Очищений препарат уратоксидази, очищена рекомбінантна уратоксидаза, кон'югат (варіанти) і фармацевтична композиція для зниження рівнів сечової кислоти в рідині або тканини організму ссавця, очищені фрагменти уратоксидази і спосіб очищення уратоксидази.

 

Область техніки, до якої належить винахід

Даний винахід відноситься до очищення і хімічної модифікації білків для збільшення періоду їх циркуляції і зниження їх імуногенності. Конкретніше, винахід відноситься до видалення агрегатів крупніше октамеров з уратоксидаз (уриказ) до кон'югування їх з полі(этиленгликолями) або полі(этиленоксидами). Це практично нівелює імуногенність урикази, не погіршуючи її уриколитическое дію.

Рівень техніки

Твердження, що містяться в розділі опису існуючого рівня техніки, не являють собою огляд аналогів, але замість цього відображають власну суб'єктивну думку та інтерпретації винахідників щодо рівня техніки на момент здійснення винаходу. Ці інтерпретації можуть включати в себе особисті, досі не розкриті здогадки винахідників, які самі по собі не були частиною аналогів.

Уратоксидази (урикази; Е. С. 1.7.3.3) є ферментами, які каталізують окислення сечової кислоти до краще розчинного продукту, алантоина, - пуринового метаболіту, який простіше виводиться. Люди не виробляють ферментативно-активну уриказу з-за кількох мутацій в генеурикази, вироб�биточние концентрації сечової кислоти в крові (гіперурикемія) і в сечі (гиперурикозурия) можуть призводити до болісного артриту (подагрі), відкладенням солей сечової кислоти (подагричним вузлів) і ниркової недостатності. У деяких уражених індивідів доступні медикаменти, такі як алопуринол (інгібітор синтезу сечової кислоти) викликають обмежують лікування побічні ефекти або не полегшують ці стани адекватним чином. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192. Ін'єкції урикази можуть послабити гіперурикемію і гиперурикозурию, принаймні, тимчасово. Однак, оскільки уриказа є чужим для людей ферментом, навіть перша ін'єкція інтактного білка, взятого від Aspergillus flavus, викликає анафілактичні реакції у декількох відсотків піддавалися лікуванню пацієнтів (Pui, С-Н, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), а імунореактивність обмежує її корисність для постійного або переривчастого лікування. Donadio, D, et al., (1981) Нус Presse Med 10:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554.

Патентна заявка №09/370084 і міжнародна заявка № PCT/US1999/017514 розкривають полі(етиленгліколь)-уратоксидазу (ПЕГ-уриказу), яка зберігає, принаймні, приблизно 75% уриколитической активності некон'югованої урикази і володіє значно ослабленою иммуногенностью. В одній з таких очищених уриказ кожна субодиниця ков�изительно між 5 кДа і 100 кДа.

Відомо, що агрегація білків збільшує їх імуногенність. Розуміння цього внесло свій внесок в розробку способів цілеспрямованої агрегації білків з допомогою такої обробки, як термічне денатурирование і перехресне зв'язування за допомогою витримування в глутаральдегиде перед приготуванням вакцин або для імунізації тварин з метою вироблення антисироваток.

Виявлено також, що небажана агрегація білків вносить внесок у імунізацію або сенсибілізацію при клінічному використанні терапевтичних білків, наприклад, для гамма-глобуліну людини (Henney et al. (1968) N. Engl. J. Med. 278:2244-2246) і для людського гормону росту (Moore et al. (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:691-697). Внесок агрегатів в імуногенність людського інтерферону альфа був продемонстрований на мишей BALB/c (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1472-1478), а для його вимірювання був розроблений твердофазних імуно-ферментний тест (ELISA) (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1394-1400).

Незважаючи на популярність впливу агрегації на імуногенність білків, дані про вплив агрегації на імуногенність білків, кон'югованих з полі(алкиленгликолями), такими як ПЕГ, відсутні. Все ще існує потреба в полі(алкиленгликоль)-уриказних конъюгатах, які пр�ой в основу даного винаходу, є задоволення згаданої існуючої суспільної потреби.

Розкриття винаходу

Конъюгирование білків з полі(алкиленгликолями), особливо з ПЕГ, дає кон'югати зі зниженою иммуногенностью і збільшеним періодом напіврозпаду в крові. При спробах отримати практично неиммуногенние кон'югати урикази, що зберігають практично всю уриколитическую активність інтактного препарату урикази, було виявлено, що сліди великих агрегатів урикази у вихідному матеріалі викликали несподівано сильне антитілоутворення і прискорене елімінування з кровотоку, що в обох випадках є погіршують факторами для повтору ін'єкцій ПЕГ-кон'югатів, приготованих з урикази, що містить такі агрегати. Несподівано винахідники виявили, що присутність добре визначені агрегатів субодиниць урикази помірного розміру, більший оригінального тетрамера, тобто агрегатів, що містять вісім субодиниць (октамеров), - не викликає підвищення імуногенності і прискорене виведення. Октамерная форма урикази представлена в досить високих концентраціях у більшості препаратів урикази, щоб виявлятися по поглинанню нею ультрафіолетового випромінювання, ний концентрації білка. Тим не менш, було виявлено, що внесок самих октамеров в імуногенність і прискорене виведення ПЕГ-уриказних кон'югатів мінімальний, на відміну від вкладу набагато меншої кількості ще більш великих агрегатів, які не виявляються шляхом поглинання ультрафіолетового в досліджуваних умовах, але виявляються шляхом статичного (Релеївського) або динамічного розсіювання світла. Таким чином, було виявлено, що вилучення таких слідів дуже великих агрегатів перед конъюгированием з ПЕГ несподівано сильно знижує імуногенність і прискорене виведення виходять ПЕГ-уриказних кон'югатів.

Одним з варіантів здійснення цього винаходу є очищена уратоксидаза (уриказа), практично вільна від агрегатів крупніше октамеров. Переважно уриказой є уриказа ссавця. Більш переважно уриказой є уриказа свинячої печінки, бичачої печінки або овечої печінки.

В одному з аспектів цього кращого варіанту здійснення уриказа є рекомбінантною. У ще одному аспекті даної кращого варіанту здійснення уриказа в значній мірі має послідовність урикази свинячий, бичачою, овечої печінки. але уриказа містить аміно-кінець і карбоксильний кінець, і уриказа скорочено на одному кінці або на обох кінцях. В одному з аспектів цього кращого варіанту здійснення описана вище уриказа кон'югується з полі(етиленгліколем) або полі(етиленоксидом) при таких умовах, щоб уриказа в конъюгате була практично вільна від агрегатів крупніше октамеров. Переважно уриказа кон'югується з полі(етиленгліколем або полі(етиленоксидом) через уретановую (карбаматную), вторинну амінну або амідну зв'язок. В одному з аспектів цього кращого варіанту здійснення полі(етиленгліколь) є монометокси полі(етиленгліколем). У ще одному аспекті даної кращого варіанту здійснення полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид) мають молекулярний вага приблизно між 5 кДа та 30 кДа. Переважно полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид) мають молекулярний вага приблизно між 10 кДа і 20 кДа. Переважно середню кількість ниток згаданого полі(етиленгліколю) або полі(етиленоксиду) становить приблизно між 2 та 12 нитками на субодиницю урикази. Більш переважно середня кількість ниток згаданого полі(етиленгліколю) або полі(етиленоксиду) становить приблизно між 6 і 10 �чи полі(етиленоксиду) становить приблизно між 7 і 9 на субодиницю урикази. Переважно полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид) є лінійним. Альтернативно полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид) є розгалуженим.

Справжній винахід також забезпечує фармацевтичну композицію для зниження рівня сечової кислоти в рідині або тканини організму, містить описаний вище кон'югат урикази і фармацевтично прийнятний носій. Переважно композиція стабілізується шляхом ліофілізації і розчиняється після відновлення для забезпечення розчинів, придатних для парентерального введення.

Ще одним об'єктом винаходу є спосіб очищення урикази, що має знижену імуногенність, що включає в себе стадію відділення агрегатів урикази крупніше октамеров, у фракціях урикази, та виключення таких агрегатів з очищеної урикази. Переважно, стадія відділення включає в себе операцію виявлення агрегатів крупніше октамеров, принаймні в частині фракцій урикази, і винятку фракцій, що містять ці агрегати. Переважно операція виявлення містить вимірювання розсіювання світла.

