Brassica juncea якості омега-9

 

ЗАЯВКА НА ПРІОРИТЕТ

По цій заявці витребовується пріоритет за датою подання попередньої патентної заявки США з серійним номером 61/198422, поданої 4 листопада 2008 року, під назвою "Omega-9 Quality Brassica Juncea".

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ

Винахід належить області поліпшених видівBrassica, включаючиBrassica juncea, поліпшених масла і борошна зBrassica juncea, способів отримання таких поліпшених видівBrassicaі способів селекції лінійBrassica. Додаткові варіанти здійснення відносяться до насіннюBrassica junceaмістить ендогенне масло з підвищеним вмістом олеїнової кислоти і зниженим вмістом ліноленової кислоти щодо існуючих в даний час комерційних культиварівBrassica junceaі до насінняBrassica junceaзі стабільно внесеними в них характеристиками збільшеного вмісту олеїнової кислоти і зниженого вмісту ліноленової кислоти в олії насіння.

ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Канола являє собою генетичну варіацію ріпаку, спеціально розроблену канадськими рослинниками через характеристик її масла і борошна, зокрема її низького рівня насичених жирів. Як правило, "канола" відноситься до рослин видуBrassica�ів на грам не містить масла борошна. Як правило, масло каноли може включати насичені жирні кислоти, відомі як пальмітинова кислота стеаринова кислота, мононенасищенную жирну кислоту, відому як олеїнова кислота, і поліненасичені жирні кислоти, відомих як лінолева кислота і ліноленова кислота. Ці жирні кислоти іноді вказують по їх довжині вуглецевого ланцюга і кількістю подвійних зв'язків у ланцюзі. Наприклад, олеїнову кислоту іноді позначають як C18:1, так як вона містить ланцюг з 18 атомів вуглецю і одну подвійну зв'язок, лінолеву кислоту іноді позначають як C18:2, так як вона містить ланцюг з 18 атомів вуглецю і дві подвійні зв'язку, а ліноленова кислота іноді позначають як C18:3, так як вона містить ланцюг з 18 атомів вуглецю і три подвійних зв'язку. Масло каноли може містити менше ніж приблизно 7% всіх насичених жирних кислот (в основному пальмітинової кислоти і стеаринової кислоти) і понад 60% олеїнової кислоти (як відсоток від усіх жирних кислот). Як правило, культури каноли включають сортиBrassica napusіBrassica rapa. Нещодавно до сімейства культур каноли додано сортBrassica junceaякості каноли з якістю масла і борошна, подібним з іншими типовими представниками каноли (патент США № 6303849 Potts et al., вид�ияет на якість масла, стійкість і корисні для здоров'я характеристики. Наприклад, визнано, що олеїнова кислота (C18:1 мононенасичених жирних кислот) володіє певною користю для здоров'я, включаючи ефективність у зниженні рівнів холестерину в плазмі, що робить підвищені рівні вмісту олеїнової кислоти в олії насіння (>70%) бажаною характеристикою. Крім того, не всі жирні кислоти в оліях однаково чутливі до високої температури і окислення. Швидше, чутливість індивідуальних жирних кислот на окислення залежить від ступеня їх ненасиченості. Наприклад, ліноленова кислота (C18:3), що містить три подвійні зв'язки вуглець-вуглець окислюється в 98 разів швидше, ніж олеїнова кислота, що містить тільки одну подвійну зв'язок вуглець-вуглець, а лінолева кислота, що містить дві подвійні связх вуглець-вуглець окислюється в 41 разів швидше, ніж олеїнова кислота (R. T. Holman and O. C. Elmer, "The rates of oxidation of unsaturated fatty acid esters", J. Am. Oil Chem. Soc. 24, 127-129 1947). Для додаткової інформації щодо відносних швидкостей окислення олеїнової, лінолевої і ліноленової жирних кислот, див. Hawrysh, "Stability of Canola Oil", Chap. 7, pp. 99-122, Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology, Shahidi, ed., Van Nostrand Reinhold, NY, 1990.

"Стійкість" � утворення продуктів, викликають згіркнення і знижують якість продукту харчування. В умовах однакової обробки, технології отримання, упаковки та умов зберігання, основні відмінності в стійкості між різними рослинними оліями відбуваються внаслідок відмінності їх профілів жирних кислот. Таким чином, рослинну олію з високим вмістом олеїнової кислоти переважно в кулінарному застосуванні внаслідок його збільшеної стійкості до окислення при нагріванні. Погана стійкість до окислення призводить, наприклад, до скорочення тривалості експлуатації у разі, коли масло використовують в якості масла для смаження, так як окислення призводить до неприємних смаків і запахів, які можуть значно знизити ринкову вартість олії. З цих причин високий вміст олеїнової кислоти і низький вміст ліноленової кислоти можуть бути бажаними характеристиками в рослинних оліях.

Рослини синтезують жирні кислоти у своїх пластидах у вигляді пальмитоил-ACP (16:0-ACP) і стеароил-ACP. Перетворення стеароил-ACP в олеоил-ACP (18:1-ACP) каталізує розчинний фермент стеароил-ACP-Δ9-десатуразу (Shanklin and Somerville, 1991). Ці ацил-ACP використовуються або для синтезу гликолипидов в хлоропластах, �відбувається тільки після того, як вона буде використана при синтезі глицеролипидов і вмонтується в мембрани, що призводить до синтезу поліненасичених жирних кислот.

Фахівцям в даній області широко відомо, що ненасиченість жирних кислот в насінні олійних культур частково контролюється ферментами десатуразами жирних кислот (FAD). Ферменти FAD регулюють ненасиченість жирних кислот, таких як стеаринова кислота (C18:0), олеїнова кислота (C18:l) і лінолева кислота (C18:2), шляхом відщеплення атомів водню від певних атомів вуглецю ацильной ланцюга жирної кислоти, утворюючи подвійні зв'язки вуглець-вуглець. Синтез поліненасичених жирних кислот, лінолевої (Δ9, 12-18:2) і α-лінолевої (Δ9, 12, 15-18:3), починається з перетворення олеїнової кислоти (Δ9-18:1) у лінолеву кислоту, ферментативний етап, каталізуються мікросомальної ω-6-десатуразой олеїнової кислоти (FAD2). Потім лінолева кислота перетворюється в ω-ліноленову кислоту за допомогою додаткової десатурации ω-3-десатуразой лінолевої кислоти (FAD3). Існують публікації, що маніпуляції з геномFAD2за допомогою генетичної інженерії можуть змінювати профілі жирних кислот. Наприклад, гетерологическая експресія генаfad2сої у мутантної лініїArabidopsis�го, мутантна лініяArabidopsisfad2-5, де транскрипція генаfad2значимо знижена внаслідок вставки Т-ДНК, демонструє значне збільшення накопичення олеїнової кислоти і значиме зниження рівнів лінолевої кислоти та ліноленової кислоти (Okuley et al., 1994). Ці дослідження дозволяють припустити, що генFAD2відіграє важливу роль у контролі перетворення олеїнової кислоти в лінолеву кислоту у що зберігаються в насінні ліпідів.

Зроблені значні зусилля для маніпуляції профілем жирних кислот рослин, зокрема сортів з маслосодержащими насінням, таких як видиBrassica, які використовують для широкомасштабного виробництва комерційних жирів та масел (див, наприклад, патенти США №№ 5625130, виданий 29 квітня 1997 року, 5668299, виданий 16 вересня 1997 року, 5767338, виданий 16 червня 1998 року, 5840946, виданий 24 листопада 1998 року, 5850026, виданий 15 грудня 1998 року, 5861187, виданий 19 січня 1999 року, 6063947, виданий 16 травня 2000 року, 6084157, виданий 4 липня 2000 року, 6169190, виданий 2 січня 2001 року, 6323392, виданий 27 листопада 2001 року, і міжнародні патентні заявки WO 97/43907, опубліковану 27 листопада 1997 року, і WO 00/51415, опубліковану 8 вересня 2000 року).

Brassica juncea(геном AA BB; n=18) (також позначається в цьому документі �являється результатом гібридизаціїBrassica rapa(геном AA; n=10) іBrassica nigra(геном BB; n=8).Brassica napus(геном AA CC; n=19) (також позначається в цьому документіB. napus") також являє собою амфидиплоидное рослина генаBrassica, але, як вважають, є результатом гібридизаціїBrassica rapaіBrassica oleracea(геном CC; n=9). У деяких умовах зростанняB. junceaможе володіти певними відмінними ознакамиB. napus. Ці чудові ознаки можуть включати підвищену врожайність, поліпшену посухо - та жаростійкість і кращу стійкість до захворювань. Інтенсивні спроби селекції дозволили отримати рослини видівBrassicaолія насіння яких містить менше 2% ерукової кислоти, і знежирене борошно містить менше 30 мікромоль глюкозинолатів на грам. Термін "канола" використовують для опису сортів видівBrassica, що містять малі кількості ерукової кислоти (Δ13-22:1) і малі кількості глюкозинолатів. Як правило, масло каноли може містити менше ніж приблизно 7% всіх насичених жирних кислот і понад 60% олеїнової кислоти (як відсоток від усіх жирних кислот). Наприклад, у Сполучених Штатах Америки, 21 CFR 184.1555, ріпакова з низьким вмістом ерукової кислоти, отримане зBrassica napusилита жирних кислот, вміст олеїнової кислоти (C18:1) становить понад 50,0% по масі вміст лінолевої кислоти (C18:2) становить менше 40,0% по масі, а вміст ліноленової кислоти (C18:3) складає менше 14,0% по масі. У Канаді додаванняBrassica junceaдо визначення каноли Canola Council of Canada встановлює додаткові вимоги, щоб сорту канолиBrassica junceaповинні давати насіння, вміст олеїнової кислоти в олії яких дорівнює або більше 55% від усіх жирних кислот в насінні, а борошно, одержувана з насіння канолиBrassica juncea, повинна містити менше 1 мікромоль аліл-(2-пропеніл)глюкозинолатів на грам не містить масла борошна.

Відмінності між складами маселBrassica junceaіBrassica napusдобре відомі в цій галузі. Наприклад, відомо, що уBrassica junceaіснують відмінності за багатьма складовими, включаючи як неограничивающих прикладів фенольні складові (наприклад, токофероли), стероли, сульфіди, склади жирних кислот, мінеральні речовини і ізотіоціанати.Brassica junceaтакож містить леткі речовини з сильними протимікробними (бактерії та гриби) властивостями.

