти CD79b мають щонайменше один вид біологічної та/або імунологічної активності, що співпадає з видами активності нативного антитіла проти CD79b, описаного в цьому документі.

У конкретних варіантах здійснення, що представляють інтерес консервативні заміни представлені в таблиці 6 під заголовком "Кращі заміни". Якщо такі заміни призводять до зміни біологічної активності, тоді вносять суттєві зміни, що позначаються в таблиці 6 "ілюстративними замінами", або, як описано нижче відносно класів амінокислот, і проводять скринінг продуктів.

Таблиця 6
Вихідний залишокІлюстративні заміниКращі заміни
Ala (A)lys; gln; asnlys
Asn (N)gln; his; lys; arggln
Asp (D)gluglu
Cys (C)serser
Gln (Q)asnasn
Glu (E)aspasp
Gly (G)pro; alaala
His (H)asn; gln; lys; argarg
Ile (I)leu; val; met; ala; phe; норлейцинleu
Leu (L)норлейцин; ile; val;
met; ala; phe
ile
Lys (K)arg; gln; asnarg
Met (M)leu; phe; ileleu
alaala

Ser (S)thrthr
Thr (T)serser
Trp (W)tyr; phetyr
Tyr (Y)trp; phe; thr; serphe
Val (V)ile; leu; met; phe; ala; норлейцинleu

Істотні модифікації функції або імунологічних властивостей антитіла проти CD79b проводять, вибираючи заміни, які значно відрізняються за їх ефекту на підтримку (a) структури поліпептидного кістяка в області заміни, наприклад, такий як конформація у вигляді шару або спіралі, (b) заряду або гідрофобності молекули у ділянці-мішені, або (c) обсягу бічного ланцюга. Зустрічаються в природі залишки можна розділити на групи на основі спільних властивостей їх бічних ланцюгів:

(1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;

(2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr;

(3) кислі: asp, glu;

�еконсервативние заміни втягують заміну члена одного з цих класів членом з іншого класу. Такі заміщені залишки також можна вносити до ділянки консервативних замін або, більш переважно, в інші (неконсервативние) ділянки.

Зміни можна проводити з використанням способів, відомих у цій галузі, таких як опосредуемий олигонуклеотидом (сайт-спрямований) мутагенез, сканування аланіном і мутагенез допомогою ПЛР. Сайт-спрямований мутагенез (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), касетний мутагенез (Wells et al., Gene. 34:315 (1985)), мутагенез з рестрикції-селекцією (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) або інші відомі способи можна проводити на клонованої ДНК з отриманням варіанти ДНК антитіла проти CD79b.

Для ідентифікації однієї або декількох амінокислот вздовж безперервної послідовності можна використовувати аналіз сканування амінокислотами. До кращим скануючим амінокислот відносяться відносно невеликі нейтральні амінокислоти. Такі амінокислоти включають аланін, гліцин, серин і цистеїн. Аланін, як правило, є кращою скануючої амінокислотою в цій групі, оскільки вона усуває боко�, cience. 244: 1081-1085 (1989)]. Також аланін зазвичай є кращим, оскільки він являє собою найбільш поширену амінокислоту. Крім того, він часто зустрічається як в поглиблених, так і в експонованих, положеннях [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Товарbiol., 150:1 (1976)]. Якщо заміна аланіном не призводить до достатньою кількістю варіанти, можна використовувати изотерную амінокислоту.

Будь залишок цистеїну, не залучений до підтримання належної конформації антитіла проти CD79b, також можна замінювати, головним чином, серином, підвищуючи стабільність молекули до окислення і перешкоджаючи аберрантному поперечного зшивання. Навпаки, для підвищення стабільності, в таку молекулу можна вносити цистеиновую зв'язок(і) (зокрема де антитіло являє собою фрагмент антитіла, такий як Fv-фрагмент).

Особливо переважний тип варіанту з замінами включає заміну одного або декількох залишків гипервариабельного ділянки вихідного антитіла (наприклад, гуманизированного антитіла або антитіла людини). Як правило, отриманий варіант(и), вибраний для подальшої розробки, буде мати кращі біологічними властивостями відносно вихідного антитіла, з якого ристанням фагового дисплею. В короткому викладі кілька областей гипервариабельного ділянки (наприклад, 6-7 областей) піддають мутації з отриманням усіх можливих амінокислотних замін в кожному ділянці. Отримані таким чином варіанти антитіла експонують в якості одновалентних антитіл з часток, ниткоподібних фагів в якості молекул, злитих з продуктом гена III M13 та упакованих у кожну частинку. Потім експоновані на фаге варіанти піддають скринінгу щодо їх біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування), як описано в цьому документі. В цілях ідентифікації областей гипервариабельного ділянки-кандидата для модифікації, можна проводити скануючий аланіном мутагенез, ідентифікуючи залишки гипервариабельного ділянки, які беруть участь у значною мірою у зв'язуванні антигену. Альтернативно або додатково, може бути доцільним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло в цілях ідентифікації точок контакту між антитілом і поліпептидом CD79b. Такі контактні залишки і сусідні залишки є кандидатами для заміни у відповідності зі способами, описаними в цьому документі. Після отримання таких варіантів, панель варіантів піддають скрини�чих аналізах можна відбирати для подальшої розробки.

Молекули нуклеїнових кислот, що кодують варіанти амінокислотної послідовності антитіла проти CD79b, отримують різними способами, відомими в даній галузі. Ці способи включають, але не обмежуються ними, виділення з природного джерела (у разі зустрічаються в природі варіантів амінокислотної послідовності) або отримання олигонуклеотид-опосредуемим (або сайт-спрямованим) мутагенезом, мутагенезом допомогою ПЛР, і касетним мутагенезом послідовності раніше отриманого варіанту або не є варіантом версії антитіла проти CD79b.

E. Модифікації антитіл проти CD79b

В обсяг цього винаходу включені ковалентно модифіковані антитіла проти CD79b. Один тип ковалентного модифікації включає проведення реакції заданих амінокислотних залишків антитіл проти CD79b з органічним утворюють похідне речовиною, яке здатне реагувати з певними бічними ланцюгами або N - або C-кінцевими залишками таких антитіл проти CD79b. Відповідним є перетворення бифункциональними речовинами, наприклад, для поперечного зшивання антитіла проти CD79b з нерозчинної у воді матрицею підкладки або поверхнею для застосування в очищенні антитетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, складні ефіри N-гидроксисукцинимида, наприклад, складні ефіри з 4-азидосалициловой кислотою, гомобифункциональние складні имидоэфири, включаючи дисукцинимидиловие складні ефіри, такі як 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), біфункціональні малеимиди, такі як біс-N-малеимидо-1,8-октан, і такі речовини, як метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат.

Інші модифікації включають дезамидацию глутаминильних і аспарагинильних залишків до відповідних глутамильних і аспартильних залишків, відповідно, гідроксилювання проліну та лізину, фосфорилювання гідроксильних груп серильних і треонильних залишків, метилювання α-аміногруп бічних ланцюгів лізину, аргініну і гістидину [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], ацетилювання N-кінцевого аміна і амидацию будь-C-кінцевий карбоксильної групи.

Інший тип ковалентного модифікації антитіл проти CD79b включає зміну нативного патерну глікозилювання антитіла або поліпептиду. "Зміна нативного патерну глікозилювання" визначають як видалення одного або декількох вуглеводневих груп, що зустрічаються в нативної послідовності антитіла проти CD79b (або за допомогою удферментативними способами), та/або додавання одного або декількох ділянок глікозилювання, які не присутні в нативної послідовності антитіла проти CD79b. Крім того, це вираз включає кількісні зміни глікозилювання нативних білків, утягують зміна структури і співвідношень різних присутніх вуглеводних груп.