Справжній винахід також забезпечує виділену уриказу, приготовану у відповідності з вищеописаним способом.

У приватному варіанті здійснення уратоксидаза виділена з організму ссавця.

У кращому варіанті здійснення уратоксидаза є виділеної з печінки свині або печінки вівці.

У ще одному приватному варіанті здійснення уратоксидаза є рекомбінантною.

У кращому варіанті здійснення рекомбінантна уриказа має аминокислотную послідовність урикази печінки свині, урикази печінки бика, урикази печінки вівці або урикази печінки бабуїна.

У ще одному варіанті здійснення рекомбінантна уриказа є химерною.

У більш кращому варіанті здійснення рекомбінантна химерна уратоксидаза включає в себе частину від урикази, виділеної з печінки свині, і частина від урикази, виділеної з печінки бабуїна.

В ще більш кращому варіанті здійснення рекомбінантна химерна уратоксидаза має аминокислотную послідовність свинячий уратоксидази SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 (R291K) та із залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301 (T301S) (CKS-уриказа).

овательность SEQ ID NO:2 з залишком гістидину замість тирозину в положенні 97 (Y97H).

В іншому приватному варіанті здійснення джерело, з якого виділена уратоксидаза, являє собою організм гриба або мікроба.

У кращому варіанті здійснення уратоксидаза є виділення або рекомбінантної і притому має аминокислотную послідовністю організму гриба або мікроба, вибраного з групи, що складається з Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. і Candida utilis.

У приватному варіанті здійснення джерело, з якого виділена уратоксидаза, являє собою організм безхребетного тварини.

У кращому варіанті здійснення уратоксидаза є виділення або рекомбінантної і притому має аминокислотную послідовність організму безхребетного тварини, вибраного з групи, що складається з Drosophila melanogaster та Drosophila pseudoobscura.

У ще одному приватному варіанті здійснення джерело, з якого виділена уратоксидаза, являє собою рослинний організм.

У кращому варіанті здійснення уратоксидаза є виділення або рекомбінантної і притому має аминокислотную послідовність рослинного організму Glycine max.

В іншому приватному варіанті здійснення щонайменше 97% від загальної кількості м�ється очищена химерна уратоксидаза (уриказа), щонайменше, 95% від загальної кількості молекул якої входить до складу тетрамеров і октамеров, при цьому вона має аминокислотную послідовність свинячий уратоксидази SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 (R291K) та із залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301 (T301S) (CKS-уриказа).

Третім об'єктом справжнього винаходу є кон'югати, що включають очищену уратоксидазу (уриказу) і полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид), в яких, щонайменше, 95% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров.

У приватному варіанті здійснення щонайменше 97% від загальної кількості молекул уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров.

У ще одному приватному варіанті здійснення, в якості вказаного полі(етиленгліколю) кон'югати включають в себе монометокси полі(етиленгліколь).

В іншому приватному варіанті здійснення кон'югати мають ковалентний лінкер між зазначеними полі(етиленгліколем) або полі(етиленоксидом) і уратоксидазой, обраний із групи, що складається з уретанового (карбаматного) лінкера, вторинного аминового лінкера і амідного лінкера.

У приватному варіанті здійснення есяти до шістдесяти тисяч дальтон.

У кращому варіанті здійснення кон'югатів, зазначені полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид) мають середній молекулярний вага приблизно від десяти до тридцяти тисяч дальтон.

У ще одному приватному варіанті здійснення кон'югатів, середня кількість ниток зазначених полі(етиленгліколю) або полі(етиленоксиду), ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від двох до дванадцяти.

У кращому варіанті здійснення кон'югатів, середня кількість ниток зазначених полі(етиленгліколю) або полі(етиленоксиду), ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від шести до десяти.

У більш кращому варіанті здійснення кон'югатів, середня кількість ниток зазначених полі(етиленгліколю) або полі(етиленоксиду), ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від семи до дев'яти.

В іншому приватному варіанті здійснення кон'югатів, як зазначеного полі(етиленгліколю) вони включають в себе лінійний полі(етиленгліколь), а в якості полі(етиленоксиду) вони включають в себе ліні�иколя) вони включають в себе розгалужений полі(етиленгліколь), а в якості вказаного полі(етиленоксиду) вони включають в себе розгалужений полі(этиленоксид).

Четвертим об'єктом справжнього винаходу є очищені фрагменти уратоксидази (урикази), що представляють собою укорочену з аміно-кінця і/або з карбоксильного кінця рекомбинантную уриказу.

У приватному варіанті здійснення щонайменше 97% від загальної кількості фрагментів входить до складу тетрамеров і октамеров.

П'ятим об'єктом справжнього винаходу є кон'югати, що включають в себе очищену уратоксидазу (уриказу) і полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид), в яких, щонайменше, 95% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров, при тому, що середня кількість ниток зазначених полі(етиленгліколю) илиполи(етиленоксиду), ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від двох до десяти.

У приватному варіанті здійснення щонайменше 97% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров.

У кращому варіанті здійснення кон'югатів, зазначені полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид) мають середн�существления кон'югатів, зазначені полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид) мають середній молекулярний вага приблизно від десяти до тридцяти тисяч дальтон.

Шостим об'єктом справжнього винаходу є кон'югати, що включають в себе очищену уратоксидазу (уриказу) і полі(етиленгліколь) або полі(этиленоксид), в яких, щонайменше, 95% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров, при тому, що середня кількість ниток зазначеного полі(етиленгліколю) або полі(етиленоксиду), ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від двох до десяти, а середня молекулярна вага названих полі(етиленгліколю) або полі(етиленоксиду) становить приблизно від десяти до шістдесяти тисяч дальтон.

У приватному варіанті здійснення щонайменше 97% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров.

Сьомим об'єктом справжнього винаходу є фармацевтична композиція для зниження рівнів сечової кислоти в рідині або тканини організму ссавця, що включає в себе кон'югат очищеної урикази з полі(етиленгліколем) або полі(етиленоксидом) і фармацевтичес�дить до складу тетрамеров і октамеров.

У приватному варіанті здійснення, композиція має стабілізовану лиофилизированную форму, швидко відновлювану розчиненням з одержанням розчину, придатного для парентерального введення.

Восьмим об'єктом даного винаходу є спосіб очищення уратоксидази (урикази) із збереженням її уриколитической активності, в якому з фракцій уратоксидази виділяють агрегати урикази крупніше октамеров і відкидають їх з отриманням очищеної урикази, щонайменше, 95% від загальної кількості молекул якої входить до складу тетрамеров і октамеров.

У приватному варіанті здійснення способу, виділення здійснюють за допомогою іонообмінних хроматографії, розмірно-ексклюзивної хроматографії або ультрафільтрації.

У ще одному приватному варіанті здійснення способу при виділенні детектують і відкидають фракції урикази, містять агрегати крупніше октамеров.

В іншому приватному варіанті здійснення способу детекцію здійснюють за допомогою вимірювання світлорозсіювання.

Дев'ятим об'єктом справжнього винаходу є виділена уратоксидаза (уриказа), одержана способом, в якому від тетрамеров урикази відокремлюють агрегати урикази крупніше октамеровдит до складу тетрамеров і октамеров.

У приватному варіанті здійснення щонайменше 97% від загальної кількості молекул уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров.

Короткий опис креслень

Фіг.1 ілюструє активність урикази, загальні концентрації білків і солей у фракціях, одержаних з аніонообмінних колонки від Pharmacia Biotech Mono Q (1×10 см). Активність урикази вимірювалася при кімнатній температурі шляхом відстеження зменшення поглинання довжини хвилі 292 нм 100 мкмоль сечової кислоти в 200 ммоль бората натрію, рН 9,2. Загальна кількість білка визначають за площі під кривою піку поглинання урикази при аналізах ВЕРХ з виключенням за розміром.

Фіг.2 ілюструє аналіз з допомогою ВЕРХ з виключенням за розміром в колонці Pharmacia Superdex 200 (1×30 см) завантаження і обраних фракцій, отриманих при Mono Q хроматографії свинячий урикази, що містить мутації R291K і T301S (PKS уриказа), що показує дані, отримані детектором світлорозсіювання при 90°C (верхні криві) і поглинання при 276 нм (нижні криві). Очевидні різні сили сигналу тетрамерних, октамерних і більше високоагрегированних форм урикази в розділеному на фракції зразку (завантаження) і в різних фракціях. Завантаження була розбавлена в співвідношенні 1/5 за допомогою буфера колонкинировались, формуючи "слабосолевой пул".