Рослинники-селекціонери вже селекціонували сорти каноли з низьким вмістом глюкозинолатів, таких як 3-бутенил-, 4-пентенр, як містить глюкозинолатів менше ніж 30 мікромоль аліфатичних глюкозинолатів на грам не містить масла борошна. В даний час основні комерційні культури каноли включають сортиBrassica napusіBrassica rapa (campestris). У патенті США № 6303849, виданому Potts et al. 16 жовтня 2001 року, описані лініїBrassica juncea, містять харчову олію з властивостями, подібними з каноли. Описані в ньому лініїBrassica junceaмають походження, що включає лініїBrassica junceaJ90-3450 і J90-4316, депоновані під інвентарними номерами ATCC 203389 і 203390, відповідно (які обидві депоновані Agriculture and Agri-Food Canada за умовами Budapest Treaty 23 жовтня 1998 року в American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Va. USA 20110-2209).

Зазначені вище приклади з пов'язаної області та пов'язані з ними обмеження призначені для ілюстрації, а не для виключення. Інші обмеження пов'язаної області будуть очевидні фахівцям в даній області при читанні опису і вивчення фігур.

СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ

Наведені нижче варіанти здійснення та його аспекти описані і проілюстровані у поєднанні з системами, засобами і способами, які вважають наведені для прикладу і ілюстративними, не обмежують обсягу. У різних вариантанти здійснення відносяться до інших поліпшень.

Винахід у різних аспектах відноситься до рослин, насіння, клітин, аллельним варіантів послідовностей нуклеїнової кислоти і маселBrassica juncea. Харчова олія в насінні рослин по винаходу може мати значимо більший вміст олеїнової кислоти і менший вміст ліноленової кислоти, що знаходиться в насінні інших рослинBrassica juncea. Ряд ліній з високим вмістом олеїнової кислоти/низьким вмістом ліноленової кислоти ("HOLL")Brassica junceaописані в цьому винаході. В одному з варіантів здійснення лініяBrassica junceaмістить гениFAD2іFAD3як описано в міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 (зміст якої включене в справжній документ як посилання), які проілюстровані на фіг. 1 і 3 уSEQ ID NO:1-4. Одержаний мутантний алель кодує білки дельта-12-десатураз жирних кислот, які проілюстровані на фіг. 2 і уSEQ ID NO:5-7. В інших варіантах здійснення лініяBrassica junceaможе містити мутації в генних локусахfad2-aіfad3-aі отримані мутантні алелі можуть кодувати одну або декілька мутацій в послідовності прогнозованих білків BjFAD2-A і BjFAD3-A. Характерні приклади мутантних генівfad2-aіfad3-aі рімерів білки і гени, описані в: міжнародної публікації № WO 2006/079567 A2 (наприклад, фіг. 1 і 2), такі якSEQ ID NO:8 і 9; міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2, такі якSEQ ID NO:10-21; патент США № 6967243 B2 (наприклад, фіг. 2 і 3), такі якSEQ ID NO:22-27; і європейська публікація No. 1862551 A1 (наприклад, фіг. 1-10), такі якSEQ ID NO:28-39. Зміст кожної із зазначених вище патентних публікацій включено в справжній документ в якості посилання. В альтернативних варіантах здійснення перетворені лінії BNfad2-aі Bnfad23-aможна використовувати для пошуку природних варіацій в BJFAD2B і BJFAD3B в рослинахBrassica, так як в рослинахBrassica juncea, містять BnFad2A, BnFad3A, можна виявити значні варіації профілів жирних кислот.

В одному з аспектів винаходу несподівано виявили, що заміна, делеція або сайленсинг ферментативної активності FAD2 та/або FAD3 в рослиніBrassicaпризводить до рослинам, здатним до продукції масла з вмістом олеїнової кислоти більш ніж приблизно 70% по масі і з вмістом ліноленової кислоти менш ніж приблизно 5% по масі. В іншому варіанті здійснення несподівано виявили, що видалення або перенесення генів, модифікуючих ферментативну активність FAD2 та/або FAD3 в рослиніBrassica, пр�про масу і з вмістом ліноленової кислоти менш ніж приблизно 5% по масі. Такі рослини, наприклад, можуть представляти собою тетраплоїдні рослини або амфидиплоидние рослини, такі якBrassica junceaабоBrassica napus. Таким чином, в одному з аспектів винахід відноситься до делеції або сайленсингу в рослині, такому як в лініяхBrassica juncea, обраних кодують послідовностейFAD2іFAD3. Харчове масло, що отримується з рослин щодо винаходу, можна охарактеризувати однією або декількома з наступних характеристик: вміст олеїнової кислоти щонайменше 70% по масі вміст ліноленової кислоти менш ніж приблизно 5% по масі, і загальний вміст насичених жирних кислот менш ніж приблизно 7% за масою.

Альтернативні аспекти винаходу включають рослини і частини рослин. Як застосовують в цьому документі, "частини рослин" включають рослинні клітини, насіння, пилок, містять нуклеїнові кислоти по винаходу, або містять кодують послідовностіfad2/fad3щодо винаходу, або містять регуляторні послідовності, такі як послідовності, розташовані вище кодують послідовностейFAD2/FAD3, які експресують ферменти FAD2 та/або FAD3Brassica napus. Надано способи иучением рослинних продуктів. Як застосовують в цьому документі, "рослинні продукти" включають все, що одержують з рослини по винаходу, включаючи частини рослин, такі як насіння, борошно, жири або олії, включаючи рослинні продукти із змінними концентраціями олеїнової кислоти і ліноленової кислоти. Надано способи модифікації рослин так, щоб вони містили перенесені кодують послідовностіfad2/fad3зBrassica napusздатні до експресії активного ферменту FAD2 та/або ферменту FAD3. Наприклад, такі способи можуть включати перенесення однієї або декількох кодують послідовностейfad2-aта/абоfad3-aзBrassica napusв рослину за допомогою міжвидової гібридизації так, щоб рослина містило заміщені кодують послідовностіfad2та/абоfad3a. Такі способи забезпечують ідентифікацію і точне введення проводяться мутаційBrassica juncea.

Надані праймери для ампліфікації для ідентифікації частин кодують послідовностейfad2/fad3щодо винаходу, які можна використовувати, наприклад, для визначення різних алелей вибраних локусів FAD2 та/або FAD3. Надано способи отримання рослин з використанням кодують послідовностейfad2/fad3�черв. Наприклад, послідовності щодо винаходу можна використовувати для проведення або напряму сайт-специфічних мутацій, які можуть пригнічувати або змінювати експресію вибраних кодують послідовностейFAD2та/абоFAD3, так як за допомогою придушення або зміни експресії генаFAD2та/абоFAD3з обраного локусуFAD2абоFAD3або за допомогою укорочення білка FAD2 та/або FAD3, кодованого геномFAD2та/абоFAD3. Для введення кодують послідовностейfad2та/абоfad3a по винаходу в потомство рослин по винаходу можна використовувати загальноприйняті способи селекції рослин, такі як схрещування і зворотне схрещування та інші способи селекції.

Альтернативний варіант здійснення включає олія в насінні сортуBrassica junceaз вмістом жирних кислот, що включає, щонайменше, 68,0% олеїнової кислоти за масою і менше ніж 4,0% ліноленової кислоти за масою.

Крім того, даний винахід включає борошно, що отримується з насіння рослинB. Junceaзазначено в цьому документі, де така мука може перебувати у формі мелених насіння, макухи, білих пластівців або борошна після застосування загальноприйнятих способів помелу і екстракції розчиннику�кти і варіанти здійснення стануть очевидні на основі малюнків і при вивченні наступного опису.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

На фіг. 1 проілюстровані часткові геномні нуклеотидні послідовності генуfad2, клоновані з DMS100 і Quantum. Вгорі представлена послідовність DMS100 (SEQ ID NO:1), а внизу представлена послідовність Quantum (SEQ ID NO:2). Стрілкою вказано однонуклеотидная мутація C T, що приводить до утворення стоп-кодона (TAG) (заштриховане). Прямий та зворотній праймери для заснованого на ПЛР аллелеспецифического маркера мутантного алелю наведено напівжирним шрифтом та підкреслені.

На фіг. 2 надані амінокислотні послідовності генаfad2, вироджені з геномної нуклеотидної послідовністю, клоновані з DMS100 (SEQ ID NO:5), Quantum (SEQ ID NO:6) і з опублікованого генаFAD2Brassica napus(BNFAD2) (SEQ ID NO:7). Стрілкою вказано положення стоп-кодона, який є результатом однонуклеотидной мутації (C T) в DMS100.

На фіг. 3 представлені геномні нуклеотидні послідовності генуfad3c, клоновані з DMS100 і Quantum. Вгорі представлена послідовність DMS100 (SEQ ID NO:3), а внизу представлена послідовність Quantum (SEQ ID NO:4). Экзони укладені в рамки, интрони не укладені в рамки, що відповідає экзонам 4, 5, 6 і 7 і интратний праймери для заснованого на ПЛР аллелеспецифического маркера мутантного алелю наведено напівжирним шрифтом та підкреслені.

На фіг. 4 проілюстровані одне або кілька зворотних схрещувань (BC3 і BC4) між батьками варіантів відбору з високим вмістом олеїнової кислоти - низьким вмістом ліноленової кислоти іB. juncea(Zem1, Zem2 і ZE Skorospelka) у відповідності з основними положеннями цього винаходу.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

Послідовності нуклеїнових кислот, перелічені у доданому списку послідовностей, наведені з використанням стандартних буквених скорочень для нуклеїнових підстав, як визначено в 37 C. F. R. § 1.822. Наведена тільки одна ланцюг кожної послідовності нуклеїнової кислоти, але зрозуміло, що комплементарна ланцюг включена в якості посилання на наведену ланцюг. У доданому списку послідовностей:

SEQ ID NO: 1 демонструє генFAD2, клонований з сортуBrassica napus, DMSI00, що позначається в міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 2 демонструє генFAD2, клонований з сортуB. napusQuantum, що позначається в міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 3 демонструє генFAD3, клонований з сортуB. napusDMS100, що позначається в міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 4 демонстрируе�Q ID NO: 13.

SEQ ID NO: 5 демонструє аминокислотную послідовність білка дельта-12-десатурази жирних кислот, кодовану геномFAD2, клонованим з сортуB. napusDMS100, обозначаемую у міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 6 демонструє аминокислотную послідовність білка дельта-12-десатурази жирних кислот, кодовану геномFAD2, клонованим з сортуB. napusQuantum, обозначаемую у міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 7 демонструє аминокислотную послідовність білка дельта-12-десатурази жирних кислот, кодовану опублікованими геномFAD2(Bnfad2), клонованимB. napus, обозначаемую у міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 8 демонструє мутантний генfad2-aяк описано в міжнародній публікації № WO 2006/079567 A2.

SEQ ID NO: 9 демонструє мутантний білок fad2-a, який кодується SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 10 демонструє генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 11 демонструє аминокислотную послідовність білка fad2-a, кодовану SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 12 демонструє генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 3.