Глікозилювання антитіл та інших поліпептидів, як правило, є або N-пов'язаних, або O-зв'язаним. N-пов'язане глікозилювання відноситься до приєднання вуглеводної групи до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидние послідовності аспарагін-X-серин і аспарагін-X-треонін, де X являє собою будь-яку амінокислоту, за винятком проліну, являють собою послідовності, розпізнавані для ферментативного приєднання вуглеводної групи до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність будь-якої з цих трипептидних послідовностей в полипептиде створює потенційний ділянку глікозилювання. O-пов'язане глікозилювання відноситься до приєднання одного з цукрів, що представляють собою N-ацетилгалактозамін, галактозу або ксилозу, до гидроксиаминокислоте, зазвичай, до серину або треонину, хоча також можна використовувати 5-гідрокси�змінюючи аминокислотную послідовність, щоб вона містила одну або кілька з описаних вище трипептидних послідовностей (для дільниць N-пов'язаного глікозилювання). Також зміни можна проводити за допомогою додавання до послідовності або заміни за допомогою одного або декількох залишків серину або треоніна в послідовності вихідного антитіла проти CD79b. Аминокислотную послідовність антитіла проти CD79b необов'язково можна змінювати за допомогою змін на рівні ДНК, зокрема, шляхом мутації ДНК, що кодує послідовність антитіла проти CD79b, попередньо обраних підставах, щоб отримати кодони, які будуть транслювати необхідні амінокислоти.

Іншим способом збільшення кількості вуглеводних груп на антителе проти CD79b є хімічне або ферментативне приєднання глікозидів до поліпептиду. Такі способи описані в даній області, наприклад, в WO 87/05330, опублікованій 11 вересня 1987 року, і в Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306 (1981).

Видалення вуглеводних груп, присутніх на антителе проти CD79b, можна проводити хімічно або ферментативно або за допомогою мутаційного заміщення кодонов, які кодують амінокислотні залишки, які служать в якості мишенр, Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) і Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981). Ферментативне відщеплення вуглеводних груп на полипептидах можна проводити з використанням безлічі ендо - і экзогликозидаз, як описано Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Інший тип ковалентного модифікації антитіла проти CD79b включає зв'язування антитіла з одним з безлічі небілкових полімерів, наприклад, поліетиленгліколем (PEG), полипропиленгликолем або полиоксиалкиленами, способом, зазначеним у патентах США No. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 або 4179337. Антитіло також можна укладати в мікрокапсули, отримані, наприклад, способами коацервации або міжфазної полімеризації (наприклад, мікрокапсули на основі гидроксиметилцеллюлози або желатину і мікрокапсули на основі поліметилметакрилату, відповідно), колоїдні системи для доставки лікарського засобу (наприклад, ліпосоми, мікросфери на основі альбуміну, микроэмульсии, наночастинки і нанокапсули), або в микроэмульсии. Такі способи описані в Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

Антитіло проти CD79b по справжньому винаходу також можна модифікувати таким чином, щоб утворювалися химерні молекули, що містять антитіло проти CD79b, поєднані з іншим гетерологич� молекула містить антитіло проти CD79b, злите з поліпептидом-міткою, який забезпечує епітоп, з яким може селективно зв'язуватися антитіло проти мітки. Епітоп-мітку, як правило, поміщають на N - або С-кінець антитіла проти CD79b. Детекцію присутності таких мічених эпитопом форм антитіл проти CD79b можна проводити з використанням антитіла проти поліпептиду-мітки. Також надання епітопу-мітки забезпечує простоту очищення антитіла проти CD79b способами афінної очистки з використанням антитіла проти мітки або іншого типу афінної матриці, яка зв'язується з эпитопом-міткою. Різні поліпептиди-мітки і відповідні антитіла до них добре відомі в цій галузі. Їх приклади включають мітки полигистидина (poly-his) або полі-гістидин-гліцину (poly-his-gly); поліпептид-мітку flu HA і антитіло до нього 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Товарbiol., 8:2159-2165 (1988)]; мітку c-myc і антитіла до неї 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 і 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; і мітку у вигляді глікопротеїну D (gD) вірусу простого герпесу і антитіло до неї [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Інші поліпептиди-мітки включають Flag-пептид [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; пептид-епітоп KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид-епітоп α-тубуліну [Skinner et al., J. Товарbiol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; і пептидний мітку білка гена 10 T7 [Lutсодержать антитіло проти CD79b, злите з імуноглобуліном або конкретною галуззю імуноглобуліну. Для двовалентної форми химерної молекули (також позначається як "иммуноадгезин"), таке злиття може бути з Fc-областю молекули IgG. Злиття молекул Ig переважно включає заміну розчинної (віддалений або інактивований трансмембранний домен) формою антитіла проти CD79b щонайменше одного вариабельного ділянки в молекулі Ig. В особливо кращому варіанті здійснення, злита молекула імуноглобуліну включає шарнірну область, CH2і CH3, або шарнірну область, CH1-, CH2- і CH3-ділянки молекули IgG1. Для отримання злитих молекул імуноглобуліном також див. патент США No. 5428130, виданий 27 червня 1995 року.

F. Отримання антитіл проти CD79b

Представлене нижче опис відноситься, головним чином, до отримання антитіл проти CD79b допомогою культивування клітин, трансформованих або трансфицированних вектором, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло проти CD79b. Безумовно, передбачається, що для отримання таких антитіл проти CD79b можна використовувати альтернативні способи, які добре відомі в цій галузі. Наприклад, відповідну аминокисзних способів [див., наприклад, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. Синтез білківin vitroможна проводити з використанням ручних способів або з допомогою автоматів. Автоматизований синтез можна проводити, наприклад, із застосуванням Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) з використанням інструкцій виробника. Різні частини антитіла проти CD79b можна хімічно синтезувати окремо і комбінувати з використанням хімічних або ферментативних способів з отриманням потрібного антитіла проти CD79b.

1. Виділення ДНК, що кодує антитіло проти CD79bДНК, що кодує антитіло проти CD79b, можна отримувати з бібліотеки кДНК, отриманої з тканини, імовірно володіє мРНК антитіла проти CD79b, і экспрессирующей її на піддається детекції рівні. Таким чином, ДНК антитіла проти CD79b людини, можна зручно отримувати з бібліотеки кДНК, отриманої з тканини людини. Ген, що кодує антитіло проти CD79b, також можна отримувати з геномної бібліотеки або відомими способами синтезу (наприклад, автоматизованим синтезом нуклеїнової кислоти).

Бібліотеки можна піддавати скринінгу за допомогою зондів (таких як олигонуклеотиди щонайменше при їм білка. Скринінг кДНК або геномної бібліотеки певним зондом можна проводити з використанням стандартних способів, як описано в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Альтернативним способом виділення гена, що кодує антитіло проти CD79b є застосування технології ПЛР [Sambrook et al., вища; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Способи скринінгу бібліотеки кДНК добре відомі в цій галузі. Послідовності олігонуклеотидів, відібрані в якості зондів, повинні володіти достатньою довжиною і повинні бути досить унікальними, щоб мінімізувати хибнопозитивні результати. Переважно олигонуклеотид є міченим, щоб його можна було виявити при гібридизації ДНК в бібліотеці, піддається скринінгу. Способи мічення добре відомі в даній області і включають застосування радіоактивних міток, таких як мічений32P ATP, биотинилирование або мічення ферментом. Умови гібридизації, включаючи умови помірної жорсткості та високої жорсткості, представлені в Sambrook et al., вище.

Послідовності, ідентифіковані в таких способах скринінгу бібліотек, можна порівнювати і вирівнювати з іншими відомими послідовність�s даних послідовностей. Ідентичність послідовностей (на рівні або амінокислот, або нуклеотидів) у певних ділянках молекули або протягом повнорозмірною послідовності можна визначати з використанням способів, відомих в даній області і як описано в цьому документі.

Нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, що кодує білок, можна отримувати скринінгом певних бібліотек кДНК або геномних бібліотек з використанням встановленої амінокислотної послідовності, описаної в цьому документі вперше, і, якщо необхідно, з використанням загальноприйнятих способів подовження праймерів, як описано в Sambrook et al., вище, для детекції попередників і проміжних форм при процессингу мРНК, які можуть не піддаватися зворотної транскрипції в кДНК.