Фіг.3 ілюструє аналізи з виключенням за розміром фракцій, отриманих з колонки Mono Q по фіг.1, показують дані, отримані детектором світлорозсіювання при 90°C і поглинання при 276 нм, як на фіг.2. Фракції, показані на цьому кресленні, використовувалися для формування "сильносолевого пулу", з якого ПЕГ-кон'югати були приготовані і ін'єктовані мишей BALB/c. Результуючі активності сироватки та імунологічні реакції мишей BALB/c показані на фіг.5 і 6.

Фіг.4 ілюструє зміст октамеров, визначене шляхом поглинання довжини хвилі 276 нм і з допомогою розсіювання світла при 90 градусах, розраховане за даними фіг.2 і 3, не розділена на фракції PKS уриказе і в обраних фракціях, одержаних з допомогою хроматографії PKS урикази в колоні Mono Q (фіг.1).

Фіг.5 ілюструє УФ-дослідження, як і на фіг.1, активності урикази після 4 годин інкубування при 37°C, в сироватках, вилучених через 24 години після кожної з шести щотижневих ін'єкцій 6×10 кДа ПЕГ-кон'югатів PKS урикази або пулів фракцій з колони Mono Q.

Фіг.6 ілюструє імуноферментні твердофазні аналізи (ELISA) формування антитіла IgG до ПЕГ-конъюгатам PKS урикази і до ПЕГ-конъюгатам пулів фракцій екций 0,2 мг уриказного білка на кожні 20 грамів ваги тіла самок мишей BALB/c. Для кожної миші дані по крові через 24 години після першої-шостої ін'єкції показані зліва направо. Умови дослідження описані в прикладі 6. Дані для восьми мишей в кожній групі організовані в порядку зростання імунної реакції, зліва направо.

Здійснення винаходу

Попередні дослідження показали, що коли значне зниження імуногенності та/або антигенності урикази досягається за допомогою її кон'югування з ПЕГ (ПЕГ-илирования), воно незмінно пов'язане зі значною втратою уриколитической активності. Даний винахід зокрема експлуатує той факт, що сліди агрегатів уратоксидаз крупніше октамеров, вносять значний внесок у імуногенність і прискорене виведення ПЕГ-уриказних кон'югатів. Це відкриття з найбільшою ймовірністю застосовно до відмінним від уриказ білків, у тому числі до интерферонам і факторів росту.

На безпеку, зручність і фінансову вигоду биомедикаментов негативно впливає зниження їх сили і випливаюча із цього необхідність збільшення дози введення. Таким чином, існує необхідність у безпечному і ефективному альтернативний засіб для зниження підвищених рівнів сечової кислоти в рідинах організму, в т�иказних агрегатів крупніше октамеров, для використання при синтезі ПЕГ-урикази. Дана ПЕГ-уриказа зберігає всю або майже всю уриколитическую активність інтактного ферменту. Також даний винахід забезпечує очищену уриказу, практично вільну від агрегатів крупніше октамеров. Термін "практично вільна" вказує на те, що очищена уриказа містить не більше приблизно 2%, а переважно не більш приблизно 1% агрегатів крупніше октамеров.

Даний винахід забезпечує такий спосіб очищення урикази, що агрегати крупніше октамеров, виключаються з очищеного препарату. Оскільки ці великі агрегати є сильно імуногенними, їх наявність в очищеному уриказном препарат небажано. Спосіб включає в себе відстеження колоночних фракцій з допомогою світлорозсіювання замість або на додаток до поглинання ультрафіолетового випромінювання з довжиною хвилі 280 нм, оскільки ці агрегати можуть бути дуже розбавлені, щоб виявлятися з допомогою поглинання ультрафіолетового випромінювання. Очищена уриказа потім кон'югується з водорозчинними полімерами, переважно з полі(этиленгликолями) або полі(этиленоксидами), як описано в паралельно розглянутої патентній заявці США №�s, може виконуватися будь-яким із способів, відомих фахівців, у тому числі хроматографією з виключенням за розміром, іонообмінною хроматографією, ультрафільтрацією крізь мікропористу мембрану і центрифугуванням, в тому числі ультрацентрифугированием. Спосіб відділення може містити поділ і аналіз фракцій і усунення або виключення тих фракцій, які містять надлишкові кількості великих агрегатів. Одержуваний уриказний препарат більшою мірою придатний для синтезу практично неиммуногенних кон'югатів урикази, ніж нерозділене на фракції уриказа. Для постійного введення важливо, щоб ПЕГ-кон'югати білків, наприклад ПЕГ-уриказа, мали низьку імуногенність і не викликали прогресуюче швидке виведення з потоку крові після повторюваних дозувань.

Винахід також забезпечує фармацевтичні склади полімер-уриказних кон'югатів. Ці кон'югати є практично неиммуногенними і зберігають щонайменше 75%, переважно 85%, а більш переважно 95% або більше уриколитической активності інтактного ферменту. Урикази, придатні для кон'югування з водорозчинними полімерами, включають в себе уратоксидази природного походження, виделЂантние, гібридні та/або усічені ферментативно-активні варіанти урикази. Водорозчинні полімери, придатні для використання в цьому винаході, включають в себе лінійні і розгалужені полі(этиленгликоли) або полі(этиленоксиди), спільно відомі як ПЕГ. Приклади розгалужених ПЕГ є предметом патенту США №5643575. Одним з кращих прикладів ПЕГ є монометоксиПЭГ з загальною структурою CH3O-(CH2CH2O)nH, де n варіює приблизно від 100 до приблизно 2300.

Одним з варіантів здійснення цього винаходу є кон'югат уратоксидази (урикази), який зберігає щонайменше приблизно 75% уриколитической активності некон'югованої урикази і володіє значно зниженою иммуногенностью. Уриказа з даного аспекту винаходу може бути рекомбінантної. Є вона рекомбінантної чи ні, це може бути уриказа, що походить від ссавця. В одному з аспектів даного варіанту здійснення уриказа може бути уриказой свинячий, бичачої або овечої печінки. У ще одному аспекті даного варіанту здійснення уриказа може бути химерною. Химерна уриказа може містити частини урикази свинячої печінки і/або уріка�). Альтернативно, уриказа може бути уриказой печінки бабуїна, в якій тирозин 97 замінений на гістидин, причому специфічна активність урикази може бути збільшена щонайменше на 60%. Уриказа щодо винаходу, якого б походження вона не була, може також бути в скороченій формі, або з боку аміно-кінця, або з боку карбоксильного кінця, або з обох кінців. Подібним же чином уриказа може бути грибний або мікробної уриказой. В одному з аспектів даного варіанту здійснення грибна або мікробна уриказа може бути природною або рекомбінантною формою урикази з Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis. Bacillus sp. або Candida utilis. Альтернативно уриказа може бути уриказой безхребетного, такий як, наприклад, природна або рекомбінантна форма урикази з Drosophila melanogaster або Drosophila pseudoobscura. Уриказа щодо винаходу може бути також рослинної уриказой, наприклад природною або рекомбінантною формою урикази з бульбочок соєвого кореня (Glycine max). ПЕГ може мати середня молекулярна вага приблизно між 5 кДа і 100 кДа; переважно ПЕГ може мати середня молекулярна вага приблизно між 8 кДа і 60 кДа; більш переважно ПЕГ може мати середня молекулярна вага між приблПЭГ може становити від 2 до 12 ниток на субодиницю урикази; переважно, середня кількість ковалентно пов'язаних ниток складає від 6 до 10 на субодиницю; більш переважно, середня кількість ниток ПЕГ становить від 7 до 9 на субодиницю. В одному з аспектів даного варіанту здійснення уриказа може бути тетрамерной. Нитки ПЕГ можуть бути ковалентно пов'язані з уриказой через уретанові (карбаматние) зв'язку, вторинні амінні зв'язку та/або амідні зв'язки. Якщо уриказа є рекомбінантною формою будь неявної тут урикази, то ця рекомбінантна форма може в значній мірі мати послідовність природної форми.