S�рілої генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 15 демонструє аминокислотную послідовність білка fad2-a, кодовану SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO: 16 демонструє генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 17 демонструє аминокислотную послідовність білка fad2-a, кодовану SEQ ID NO: 16.

SEQ ID NO: 18 демонструє генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 10 демонструє генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 20 демонструє генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 21 демонструє генfad2-aB. napus, позначуваний у міжнародній публікації № WO 2007/107590 A2 як SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 22 демонструє мутантний ген "Fad2-D"B. napus, позначуваний в патенті США 6967243 як SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 23 демонструє аминокислотную послідовність, кодовану SEQ ID NO: 22, обозначаемую в патенті США 6067243 як SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 24 демонструє мутантний ген "Fad2-F"B. napus, позначуваний в патенті США 6067243 як SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 25 демонструє ам�демонструє мутантний ген "Fad2-F"B. napus, позначуваний в патенті США 6067243 як SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 27 демонструє аминокислотную послідовність, кодовану SEQ ID NO: 26, обозначаемую в патенті США 6067243 як SEQ ID NO: 18.

SEQ ID NO: 28 демонструє мутантний генFAD2B. napus, позначуваний в публікації європейського патенту № 1862551 A1 SEQ ID NO: 22.

SEQ ID NO: 29 демонструє продукт мутантного генаFAD2B. napus, позначуваний в публікації європейського патенту № 1862551 A1 SEQ ID NO: 23.

SEQ ID NO: 30 демонструє мутантний генfad2-aB. napus, позначуваний в публікації європейського патенту № 1862551 A1 SEQ ID NO: 24.

SEQ ID NO: 31 демонструє аминокислотную послідовність, кодовану мутантним геномfad2-aB. napusз SEQ ID NO: 30, яка в публікації європейського патенту № 1862551 A1 позначена як SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 32 демонструє мутантний генfad2-aB. napus, позначуваний в публікації європейського патенту № 1862551 A1 SEQ ID NO: 26.

SEQ ID NO: 33 демонструє аминокислотную послідовність, кодовану мутантним геномfad2-aB. napusз SEQ ID NO: 32, яка в публікації європейського патенту № 1862551 A1 позначена як SEQ ID NO: 27.

SEQ ID NO: 34 демонструє мутантний генfad2-aB. napus, позначуваний в публікації європейського патенту �мfad2-aB. napusз SEQ ID NO: 34, яка в публікації європейського патенту № 1862551 A1 позначена як SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 36 демонструє мутантний генfad2-aB. napus, позначуваний в публікації європейського патенту № 1862551 A1 SEQ ID NO: 30.

SEQ ID NO: 37 демонструє аминокислотную послідовність, кодовану мутантним геномfad2-aB. napusз SBQ ID NO: 36, яка в публікації європейського патенту № 1862551 A1 позначена як SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 38 демонструє мутантний генfad2-aB. napus, позначуваний в публікації європейського патенту № 1862551 A1 SEQ ID NO: 32.

SEQ ID NO: 39 демонструє аминокислотную послідовність, кодовану мутантним геномfad2-aB. napusз SEQ ID NO: 38, яка в публікації європейського патенту № 1862551 A1 позначена як SEQ ID NO: 33.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Для ясності опису нижче визначені деякі терміни, еприменяемие в цьому документі.

Термін "лінія" відноситься до групи рослин, що демонструє дуже невелику загальну варіативність між індивідуальними рослинами, до яких належить це позначення. Як правило, "лінія" відноситься до групи рослин, що демонструє невелику генетичну варіативність або її відсутність між індивідуальними я" відноситься до групи рослин, одержуваної за допомогою культивування гаплоїдною тканини, а потім подвоєння вмісту хромосом без супроводжуючого клітинного ділення з отриманням рослини з диплоидном кількістю хромосом, де кожна пара хромосом складається з двох дуплицированних хромосом. Таким чином, DH лінія в нормі демонструє невелику генетичну мінливість ознак або її відсутність між індивідуальними рослинами.

"Сорт" або "культивар" являє собою лінію рослин, які використовують для комерційного отримання, яка чітко можна відрізнити, стійка і однорідна за своїми ознаками при вирощуванні.

"Подвійна гаплоїдна" (DH) лінія відноситься до лінії, одержуваної способом микроспорического ембріогенезу, при якому рослина отримують з окремою мікроспори. Цим способом одержують лінії, які гомогенни, тобто всі рослини в лінії мають однакову генетичну структуру. Початкове DH рослина позначають як DH1, тоді як наступні покоління позначають як DH2, DH3 і т. д. Способи подвійних гаплоидов добре відомі і розроблені для декількох культур. Спосіб дляBrassica junceaописаний Thiagrarajah and Stringham (1993) (A comparison of genetic segregation in traditional and microspore-derived populations ofBrassica junceaу L. Czern and Coss. Plant Breeding 111:330-334).

<рбить продиктовано контекстом, з вмістом олеїнової кислоти більшим, ніж вміст олеїнової кислоти в дикому типі або в інших еталонних сорт або лінії, більш широко, це вказує на склад жирних кислот, що містить щонайменше 70,0% по масі олеїнової кислоти.

"Всі насичені вуглеводні сполуки" відноситься до об'єднаної частці пальмітинової (C16:0), стеаринової (C18:0), арахидиновой (C20:0), бегенової (C22:0) і тетракозановой (C24:0) жирних кислот. Концентрації жирних кислот, описані в цьому документі, визначають стандартними способами, добре відомими фахівцям в даній області. Конкретні способи описані в прикладах. Концентрації жирних кислот виражають у вигляді відсотка по масі від змісту всіх жирних кислот.

Аналіз "полусемени" відноситься до способу, в якому аналіз жирних кислот проводять на одній семядоле (полусемени), а решту полусемя використовують для одержання рослини, якщо результат аналізу є позитивним.

"Мутагенез" являє собою спосіб, в якому до рослинного матеріалу застосовують засіб, про якого відомо, що воно викликає мутації в генетичному матеріалі. Використовується в експериментальній роботі мутагенна засіб являло собою этилметилсульфон� на увазі конкретний ознака. Приклад мутагенезу, використовуваного для гаплоидов з індукцією нової мінливості, описаний в Swanson et al. (Plant cell Rep. 7:83-87, 1988). Слід розуміти, що для отримання мутантів може підходити ряд інших методів, таких як рекомбінація з фрагментами чужорідної нуклеїнової кислоти, і що, використовуючи різні способи, одержання мутантів можна проводити в напрямку заміни конкретних нуклеотидів або амінокислот, а не залишати його повністю випадковим. Слід розуміти, що всі такі способи проведення замін послідовності нуклеїнової кислоти включені в термін "мутагенез", як застосовують у цьому документі.

"Регенерація" включає відбір з селекціонованої рослини або сорту клітин, здатних до регенерації (наприклад, насіння, мікроспор, яйцеклітин, пилку, вегетативних частин). Ці клітини необов'язково можна піддавати мутагенезу, після чого з клітин вирощують рослину з використанням регенерації, запилення та/або способів вирощування на основі видів клітин, що піддаються мутагенезу. Застосовні способи регенерації відомі фахівцям в даній області; див., наприклад, Pua et al., Bio/Technology 5:815-817 (1987); Jain et al., Euphytica 40:75-81 (1989); Szarejko et al., Proceedings of an International Symposium on the Contribution of Plant Mutation Breeding Improvement to Crop, 2:355-rtr. Pfl anzenzüchtg. 45:133-154 (1999); Swanson et al., Theoretical and Applied Genetics. 78:525-530 (1989); і Kirti and Chopra, Plant Breeding 102:1, 73-78 (1988). У цьому контексті "M0" відноситься до необробленим насінням; "M1" відноситься до насіння, подвергаемим дії мутагенів, і отриманим рослинам; "M2" являє собою потомство (насіння і рослини) самоопиляемих рослин M1; "M3" являє собою потомство (насіння і рослини) самоопиляемих рослин M2; "M4" являє собою потомство (насіння і рослини) самоопиляемих рослин M3; "M5" являє собою потомство (насіння і рослини) самоопиляемих рослин M4 і т. д.

Як застосовують у цьому документі, термін "стійкість" або "стійкий" відносно даного генетично контрольованого компонента жирних кислот означає, що компонент жирних кислот зберігається від покоління до покоління протягом щонайменше двох поколінь, а переважно - щонайменше три покоління по суті на однаковому рівні, наприклад, переважно ±5%. Способи винаходу можуть приводити до отримання лініїBrassica junceaз поліпшеним складом жирних кислот, стійким в межах ±5% від покоління до покоління. Фахівцям у даній галузі слід розуміти, що на зазначену вище стійкість може впливати температура, меноли слід проводити з використанням насіння, отриманих в подібних умовах вирощування.

Коли в контексті цього винаходу використовують термін "рослинаBrassica"він також включає будь-які конверсії одного гена в цій групі. Як застосовують у цьому документі, термін "рослина з конверсією одного гена" відноситься до рослинBrassica, які отримують способом селекції рослин, званим зворотним схрещуванням, де на додаток до одного гену, переносимого в сорт способом зворотного схрещування, відновлюють по суті всі бажаних морфологічних і фізіологічних ознак сорту. Способи зворотного схрещування можна використовувати по справжньому винаходу для поліпшення ознаки в сорті або введення ознаки в сорт. Як застосовують у цьому документі, термін "зворотне схрещування" відноситься до повторного схрещування гібридного потомства знову з рекуррентним батьком, тобто до зворотного схрещування один або кілька разів з рекуррентним батьком (визначаються як "BC1", "BC2" тощо). Батьківська рослинаBrassica, яке надає ген для отримання бажаної ознаки, називають "нерекуррентним" або "донорським батьком". Ця термінологія належить до тій обставині, що нерекуррентного батьків викорис�дещо рослинаBrassica, якому переносять ген або гени від нерекуррентного батьків, відомо як рекурентний батько, так як в протоколі зворотного схрещування його використовують у кількох циклах (Poehiman & Sleper, 1994; Fehr, 1987). У типовому протоколі зворотного схрещування вихідний сорт, що представляє інтерес (рекурентний батько), схрещують з другим сортом (нерекуррентний батько), який несе один представляє інтерес ген для перенесення. Потім отримане потомство цього схрещування знову схрещують з рекуррентним батьком і процес повторюють до одержання рослиниBrassica, де в змінюваному рослині відновлені по суті всі бажаних морфологічних і фізіологічних ознак рекурентного батька, крім одного стерпного гена від нерекуррентного батьків, як визначають на рівні значущості 5% при вирощуванні в однакових умовах навколишнього середовища.