2. Вибір і трансформація клітин-господарів

Клітини-господарі трансфицируют або трансформують экспрессирующими або клонирующими векторами, описаними в цьому документі, для продукції антитіла проти CD79b і культивують в загальноприйнятих поживних середовищах, модифікованих відповідним чином для індукції промоторів, селекцію трансформантів або ампліфікації генів, що кодують необхідні последоватвибрать без зайвого експериментування. Як правило, принципи, протоколи та практичні способи для максимізації продуктивності клітинних культур можна знайти в Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) і Sambrook et al., вище.

Способи трансфекції эукариотических кліток і трансформації прокариотических клітин, під якими розуміють введення ДНК у клітину, таким чином, щоб ДНК реплицировалась, або экстрахромосомним, або хромосомним інтегруванням, відомі фахівця в даній області, наприклад, опосредуемий CaCl2, CaPO4, ліпосомами спосіб і електропорація. В залежності від використовуваної клітини-господаря, трансформацію проводять з використанням стандартних методів, придатних для таких клітин. Обробку кальцієм з використанням хлориду кальцію, як описано в Sambrook et al., вище, або электропорацию, як правило, використовують для прокаріотів. Для трансформації певних клітин рослин використовують інфікування допомогоюAgrobacterium tumefaciensяк описано в Shaw et al., Gene. 23:315 (1983) і WO 89/05859, опублікованій 29 червня 1989 року. Для клітин ссавців без таких клітинних стінок можна використовувати спосіб осадження фосфатом кальцію по Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Основні аспекти трансфекций систем клітин-господарів млекопитаolingen et al., J. Bact, 130:946 (1977) і Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Однак також можна використовувати інші способи введення ДНК в клітини, наприклад, за допомогою мікроін'єкції в ядро, електропорації, злиття протопласта бактерій з інтактними клітинами, або поликатионов, наприклад, полибрена, полиорнитина. Для різних способів трансформації клітин ссавців, див. Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) і Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Відповідні клітини-господарі для клонування або експресії ДНК у вектори, представлені у цьому документі, включають клітини прокаріотів, дріжджів або вищих еукаріотів.

a. Прокариотические клітини-господарі

Відповідні прокаріоти включають, але не обмежуються ними еубактерії, такі як грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Enterobacteriaceae, такі якE. coli. Різні штамиE. coliє загальнодоступними, такі якE. coliK12 штам MM294 (ATCC 31446);E. coliX1776 (ATCC 31537);E. coliштам W3110 (ATCC 27325) і K5 772 (ATCC 53635). Інші відповідні прокариотические клітини-господарі включають Enterobacteriaceae, такі якEscherichiaнаприклад,E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus,Salmonellaнаприклад,Salmonellatyphimurium,Serratiaнаприклад,Serratia marcescansтаShigella, а такожBacilli, такі якB. subtili�акіP. Aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, ParacoccusіStreptomyces. Ці приклади є ілюстративними, але не обмежують. Штам W3110 є одним особливо кращим господарем або батьком, оскільки він являє собою поширений штам-господар для ферментації продукту рекомбінантної ДНК. Переважно, клітина-господар секретує мінімальні кількості протеолітичних ферментів. Наприклад, штам W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D. C: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; номер депонованого зразка ATCC No. 27325) можна модифікувати для досягнення генетичної мутації в генах, що кодують білки, ендогенні для господаря, приклади таких господарів включаютьE. coliW3110 штам 1A2, який має повний генотип tonA;E. coliW3110 штам 9E4, який має повний генотипtonA ptr3;E. coliW3110 штам 27C7 (ATCC 55244), який має повний генотипtonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ampT kanr;E. coliW3110 штам 37D6, який має повний генотипtonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvGkanr;E. coliW3110 штам 40B4, який представляє собою штам 37D6 з делеционной мутацією degP без стійкості до канаміцину;E. coliW3110 штам 33D3, має генотип W3110 ΔfhuAtonA)ptr3lacIqlacL8ΔompTΔ (nmpc-fepE)degP41<� патенті США No. 4946783, виданому 7 серпня 1990 року. Також підходять інші штами та їх похідні, такі якE. coli294 (ATCC 31446),E. coliB,E. coliλ1776 (ATCC 31537) іE. coliRV308 (ATCC 31608). Всі ці приклади є ілюстративними, але не обмежують. Способи конструювання похідних будь-який із зазначених вище бактерій, мають певні генотипи, відомі в даній області і описані, наприклад, в Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Як правило, необхідно вибирати відповідні бактерії, враховуючи здатність до реплікації репликона в клітинах бактрий. Наприклад, видиE. coli,SerratiaабоSalmonellaможна відповідним чином використовувати в якості господарів, коли для надання репликона використовують добре відомі плазміди, такі як pBR322, pBR325, pACYC177 або pKN410. Як правило, клітина-господар повинна секретувати мінімальні кількості протеолітичних ферментів, і може бути бажаним додавання в клітинну культуру додаткових інгібіторів протеаз. Альтернативно підходять способи клонуванняin vitroнаприклад, ПЛР або інші полімеразні реакції нуклеїнових кислот.

Повнорозмірне антитіло, фрагменти антитіла і злиті білки антитіла можна продукувати в бактеріях, зокрема, коли гликозилирован�еским засобом (наприклад, токсином) і сам иммуноконъюгат демонструє ефективність щодо руйнування пухлинних клітин. Повнорозмірні антитіла володіють більш тривалим часом напівжиття в кровотоці. ПродукціяE. coliє більш швидкого та більш економічною. Для експресії фрагментів антитіла та поліпептидів в бактеріях, див., наприклад, U. S. 5648237 (Carter et. al), U. S. 5789199 (Joly et al) та U. S. 5840523 (Simmons et al.) в яких описані ділянку ініціації трансляції (TIR) і сигнальні послідовності для оптимізації експресії і секреції, ці патенти включені в справжній документ в якості посилань. Після експресії антитіло виділяють з клітинної масиE. coliв розчинній фракції, і його можна очищати, наприклад, за допомогою колонки з білком A або G, в залежності від изотипа. Кінцеву очистку можна проводити аналогічно процесу очищення антитіла, експресованого, наприклад, у клітинах CHO.

b. Эукариотические клітини-господарі

На додаток до прокариотам, придатними господарями для клонування та експресії векторів, що кодують антитіло проти CD79b є эукариотические мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі. Часто використовують нижчий эукариотический мікроорганізм-господарSaccharomyces cerevisiae. Інші господарі вкл�т США No. 4943529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), наприклад, такі якK. lactis(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2):737-742 [1983]),K. fragilis(ATCC 12424),K. bulgaricus(ATCC 16045),K. wickeramii(ATCC 24178),K. waltii(ATCC 56500),K. drosophilarum(ATCC 36906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)),K. thermotoleransіK. marxianus;yarrowia(EP 402226);Pichia pastoris(EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 [1988]);Candida;Trichoderma reesia(EP 244234);Neurospora crassa(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]);Schwanniomyces, такі якSchwanniomyces occidentalis(EP 394538, опублікований 31 жовтня 1990 року); і нитчасті гриби, наприклад, такі якNeurospora, Penicillium, Tolypocladium(WO 91/00357, опублікована 10 січня 1991 року), і господаріAspergillus, такі якA. nidulans(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene. 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 1470-1474 [1984]) іA. niger(Kelly and Hynes, EMBO J. 4:475-479 [1985]). Для цього придатні метилотропние дріжджі і вони включають, але не обмежуються ними, дріжджі, здатні рости на метанолі, вибрані з пологів, що складаються зHansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, TorulopsisіRhodotorula. Перелік конкретних видів, які є прикладами цього класу дріжджів, можна знайти в C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Відповідні клітини-господарі для експресії глікозильованого анти-CD79b антитіла отримують з многоклакже клітини рослин, таких як культури бавовни, кукурудзи, картоплі, сої, петунії, томату та тютюну. Було ідентифіковано велике число бакуловирусних штамів, їх варіанти і відповідні дозволені клітини-господарі, такі якSpodoptera frugiperda(гусениця),Aedes aegypti(комар),Aedes albopictus(комар),Drosophila melanogaster(плодова мушка) іBombyx mori. Доступні різні вірусні штами для трансфекції, наприклад, варіант L-1Autographa californicaNPV і штам Bm-5Bombyx moriNPV, і такі віруси можуть використовуватися в якості вірусів по справжньому винаходу, зокрема, для трансфекції клітинSpodoptera frugiperda.