Однією з бажаних уриказ ссавця є рекомбінантна химерна уриказа свині-бабуїна, складена з частин послідовностей урикази свинячої печінки і печінки бабуїна, обидві з яких були вперше визначені Wu et al., (1989). Один із прикладів такої химерної урикази містить перші 288 амінокислот свинячий послідовності (SEQ ID NO:1), а останні 16 амінокислот бабуиновой послідовності (SEQ ID NO:2). Hershfield, et al. International Publication WO 00/08196, Urate Oxidase, опубліковано 17 лютого 2000. Оскільки остання послідовність відрізняється від свинячий послідовності тільки двох позиціях, утримуючи лізин (K)і PKS уриказа (SEQ ID NO:3). PKS уриказа має на один лизиновий залишок більше і, отже, на один потенційний сайт ПЭГилирования більше, ніж свиняча або бабуиновая послідовності.

кДНК для різних уриказ ссавців, у тому числі PKS урикази, були субклонировани, і були визначені оптимальні умови для експресії в E. coli з допомогою стандартних способів. См. Erlich, НА, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Рекомбінантні урикази екстрагували, очищали, а їх стабільність і активність досліджували за допомогою модифікацій стандартних тестів. См. Fridovich, I, (1965) J Товарbiol Chem 240:2491-2494; Nishimura et al., (1979), і приклади 1 і 5.

В одному з варіантів здійснення винаходу уриказа може конъюгироваться з допомогою біологічно стабільної, нетоксичною, ковалентного зв'язку з відносно невеликою кількістю ниток ПЕГ. Такі зв'язки можуть бути уретановими (карбаматними) зв'язками, вторинними амінними зв'язками і амидними зв'язками. Різні активовані ПЕГ, придатні для такого кон'югування, комерційно доступні у фірми Shearwater Polymers, Huntsville, AL.

Наприклад, уретанові зв'язку з уриказой можуть формуватися шляхом інкубування урикажет бути синтезований за допомогою процедури, описаному в патенті США №5612460. НФК-ПЕГ може бути синтезований шляхом реагування ПЕГ з п-нитрофенилхлорформатом у відповідності зі способами, описаними в Veronese, FM, et al., (1985) Допоможіть Biochen Biotechnol 11:141-152, і в патенті США №5286637. Способи, описані в патенті '637, адаптовані для ПЕГ з великою молекулярною вагою шляхом регулювання концентрацій реагентів для підтримки подібної стехіометрії. Альтернативний спосіб синтезу НФК-ПЕГ описаний в Buttner, W, et al., опис патенту НДР №279486 А1.

Амідні зв'язки з уриказой можуть бути отримані з допомогою N-гидроксисукцинимидного сложноефірного карбоксилово-кислотного похідного ПЕГ (Shearwater Polymers). Вторинні амінні зв'язку можуть бути сформовані за допомогою 2,2,2-трифторэтансульфонилового ПЕГ (тресил ПЕГ; Shearwater Polymers) або шляхом відновлювального алкілування за допомогою ПЕГ-альдегіду (Shearwater Polymers) і цианборгидрата натрію.

У конъюгатах, що містять ПЕГ з молекулярною вагою до 10 кДа, максимальна кількість ниток ПЕГ, які пов'язувалися з однією субодиницею при збереженні щонайменше 75% уриколитической активності інтактного ферменту, становило приблизно 12 ниток для уриказ ссавців (наприклад, PKS урикази, мутеина свинячий урикази; див. умови тесту в Примерполнения винаходу середня кількість ниток ПЕГ, пов'язаних з субодиницею урикази, становило приблизно між 2 і 12. У кращому варіанті здійснення середня кількість ниток ПЕГ, пов'язаних з субодиницею урикази, становило приблизно між 6 і 10. У більш кращому варіанті существления середня кількість ковалентно пов'язаних з субодиницею урикази ниток ПЕГ становило приблизно між 7 і 9. Ще В одному варіанті здійснення молекулярний вага ПЕГ, використаних у реакції зв'язування, становив приблизно між 5 кДа та 30 кДа, переважно приблизно між 10 кДа і 20 кДа.

Існує кілька факторів, які можуть впливати на вибір оптимального молекулярного ваги і кількості ниток ПЕГ для зв'язування з певною формою урикази. В цілому зменшення або усунення імуногенності без значної втрати уриколитической активності може зажадати зв'язування порівняно більшої кількості ниток ПЕГ більш низької молекулярної ваги, у порівнянні з відносно меншою кількістю ниток ПЕГ більш високої молекулярної ваги. Подібним же чином, кожна відмінна форма урикази може мати різний оптимум по відношенню і до розміру, та до кількості ниток. Оптимальна кількість ні�гати урикази ссавця були приготовані з очищених тетрамерних і октамерних форм ферменту (містять чотири або вісім субодиниць вагою приблизно 35 кДа), вони виявляли докорінно ослаблену імуногенність у мишей, в протилежність помірної імуногенності ПЕГ-кон'югатів препаратів урикази, що містили великі агрегати (див. фіг.6), і дуже високою імуногенності інтактного ферменту.

Очищені препарати природних і рекомбинантнихуриказ зазвичай містять суміш дуже великих агрегатів ферменту додатково до тетрамерной (140 кДа) і октамерной (280 кДа) формами. Відсоток урикази, що знаходиться або в тетрамерной, або в октамерной формі в кожному уриказном препараті, зазвичай варіюється приблизно від 20% до 95% (див. фіг.2-4). Незважаючи на очевидність того, що не-ПЕГ-илированние агрегати кількох інших білків є високоиммуногенними (наприклад, див. Moore, WV, et al., (1980)JCIin Endocrinol Metab 51:691-697), попередні дослідження ПЕГ-урикази не описували ніяких спроб обмежити вміст агрегатів, що говорить про те, що потенційна імуногенність ПЕГ-модифікованих агрегатів не розглядалася. На основі спостережень винахідників представляється вірогідним, що такі агрегати були присутні в ферментних препаратах, що використовувалися раніше для синтезу ПЕГ-урикази. Їх присутність могла ускладнювати завдання приготування неиммуногенних конъѾпитках ПЕГ-илирования урикази, були пов'язані з великою кількістю ниток ПЕГ низької молекулярної ваги, які зв'язувалися. З іншого боку, способи очищення та ПЕГ-илирования урикази, описані тут, забезпечують ковалентное приєднання 12 ниток ПЕГ на субодиницю, зберігаючи при цьому більше 75% уриколитической активності, принаймні для деяких уриказ, наприклад, PKS урикази (мутеина свинячих уриказ) і ферменту з термофільною Bacillus sp.

У ще одному варіанті здійснення практично всі великі агрегати ферменту можуть бути видалені іонообмінною хроматографією (фіг.1, 2 і 3) або хроматографією з виключенням за розміром при рН приблизно 9 до 10,5, переважно 10,2 перед конъюгированием отриманого практично вільного від агрегатів препарату урикази з ПЕГ. Молекулярний вага урикази в кожній фракції, отриманої з препаративної колонки, може бути відстежено за допомогою будь-якої залежить від розміру аналітичної технології, в тому числі, наприклад, ВЕРХ, загальноприйнятою хроматографії з виключенням за розміром, центрифугування, світлорозсіювання, капілярного електрофорезу або гель-електрофорезу в неденатурирующем буфері. Для вільної від агрегатів урикази, виділеної з допомогою хроматогра�ься і використовуватися для кон'югування з ПЕГ. Для тетрамерной і октамерной урикази, виділеної за допомогою іонообмінної хроматографії, фракції, отримані з іонообмінної колони, можуть аналізуватися щодо розміру для визначення того, які фракції содержатзначительние кількості тетрамерних і октамерних форм без великих агрегатів, за допомогою світлорозсіювання. В очищеному продукті небажані великі агрегати можуть, таким чином, складати не більше приблизно 1% від усієї урикази.

Результати, представлені тут, показують, що, навіть у разі сильного ПЕГ-илирования, форми PKS урикази крупніше октамеров, провокують прискорене виведення (фіг.5) і є в деякій мірі імуногенними для мишей (фіг.6). Навпаки, кон'югати, приготовані з урикази, яка була практично вільна від великих агрегатів (що виявляються за допомогою світлорозсіювання), можуть повторно ін'єктувати щонайменше шість разів з інтервалом в один тиждень з набагато менш помітним збільшенням швидкостей виведення (фіг.5) і без виявленої формування антитіл, як було показано за допомогою чутливого твердофазного імуноферментного тесту (фіг.6). Використання високоочищений тетрамерной або октамерной урикази �раніше. Навпаки, наявність значної кількості великих агрегатів в препаратах урикази, що використовувалися деякими попередніми дослідниками, могло призводити до спроб зв'язування великої кількості ниток ПЕГ для придушення імуногенності. Внаслідок этогоферментативная активність получавшихся кон'югатів сильно послаблювалася.