Вибір відповідного рекурентного батька є важливим етапом для успішної процедури зворотного схрещування. Метою протоколу зворотного схрещування є зміна або заміна конкретного властивості або ознаки у вихідному сорті. Для здійснення цього один ген рекурентного сорти модифікують або замінюють бажаним ге�аким чином, бажане фізіологічне та морфологічна будова вихідного сорту. Вибір конкретного нерекуррентного батьків залежить від мети зворотного схрещування. Однією з основних цілей є додавання рослині комерційно бажаного, агрономічно важливого властивості. Точний протокол зворотного схрещування залежить від змінюваного ознаки або властивості для визначення відповідного протоколу тестування. Хоча способи зворотного схрещування, коли ознака для перенесення являє собою домінантний алель, спрощуються, рецесивний алель також можна переносити. У цьому випадку для визначення того, що бажаний ознака успішно перенесений, може бути необхідним застосовувати тестування потомства.

Визначено безліч контрольованих одним геном властивостей, які регулярно не відбирають при отриманні нового сорту, але які можна покращувати способами зворотного схрещування. Контрольовані одним геном властивості можуть бути трансгенними чи ні, приклади цих властивостей включають в якості неограничивающих прикладів мужскуую стерильність, воскової крохмаль, стійкість до гербіцидів, стійкість до бактеріальних, грибкових або вірусних захворювань, стійкість до комах,Ці гени, як правило, успадковуються за допомогою ядра. Деякі з цих контрольованих одним геном властивостей описані в патентах США №№ 5959185, 5973234 і 5977445.

В деяких варіантах здійснення для визначення присутності або експресії одного з описуваних алелів і для розрізнення мутантних білків і білків дикого типу або інших мутантів можна отримувати антитіла до будь-якого з поліпептидів, описаних у цьому документі або одержуваних з них.

В даній заявці "покращені ознаки" означає, що розглянуті ознаки змінюють таким способом, який бажаний або вигідним, або і те, і інше, в порівнянні з еталонним значенням або ознакою, які можуть ставитися до еквівалентного ознакою лінії дикого типуBrassica junceaабо який-небудь інший розглянутої лініїBrassica. Однією з можливих ліній дикого типуBrassica juncea, ознаки якої можна взяти за еталон (або в якості контролю), є J96D-4830, але можливі й багато інших лінії і їх легко визначать фахівці в даній області.

В даній заявці "потомство" означає всіх нащадків, включаючи нащадків і похідні рослини або рослин, і включає перше, друге, третє і наступні покоління і може утворюватися посередництвом�м підходящих способів генетичної інженерії.

В даній заявці "селекція" включає всі способи розвитку або розмноження рослин і включає внутрішньо - та міжвидові і всередині - і межлинейние схрещування, а також всі відповідні загальноприйняті способи селекції і штучної селекції. Бажані властивості можна переносити в інші лініїBrassica junceaзагальноприйнятими способами селекції, а також можна переносити в інші видиBrassica, такі якBrassica napusіBrassica rapaшляхом міжвидового схрещування. Загальноприйняті способи селекції і способи міжвидового схрещування, а також інші способи перенесення генетичного матеріалу між рослинами добре документовані в літературі.

В даній заявці "молекулярно-біологічні способи" означають всі форми маніпуляції з послідовністю нуклеїнової кислоти зі зміною послідовності та її експресією, і включають вставку, видалення або модифікацію послідовностей і послідовностей фрагментів і пряме введення нових послідовностей в геном організму за допомогою спрямованої або випадкової рекомбінації з використанням будь-яких відповідних векторів та/або способів.

В даній заявці "генетично успадкована", як використовують, наприклад, у фразі "генетично спадщину незалежно в�твами генетичного складу розглянутого рослини.

В даній заявці термін "Brassica" може включати будь-яку або всі з видів, що належать до родуBrassica, включаючиBrassica napus, Brassica juncea, Brassica nigra, Brassica carinata, Brassica oleraceaіBrassica rapa.

Як застосовують у цій заявці, канолаBrassica junceaвідноситься доBrassica juncea, яка дає насіння з якістю масла і борошна, що задовольняє вимогам для комерційного позначення як масло або борошно "каноли", відповідно, (тобто рослин видуBrassica juncea, містять менше 2% ерукової кислоти (Δ13-22:1) по масі в олії насіння і менш 30 мікромоль глюкозинолатів на грам не містить масла борошна).

Різні гени і послідовності нуклеїнової кислоти по винаходу можуть бути рекомбінантними послідовностями. Термін "рекомбінантний" означає, що що-небудь рекомбинировано, так що, коли його застосовують у відношенні конструкції нуклеїнової кислоти, термін відноситься до молекули, що містить послідовності нуклеїнової кислоти, які пов'язані разом і отримані молекулярно-біологічними способами. Коли термін "рекомбінантний" застосовують щодо білка або поліпептидів, він відноситься до білкової або молекулі поліпептидного, экспрессируемой з використанням рекомбінантної конструкції нуклеін�стосовно генетичної структури, він відноситься до гаметі або потомству з новими комбінаціями алелей, яких немає в батьківських геномах. Конструкції рекомбінантних нуклеїнових кислот можуть містити нуклеотидну послідовність, яка може бути пов'язана, або з якої провели маніпуляцію, так, щоб вона зв'язалася з послідовністю нуклеїнової кислоти, з якої вона не пов'язана в природі, або з якої в природі вона пов'язана в іншому положенні. Таким чином, вказівка конструкції нуклеїнової кислоти як "рекомбінантної" означає, що молекулу нуклеїнової кислоти піддавали маніпуляціям із застосуванням генетичної інженерії, тобто за допомогою втручання людини. Конструкції рекомбінантних нуклеїнових кислот можна, наприклад, вводити в клітину-хазяїна за допомогою трансформації. Такі конструкції рекомбінантних нуклеїнових кислот можуть містити послідовності, одержувані з клітини-господаря того ж виду або з клітини-господаря іншого виду, які виділили і знову внесли в клітини виду-господаря. Послідовності рекомбінантних конструкцій нуклеїнових кислот можуть інтегруватися в геном клітини-господаря, або в результаті вихідної трансформації клітин-господарів, або в результаті наступних подій рЕсе від всіх жирних кислот олії, в якому жирна кислота є компонентом. Наприклад, вказівка рослини, як має 70%-вміст олеїнової кислоти означає, що компонент жирної кислоти олії містить 70% олеїнової кислоти.

"Поліморфізм" в популяції відноситься до стану, при якому найбільш частий варіант (або алель) конкретного локусу має популяційну частоту, що не перевищує 99%.

Термін "гетерозиготність" (H) використовують, коли частина індивідуумів в популяції несе різні алелі певного локусу (в протилежність двох копій одного і того ж алелі). Гетерозиготність являє собою ймовірність того, що індивідуум в популяції гетерозиготен по локусу. Як правило, гетерозиготність виражають у вигляді процента (%) в діапазоні від 0 до 100% або за шкалою від 0 до 1.

"Гомозиготність" або "гомозиготний" означає, що частина індивідуумів в популяції несе дві копії одного і того ж алелі певного локусу. Коли рослини є подвійними гаплоидами, припускають, що, допускаючи будь-які спонтанні мутації, що відбуваються при дуплікація гаплотипу, всі локуси є гомозиготними. Рослини можуть бути гомозиготними по одному, кільком або всім локусами в залежності від контексту.

"Праймери" �і, які комплементарни частини ампліфікованого полинуклеотида. Наприклад, довжина праймера може складати не більше 50 нуклеотидів, переважно - менш ніж приблизно 30 нуклеотидів, а найбільш переважно - менш ніж приблизно 24 нуклеотиду.

Як застосовують в цьому документі, "виділені" нуклеїнова кислота або полинуклеотид відносяться до компоненту, який виділений з його вихідного оточення (наприклад, його природного оточення, якщо він є природним). Виділені нуклеїнова кислота або поліпептид можуть містити менше 50%, менше 75%, менше 90% і менше 99,9% або менше ніж будь-яке ціле значення між 50 і 99,9% клітинних компонентів, з якими вони початково асоційовані. Наприклад, полинуклеотид, амплифицированний із застосуванням ПЛР так, що він в достатній мірі відрізнити (наприклад, на гелі) від інших клітинних компонентів, можна розглядати як "виділений". Полінуклеотиди щодо винаходу можуть бути "по суті чистими", тобто володіють найвищим ступенем чистоти, якої можна досягти із застосуванням конкретного способу очищення, відомого в даній області.

"Гібридизація" відноситься до способу, в якому ланцюг нуклеїнової кислоти зв'язується з комплементарн�еньшей принаймні одна ланцюг одного полинуклеотида може гибридизоваться з ланцюгом іншого полинуклеотида в умовах з певною суворістю. Для гібридизації необхідно, щоб два полинуклеотида містили по суті комплементарні послідовності; проте в залежності від строгості гібридизації можуть бути допустимі невідповідності. Як правило, для гібридизації двох послідовностей з високою твердістю (наприклад, такий, як у водному розчині 0,5×SSC при 65°C) необхідно, щоб послідовності демонстрували певну високу ступінь комплементарності по всій їх послідовності. Умови з проміжною строгістю (наприклад, такі як водний розчин 2×SSC при 65°C) і з низькою строгістю (наприклад, такі як водний розчин 2×SSC при 55°C) вимагають відповідно меншій загальній комплементарності між гибридизующимися послідовностями (1×SSC являє собою 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат Na). Як застосовують у цьому документі, наведені вище розчини і температури відносяться до стадії відмивання зонда способу гібридизації. Термін "полинуклеотид, гибридизующийся в строгих (несуворих, проміжних) умовах" призначений для включення і одно - та дволанцюгових полінуклеотидів, хоча з комплементарної ланцюгом іншого полинуклеотида буде гибридизоваться тільки один ланцюг. Відмивання в зазначених розчинах можна проводити в теия різних рівнів гомології пов'язаних послідовностей легко оберуть відповідні часи відмивки.