Однак найбільший інтерес представляють клітини хребетних, і розмноження клітин хребетних в культурі культура тканин) стало загальноприйнятим способом. Прикладами відповідних клітинних ліній ссавців є лінія нирки мавпи CV1, трансформована SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); лінія нирки ембріона людини (клітини 293 або клітини 293, субклонированние для зростання в суспензионной культурі, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клітини нирки дитинчат хом'яка (BHK, ATCC CCL 10); клітини яєчника китайського хом'яка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); клітини Сертолі миші (TM4, Mather, Товарbiol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (CV1 ATCC CCL 70); клітини нирки африканскойCL 34); клітини печінки щура буффало (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клітини легкого людини (W138, ATCC CCL 75); клітини печінки людини (Hep G2, HB 8065); пухлина молочної залози миші (MMT 060562, ATCC CCL51); клітини TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клітини MRC 5; клітини FS4; і лінія гепатоми людини (Hep G2).

Клітини-господарі трансформують описаними вище экспрессирующими або клонирующими векторами для продукції антитіла проти CD79b і культивують в загальноприйнятих поживних середовищах, модифікованих відповідним чином для індукції промоторів, селекцію трансформантів або ампліфікації генів, що кодують потрібній послідовності.

3. Вибір і застосування реплицируемого вектора

Для рекомбінантної продукції антитіла щодо винаходу нуклеїнову кислоту (наприклад, кДНК або геномну ДНК), кодує його, виділяють і вбудовують в реплицируемий вектор для подальшого клонування (ампліфікації ДНК) або для експресії. ДНК, що кодує антитіло, легко виділяють і секвенируют з використанням загальноприйнятих способів (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні специфічно зв'язуватися з генами, кодирующими важку і легку ланцюга антитіла). Доступно безліч векторів. Вибір вектора залежить частково від клеткиибо эукариотическое (як правило з ссавців) походження.

Наприклад, вектор може бути представлений у формі плазміди, космиди, вірусної частинки або фага. Відповідну послідовність нуклеїнової кислоти можна вбудовувати в вектор безліччю способів. Як правило, ДНК вбудовують у відповідний ділянку(ки) для ендонуклеази рестрикції з використанням способів, відомих в даній області. Компоненти вектора, як правило, включають, але не обмежуються ними, одну або декілька сигнальних послідовностей, оріджін реплікації, один або кілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор і послідовність термінації транскрипції. При конструюванні відповідних векторів, що містять один або декілька з цих компонентів, використовують стандартні способи лігування, які відомі кваліфікованого фахівця.

CD79b можна продукувати рекомбінантними способами не тільки прямо, але також як поліпептиду, злитого з гетерологічних поліпептидом, який може представляти собою сигнальну послідовність, або іншим поліпептидом, що мають певну ділянку розщеплення на N-кінці зрілого білка або поліпептиду. Як правило, сигнальна послідовність може бути компонентом вектора, або вона може побут�т представляти собою прокариотическую сигнальну послідовність, обрану, наприклад, із групи, що складається з лидерних послідовностей лужної фосфатази, пеніцилінази, lpp або термостабільного ентеротоксин II. У разі секреції в дріжджах, сигнальна послідовність може являти собою, наприклад, лидерную послідовність інвертази дріжджів, лидерную послідовністю альфа-фактора (включаючи лидерние послідовності α-фактораSaccharomycesіKluyveromyces,остання з яких описана у патенті США No. 5010182) або лидерную послідовність кислої фосфатази, лидерную послідовність глюкоамилазиC. albicans(EP 362179, опублікований 4 квітня 1990 року) або сигнальну послідовність, описану в WO 90/13646, опублікованій 15 листопада 1990 року. При експресії в клітинах ссавців, для направлення секреції білка можна використовувати сигнальні послідовності ссавців, такі як сигнальні послідовності з секретуються поліпептидів того ж чи спорідненого виду, а також вірусні секреторні лидерние послідовності.

a. Прокариотические клітини-господарі

Полинуклеотидние послідовності, що кодують поліпептидні компоненти антитіла щодо винаходу, можна отримувати з використанням стандартних рекомбинант�уцирующих клітин, таких як клітини гибридоми. Альтернативно полінуклеотиди можна синтезувати з використанням пристрою для синтезу нуклеотидів або способами ПЛР. Після отримання послідовності, що кодують поліпептиди, вбудовують у рекомбінантний вектор, здатний повторити і експресувати гетерологичние полінуклеотиди в прокариотических господарях. Для цілей цього винаходу можна використовувати безліч векторів, які доступні і відомі в даній області. Вибір відповідного вектора залежить, головним чином, від розміру нуклеїнових кислот, які підлягають влаштуванню в вектор, і конкретної клітини-господаря, що підлягає трансформації за допомогою вектора. Кожен вектор містить різні компоненти, в залежності від його функції (ампліфікація або експресія гетерологічного полинуклеотида, або обидві з них) і його сумісності з конкретної клітиною-хазяїном, в якій він знаходиться.

Як правило, стосовно до цих господарям використовують плазмідні вектори, що містять реплікон та послідовності контролю з видів, сумісних з клітиною-господарем. Як експресують, так і клонуючі вектори містять послідовності нуклеїнової кислоти, яка забезпечує репликациюособни забезпечувати фенотипічну селективність трансформованих клітин. Такі послідовності добре відомі для багатьох бактерій, дріжджів і вірусів. Оріджін реплікації з плазміди pBR322, яка містить гени, що кодують стійкість до ампіциліну (Amp) і тетрацикліну (Tet) і, таким чином, забезпечує прості способи ідентифікації трансформованих клітин, є підходящим для більшості грамнегативних бактерій, плазмідний оріджін 2µ придатний для дріжджів, і різні вірусні ориджини (SV40, полиоми, аденовіруси, VSV або BPV) придатні для клонування векторів в клітинах ссавців. pBR322, її похідні, або інші плазміди мікроорганізмів або бактеріофаги також можуть містити, або бути модифікованими, щоб вони містили, промотори, які можуть використовуватися мікроорганізмом для експресії ендогенних білків. Приклади похідних pBR322, використовувані для експресії конкретних антитіл, докладно описані в Carter et al., патент США No. 5648237.

Крім того, стосовно до цих господарям, як трансформуються векторів можна використовувати фаговие вектори, що містять реплікон та послідовності контролю, які сумісні з мікроорганізмом-господарем. Наприклад, при отриманні рекомбінантного вектора можна використовувати бактеріофаг, такий до�>LE392.

Экспрессирующий вектор за винаходу може містити дві або більше пар промотор-цистрон, які кодують кожний з поліпептидних компонентів. Промотор являє собою нетранслируемую регуляторну послідовність, розташовану вище (5') цистрона, яка модулює його експресію. Прокариотические промотори, як правило, відносяться до одного з двох класів: индуцибельние і конститутивні. Индуцибельний промотор являє собою промотор, який ініціює підвищення рівнів транскрипції цистрона, що знаходиться під його контролем, у відповідь на зміну умови культивування, наприклад на наявність або відсутність поживних речовин або зміну температури.

Добре відомо велика кількість промоторів, розпізнаваних різними потенційними клітинами-господарями. Вибраний промотор можна функціонально пов'язувати з цистронной ДНК, що кодує легкий або важкий ланцюг, шляхом видалення промотора з ДНК, що є його джерелом, за допомогою розщеплення ферментом рестрикції і вбудовування виділеної послідовності промотору у вектор щодо винаходу. Для напряму ампліфікації та/або експресії генів-мішеней можна використовувати як нативну промоторную пос гетерологичние промотори, оскільки вони дозволяють більш високу транскрипцію і більш високий вихід експресованого гена-мішені порівняно з нативним промотором поліпептиду-мішені.