ПЕГ-уриказние кон'югати по справжньому винаходу корисні для зниження рівнів сечової кислоти в рідинах і тканинах організму ссавців, переважно людей, і, таким чином, може використовуватися для лікування підвищених рівнів сечової кислоти, пов'язаних з такими станами як подагра, подагричні вузли, ниркова недостатність, трансплантація і злоякісне захворювання органу. ПЕГ-уриказние кон'югати можуть ін'єктувати ссавцю, має надлишкові рівні сечової кислоти, будь-яким з декількох маршрутів, у тому числі внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньошкірно, внутрішньом'язово і внутрішньочеревно. Альтернативно, вони можуть розпорошуватися і ингалироваться. См. Patton, JS (1996) Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 і патент США №5458135. Ефективна доза ПЕГ-урикази по справжньому винаходу буде залежати від рівня сечової кислоти та розміру індивіда. В одному з вариантли розчиннику в кількості від приблизно 10 мкг до приблизно 1 р. У кращому варіанті здійснення вводиться кількість становить приблизно між 100 мкг і 500 мг. Більш переважно кон'юговані уриказа вводиться в кількості між 1 мг і 100 мг, наприклад 5 мг, 20 мг або 50 мг. Маси, задані для дозувань за варіантами здійснення, відносяться до кількості білка в конъюгате.

Фармацевтичні композиції, що містять ПЕГ-уриказу, можуть бути приготовані за допомогою общепринятихтехнологий, наприклад, какописано в Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Easton, PA: Mack Publishing Co. Придатні наповнювачі для приготування ін'єкційних розчинів включають в себе, наприклад, фосфатно-сольовий буферний розчин, лактатний розчин Рінгера, воду, поліоли і гліцерин. Фармацевтичні композиції для парентеральної ін'єкції містять фармацевтично прийнятні стерильні водні і неводні рідини, дисперсії, суспензії або емульсії, а також стерильні порошки для одержання стерильних ін'єкційних розчинів чи дисперсій прямо перед використанням. Ці композиції можуть містити такі додаткові компоненти, як, приміром, консерванти, солюбилизатори, стабілізатори, зволожуючі агенти, емульгатори, буфери, антиоксиданти і розріджувачі.

ПЕГ-для тривалого управління підвищеними рівнями сечової кислоти в рідинах організму. Наприклад, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, регенерований колаген, полі-L-лізин, алгинат натрію, геллановая гума, хітозан, агароза, многопластинчатие ліпосоми і багато загальноприйняті формули пролонгованої дії містять биоэродирующие і биоразрушаемие матеріали, які можуть вводитися в формулу з біологічно активними сполуками. Ці матеріали, будучи імплантованими або введеними шляхом ін'єкції, поступово руйнуються і вивільняють активний матеріал в навколишню тканину. Наприклад, один із способів інкапсулювання ПЕГ-урикази містить спосіб, розкритий у патенті США №5653974. Використання биоэродируемих, биоразрушаемих та інших композицій пролонгованої дії явно включено в даний винахід. Використання інфузійних насосів і систем матричних носіїв для доставки ПЕГ-урикази також входить в обсяг цього винаходу. ПЕГ-уриказа також може вигідним чином инкапсулирована в міцели або ліпосоми. Технологія липосомной інкапсуляції добре відома з рівня техніки. См., наприклад, Lasic, D, etal., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, FL: CRC Press.

Фармацевтичні композиції з ПЕГ-уриказой по справжньому винаходу зменшать потреба в гемодиа�нсплантированним органом (див. Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56:317-321) і пацієнтів з деякими злоякісними захворюваннями. У пацієнтів з великими відкладеннями кристалічних уратів (подагричними вузлами) такі фармацевтичні композиції поліпшать якість життя швидше, ніж доступне в даний час лікування.

Наступні приклади, які не слід розглядати, як яке-небудь обмеження винаходу, ілюструють різні розкриті вище аспекти. Ці приклади описують ПЕГ-урикази, приготовані шляхом зв'язування активованого ПЕГ (наприклад, похідного п-нитрофенилкарбоната) з мутеином свинячий урикази. Ці приклади дають фахівцю керівництво для виробництва практично неиммуногенних кон'югатів урикази, які зберігають, щонайменше, приблизно 75% уриколитической активності інтактного ферменту і добре придатні для постійного введення.

Приклад 1

Препаративна іонообмінна хроматографія урикази

Препаративнаяионообменнаяхроматография виконувалась на апараті швидкої білкової рідинної хроматографії (ББЖХ) (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Колонку Mono Q (1×10 см, Amersham Pharmacia) элюируют градієнтом від 50 ммоль карбонату натрію, рН 10,3, 0,1 моль NaCl (буфер А) до 50 ммоль карбонату натрію, рН 10,3, 0,6 моль потоку. Цю технологію використовують для поділу на фракції 25 мл розчину PKS урикази (рН 10,3). PKS уриказа була отримана у фірми Bio-Tecnology General Limited (Rehovot, Israel). Уриказа була рекомбінантної свинячий уриказой, в якій один лизиновий залишок (K) і один сериновий залишок (S) замінили один аргининовий залишок і один треониновий залишок, відповідно, в батьківській свинячий послідовності (Lee et al., (1988) Science 239:1288-1291; Wuet at., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:9412-9416). Після завантаження зразка колона промивалася з допомогою 100 мл буфера А. Пикурикази почав элюироваться наприкінці 31-мл лінійного буфера Б з градієнтом від 0 до 26%. Велика частина урикази изократически элюируется 7 мл буфера, що містить 26% буфера Б. Залишок відновленої урикази элюируют 89-мл буфера Б з лінійним градієнтом від 26% до 100%. Фракції 4 мл або 6 мл збирають. Аликвотние кількості фракцій №4-11 тестують на уриказу і загальний вміст білка (фіг.1) і аналізують високоефективної рідинної хроматографією (ВЕРХ) з виключенням за розміром, як описано в прикладі 2 (фіг.2 і 3). Решту частини фракцій №5-10 пов'язують з ПЕГ, як описано в прикладі 3. На підставі результатів аналізів прикладу 2 ПЕГ-кон'югати фракцій №5 і 6 об'єднують в якості "слабосолевого пулу", а ПЕГ-конъюгафия з виключенням за розміром урикази, отслеженной за светорассеиванию і поглинання ультрафіолетового

ВЕРХ з виключенням за розміром проводять при кімнатній температурі на колоні Superdex 200 (1×30 см, Amersham Pharmacia Biotech) над нерозділеного на фракції PKS уриказой і над обраними фракціями з препаративної Mono Q-хроматографії PKS урикази з прикладу 1. Світлорозсіювання елюату з монітора поглинання (UV 2000) Thermo Separations HPLC (Sunnyvale, CA) аналізують на детекторі MiniDawn компанії Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA) при куті падіння світла 90 градусів.

Результати, показані на фіг.2-4, ілюструють відмінність між тетрамер, октамером і великими агрегатами субъдиниц урикази і різні сигнали, зафіксовані від цих форм урикази в різних зразках. На відміну від сигналу поглинання, який прямо пропорційний концентрації, сигнал світлорозсіювання пропорційний добутку концентрації та розміру светорассеивающей одиниці. Результуюча чутливість детектора світлорозсіювання до дуже малих кількостей сильноагрегированной урикази дозволила виявити наявність самих великих агрегатів, які элюировали в мертвому обсязі (приблизно 7 мл).