В одному з аспектів винахід відноситься до рослинBrassica, таким як рослиниBrassica juncea, здатним давати насіння з ендогенним вмістом жирних кислот, що містять високий відсоток олеїнової кислоти і низький відсоток ліноленової кислоти за масою. У конкретних варіантах здійснення вміст олеїнової кислоти може становити більш ніж приблизно 70,0%, 71,0%, 72,0%, 73,0%, 74,0%, 75,0%, 76,0%, 77,0%, 78,0%, 79,0%, 80,0%, 81,0%, 82,0%, 83,0%, 84,0% або 85,0%, включаючи всі цілі числа і їх частки або будь-яке ціле число із значенням, більшим 85%, олеїнової кислоти. У конкретних варіантах здійснення вміст ліноленової кислоти жирних кислот може становити менше ніж приблизно 5%, 4%, 3%, 2,5%, 2,0%, 1,5%, 1,0%, 0,5% чи 0%, включаючи всі цілі числа і їх частки. В одному ілюстративному варіанті здійснення рослина являє собою Brassica juncea, ендогенне вміст жирних кислот насіння якого включає, щонайменше, 70% олеїнової кислоти за масою і менш ніж 3% ліноленової кислоти за масою. У додатковому варіанті здійснення рослина являє собою рослина Brassica juncea, ендогенне вміст жирних кислот насіння якого включає, щонайменше, 70,0% олеїнової кислоти за масою і не більше ніж приблизно 5% линоленово�ea, здатним давати насіння з ендогенним вмістом жирних кислот, що включає високий відсоток олеїнової кислоти і низький відсоток ліноленової кислоти за масою і низька кількість всіх насичених жирних кислот або висока кількість всіх насичених жирних кислот, яке може становити менше ніж приблизно 5,5% всіх насичених жирних кислот або >10% всіх насичених жирні кислоти

Відомо, що склад олії з насіння Brassica juncea відрізняється від складу олії з насіння Brassica napus по обох компонентів жирних кислот (наприклад, більш високий вміст ерукової кислоти), ефірних масел (наприклад, аллилизотиоцианату) і минорним складових (наприклад, токоферолам, металів, танінами, фенольним складовим, фосфоліпідів, що обумовлює колір речовин тощо). Виявлено, що олії з насіння (включаючи виділені масла)Brassica junceaє більш стійкими до окислення в порівнянні з масламиBrassica napusнезважаючи на те, що масла зBrassica juncea, як правило, містять більш високі рівні C18:3. (C. Wijesundera et al., "Canola Quality Indian Mustard oil (Brassica juncea) is More Stable to Oxidation than Conventional Canola oil (Brassica napus)", J. Am. Oil Chem. Soc. (2008) 85:693-699).

В альтернативному аспекті винахід відноситься до способів збільшення вмісту ать: (a) індукцію мутагенезу щонайменше в деяких клітинах лініїBrassicaз вмістом олеїнової кислоти більше 55% і вмістом ліноленової кислоти менше 14%; (b) регенерацію рослин щонайменше з однієї з зазначених мутованих клітин і відбір регенерованих рослин з вмістом жирних кислот, що включає щонайменше 70% олеїнової кислоти (або альтернативну граничну концентрацію олеїнової кислоти, як зазначено вище) і менше 3% ліноленової кислоти (або альтернативну граничну концентрацію ліноленової кислоти, як зазначено вище); і (c) виведення подальших поколінь рослин із зазначених регенерованих рослин, де вміст жирних кислот індивідуальних рослин зазначених подальших поколінь рослин включає, щонайменше, 70% олеїнової кислоти (або альтернативну граничну концентрацію) і менше 3% ліноленової кислоти (або альтернативну граничну концентрацію). В деяких варіантах здійсненняBrassicaможе являти собоюBrassica juncea. Термін "високий вміст олеїнової кислоти" і "низький вміст ліноленової кислоти" включає повний діапазон можливих значень, описаних вище. В альтернативних варіантах здійснення способи винаходу можуть додатково включати відбір одного або декількох з лін�лоти, такого як діапазон можливих значень, описаних вище. У додаткових варіантах здійснення стадія (c) може включати відбір і вирощування насіння регенерованих рослин зі стадії (b). У додаткових варіантах здійснення способи винаходу можуть включати повторення зазначених стадій до того, поки не буде досягнуто бажані вміст олеїнової кислоти, вміст лінолевої кислоти або обидва.

В альтернативних варіантах здійснення надані способи скринінгу окремих насінин на збільшений вміст олеїнової кислоти і знижений вміст лінолевої кислоти, включають: визначення одного або декількох з вмісту олеїнової кислоти; або вмісту лінолевої кислоти; або вмісту олеїнової кислоти і вмісту лінолевої кислоти в жирних кислотах частини проростків насіння; порівняння одного або декількох з змістів з еталонним значенням; та отримання висновку про ймовірне відносному вмісті олеїнової кислоти, лінолевої кислоти або олеїнової кислоти і лінолевої кислоти в насінні. У конкретних варіантах здійснення частина рослини, що використовується для аналізу, може являти собою частину листа або весь аркуш, сім'ядолю, стебло, стовбур, �вірну кореляцію зі складом насіння. В одній групі варіантів здійснення частина проростків може являти собою частину листа. У певних варіантах здійснення етап отримання висновку про склад жирних кислот в насінні може включати допущення, що значимо змінений рівень даної кислоти в зазначеному листі відображає подібне відносна зміна в рівні цієї кислоти в насінні. У конкретному варіанті здійснення цього винаходу надано спосіб скринінгу рослинBrassicaна конкретні лінії рослин, насіння яких мають ендогенне вміст жирних кислот, що включає щонайменше 70% олеїнової кислоти і менше 3% ліноленової кислоти за масою, за допомогою аналізу тканини листка. Крім того, тканина листа можна аналізувати на склад жирних кислот за допомогою газорідинної хроматографії, де виділення жирних кислот можна проводити такими способами, як аналіз партії насіння або аналіз полусемени.

В альтернативних варіантах здійснення винахід відноситься до рослинBrassica, які можуть представляти собою рослиниBrassica junceaмістить раніше описані алелі генів з лінійBrassica juncea. У певних варіантах здійснення рослина може бути гомозиготних за локусами його рослинна клітина або частина несе алелі генів з послідовностями нуклеїнової кислоти з раніше описаних послідовностей, представлених в цьому документі.

В деяких варіантах здійснення винахід може включати розрізнення HOLL,Brassica junceaякості каноли по справжньому винаходу (≥70% олеїнової кислоти і ≤5% ліноленової кислоти) відBrassica junceaз низьким вмістом олеїнової кислоти/високим вмістом ліноленової кислоти (≈45% олеїнової кислоти і ≈14% ліноленової кислоти) за допомогою перевірки присутності або відсутності гена BJfad2b(посилання див. патентну публікацію США № 20030221217, Yao et al.). Це розрізнення може включати підтвердження того, що ген BJfad2aє функціональним геном олеатдесатурази жирних кислот тільки в лініїBrassica junceaякості каноли, як відомо в даній області.

В одному з варіантів здійснення лініяBrassica junceaнесе гениfad2іfad3як описано в міжнародній публікації № US 2006/0248611 A1 (зміст якої включене в справжній документ як посилання), які проілюстровані на фіг. 1 і 3 в ній. Гениfad2іfad3проілюстровані у цьому документі за допомогоюSEQ ID NO:1-4. Отримані мутантнѿубликации № US 2006/0248611 A1 і додатково проілюстровані за допомогоюSEQ ID NO:5-7 цього документа. В інших варіантах здійснення лініяBrassica junceaможе містити мутації в генних локусахfad2-aіfad3-aі отримані мутантні алелі можуть кодувати одну або декілька мутацій в послідовності прогнозованих білків BjFAD2-a і BjFAD3-a. Характерні приклади мутантних генівfad2-aіfad3-aі білків, придатних для використання по справжньому винаходу, також включають в якості неограничивающих прикладів білки і гени, описані в: міжнародної публікації № WO 2006/079567 A3 (наприклад, фіг. 1 і 2), такі якSEQ ID NO:8 і 9; міжнародній публікації № WO 2005/107590 A2, такі якSEQ ID NO:10-21; патенті США № 6967243 B2 (наприклад, фіг. 2 і 3), такі якSEQ ID NO:22-27; та європейської публікації № 1862551 A1 (наприклад, фіг. 1-10), такі якSEQ ID NO:28-39). Зміст кожної з наведених вище патентних публікацій включено в справжній документ в якості посилання.

Гомологію з послідовностями щодо винаходу можна детектувати допомогою гібридизації з відповідними зондами нуклеїнової кислоти, способами ПЛР з відповідними праймерами або будь-якими іншими широко використовуваними способами. У конкретних варіантах здійснення надані зонди нуклеїнової кислоти, які провадження можуть включати використання відповідних пар праймерів для ампліфікації або детекції присутності послідовності щодо винаходу, наприклад, послідовності, яка асоційована з підвищеним вмістом олеїнової кислоти.

Для опису споріднення послідовностей двох або більше нуклеїнових кислот або полінуклеотидів використовують наступні терміни: (a) "еталонну послідовність", (b) "вікно порівняння", (c) "ідентичність послідовностей", (d) "відсоток ідентичності послідовностей" і (e) "істотна ідентичність".

Як застосовують в цьому документі, "еталонна послідовність" являє собою певну послідовність, яка використовується в якості основи для порівняння послідовностей. Еталонна послідовність може являти собою частину вказаної послідовності або цілу зазначену послідовність; наприклад, у вигляді ділянки повнорозмірною послідовності кДНК або гена або повної послідовності кДНК або гена.

Як застосовують в цьому документі, "вікно порівняння" вказує на безперервний і точно певний сегмент полінуклеотидного послідовності, де полинуклеотидная послідовність у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто пропуски) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить додавань або де щонайменше 20 суміжних нуклеотидів, і необов'язково може бути 30, 40, 50, 100 або довше. Фахівці в цій галузі розуміють, що для уникнення високого подібності з еталонною послідовністю внаслідок додавання пропусків у полинуклеотидную послідовність, як правило, вводять штраф за пропуск і віднімають від кількості збігів.

Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в цій галузі. Таким чином, визначення відсотка ідентичності будь-яких двох послідовностей можна проводити з використанням математичного алгоритму. Неограничивающие приклади таких математичних алгоритмів являють собою Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17; алгоритм локальної гомології Smith et al. (1981) Adv. Appl Math. 2:482; алгоритм вирівнювання по гомології Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Товарbiol. 48:443-453; спосіб пошуку за подібністю Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, модифікований Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Для порівняння послідовностей з визначенням ідентичності послідовностей можна використовувати комп'ютерні реалізації цих математичних алгоритмів. Такі реалізації включають в якості неограничивающих прикладів: CLUSTAL у програмі PC/Gene (доступно ge, версії 8 (доступному в Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USA). Вирівнювання з використанням цих програм можна проводити із застосуванням параметрів за замовчуванням. Програма CLUSTAL добре описана в Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; і Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Товарbiol. 24:307-331. Програма ALIGN заснована на алгоритмі Myers and Miller (1988), вище. При порівнянні амінокислотних послідовностей для програми ALIGN можна використовувати таблицю ваг залишків PAM120, штраф за продовження пропуску 12 і штраф за пропуск 4. Програми BLAST Altschul et al. (1990) J. Mol. Товарbiol. 215:403 засновані на алгоритмі Karlin and Altschul (1990), вище. Пошук нуклеотидів за допомогою BLAST для отримання нуклеотидних послідовностей, гомологічних нуклеотидної послідовності, що кодує білок щодо винаходу, можна проводити з використанням програми BLASTN, score (показника) = 100, wordlength (довжини слова) = 12. Пошуки білків допомогою BLAST для отримання амінокислотних послідовностей, гомологічних білку або поліпептиду щодо винаходу, можна проводити з використанням програми BLASTX, score (показника) = 50, wordlength (довжини слова) = 3. Для отримання вирівнювань з пропусками з метою порівняння можна використовувати Gapped BLAST (BLAST 2.0), як �елять спорідненість молекул, можна використовувати PSI-BLAST (BLAST 2,0). См. Altschul et al. (1997), вище. Коли використовують BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, можна використовувати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, BLASTN для нуклеотидних послідовностей, BLASTX для білків). Вирівнювання також можна проводити вручну за допомогою перегляду. Для визначення гомологий і варіацій, якщо вони існують, у виравниваемих вирівнювання послідовностей також можна проводити із застосуванням програмного забезпечення Sequencher™ (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).