Добре відомі промотори, підтримувані різними потенційними клітинами-господарями. Промотори, які підходять для застосування з прокариотическими господарями, включають промотор PhoA, промоторние системи β-галактамази і лактози [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], промоторную систему лужної фосфатази, триптофановую (trp) промоторную систему [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36776] і гібридні промотори, такі як промотор tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] або trc. Промотори для застосування бактеріальних системах також містять послідовність Шайна-Дальгарно (S. D.), функціонально пов'язану з ДНК, що кодує антитіло проти CD79b. Однак також підходять інші промотори, які є функціональними в бактеріях (такі як інші відомі бактеріальні або фаговие промотори). Їх нуклеотидні послідовності опубліковані, тим самим дозволяючи кваліфікованого фахівця функціонально лігувати їх з цистронами, кодирующими необхідні легкі і важкі ланцюги (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) з використанням линкеров або адапто�н у рекомбинантном векторі містить компонент, представляє собою секреторну сигнальну послідовність, який направляє переміщення експресованих поліпептидів через мембрану. Як правило, сигнальна послідовність може бути компонентом вектора, або вона може бути частиною ДНК поліпептиду-мішені, яку вбудовують в вектор. Сигнальна послідовність, обрана для цілей цього винаходу, повинна являти собою послідовність, яка розпізнається клітиною-господарем і піддається процесингу (тобто відщеплюється сигнальної пептидазой) в ній. Для прокариотических клітин-господарів, які не розпізнають і не здійснюють процесинг сигнальних послідовностей, нативних для гетерологічних поліпептидів, сигнальну послідовність замінюють прокариотической сигнальної послідовністю, обраної, наприклад, із групи, що складається з лидерних послідовностей лужної фосфатази, пеніцилінази, Ipp, або термостабільного ентеротоксин II (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA і MBP. В одному варіанті здійснення винаходу, сигнальні послідовності, що використовуються в обох цистронах экспрессирующей системи являють собою сигнальні послідовності STII або їх варіанти.

В іншому аспекті продукція �ет присутності секреторних сигнальних послідовностей в кожному цистроне. В цьому відношенні, легкі і важкі ланцюги імуноглобулінів експресуються, згортаються і збираються з утворенням функціональних імуноглобулінів у цитоплазмі. Певні штами-господарі (наприклад, штами trxB-E. coli) забезпечують умови в цитоплазмі, які сприяють утворенню дисульфідних зв'язків, тим самим забезпечуючи належну згортання і складання експресованих субодиниць білків. Proba and Gene Pluckthun, 159:203 (1995).

Даний винахід відноситься до экспрессирующей системі, в якій кількісне відношення експресованих поліпептидних компонентів можна модулювати для максимізації виходу секретированних і належним чином згорнутих антитіл щодо винаходу. Таке модулювання проводять щонайменше частково шляхом одночасного модулювання ефективності трансляції поліпептидних компонентів.

Один спосіб модулювання ефективності трансляції описаний в Simmons et al., патент США No. 5840523. У ньому використовуються варіанти ділянки ініціації трансляції (TIR) в цистроне. Для даного TIR, можна створювати серію варіантів амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнових кислот з діапазоном ефективності трансляції, тим самим забе�арианти TIR можна отримувати загальноприйнятими способами мутагенезу, які призводять до змін кодонов, які можуть змінювати аминокислотную послідовність, хоча переважними є мовчазні зміни нуклеотидної послідовності. Зміни TIR можуть включати, наприклад, зміни кількості або розміщення послідовностей Шайна-Дальгарно, разом із змінами сигнальної послідовності. Одним способом отримання мутантних сигнальних послідовностей є отримання "банку кодонов" на початку кодуючої послідовності, які не змінюють аминокислотную послідовність у сигнальної послідовності (тобто, зміни є молчащими). Це можна здійснювати зміною третього нуклеотидного положення кожного кодона; крім того, деякі амінокислоти, такі як лейцин, серин і аргінін, мають кілька перших і других положень, що може ускладнювати одержання банку. Цей спосіб мутагенезу докладно описаний у Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4: 151-158.

Переважно, отримують набір векторів з діапазоном ефективності TIR для кожного цистрона в них. Цей обмежений набір забезпечує порівняння рівнів експресії кожної ланцюга, а також вихід необхідних продуктів антитіла при різних поєднаннях эфферного гена, як детально описано в Simmons et al., патент США No. 5840523. На основі порівняння ефективності трансляції, відбирають необхідні окремі TIR, що підлягають поєднання в конструкціях експресують векторів по винаходу.

b. Эукариотические клітини-господарі

Компоненти вектора, як правило, включають, але не обмежуються ними, один або кілька з таких дій: сигнальна послідовність, оріджін реплікації, один або кілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор і послідовність термінації транскрипції.

(1) Компонент - сигнальна послідовність

Вектор для застосування в эукариотической клітці-хазяїні також може містити сигнальну послідовність або інший поліпептид, який володіє ділянкою для специфічного розщеплення на N-кінці зрілого білка або представляє інтерес поліпептиду. Обрана гетерологічних сигнальна послідовність переважно представляє собою послідовність, яка розпізнається і перетворюється (тобто, розщеплюється сигнальної пептидазой) в клітині-хазяїні. Для експресії в клітинах ссавців, доступні сигнальні послідовності ссавців, а також вірусні секреторні лидерние послідовності�тка лигируют в рамці зчитування з ДНК, кодує антитіло.

(2) Оріджін реплікації

Як правило, для експресують векторів ссавців компонент, що представляє собою оріджін реплікації, не потрібно. Наприклад, як правило, можна використовувати оріджін SV40, тільки тому, що він містить ранній промотор.

(3) Компонент - ген селективного маркера

Експресують і клонуючі вектори, як правило, містять ген для селекції, також званий селективним маркером. Типові гени для селекції кодують білки, які (a) надають стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, неоміцину, метотрексату або тетрацикліну, (b) комплементируют дефекти ауксотрофов або (c) забезпечують основні поживні речовини, які не доступні з комплексних середовищ, наприклад, ген, що кодує D-аланинрацемазу дляBacilli.

В одному прикладі схеми селекції використовують лікарський засіб для зупинки росту клітини-господаря. Клітини, які успішно трансформовані гетерологічних геном, продукують білок, що надає стійкість до лікарського засобу і, таким чином, виживають після режиму селекції. Прикладами такого домінантного виду селекції є застосування лікарських засобів нео�итающих є маркери, які дозволяють ідентифікацію клітин, здатних захоплювати нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло проти CD79b, такі як гени DHFR, тимідинкінази, металлотионеина-I-II, переважно гени металлотионеина приматів, аденозиндезамінази, орнитиндекарбоксилази і т. д. Підходящої клітиною-господарем, коли використовується DHFR дикого типу, є клітинна лінія CHO з дефіцитом активності DHFR (наприклад, ATCC CRL-9096), отримана і розмножена, як описано Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Наприклад, клітини, трансформовані геном для селекції DHFR, спочатку ідентифікують культивуванням всіх трансформантів в культуральному середовищі, що містить метотрексат (Mtx), конкурентний антагоніст DHFR. Альтернативно, клітини-господарі (зокрема, господарі дикого типу, які містять ендогенний DHFR), трансформовані або спільно трансформовані з послідовностями ДНК, кодирующими антитіло, білок DHFR дикого типу та іншої селективний маркер, такий як аміноглікозид-3'-фосфотрансфераза (APH), можна відбирати вирощуванням клітин на середовищі, що містить речовину для селекції за селективного маркера, таке як аминогликозидний антибіотик, наприклад, канаміцин, неоміцин або G418. См. патент США No. 4965199.

Підходи�nchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. Генtrp1 являє собою селективний маркер для мутантного штаму дріжджів, у якого відсутня здатність рости у відсутності триптофану, наприклад, ATCC No. 44076 або PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].

(4) Промоторний компонент

Експресують і клонуючі вектори, як правило, містять промотор функціонально пов'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, кодує антитіло проти CD79b для направлення синтезу мРНК. Промотори, розпізнавані безліч потенційних клітин-господарів, добре відомі.