Приклад 3

Синтез ПЕГ-уриказних кон'югатів

Нефракционированную PKS уриказу (від Bio-Technology General Limi�онатного виробництва ПЕГ (НФК-ПЕГ), отриманого від Shearwater Polymers (Huntsville, AL). Отримання НФК-ПЕГ з ПЕГ з допомогою фенилхлорформатов було описано у кількох статтях (наприклад, Veronese, FM, et at., (1985) Допоможіть Biochem Biotechnol 11:141-152; Kito, M, et al., (1996)J Clin Biochem Nutr 21:101-111), a НФК-ПЕГ використовувався для синтезу ПЕГ-білкових кон'югатів попередніми дослідниками, в тому числі, даними винахідниками (наприклад, Veronese, FM, вище; Sherman, MR, et at., у JM Harris et al., (Eds.) Poly(ethylene glycol) Biological Chemistry and Applications. ACS Symposium Series 680 (pp.155-176) Washington, DC: American Chemical Society). Кількість ниток ПЕГ вагою 10-40 кДа, пов'язаних з кожної субодиницею урикази визначалося рівним шести у відповідності зі способом, описаним у Kumtani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588:125-137.

Приклад 4

Стійкість та імуногенність урикази і ПЕГ-урикази в сироватці in vivo

ПЕГ-коъюгати рекомбінантних уриказ ссавців, приготовані у відповідності зі способом за прикладом 3, доводять до 1 мг білка в фосфатно-буферному сольовому розчині (ФБС), рН 7,4, для ін'єктованість. Зразки заморожують і зберігають до аналізу або ін'єктованість. Зразки нагрівають до 37°C аж до 1 години перед ін'єктуванням групам з восьми самок мишей BALB/c. Групи мишей мали середній вагу в діапазоні 18-22 г на початку дослідження.

Вага всіх мишей відстежують, і записують показання до� з шести щотижневих ін'єкцій тваринам робилася анестезія за допомогою кетаміну, і ретроорбитально отримують 100-200 мкл крові, крім випадку умертвіння (знекровлення), коли збирався більший обсяг. Сироватку готують із крові, яка згортається протягом від 4 до 32 годин при 2-8°C. Сироватки зберігають при -20°C. Сироватки аналізують на уриколитическую активність, як описано в прикладі 5, і аналізувалися на антитіла до уриказам, як описано в прикладі 6.

Приклад 5

Тести уриколитической активності ПЕГ-урикази в сироватках мишей, инъецированних ПЕГ-уриказой

Тест на активність, заснований на поглинанні ультрафіолетового світла (УФ-тест), виконують з допомогою 100 мкмоль сечової кислоти в якості субстрату в 200 ммоль бората натрію, рН 9,2, в микропластиночной модифікації способу Fridovich I. (J Товарbiol Chem. (1965) 240:2491-2494). Зменшення поглинання довжини хвилі 292 нм відстежують протягом 15 хвилин при кімнатній температурі 96-чарункова планшеті з прозорим для УФ-випромінювання дном (Costar, Coming, NY) за допомогою микропластиночного зчитувача SpectraMAX 250 компанії Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Дані аналізувалися шляхом знаходження максимальної крутості характеристики (міллі-одиницях поглинання в хвилину) вимірювань поглинання, виконаних в ході інтервалу, протягом якого окислювалося від 10 до 40% субстрату. Резу�воротках мишей, инъецированних вперше за допомогою PKS урикази, пов'язаної з шістьма нитками ПЕГ вагою 10 кДа, на субодиницю (6×10-кДа ПЕГ PKS) становив 29±4 години на підставі даних сироваток, отриманих через 24 і 72 години після ін'єкції.

В окремих експериментах було встановлено, що виявляється уриколитическая активність у сироватках мишей, инъецированних з допомогою ПЕГ-урикази, зменшувалася під час зберігання при -20°C, і що максимальне відновлення даної активності досягалося шляхом 4-годинного інкубування при 37°C перед дослідженням. Фіг.5 показує, що відновлення уриколитической активності після повторних щотижневих ін'єкцій 6×10-кДа ПЕГ PKS урикази було найбільшим, коли фермент очищався допомогою хроматографії на колонці Mono Q, як у прикладі 1, перед ПЭГилированием у відповідності зі способом за приклад 3. Відновлення було найвищим після ін'єктованість кон'югатів, приготованих з пулу сильносолевих елюатів з прикладу 1 (див. фіг.1), який має найменшу зміст дуже великих агрегатів (див. профілі світлорозсіювання фракцій 7-10 на фіг.3). Негайне відновлення досягалося з допомогою кон'югатів, приготованих з пулу слабосолевих елюатів з колони Mono Q за прикладом 1, а наихудшрая мала найменше зміст дуже великих агрегатів (див. фіг.2). Той же порядок відносних активностей, відновлених у сироватці після повторних ін'єкцій (сильносолевой пул > слабосолевой пул > нерозділена уриказа) спостерігався незалежно від того, чи використовувався описаний вище УФ-тест або колорометрический тест адаптований варіант Р. Fossati et al., (J. Clin Chem (1980) 26:227-231), і незалежно від того, инкубировались чи сироватки при 37°C перед тестуванням.

Приклад 6

Твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) сироваток мишей, инъецированних з допомогою ПЕГ-урикази

Неконкурентні аналізи ELISA проводилися на свинячий уриказе, сорбированной на 96-чарункових планшетах Immulon 2 (Dynex Technologies, VWR Scientific, San Francisco, CA). Первинні антисироватки бралися у мишей, инъецированних уриказой або 6×10-кДа ПЕГ-кон'югатами, приготованими у відповідності зі способом за приклад 3. Вторинне антитіло було козячим антимишиним IgG, пов'язаних з пероксидазою хрону (Calbiochem-Novabiochem #401 253, La Jolla, CA), а субстратом був про-фенилендиаминдигидрохлорид (Sigma P-9187, St. Louis, MO), як описано в Ст. Porstmann et al., (J dm. Chem. din. Biochem. (1981) 19:435-440).

Фіг.6 ілюструє результати неконкурентних тестів ELISA. Результати демонструють, що 6×10-кДа ПЕГ-уриказа, синтезована у відповідності зі способом по �х імунних реакцій ні в одній з восьми мишей, отримували щотижневі ін'єкції протягом шести тижнів. Кілька мишей, инъецированних кон'югатами, приготованими з не розділена на фракції PKS урикази у відповідності зі способом за прикладом 3, виявили слабкі, але виявляються імунні реакції. Найбільш часті випадки імунних реакцій спостерігались у мишей, инъецированних кон'югатами, приготованими у відповідності зі способом за прикладом 3 з пулу слабосолевих елюатів з колонки Mono Q приклад 1.

Без переваг, обумовлених детектором світлорозсіювання в аналізах ВЕРХ з виключенням за розміром, як описано в прикладі 2, не було б очевидно, що присутність самих великих агрегатів неоктамерной форми урикази пов'язано з прогресивно зменшується відновленням ПЕГ-уриказних кон'югатів після повторних ін'єкцій, що спостерігалося в прикладі 5 (фіг.5), і з збільшенням імуногенності у мишей BALB/c, що спостерігалося в прикладі 6 (фіг.6). Ці результати мають важливі наслідки для специфікацій урикази, використовуваної в якості стартового матеріалу для виробництва ПЕГ-урикази для клінічного використання.

Хоча винахід було описано ілюстративно з деякими подробицями і у вигляді прикладів в цілях ясності розуміння, специалистенения і модифікації без відходу від сутності та обсягу, який описаний і становить формулу винаходу.

1. Очищений препарат уратоксидази, що володіє зниженою иммуногенностью, що включає уратоксидазу з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:1, в якій залишок аргініну замінений залишком лізину в положенні 291, а залишок треоніна замінений залишком серину в положенні 301, причому щонайменше 95% від загальної кількості її молекул входить до складу тетрамеров і октамеров.

2. Очищена рекомбінантна уратоксидаза (уриказа), що характеризується вмістом тетрамеров і октамеров щонайменше 95% від загальної кількості її молекул, при цьому вона має аминокислотную послідовність свинячий уратоксидази SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 (R291K) та із залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301 (T301S) (PKS-уриказа).

3. Кон'югат для зниження рівнів сечової кислоти в рідині або тканини організму ссавця, що включає очищену уратоксидазу (уриказу) і поліетиленгліколь або поліетиленоксид, при цьому уратоксидаза має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 і з залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301, причому щонайменше 95% �про п. 3, в якому поліетиленгліколь являє собою монометоксиполиэтиленгликоль.

5. Кон'югат за п. 3, який містить ковалентний лінкер між
поліетиленгліколем або поліетиленоксид і уратоксидазой, обраний із групи, що включає уретановий (карбаматний) лінкер, вторинний аминовий лінкер і амідний лінкер.