Як застосовують в цьому документі, "ідентичність послідовностей" або "ідентичність" в контексті двох послідовностей нуклеїнових кислот або поліпептидів вказує на залишки у двох послідовностей, які є однаковими при вирівнюванні при максимальній відповідності у вказаному вікні порівняння. Коли відсоток ідентичності послідовностей використовують по відношенню до білків, вважають, що положення залишків, які не ідентичні, часто відрізняються консервативними амінокислотними замінами, де амінокислотні залишки заміщені іншими амінокислотними залишками з подібними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю) і, таким чином, не зм�ент ідентичності послідовностей можна підвищувати для корекції на консервативну природу заміни. Вважають, що у послідовностей, що відрізняються такими консервативними замінами, існує "схожість послідовностей" або "подібність". Кошти для проведення такої регулювання добре відомі фахівцям в даній області. Як правило, вони включають оцінку консервативної заміни як часткового, а не повної розбіжності, таким чином, підвищуючи відсоток ідентичності послідовностей. Наприклад, таким чином, коли ідентична амінокислота дає показник 1, а неконсервативная заміна дає показник нуль, консервативна заміна дає показник між нулем і 1. Оцінки консервативних замін підраховують, наприклад, як застосовують у програмі PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.).

Як застосовують в цьому документі, "відсоток ідентичності послідовностей" означає показник, який визначається через порівняння двох оптимально вирівняних послідовності у вікні порівняння, де частина полінуклеотидного послідовності у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто пропуски) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток розраховують, визначаючи количествнокислотние залишки, з отриманням кількості співпадаючих положень, розділяючи кількість співпадаючих положень на загальну кількість положень у вікні порівняння і помноживши результат на 100 з отриманням відсотка ідентичності послідовностей.

Термін "істотна ідентичність" полінуклеотидних послідовностей означає, що полинуклеотид містить послідовність щонайменше 70% ідентичністю послідовності, переважно - щонайменше 80%, більш переважно - щонайменше 90%, а найбільш переважно - щонайменше 95%, в порівнянні з еталонною послідовністю при застосуванні однієї з програм вирівнювання, описаних із застосуванням стандартних параметрів. Фахівець в даній області зрозуміє, що ці значення можна відповідним чином скорегувати для визначення відповідної ідентичності білків, що кодуються двома нуклеотидними послідовностями, беручи до уваги вирожденность кодонов, схожість амінокислот, положення рамки зчитування і т. п. Термін "істотна ідентичність" в контексті пептидів означає, що пептид містить послідовність, щонайменше, з 70% ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю, предоследовательности з еталонною послідовністю у вказаному вікні порівняння. Переважно оптимальне вирівнювання проводять із застосуванням алгоритму вирівнювання по гомології Needleman et al. (1970) J. Mol. Товарbiol. 48:443. Показником того, що дві пептидні послідовності є, по суті, ідентичними, є те, що один пептид імунологічно реагує з антитілами, індукованими до другого пептиду. Таким чином, пептид є по суті однаковим з другим пептидом, наприклад, коли два пептиду відрізняються тільки консервативними замінами. Пептиди, які є "по суті подібними", містять загальні послідовності, як вказано вище, за винятком того, що положення залишків, які не однакові, можуть відрізнятися замінами консервативних амінокислот.

Як застосовують у цьому документі, термін "Омега-9" щодо профілю масла їх каноли означає негидрогенизированное олія з вмістом жирних кислот, включають щонайменше 68,0% олеїнової кислоти за масою і менше або рівних 4,0% ліноленової кислоти за масою. У відношенні рослини каноли, термін "Омега-9" означає рослину каноли, що дає насіння з ендогенним вмістом жирних кислот, включають щонайменше 68,0% олеїнової кислоти за масою і менше 4,0% ліноленової кислоти за масою.

У вибр� відкриті рамки зчитування (ORF) та/або вищерозміщені 5' області раніше описаних мутантних генівfad2іfad3. Таким чином, винахід відноситься до полипептидним послідовності прогнозованих мутантних білків, що містять мутації з раніше описаних мутантних алелів. Відомо, що мембранозв'язані десатурази, такі як FAD2, містять консервативні гистидиновие ділянки. Заміни амінокислотних залишків поза цих гистидинових ділянок також можуть впливати на ферментативну активність FAD2 (Tanhuanpää et al., Molecular Breeding 4:543-550, 1998).

В одному з аспектів винаходу мутантні алелі, описані в цьому документі, можна використовувати при селекції рослин. Зокрема, алелі щодо винаходу можна використовувати для селекції видівBrassicaз високим вмістом олеїнової кислоти, таких якBrassica juncea, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica nigraіBrassica carinata. Винахід відноситься до молекулярних маркерів для розрізнення мутантних алелей від альтернативних послідовностей. Таким чином, винахід відноситься до способів сегрегационного і селекційного аналізу генетичних схрещувань, в яких беруть участь рослини з алелями щодо винаходу. Таким чином, винахід відноситься до способів сегрегационного і селекційного аналізу нащадків, що отримуються від генетичного схрещування, в�ок в ток відноситься до способів визначення рослинBrassica, таких як рослиниBrassica junceaз бажаним складом жирних кислот або бажаними геномними ознаками. Наприклад, способи щодо винаходу можуть включати визначення присутності в геномі конкретних алелівFAD2та/абоFAD3, таких як алелі щодо винаходу або алель J96D-4830/BJfad2aдикого типу. У конкретних варіантах здійснення способи можуть включати визначення присутності поліморфізму нуклеїнової кислоти, асоційованого з одним із визначаються алелей, або антигенної детермінанти, асоційованої з одним з алелей по винаходу. Таке визначення можна проводити рядом способів, таких як ампліфікація ПЛР відповідного фрагмента ДНК, ДНК-фингерпринтинг, РНК-фингерпринтинг, гель-блоттінг і аналіз ПДРФ, аналізи захисту від нуклеаз, секвенування відповідного фрагмента нуклеїнової кислоти, отримання антитіл (моноклональних або поліклональних) або альтернативні способи, адаптовані для розрізнення білка, продукованого відповідними алелями від інших варіантів або форм дикого типу цього білка. Даний винахід відноситься до способу визначення рослинB. juncea, ендогенне вміст жирних кислот в насінні яких включає по мень�.

У деяких з обраних варіантів здійснення для конструювання аллелеспецифических праймерів для ПЛР можна використовувати конкретні заміни окремих пар підстав мутантних алелів щодо винаходу, наприклад, використовуючи невідповідності на 3'-кінцях. Можна отримувати різні комбінації праймерів, таких як прямі праймери або зворотні праймери, з "G/C" на 3'-кінці (для ампліфікації алелі дикого типу) або "A/T" на 3'-кінці (для ампліфікації мутантного алелю). В інших обраних варіантах здійснення для конструювання аллелеспецифических праймерів для ПЛР можна використовувати конкретні заміни окремих пар підстав мутантних алелів щодо винаходу, наприклад, використовуючи невідповідності на 3'-кінцях. Можна отримувати різні комбінації праймерів, таких як прямі праймери або зворотні праймери, з "G/C" на 3'-кінці (для ампліфікації алелі дикого типу) або "A/T" на 3'-кінці (для ампліфікації мутантного алелю). Для ілюстративного викладу протоколів аллелеспецифической ПЛР див. Myakishev et al., 2001, Genome Research 11:163-169 або Tanhuanpää et al., 1999, Molecular Breeding 4:543-550.

В альтернативних варіантах здійснення для визначення алелей по винаходу можна використовувати різні способи визначення однонуклео�(Tapp et al., BioTechniques 28:732-738), аналізи Invader (Mein et al., Mein et al., Genome Research 10:330-343, 2000), аналізи Illlumina® Golden Gate (www.illumina.com) або аналізи на основі конформационного поліморфізму одиночної ланцюга (SSCP) (Orita et al., Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A. 86:2766-2770, 1989).

В альтернативних варіантах здійснення винахід відноситься до рослинBrassicaмістить кодують послідовностіfad2іfad3, що кодують мутантні білки FAD2 і FAD3 білки. Такі мутантні білки FAD2/FAD3 можуть містити тільки одну аминокислотную заміну порівняно з білком FAD2 дикого типу. В характерних варіантах здійснення різні лініїBrassica junceaмістять раніше описані мутантні білки FAD2, кодовані раніше описаними алелями. Такі алелі можна вибирати так, щоб вони були ефективні для отримання збільшеного вмісту олеїнової кислоти і зниженого вмісту ліноленової кислоти в рослинах по винаходу. У конкретних варіантах здійснення бажаний алель можна вводити в рослини способами селекції. В альтернативних варіантах здійснення алелі щодо винаходу можна вводити молекулярно-біологічними способами, включаючи трансформацію рослин. У таких варіантах здійснення рослини по винаходу можуть давати насіння з ендогенним сод�риблизительно 3% ліноленової кислоти за масою, або будь-який інший межа вмісту олеїнової кислоти і ліноленової кислоти, як зазначено вище. Рослини по винаходу також можуть містити приблизно від 70% до приблизно 85% по масі олеїнової кислоти, приблизно від 70% до приблизно 78% олеїнової кислоти і приблизно від 0,1% до приблизно 3% лінолевої кислоти, де склад олії генетично успадковується від батьківської лінії. Зміст всіх жирних кислот в рослинах по винаходу також може становити менше ніж від 7,1% до менш ніж приблизно 6,2% по масі. В одному з варіантів здійснення рослина дає насіння з ендогенним вмістом жирних кислот, що включає, щонайменше, приблизно 70% олеїнової кислоти і менш ніж 3% лінолевої кислоти, де склад олії генетично успадковується від батьківської лінії.