Практично всі эукариотические гени мають AT-багатою областю, розташованої приблизно від 25 до 30 підстав вище ділянки ініціації транскрипції. Інша послідовність, що знаходиться від 70 до 80 підстав вище точки початку транскрипції безлічі генів, являє собою ділянку CNCAAT, де N може бути будь-який нуклеотид. На 3'-кінці більшості эукариотических генів знаходиться послідовність AATAAA, яка може представляти собою сигнал для додавання полі-A хвоста до 3'-кінця кодуючої послідовності. Всі з цих послідовностей можна вбудовувати в эукариотические експресують вектоѾмотори 3-фосфоглицераткинази [Hitzeman et al., J. Товарbiol. Chem., 255:2073 (1980)] або інших гліколітичних ферментів [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], таких як енолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегідрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицеромутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкоизомераза і глюкокінази.

Інші дріжджові промотори, які являють собою индуцибельние промотори, що володіють додатковою перевагою контрольованої умовами вирощування транскрипції, являють собою промоторние ділянки алкогольдегідрогенази 2, изоцитохрома C, кислої фосфатази, ферментів деградації, пов'язаних з метаболізмом азоту, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегідрогенази і ферментів, відповідальних за вживання мальтози і галактози. Крім того, відповідні вектори і промотори для застосування для експресії в дріжджах описані у EP 73657.

Транскрипція антитіла проти CD79b з векторів в клітинах-хазяїнах ссавців контролюється, наприклад, промоторами, одержуваними з геномів вірусів, таких як вірус полиоми, що вірус віспи птахів (UK 2211504, опублікованій 5 липня 1989), аденовірус (такий як аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби� 40 (SV40), гетерологичними промоторами ссавців, наприклад, промотором актину або промотором імуноглобуліну, промоторами теплового шоку, за умови, що такі промотори є сумісними з системами клітин-господарів.

Ранні та пізні промотори вірусу SV40 зазвичай отримують в якості рестрикційного фрагмента SV40, який також містить оріджін реплікації вірусу SV40. Предранний промотор цитомегаловірусу людини зазвичай отримують в якості рестрикційного фрагмента HindIII E. Система для експресії ДНК в господарях, що належать до ссавцем, з використанням вірусу папіломи великої рогатої худоби в якості вектора описана в патенті США No. 4419446. Модифікація цієї системи описана в патенті США No. 4601978. См. також Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) щодо експресії кДНК β-інтерферону людини в клітинах мишей під контролем промотору тимідинкінази з вірусу простого герпесу. Альтернативно як промотора можна використовувати довгий кінцевий повтор вірусу саркоми Рауса.

(5) Компонент - енхансерний елемент

Транскрипцію ДНК, що кодує антитіло проти CD79b, у вищих еукаріотів можна підвищувати за допомогою вбудовування в вектор энхансерной послідовності. Энхансери представляють соя його транскрипцію. Відомо багато энхансерних послідовностей з генів ссавців (глобіну, еластази, альбуміну, α-фетопротеїну та інсуліну). Однак, як правило, використовують енхансер з вірусу эукариотической клітини. Їх приклади включають енхансер SV40 на пізній стороні ориджина реплікації (п. о. 100-270), енхансер раннього промотору цитомегаловірусу, енхансер полиоми на пізній стороні ориджина реплікації і энхансери аденовірусу. См. також Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) щодо енхансерів для активації эукариотических промоторів. Енхансер може бути приєднаний у векторі до кодує антитіло проти CD79b послідовності в положенні 5' 3', проте переважно він розташований в ділянці, розташованому в 5'-напрямку від промотору.

(6) Компонент для термінації транскрипції

Експресують вектори, використовувані в эукариотических клітинах-хазяїнах (в клітинах дріжджів, грибів, комах, рослин, тварин, людини, або містять ядро клітини з інших багатоклітинних організмів) також містять послідовності, необхідні для термінації транскрипції і для стабілізації мРНК. Такі послідовності зазвичай знаходяться на 5'- і, іноді, на 3'-нетранслируемих ділянках эукариотических або вірусних фрагментів в нетранслируемом ділянці мРНК, кодує антитіло проти CD79b. Одним відповідним компонентом для термінації транскрипції є ділянка полиаденилирования бичачого гормону росту. См. WO94/11026 і описаний в ній экспрессирующий вектор.

Інші способи, вектори, і клітини-господарі, підходящі для адаптації для синтезу антитіла проти CD79b в культурі рекомбінантних клітин хребетних описані в Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117060; і EP 117058.

4. Культивування клітин-господарів

Клітини-господарі, використовувані для продукції антитіла проти CD79b згідно винаходу, можна культивувати в різних середовищах.

a. Прокариотические клітини-господарі

Прокариотические клітини, що використовуються для отримання поліпептидів щодо винаходу, вирощують на середовищах, відомих в даній області, і вони підходять для культивування вибраних клітин-господарів. Приклади відповідних середовищ включають бульйон Луриа (LB) разом з необхідними поживними речовинами. В деяких варіантах здійснення, середовище також містить засіб для селекції, вибране, виходячи з конструкції экспрессирующего вектора, для селективного забезпечення зростання прокариотических клітин, що містять экспрессирующий вектор. Наприклад, ампіцилін додають � вуглецю, азоту і неорганічного фосфату, можна додавати будь-які необхідні добавки у відповідних концентраціях, які додаються окремо або в суміші з добавкою або інший середовищем, такий як комплексний джерело азоту. Необов'язково, культуральна середовище може містити один або кілька відновників, вибраних з групи, що складається з глутатіону, цистеїну, цистамина, тиогликолята, дитиоэритрита і дитиотреитола.

Прокариотические клітини-господарі культивують при відповідних температурах. Для ростуE. coliнаприклад, бажана температура знаходиться в діапазоні приблизно від 20°С до 39°C, переважно від приблизно 25°C до приблизно 37°C, переважно, вона становить приблизно 30°С. рн середовища може бути будь-яким в діапазоні від приблизно 5 до приблизно 9, в залежності, головним чином, від організму господаря. ДляE. coli, pH переважно становить приблизно від 6,8 до 7,4, і більш переважно приблизно 7,0.

Якщо в экспрессирующем векторі щодо винаходу використовують индуцибельний промотор, індукують експресію білка в умовах, відповідних для активації промотору. В одному аспекті винаходу, для� клітини культивують на середовищі з обмеженим вмістом фосфату. Переважно, середа з обмеженим вмістом фосфату являє собою середовище C. R. A. P (див., наприклад, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Можна використовувати безліч інших індукують речовин, відповідно до використовуваної векторною конструкцією, як відомо в даній області.

В одному варіанті здійснення, экспрессируемие поліпептиди по справжньому винаходу секретуються в периплазму клітини-господаря і з неї їх виділяють. Виділення білка, як правило, залучає руйнування мікроорганізму, як правило, такими способами, як осмотичний шок, обробка ультразвуком або лізис. Після руйнування клітин, клітинний дебрис або цілі клітини можна видаляти центрифугуванням або фільтрацією. Крім того, білки можна очищати, наприклад, хроматографією з афінної смолою. Альтернативно білки можуть транспортуватися в культуральне середовище і можуть бути виділені з неї. Клітини можна видаляти з культури і культуральний супернатант фільтрувати і концентрувати для подальшого очищення продукованих білків. Экспрессированние поліпептиди можна далі виділяти та ідентифікувати з використанням широко відомих способів, таких як електрофорез у поліакриламідному гелі (PAGE) та вестерн-бл� ферментації. Для продукції рекомбінантних білків доступні різні великомасштабні способи ферментації з підживленням. Великомасштабна ферментація має ємність щонайменше 1000 літрів, переважно приблизно від 1000 до 100000 літрів. У цих ферментери використовуються змішуючі лопаті для розподілу кисню і поживних речовин, особливо глюкози (пріоритетного джерела вуглецю/енергії). Мелкомасштабная ферментація відноситься, головним чином, до ферментації у ферментері, який має ємність не більше ніж приблизно 100 літрів, і вона може знаходитися в діапазоні приблизно від 1 літра до приблизно 100 літрів.