6. Кон'югат за п. 3, в якому поліетиленгліколь або поліетиленоксид мають середній молекулярний вага приблизно 10000-60000 Так.

7. Кон'югат за п. 6, в якому поліетиленгліколь або поліетиленоксид мають середній молекулярний вага приблизно 10000-30000 Так.

8. Кон'югат за п. 3, в якому середня кількість ниток поліетиленгліколю або поліетиленоксиду, ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від двох до дванадцяти.

9. Кон'югат за п. 8, в якому середня кількість ниток поліетиленгліколю або поліетиленоксиду, ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від шести до десяти.

10. Кон'югат за п. 9, в якому середня кількість ниток поліетиленгліколю або поліетиленоксиду, ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються вказаний�дставляет собою лінійний поліетиленгліколь, а поліетиленоксид являє собою лінійний поліетиленоксид.

12. Кон'югат за п. 3, в якому поліетиленгліколь являє собою розгалужений поліетиленгліколь, а поліетиленоксид являє собою розгалужений поліетиленоксид.

13. Очищені фрагменти уратоксидази (урикази), що включають рекомбинантную уратоксидазу з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:1, в якій залишок аргініну замінений залишком лізину в положенні 291, а залишок треоніна замінений залишком серину в положенні 301, укорочену з аміно-кінця більшою мірою на 5 амінокислот та/або з карбоксильного кінця більшою мірою на 3 амінокислоти, причому щонайменше 95% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров.

14. Кон'югат для зниження рівнів сечової кислоти в рідині або тканини організму ссавця, що включає в себе очищену уратоксидазу (уриказу) і поліетиленгліколь або поліетиленоксид, при цьому уратоксидаза має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 і з залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301, а щонайменше 95% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази вхоиленоксида, ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від двох до десяти.

15. Кон'югат за п. 14, в якому поліетиленгліколь або поліетиленоксид мають середній молекулярний вага приблизно 10000-60000 Так.

16. Кон'югат за п. 15, в якому поліетиленгліколь або поліетиленоксид мають середній молекулярний вага приблизно 10000-30000 Так.

17. Кон'югат для зниження рівнів сечової кислоти в рідині або тканини організму ссавця, що включає в себе очищену уратоксидазу (уриказу) і поліетиленгліколь або поліетиленоксид, при цьому уратоксидаза має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 і з залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301, а щонайменше 95% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров, причому середня кількість ниток зазначеного поліетиленгліколю або поліетиленоксиду, ковалентно пов'язаних з кожної субодиницею, з яких складаються зазначені тетрамери і октамери, становить від двох до десяти, а середня молекулярна вага названих поліетиленгліколю або поліетиленоксиду становить приблизно 10000-60� ссавця, включає в себе ефективне кількість кон'югату очищеної уратоксидази (урикази) з поліетиленгліколем або поліетиленоксид і фармацевтично прийнятний носій, при цьому уратоксидаза має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 і з залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301, причому щонайменше 95% від загальної кількості молекул зазначеної уратоксидази входить до складу тетрамеров і октамеров.

19. Композиція з п. 18, яка має стабілізовану лиофилизированную форму, швидко відновлювану розчиненням з одержанням розчину, придатного для парентерального введення.

20. Спосіб очищення уратоксидази (урикази) із збереженням її уриколитической активності, що включає виділення і відкидання агрегатів урикази крупніше октамеров з отриманням очищеної урикази, при цьому уратоксидаза має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 з залишком лізину замість залишку аргініну в положенні 291 і з залишком серину замість залишку треоніна в положенні 301, причому щонайменше 95% від загальної кількості молекул якої входить до складу тетрамеров і октамеров.

21. Спосіб за п. 20, в якому виділення здійснюва�>p>22. Спосіб за п. 20, в якому при виділенні детектують і відкидають фракції урикази, містять агрегати крупніше октамеров.

23. Спосіб за п. 22, в якому детектування здійснюють за допомогою вимірювання світлорозсіювання.



 

Схожі патенти:

Білок, що володіє активністю щодо стимуляції елонгації ланцюгів жирних кислот, кодує його ген та їх застосування

Група винаходів відноситься до біотехнології, зокрема до білка, що володіє активністю щодо стимуляції елонгації ланцюгів жирних кислот, і полинуклеотиду, кодирующему цей білок. Запропоновані також вектор експресії, що містить полинуклеотид, і трансформант, отриманий із S. cerevisiae, для продукції зазначеного білка, що містить полинуклеотид або вектор. Група винаходів забезпечує ефективне продукування жирних кислот з довгим ланцюгом, які мають 18 атомів вуглецю. 5 н. і 4 з.п. ф-ли, 3 іл., 3 табл.

Спосіб отримання флуоресціюючих похідних катехоламінів та їх метаболітів методом дериватизации

Винахід відноситься до нового способу отримання флуоресціюючих катехоламінів, вибраних з дофаміну та адреналіну, і їх метаболітів, вибраних з гомованілінової і ванилилминдальной кислот, методом дериватизации. З'єднання можуть бути використані в якості високочутливих і селективних маркерів для визначення різних захворювань. Спосіб дериватизации включає окислення вихідних сполук та їх взаємодія з утворюють конденсовані структури амінами в середовищі CAPS-буферного розчину або гліцин - КОН 0.1 мМ пероксидом водню в присутності як каталізатора пероксидази хрону. Переважно процес проводять в 0,1 М буферному розчині при концентрації пероксидази хрону 0,01-1 мкМ; концентрації пероксиду водню - 100 мкМ, концентрації аміну - 0,1-33 мМ; концентрації катехоламінів і метаболітів - 0,03-1 мкМ. Спосіб є простим і технологічним, оскільки не вимагає підвищеної температури і здійснюється у водному розчині. 1 з.п.ф-ли, 2 іл., 3 пр.

Клітка мицелиального гриба penicillium canescens - продуцент ксиланази і лаккази, спосіб отримання комбінованого ферментного препарату ксиланази і лаккази

Група винаходів відноситься до біотехнології. Запропоновано клітина мицелиального гриба Penicillium canescens зі знятою катаболитной репресією і арабинозной індукцією, яка продукує ксиланазу і лакказу. Трансформована клітина плазміди, що містить промотор гена bgaS, лидерний пептид bgaS, фрагмент ДНК, що кодує ксиланазу, термінатор bgaS, ген β-лактамази і реплікон pMB1, і плазміди, що містить промотор гена bgaS, лидерний пептид bgaS, фрагмент ДНК, що кодує лакказу, термінатор bgaS, ген β-лактамази і реплікон pMB1. Запропоновано також спосіб ферментного препарату ксиланази і лаккази з використанням зазначеної клітини Penicillium canescens. Група винаходів забезпечує підвищення виходу цільових ферментів. 2 н. і 8 з.п. ф-ли, 9 іл., 3 табл., 4 пр.
Винахід відноситься до області біохімії і стосується застосування концентрату культуральної рідини штаму Trichoderma harzianum Rifai, депонованого у Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів під № МКПМ F-180, в якості інгібітора Андійських вірусу крапчастості картоплі. Винахід дозволяє знизити втрати картоплі від зараження рослин Андийским вірусом крапчастості. 2 пр.

Спосіб визначення активності пероксидаз і субстратна суміш для визначення активності пероксидаз

Група винаходів відноситься до біотехнології і може бути використане при створенні аналітичних наборів з використанням пероксидаз. Спосіб передбачає приготування субстратної суміші, введення в субстратную суміш пероксидаз з подальшою реєстрацією інтенсивності утворюється світіння. Субстратна суміш включає в себе наступні компоненти, зазначені у кінцевих концентраціях: буферний розчин 10-125 мМ, люмінол 0.05-8 мМ, пероксид водню 0.05-8 мМ, 4-аминопиридини 0.1-10 мМ, N-карбоксифенотиазин, або N-(карбоксиметил)фенотіазін, або N-(2-карбоксиэтил)фенотіазін 0.1-10 мМ. При цьому рН буферного розчину становить 7,9-9.0. Винахід забезпечує отримання високої інтенсивності хемілюмінесценції і, відповідно, високої чутливості визначення активності пероксидаз. 2 н. і 2 з.п. ф-ли, 8 пр.