У вибраних варіантах здійснення винахід відноситься до насінняBrassica, які можуть представляти собою насінняBrassica junceaз ендогенним вмістом олії зі складом жирних кислот, передбаченим для одного або декількох із зазначених вище варіантів здійснення, і де генетичні детермінанти для ендогенного вмісту олії отримують на основі мутантних алелей по винаходу. НапрАльтернативно такі насіння можна отримувати, наприклад, шляхом схрещування ліній з мутантним аллелем з другим батьком з подальшою селекцією, де другий батько може представляти собою інші лініїBrassica, такі як лініяBrassica junceaєBrassica junceaякості каноли абоBrassica junceaбез якості каноли, або будь-які інші лініїBrassica, такі якBrassica napus, Brassica rapa, Brassica nigraіBrassica carinata. Ці способи селекції добре відомі фахівцям в даній області.

В альтернативних варіантах здійснення винахід відноситься до генетично стійких рослин родуBrassica, таким як рослиниBrassica juncea, що дає зрілі насіння зі складом, описуваними в одному або декількох із зазначених вище варіантів здійснення. Такі рослини можна отримувати з лінійBrassica junceaз мутантними алелями щодо винаходу. Склад олії таких рослин може генетично успадковані від батьківських ліній.

В альтернативних варіантах здійснення винахід відноситься до способів одержання генетично сталого рослиниBrassica, такого як рослинаBrassica juncea, що дає зрілі насіння з ендогенним вмістом жирних кислот, що включає склад, визначений для одного або декількох із зазначених вище варіантів �a)Brassica napusз іншими рослинамиBrassica, такими якBrassica junceaз утворенням потомства F1. Потомство F1 можна вирощувати, наприклад, способами, які можуть включати самозапилення або вирощування подвійних гаплоидних рослин. При комбінації мутантних алелів FAD2 і мутантних алелів FAD3, рослини з двома мутантними алелями генів (fad2іfad3можуть містити чудовий профіль жирних кислот олії, ніж будь-які рослини з поодинокими мутаціями. Отримане потомство можна піддавати відбору на генетично стійкі рослини, що дають насіння зі складом, описуваним для одного або декількох із зазначених вище варіантів здійснення. Наприклад, такі насіння можуть мати стабілізований профіль жирних кислот, що включає зміст усіх насичених вуглеводневих сполук приблизно від 7,1% приблизно до 6,5% у всіх виділених оліях. У певних варіантах потомство може самостійно давати насіння або, в якості альтернативних варіантів здійснення, з нього можна отримувати масло зі складом, як зазначено вище з вмістом олеїнової кислоти більш ніж приблизно 70% за масою і вмістом ліноленової кислоти менш ніж приблизно 3% по масі.

У вибранастения, одержувані на основі мутантних алелей по справжньому винаходу, може супроводжуватися відповідним зниженням вмісту лінолевої кислоти та ліноленової кислоти, тоді як вміст інших жирних кислот може залишатися фактично незмінним.

В одному з аспектів винахід відноситься до рослин з стійким, наслідуваним фенотипом з високим вмістом олеїнової кислоти і низьким вмістом ліноленової кислоти. Наприклад, фенотип з високим вмістом олеїнової кислоти і низьким вмістом ліноленової кислоти, що утворюється в результаті присутності мутантних алелів щодо винаходу, генетично успадковується в поколіннях M2, M3 і M4.

В різних аспектах винахід включає зміну кількості копій экспрессируемой кодуючої послідовності в геномі рослини. Під "экспрессируемим" розуміють, що первинна структура, тобто послідовність кодуючої послідовності означає, що кодує послідовність активний білок. Однак экспрессируемие кодують послідовності можуть не экспрессироваться в якості активного білка в конкретній клітці. Наприклад, цей "генний сайленсинг" може відбуватися внаслідок дії різних механізмів трансген вводили в смислової орієнтації з несподіваним результатом, що активність і гена, і трансгену придушувалася (Napoli et al., 1990 Plant Cell 2:279-289). Точний молекулярний механізм такої косупрессии невідомий, хоча існують щонайменше два передбачуваних механізму інактивації гомологічних генетичних послідовностей. В якості одного з механізмів запропоновано інактивація транскрипції за допомогою метилювання, де сигнал ендогенних механізмів генного сайленсинга дають області дуплицированной ДНК. Також запропоновано посттранскрипционний механізм, при якому, як вважають, спільні рівні експресії гена і трансгену призводять до високих рівнів транскрипту, що запускає деградацію обох транскриптів, индуцируемую пороговим рівнем (van Bokland et al., 1994, Plant J. 6:861-877). Таким чином, у цьому винаході экспрессируемие кодують послідовності в геномі можуть не экспрессироваться в конкретній клітці.

В альтернативних варіантах здійснення винахід відноситься до рослинBrassica juncea, де змінена десатуразная активність жирних кислот, змінено вміст олеїнової кислоти або змінено вміст ліноленової кислоти щодоB. junceaдикого типу, яку використовували для експерименту по мутагенезу. Під десатуразой жирних ки�и. Наприклад, ферменти FAD2/FAD3 можуть характеризуватися активністю введення другої подвійний зв'язку при біосинтезі лінолевої кислоти з олеїнової кислоти. Змінена десатуразная активність може включати збільшення, зниження або усунення десатуразной активності порівняно з еталонними рослиною, клітиною або зразком.

В інших аспектах зниження десатуразной активності може включати усунення експресії послідовності нуклеїнової кислоти, кодує десатуразу, такий як послідовність нуклеїнової кислоти по винаходу. Під усуненням експресії в цьому документі розуміють, що функціональна амінокислотна послідовність, послідовність кодується нуклеїнової кислоти, не продукується на детектируемом рівні. Зниження десатуразной активності може включати усунення транскрипції послідовності нуклеїнової кислоти, кодує десатуразу, такий як послідовність щодо винаходу, що кодує фермент FAD2 або фермент FAD3. Під усуненням транскрипції у цьому документі мають на увазі, що послідовність мРНК, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, не транскрибується на детектируемая рівнях. Зниження десатсатуразу, укороченою амінокислотною послідовністю. Під продукцією укороченою амінокислотної послідовності в цьому документі розуміють, що в амінокислотної послідовності, кодованої послідовності нуклеїнової кислоти, відсутня одна або кілька амінокислот функціональної амінокислотної послідовності, кодованої послідовності нуклеїнової кислоти дикого типу. Крім того, зниження десатуразной активності може включати продукцію варіанти амінокислотної послідовності десатурази. Під продукцією варіанти амінокислотної послідовності в цьому документі розуміють, що амінокислотна послідовність містить одну або кілька амінокислот, що відрізняються від амінокислотної послідовності, кодованої послідовності нуклеїнової кислоти дикого типу. Як обговорюється в цьому документі більш докладно, у цьому винаході описано, що мутантні лінії по винаходу продукують ферменти FAD2 і FAD3 з зміненими амінокислотами порівняно з лінією J96D-4830 дикого типу. У послідовності нуклеїнової кислоти з метою зниження десатуразной активності можна здійснювати безліч типів мутацій, таких як мѾвим полипептидним послідовності FAD2/FAD3, які можна модифікувати у відповідності з альтернативними варіантами здійснення винаходу. В даній області добре відомо, що в структурі поліпептиду можна проводити деякі модифікації і заміни по суті без зміни біологічної функції цього пептиду з отриманням біологічно еквівалентного поліпептиду. Як застосовують у цьому документі, термін "консервативні амінокислотні заміни" відноситься до заміни однієї амінокислоти в даному положенні пептиду на іншу, де заміну можна проводити без яких-небудь помітних втрати або придбання функції з отриманням біологічно еквівалентного поліпептиду. При проведенні таких замін заміни подібних амінокислотних залишків можна проводити на підставі відносного подібності заступників бічного ланцюга, наприклад, їх розміру, заряду, гідрофобності, гідрофільності і т. п., і такі заміни можна оцінювати за їх впливом на функцію пептиду допомогою стандартного тестування. І навпаки, як застосовують у цьому документі, термін "неконсервативние амінокислотні заміни" відноситься до заміни однієї в даному положенні пептиду амінокислоти на іншу, де заміна викликає відчутні втрату або придбання функції пептиду з пония можна проводити консервативні амінокислотні заміни, де амінокислотний залишок замінюють на іншого з подібним значенням гідрофільності (наприклад, в межах значень плюс або мінус 2,0), де амінокислотним залишкам присвоєні наступні значення гідрофільності (детально викладено в патенті США № 4554101): Arg (+3,0); Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2); Gln (+0,2); Gly (0); Pro (-0,5); Thr (-0,4); Ala (-0,5); His (-0,5); Cys (-1,0); Met (-1,3); Val (-1,5); Leu (-1,8); Ile (-1,8); Tyr (-2,3); Phe (-2,5) і Trp (-3,4). Можна проводити неконсервативние амінокислотні заміни, де значення гідрофільності залишків значно відрізняється, наприклад, відрізняючись більш ніж на 2,0.

В альтернативних варіантах здійснення можна проводити консервативні амінокислотні заміни, де амінокислотний залишок замінюють на іншого з подібним значенням індексу гідрофобності (наприклад, в межах значень плюс або мінус 2,0). У таких варіантах здійснення кожного амінокислотного залишку можна присвоїти індекс гідрофобності на підставі його характеристик гідрофобності і заряду, наступним чином: Ile (+4,5); Val (+4,2); Leu (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8); Gly (-0,4); Thr (-0,7); Ser (-0,8); Trp (-0,9); Tyr (-1,3); Pro (-1,6); His (-3,2); Glu (-3,5); Gln (-3,5); Asp (-3,5); Asn (-3,5); Lys (-3,9) і Arg (-4,5). Можна проводити неконсервативние амінокислотні заміни, де індекс гідрофобності залишків значно отлЎщие заміни амінокислоти дикого типу His (-3,2) у положенні, відповідному амінокислоти 105 BJfad2-a: Ile (+4,5); Val (+4,2); Leu (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8); Gly (-0,4); Thr (-0,7); Ser (-0,8) і Trp (-0,9).

В альтернативних варіантах здійснення можна проводити консервативні амінокислотні заміни, де амінокислотний залишок замінюють на інший, що належить до того ж класу, де амінокислоти поділяють на класи неполярних, кислих, основних і нейтральних наступним чином: неполярні: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; кислі: Asp, Glu; основні: Lys, Arg, His; нейтральні: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr. Можна проводити неконсервативние амінокислотні заміни, де залишки не потрапляють в один і той же клас, наприклад, заміну основний амінокислоти на нейтральну або неполярних амінокислоту.