У процесі ферментації, індукцію експресії білка, як правило, починають після того, як клітини виростають у відповідних умовах до необхідної щільності, наприклад, OD550приблизно 180-220, на тій стадії, коли клітини знаходяться в ранній стаціонарній фазі. Можна використовувати різні індуктори відповідно до використовуваної конструкцією вектора, як відомо в цій галузі і як описано вище. Перед індукцією клітини можна вирощувати протягом коротких періодів часу. Клітини, як правило, індукують протягом приблизно 12-50 годин, хот�ства поліпептидів щодо винаходу, можна змінювати різні умови ферментації. Наприклад, для поліпшення належної складання і згортання секретуються поліпептидів антитіла, можна використовувати додаткові вектори, сверхэкспрессирующие білки-шаперони, такі як білки Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD і чи DsbG) або FkpA (пептидилпролил-цис,транс-изомераза з активністю шаперон) для котрансформации прокариотических клітин-господарів. Було показано, що білки-шаперони сприяють належному згортання і розчинності гретерологичних білків, які продукуються в бактеріальних клітинах-хазяїнах. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al., патент США No. 6083715; Georgiou et al., патент США No. 6027888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Товарbiol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Товарbiol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.

Для мінімізації протеолізу експресованих гетерологічних білків (особливо білків, які є чутливими до протеолизу), для цього винаходу можна використовувати певні штами-господарі з дефіцитом протеолітичних ферментів. Наприклад, штами клітин-господарів, можна модифікувати для забезпечення генетичної мутації(ий) у генах, що кодують відомі бактеріальні протеази, такі як протеаза III, OmpT, DegP, Tsp, протеаза I, протеаза Mi, протеаза V, проl. (1998), вище; Georgiou et al., патент США No. 5264365; Georgiou et al., патент США No. 5508192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

В одному варіанті здійснення, в якості клітин-господарів у экспрессирующей системі винаходу використовують штамиE. coliз дефіцитом протеолітичних ферментів і трансформовані плазмідами, сверхэкспрессирующими один або кілька белков-шаперонов.

b. Эукариотические клітини-господарі

Для культивування клітин-господарів придатними є комерційно доступні середовища, такі як середовище Хема F10 (Sigma), мінімальна підтримуюча середовище ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma), і середовище Ігла, модифікована способом Дульбекко, ((DMEM), Sigma). Крім того, для клітин-господарів як культурального середовища можна використовувати будь-яку з середовищ, описаних в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патенти США No. 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 або 5122469; WO9003430; WO 87/00195; або патенті США Re. 30985. Будь-які їхні цих середовищ можна доповнити за необхідності гормонами й/або іншими чинниками зростання (такими як інсулін, трансферрин або епідермальний фактор росту), солями, такими як хлориди натрію, кальцію, магнію і фосфат), буферами (такими як HEPES), нуклеотидами (такими як аденозин і тимидин), антибіотиками (такими як лікарський средствонцентрациях микромолярного діапазону) і глюкозою або еквівалентними джерелами енергії. Також можна додавати будь-які інші необхідні додаткові речовини у відповідних концентраціях, які відомі фахівцям в даній області. Умови культивування, такі як температура, pH тощо, являють собою умови, які раніше використовували для обраних для експресії клітин-господарів, і вони будуть зрозумілі фахівця в даній області.

5. Детекція ампліфікації/експресії гена

Ампліфікацію і/або експресію гена можна визначати безпосередньо в зразку, наприклад, за допомогою загальноприйнятого саузерн-блот, нозарен-блот для кількісного визначення транскрипції мРНК [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], дот-блот (аналіз ДНК), або гібридизаціїin situз використанням відповідним чином міченого зонда на основі послідовностей, представлених в цьому документі. Альтернативно можна використовувати антитіла, які можуть розпізнавати певні дуплекси, включаючи дуплексів ДНК, дуплекси РНК і гібридні дуплексів ДНК-РНК або дуплексів ДНК-білок. Антитіла в свою чергу можна мітити, і можна проводити аналіз, де дуплекс пов'язаний з поверхнею, так щоб при утворенні дуплексу на поверхні можна було виявити присутність собами, такими як імуногістохімічне фарбування клітин або зрізів тканин і аналіз клітинної культури або рідин організму, для кількісного визначення безпосередньо продукту експресії гена. Антитіла, що підходять для імуногістохімічного фарбування і/або аналізу зразків рідин, можуть бути або моноклональними або поликлональними, і їх можна отримувати в будь-якому млекопитающем. Зручно, щоб антитіла, які підходять для способу по справжньому винаходу, можна було отримувати проти поліпептиду CD79b з нативною послідовністю, або проти синтетичного пептиду на основі послідовностей ДНК, представлених в цьому документі, або проти екзогенної послідовності, злитої з ДНК CD79b і кодує специфічний для антитіла епітоп.

6. Очищення антитіла проти CD79b

Форми антитіла проти CD79b можна виділяти з культурального середовища або з лізатів клітин-господарів. У разі пов'язаної з мембраною форми, його можна вивільняти з мембрани з використанням відповідного розчину детергенту (наприклад, Triton X 100) або за допомогою ферментативного розщеплення. Клітини, що використовуються для експресії антитіла проти CD79b, можна руйнувати різними фізичними або хімічними сп�едства для лізису клітин.

Може бути бажаною очищення антитіла проти CD79b з рекомбінантних білків або поліпептидів клітин. Наступні способи ілюструють відповідні способи очищення: фракціонування на іонообмінній колонці; осадження етанолом; обращенно-фазова ВЕРХ; хроматографія на діоксиду кремнію або на катіонообмінної смоли, такий як DEAE; хроматофокусирование; SDS-PAGE; осадження сульфатом амонію; гель-фільтрація з використанням, наприклад, Sephadex G-75; колонки з білком A-сефарозой для видалення домішок, таких як IgG; і хелатирующие метали колонки для зв'язування мічених эпитопом форм антитіла проти CD79b. Можна використовувати різні способи очищення білків, і такі способи відомі в даній області і описані, наприклад, Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Обрана стадія(і) очищення, буде залежати, наприклад, від характеру використовуваного процесу отримання і конкретного продукованого антитіла проти CD79b.

При використанні рекомбінантних способів, антитіло може продукуватися внутрішньоклітинно, в периплазматическом просторі, або безпосередньо секретироваться в середу. Якщо такі антитіла продукуються внутрішньоклітинно, на першій стадії, дебрис у вигляді чаультрафильтрации. У Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) описаний спосіб виділення антитіл, які секретуються в периплазматическое простірE. coli. У короткому викладі, клітинну масу розморожують у присутності ацетату натрію (рн 3,5), EDTA і фенилметилсульфонилфторида (PMSF) протягом приблизно 30 хв. Клітинний дебрис можна видаляти центрифугуванням. Коли антитіло секретується в середу, супернатанти з таких експресують систем, як правило, спочатку концентрують з використанням комерційно доступного фільтра для концентрування білка, наприклад, елементу для ультрафільтрації Amicon або Millipore Pellicon. На кожній з попередніх стадій можна включити інгібітор протеаз, такий як PMSF, для інгібування протеолізу, і для запобігання росту непотрібних контаминирующих організмів можна додавати антибіотики.

Композицію антитіла, отриману з клітин, можна очищати з використанням, наприклад, хроматографії з гидроксилапатитом, гель-електрофорезу, діалізу та афінної хроматографії, причому аффинная хроматографія є кращим способом очищення. Придатність білка A в якості афінного ліганду залежить від виду і изотипа будь-якого Fc-домену імуноглобуліну, який присутній в антителе. Б., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Білок G рекомендований для всіх изотипов миші і для γ3 людини (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). Матрицею, до якої приєднують аффинний ліганд, найбільш часто є агароза, однак доступні інші матриці. Механічно стабільні матриці, такі як скло з контрольованим розміром пор або полі(стиролдивинил)бензол дозволяють більш швидкі швидкості потоку і більш короткий час обробки, ніж швидкості потоку і час обробки, яких можна досягати за допомогою агарози. Коли антитіло містить CH3-домен, для очищення підходить смола Bakerbond ABXTM(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Також доступні інші способи очищення білка, такі як фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, обращенно-фазова ВЕРХ, хроматографія на діоксиду кремнію, хроматографія на гепарин-SEPHAROSETM, хроматографія на аніоно - або катіонообмінної смоли (така як колонка з поліаспарагіновой кислотою), хроматофокусирование, SDS-PAGE і осадження сульфатом амонію, в залежності від підлягає виділенню антитіла.