Гени дельта-8-десатурази, ферменти, кодовані ними та їх застосування

Винахід відноситься до біохімії і являє собою виділені полінуклеотиди, що кодують Δ8-десатуразу. Винахід відноситься до самих Δ8-десатуразам, кодируемим виділеними полинуклеотидами, векторах експресії, що містять виділені полінуклеотиди, клітин-господарів, що містить вектори експресії, і до способів отримання Δ8-десатураз і поліненасичених жирних кислот, виділених з групи, що складається з дигомо-гамма-ліноленової кислоти (DGLA), ω3-эйкозатетраеновой кислоти (ω3-ЕТА) і будь-яких їх поєднань. Винахід дозволяє розширити асортимент Δ8-десатураз, що використовуються для отримання поліненасичених жирних кислот. 10 н. і 2 з.п. ф-ли, 12 іл., 14 табл., 6 пр.

Трансгенні рослини

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до генетичної конструкції для експресії нечутливою до треонину аспартаткинази в рослині, де конструкція містить специфічний для фази старіння промотор, функціонально пов'язаний з кодує послідовність, яка кодує поліпептид, що володіє активністю нечутливою до треонину аспартаткинази, і в якій специфічний до старіння промотор обраний із групи, що складається з SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 і SAG18, або їх функціональних варіантів, або фрагментів. Розкрито вектор, рослинна клітина, трансгенна рослина, матеріал для розмноження рослини, зібраний лист, курильний тютюн, містять вищевказану генетичну конструкцію. Також розкрито спосіб отримання трансгенної рослини, яке має здатність накопичувати треонін в в'янучих листках у більшій кількості, ніж у листках відповідного рослини дикого типу, і спосіб підвищення рівня треоніна в листі старіючого рослини до рівнів треоніна, що перевищують вміст треоніна у листках рослини дикого типу без погіршення пристосованості рослини з використанням вищевказаної генетичної конструкції. Винахід дозволяє отримувати т�даль, ніж у листках рослини дикого типу. 9 н. і 13 з.п. ф-ли, 16 іл., 2 табл., 4 пр.

Укорочена мутантна люцифераза з metridia longa для застосування в якості біолюмінесцентного репортера в живих клітинах

Винахід відноситься до біохімії і являє собою укорочену мутантную люциферазу MLM4 з Metridia longa розміром ~16 кДа з покращеними властивостями для використання в якості генетично-кодованого біолюмінесцентного репортера для візуалізації молекулярних процесів у живих клітинах. Амінокислотні заміни I69L, H74E, K125V, W139F введені в послідовність укороченою люциферази MLM4 з Metridia longa розміром ~16 кДа. Винахід дозволяє отримати люциферазу з підвищеною термостабільність і зі зсувом спектру в довгохвильову область, що обумовлює загальне збільшення чутливості біолюмінесцентного репортера при використанні в живих клітинах і організмах. 4 іл., 1 табл., 3 ін.

Поліпептиди для энантиоселективного ферментативного відновлення проміжних сполук

Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використане для энантиоселективного ферментативного відновленнякетосоединения загальної формули (I):де R являє собою захисну групу для функціональних аміногруп, а Х означає-Cl, -CN, -OH, Br, F

Мутантна рослинна формиатдегидрогеназа (варіанти)

Винахід відноситься до галузі генної інженерії і являє собою дві нові мутантні форми рослинної формиатдегидрогенази (ФДГ), що володіють підвищеною термостабільність порівняно з вихідним білком. У мутантних білках природний залишок аланіну в положенні, відповідному положенню 267 у вихідній послідовності формиатдегидрогенази з сої Glycine max, замінений на залишок метіоніну. Крім того, в одному з мутантів доподнительно природний залишок ізолейцину в положенні 272 замінений на залишок валіну. Винахід дозволяє отримати формиатдегидрогенази з підвищеною температурною стабільністю. 2 н. п. ф-ли, 2 табл., 4 пр.

Мутантна формиатдегидрогеназа (варіанти)

Винахід відноситься до галузі генної інженерії і може бути використане в процесах синтезу оптично активних з'єднань або фізіологічно активних речовин, детекції форміату, а також для отримання стресостійкість рослин. Винахід являє собою чотири нові мутантні форми рослинної формиатдегидрогенази (ФДГ). У першому з запропонованих мутантних білків природний залишок фенілаланіну в положенні, відповідному положенню 290 в послідовності формиатдегидрогенази з сої Glycine max, замінений на залишок аланіну. У другій мутантній формі ферменту цей же природний залишок фенілаланіну 290 замінений на залишок тирозину, у третій - на залишок треоніна і в четвертій - на залишок глутаміну. Винахід дозволяє отримати формиатдегидрогенази, що володіють поліпшеними властивостями в порівнянні як з ферментом дикого типу, так і з раніше описаними його мутантними формами 4 н. п. ф-ли, 2 табл., 5 пр.

Клітка мицелиального гриба penicillium canescens - продуцент ксиланази і лаккази, спосіб отримання комбінованого ферментного препарату ксиланази і лаккази

Група винаходів відноситься до біотехнології. Запропоновано клітина мицелиального гриба Penicillium canescens зі знятою катаболитной репресією і арабинозной індукцією, яка продукує ксиланазу і лакказу. Трансформована клітина плазміди, що містить промотор гена bgaS, лидерний пептид bgaS, фрагмент ДНК, що кодує ксиланазу, термінатор bgaS, ген β-лактамази і реплікон pMB1, і плазміди, що містить промотор гена bgaS, лидерний пептид bgaS, фрагмент ДНК, що кодує лакказу, термінатор bgaS, ген β-лактамази і реплікон pMB1. Запропоновано також спосіб ферментного препарату ксиланази і лаккази з використанням зазначеної клітини Penicillium canescens. Група винаходів забезпечує підвищення виходу цільових ферментів. 2 н. і 8 з.п. ф-ли, 9 іл., 3 табл., 4 пр.

Мутантна оксидаза d-амінокислот (варіанти)

Винахід відноситься до галузі генної інженерії і може бути використане для детекції D-амінокислот у складних зразках і в процесах ферментативного синтезу оптично активних речовин, альфа-кетокислот, цефалоспоринових антибіотиків та інших органічних сполук з використанням оксидаз. Отримані нові мутантні форми оксидази D-амінокислот з дріжджів Trigonopsis variabilis. В якості вихідного ферменту використана мутантна оксидаза D-амінокислот з дріжджів Trigonopsis variabilis з заміною Cys108Phe. Запропоновані нові мутантні форми відрізняються тим, що амінокислотний залишок фенілаланіну в положенні, відповідному положенню 54 в послідовності вищевказаної оксидази D-амінокислот, заміщений одним з таких залишків тирозину або серину. Винахід дозволяє отримати мутантні оксидази D-амінокислот, що характеризуються поліпшеними порівняно з вихідним мутантом і відповідним ферментом дикого типу каталітичними властивостями. 2 н.п. ф-ли, 1 іл., 2 табл., 4 пр.

Поліпептид, що має nadh-залежний hmf-редуктазную активність

Винахід відноситься до галузі біохімії

Композиції та способи зниження рівня h2s у ферментованих напоїв

Винахід відноситься до галузі біотехнології

Мутантна форма пероксидази хрону

Винахід відноситься до галузі біохімії

Набір синтетичних олігонуклеотидів для визначення нуклеотидної послідовності кодуючої частини гена des і виявлення мутацій, асоційованих з десминовими кардіоміопатіями

Винахід відноситься до галузі молекулярної біології і може бути використано в діагностиці кардіоміопатій різної природи. Запропонований набір синтетичних олігонуклеотидів для виявлення мутацій кодуючої частини гена десмина (DES), асоційованих з кардіоміопатіями. Мутації виявляють шляхом визначення повної нуклеотидної послідовності кодуючої частини гена DES. Здійснюють ампліфікацію кодуючої частини гена DES з допомогою 7 пар синтетичних олігонуклеотидів при одній температурі та часу відпалу, з подальшим секвенированием отриманих продуктів ампліфікації за допомогою однієї пари універсальних праймерів. Запропоноване винахід дозволяє чутливо і специфічно визначати мутації гена DES, при цьому скорочуються час реакції ампліфікації, кількість маніпуляцій, час внесення реактивів для реакції секвенування і знижується ймовірність помилки при постановці реакції. 2 з.п. ф-ли, 1 іл.
Up!