Після попередньої стадії(ий) очищення, суміш, що містить представляє інтерес антитіло і домішки, можна піддавати хроматографії гідрофобної взаємодії з низьким зна� при низьких концентраціях солі (наприклад, від приблизно 0-0,25 M солі).

G. Фармацевтичні склади

Коъюгати антитіло-лікарський засіб (ADC) щодо винаходу можна вводити будь-яким способом, придатним для стану, на яке спрямоване лікування. ADC, як правило, вводять парентерально, тобто шляхом інфузії, підшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньовенно, интрадермально, інтратекально та епідурально.

Для лікування цих злоякісних пухлин, в одному варіанті здійснення, кон'югат антитіло-лікарський засіб вводять шляхом внутрішньовенної інфузії. Доза, що вводиться шляхом інфузії, знаходиться в діапазоні від приблизно 1 мкг/м2приблизно 10000 мкг/м2на дозу, як правило, по одній дозі в тиждень всього з однією, двома, трьома або чотирма дозами. Альтернативно дозування знаходиться в діапазоні від приблизно 1 мкг/м2до приблизно 1000 мкг/м2від приблизно 1 мкг/м2приблизно до 800 мкг/м2від приблизно 1 мкг/м2приблизно 600 мкг/м2від приблизно 1 мкг/м2до приблизно 400 мкг/м2від приблизно 10 мкг/м2до приблизно 500 мкг/м2від приблизно 10 мкг/м2до приблизно 300 мкг/м2від приблизителѺг/м2. Для пом'якшення або ослаблення симптомів захворювання дозу можна вводити один раз на добу, один раз в тиждень, кілька разів на тиждень, але рідше ніж один раз на добу, кілька разів в місяць, але рідше ніж один раз на добу, кілька разів в місяць, але рідше ніж один раз на тиждень, один раз в місяць або періодично. Введення можна продовжувати протягом будь-якого з описаних інтервалів до ремісії пухлини або симптомів лімфоми, лейкемії, що піддаються лікуванню. Введення можна продовжувати після досягнення ремісії або пом'якшення симптомів, де така ремісія або пом'якшення продовжуються шляхом такого продовженого введення.

Винахід відноситься до способу пом'якшення аутоімунного захворювання, що включає введення пацієнту, який страждає аутоімунним захворюванням, терапевтично ефективного кількості кон'югату гуманізоване антитіло 2F2-лікарський засіб по будь-якому з попередніх варіантів здійснення. У кращих варіантах здійснення антитіло вводять внутрішньовенно або підшкірно. Кон'югат антитіло-лікарський засіб вводять внутрішньовенно в дозі в діапазоні від приблизно 1 мкг/м2до приблизно 100 мг/м2на дозу та, у конкретному варіанті осуществлемптомов захворювання дозу можна вводити один раз на добу, один раз в тиждень, кілька разів на тиждень, але рідше ніж один раз на добу, кілька разів в місяць, але рідше ніж один раз на добу, кілька разів в місяць, але рідше ніж один раз на тиждень, один раз в місяць або періодично. Введення можна продовжувати протягом будь-якого з описаних інтервалів до пом'якшення або ослаблення симптомів аутоімунного захворювання, що піддається лікуванню. Введення можна продовжувати після досягнення пом'якшення або послаблення симптомів, де таке пом'якшення або ослаблення продовжуються шляхом такого продовженого введення.

Винахід відноситься до способу лікування B-клітинної порушення, що включає введення пацієнту, який страждає B-клітинним порушенням, таких як B-клітинно-проліферативне порушення (включаючи, але не обмежуючись ними, лімфому і лейкоз) або аутоімунне захворювання, терапевтично ефективного кількості гуманизированного антитіла 2F2 по будь-якому з попередніх варіантів здійснення, причому це антитіло не є конъюгированним з цитотоксичною молекулою або піддається детекції молекулою. Антитіло, як правило, вводять у діапазоні доз від приблизно 1 мкг/м2до приблизно 1000 мг/м2.

В одному аспекті винахід, кромению та/або щонайменше один його иммуноконъюгат та/або щонайменше один кон'югат антитіло проти CD79b-лікарський засіб щодо винаходу. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичний склад містить (1) антитіло щодо винаходу та/або його иммуноконъюгат, і (2) фармацевтично прийнятний носій. В деяких варіантах здійснення, фармацевтичний склад містить (1) антитіло щодо винаходу та/або його иммуноконъюгат, і необов'язково, (2) принаймні один додатковий лікарський засіб. Додаткові лікарські засоби включають, але не обмежуються ними, лікарські засоби, описані нижче. ADC, як правило, можна вводити парентерально, тобто шляхом інфузії, підшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньовенно, интрадермально, інтратекально та епідурально.

Терапевтичні сполуки, що містять антитіло проти CD79b або иммуноконъюгат проти CD79b, використовуваний у відповідності з цим винаходом, отримують для зберігання шляхом змішування антитіла або иммуноконъюгата, що має необхідну ступінь чистоти, з необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями, эксципиентами або стабілізаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), у формі ліофілізованих складів або водних розчинів. Прийнятні носії, эксципиенти або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозах і�данти, включаючи аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалконію, хлорид бензэтония; фенол, бутил або бензиловий спирт; алкилпарабени, такі як метил - або пропілпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; м-крезол); низькомолекулярні (менше 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, маннозу або декстрини; хелатирующие агенти, такі як EDTA; змінюють тоничность речовини, такі як трегалоза і хлорид натрію; цукру, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; поверхнево-активна речовина, таке як полісорбат; солеобразующие протівоіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси Zn-білок); та/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як TWEEN®, PLURONICS®або поліетиленгліколь (PEG). Фармацевтичні склади, підлягають застосуванню для введенняin vivo, як правило, є стерильними. Цього легко досягти путтакже можуть містити більше одного активного з'єднання, якщо необхідно для конкретного свідчення, на яке спрямоване лікування, переважно з'єднання з додатковими видами активностями, які не чинять несприятливого ефекту один на одного. Наприклад, на додаток до антителу проти CD79b, може бути бажаним включення в один складу додаткового антитіла, наприклад, другого антитіла проти CD79b, яке пов'язується з відмінними эпитопом на полипептиде CD79b, або антитіла до будь-якої іншої мішені, такий як фактор росту, який впливає на ріст злоякісної пухлини. Альтернативно або додатково, композиція може далі містити хіміотерапевтичне засіб, цитотоксична засіб, цитокін, інгібуючу зростання засіб, антигормональное засіб та/або кардіопротектор. Такі молекули відповідно присутні в поєднанні у кількостях, які ефективні для поставленої мети.

Активні інгредієнти можуть бути укладені в мікрокапсули, отримані, наприклад, способами коацервации або міжфазної полімеризації, наприклад, мікрокапсули на основі гидроксиметилцеллюлози або желатину і мікрокапсули на основі поліметилметакрилату, відповідно, в колоїдні системи для доставки лікарського средствмульсии. Такі способи описані в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Можна отримувати препарати з уповільненим вивільненням. Відповідні приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, які представлені у вигляді мають форму виробів, наприклад плівок або мікрокапсул. Приклади матриць з уповільненим вивільненням включають поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2-гидроксиэтилметакрилат) або полі(вініловий спирт)), полилактиди (патент США No. 3773919), сополімери L-глутамінової кислоти і γ-етил-L-глутамату, недеградируемий етиленвінілацетат, деградируемие сополімери молочна кислота-гліколева кислота, такі як LUPRON DEPOT®(инъецируемие мікросфери, що складаються з сополімеру молочної кислоти та гліколевої кислоти і ацетату леупролида), і полі-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. У той час як полімери, такі як етилен-вінілацетат і молочна кислота-гліколева кислота забезпечують вивільнення молекули протягом понад 100 діб, визначені гідрогелі вивільняють білки протягом коротких періодів часу. При инкапсулировании антитіла залишаються в організм