Даний винахід додатково відноситься до борошні, що отримується з насіння рослинB. junceaзазначено в цьому документі, де така мука може перебувати у формі мелених насіння, макухи (насіння, які спрессовивали для видавлювання олії, але не піддавали дії розчинника або інших способів хімічної екстракції), білих пластівців (насіння, які розтерли і піддали екстракції розчинником, таким як гексан, з виділенням більшої кількості масла) або борошна після загальноприйнятих способів помелу і е�отке типу, описуваного, наприклад, в WO2008024840 A2, WO03/053157, патенті США № 5844086; WO 97/27761; патентній заявці США 2005/0031767, або J. Caviedes, "Aqueous Processing Of Rapeseed (Canola)", Thesis For Degree Of Master Of Applied Science, University Of Toronto 1996, p.p. 1-147.

Масла по справжньому винаходу можна також використовувати в некулинарних або харчових способи і композиціях. Деякі з цих застосувань можуть бути виробничими, косметичними або медичними. Масла по справжньому винаходу також можна використовувати в будь-якому застосуванні, для якого підходять масла по справжньому винаходу. В основному масла по справжньому винаходу можна використовувати для заміни, наприклад, мінеральних масел, складних ефірів жирних кислот або тваринних жирів в ряді застосувань, таких як мастильні засоби, добавки до мастильних засобів, технологічні мастила, гідравлічні рідини і вогнестійкі гідравлічні рідини. Масла по справжньому винаходу також можна використовувати в якості матеріалів в процесі отримання модифікованих олій. Приклади способів модифікації масел по справжньому винаходу включають фракціонування, гідрування, зміна вмісту олеїнової кислоти або вмісту ліноленової кислоти в олії та інші способи модифікації, известнизуют для отримання переэтерифицированних масел, для отримання тристеаринов або в композиціях рідких діелектриків, які можна включати в електричні пристрої.

Приклади індустріальних застосувань масел по справжньому винаходу включають складову частину мастильної композиції (патент США № 6689722; також див. WO 2004/0009789A1); паливо, наприклад, біодизельне паливо (патент США No. 6887283; також див. WO 2009/038108A1); реєструючий матеріал для застосування в репрографирующем обладнанні (патент США № 6310002); імітують нафту композиції (патент США № 7528097); герметизуючі композиції для бетону (патент США № 5647899); вулканизирующее покриває засіб (патент США № 7384989); промислові масла для смаження; миючі склади (WO 2007/104102A1; також див. WO 2009/007166A1) і розчинники в присадке для пайки (WO 2009/069600A1). Масла по справжньому винаходу можна також використовувати в промислових способи, наприклад, отримання біопластика (патент США № 7538236); і отриманні поліакриламіду інверсної емульсійною полімеризацією (патент США № 6686417).

Приклади косметичних застосувань масел по справжньому винаходу включають використання в якості пом'якшує кошти в косметичній композиції; в якості заміни гелю з нафтопродуктів (патент США № 5976560); в якості складових якості складової частини розчину для перорального введення (WO 00/62748A1); в якості складової частини композиції проти старіння (WO 91/11169) і в якості складової частини пінного аерозольного препарату для шкіри або волосся (патент США № 6045779).

Крім того, масла по справжньому винаходу можна використовувати в медичних застосуваннях. Наприклад, масла по справжньому винаходу можна використовувати в захисному бар'єрі проти інфекції (Barclay and Vega, "Sunflower oil may help reduce nosocomial infections in preterm infants." Medscape Medical News <http://cme.medscape.com/viewarticle/501077>, доступно з 8 вересня 2009 року); і масла з високим вмістом омега-9 жирних кислот можна використовувати для поліпшення виживання трансплантата (патент США № 6210700).

Слід розуміти, що наведене вище являє собою неограничивающие приклади некулинарних застосувань, для яких підходять масла по справжньому винаходу. Як зазначено раніше, масла і модифіковані масла по справжньому винаходу можна використовувати, наприклад, для заміни мінеральних масел, складних ефірів жирних кислот або тваринних жирів у всіх застосуваннях, відомих фахівців у даній області.

Слід розуміти, що можуть існувати різні модифікації і альтернативи по справжньому винаходу. Його певні конкретні варіанти здійснення описаний� видамиBrassica junceaякості каноли, а також до всіх видівBrassica junceaне володіє якістю каноли. Винахід можна застосовувати до всіх інших видівBrassica, включаючиBrassica juncea, Brassica nigraіBrassica carinataз отриманням по суті подібних результатів. Також слід розуміти, що наведені нижче приклади не призначені для обмеження винаходу конкретними описаними формами, але замість цього винахід призначений для включення всіх модифікацій, еквівалентів і альтернатив, що знаходяться в обсязі винаходу.

ПРИКЛАДИ

ПРИКЛАД 1

Зворотне схрещування

Щодо фіг. 1, одне або кілька зворотних схрещувань (BC3 і BC4) між відібраними варіантами з високим вмістом олеїнової кислоти - низьким вмістом ліноленової кислоти та партнерамиB. juncea(Zem1, Zem2 і ZE Skorospelka) для повного відновлення генетичного оточенняB. juncea. у програмі зворотного схрещування використовували тільки лінії з відсутністю ерукової кислотиB. juncea, так як це могло забезпечити повну експресію мутантних алелівfad2іfad3у неконкуруючих умовах з геном(ами) FAE.

Після кожного успішного зворотного схрещування (наприклад, BC3, BC4) і подальшого самозапилення (наприклад, BC3F2,�м маркерів, як більш докладно описано в цьому документі), потім вирощували до цвітіння для використання в наступних зворотних схрещуваннях. Зібране насіння з відібраних ліній піддають аналізу профілю олії з застосуванням полусемени, неруйнівного NIR аналізу цілих насіння або NIR одного насіння (FTNIR). Потім зразки, що містять збільшені рівні олеїнової кислоти і знижені рівні ліноленової кислоти, висаджували в ґрунт і вирощували до дозрівання. Від цих рослин отримують самоопиленние насіння, і партію насіння аналізують на профіль масла, представляє високий вміст олеїнової і низький вміст ліноленової кислоти. Визначають відібрані варіанти, які містять олеїнову кислоту в діапазоні 67-80% і менше 5% ліноленової кислоти. Ці відібрані варіанти схрещували між собою з отриманням бажаного профілю жирних кислот.

Виділяли геномну ДНК тканин листя і скринировали на присутність мутацій, специфічних для генівfad2aіfad3a, для яких відомо, що вони зумовлюють фенотипом з високим вмістом олеїнової кислоти і низьким вмістом ліноленової кислоти в олії насіння. Рослини за своїм фенотипом (листа і будова листків) були високо схожими з батьківськими рахе в польових умовах, подібні з батьківськогоB. juncea.

SSR-маркери, специфічні для геному CC і небажані області геному AA, більше не присутні в потомстві при зворотному схрещуванніB. juncea×B. napusB. juncea.

Тканини листя, отримані з лінійB. junceaі омега-9B. Napus, лиофилизировали для проведення генетичного фингерпринтинга. У випадках, коли для отримання індивідуальних рослин F1 використовували кілька рослин, також збирали тканину від усіх предків для обліку алелів, які можна спостерігати в наступних поколіннях. Якщо батьківську тканина не збирали, здійснювали альтернативний варіант, коли збирали випадкові зразки шести рослин з кожної партії насіння батьківських (джерела). ДНК виділяли з рослин в кількості до шести індивідуальних рослин на лінію та рівні аликвоти від кожного індивідуального рослини об'єднували з отриманням батьківського контролю для генетичного фингерпринтинга. Попередньо отримували генетичні відбитки всіх ліній омега-9B. napus, використовуваних у програмі схрещування, і представляли дані, зібрані у всіх групах зчеплення геному A і генома C в цих лініях.

Для подальшого поліпшення інтерпретації та обґрунтованості резуль� B. nigraіB. oleraceaз метою можливої ідентифікації алелів, відповідних геномам A, B і C, відповідно.

СукупностіB. juncea,B. napus,B. rapa,B. nigraіB. oleraceaпіддавали скринінгу з панеллю маркерів SSR. На додаток до зібраної інформації про спостережуваних фрагментах ДНК, відзначали інформацію про нульових алелях. Зібрану інформацію за генотипированию зберігали в базі даних генотипування Geneflow™. Ідентифікацію інформативних маркерів SSR для обраних лінійB. junceaіB. napusпроводили із застосуванням функції звіту про полиморфизмах в базі даних генотипування Geneflow™.

Для зменшення скорочення областей, специфічних дляB. napusз використанням поліморфних маркерів SSR, ідентифікованих при скринінгу батьків, у поколіннях зворотного схрещування допомогою скринінгу популяцій зворотного схрещування проводять селекцію за допомогою маркерів. На додаток до поліморфних кодоминантним маркерів, для отримання бажаних областей геномів A і B для селекції за допомогою маркерів також використовують маркери, що враховують нульові алелі для лінійB. juncea. Відбір рослин для поліпшень проводять за допомогою селекції і лабораторних досліджень з використанням фенотипическ�х ділянок геному AA на основі профілів маркерів, вибирають для покращення на наступному етапі.

Приклад 2

Отримання маркерів, специфічних дляB. juncea

Отримували ДНК маркери, за допомогою яких можна детектувати присутність ДНК геному BB, відноситься до FAD2b та іншим доступним послідовностям зB. nigraіB. juncea(представляє геном BB). Для отримання маркерів отримували картированние популяції подвійних гаплоидов. Крім того, маркери ДНК (SSR і SNP) отримували з відомих послідовностей геному B. Ці маркери можуть підтверджувати ступінь відновлення вихідної основиB. junceaу перетворюються лініях.

Для скринінгу батьків усього доступні 1931 маркерів SSRB. napus, переважно містять мотиви ді - і тринуклеотидних повторів. Ці маркери в даний час піддають скринінгу на панелі лінійBrassica, належатьB. juncea(лінії Zem1, Zem2 і ZE Skorospelka), омега-9B. napus, B. rapa, B. nigraіB. oleracea. Цей скринінг надає інформацію двох видів. По-перше, так як ці маркери SSR отримані з геномаB. napusскринінг надає інформацію про їх застосування для інших геномів і забезпечує ідентифікацію алелей, специфічно відповідних геномам AA, BB або CC. По-друге, скринінг забезпечує ідентифікацію основЋм вище маркерів, для отримання маркерів SSR проводився пошук в загальнодоступних базах даних на маркери SSR, які можна використовувати дляB. juncea. Всього в загальнодоступних базах даних ідентифіковано 438 SSR, з яких 101 відбуваються B. napus (геном AA CC), 113 з B. nigra (геном BB), 95 B. oleracea (геном CC) та 129 з B. rapa (геном AA). З них 113 SSR з B. nigra, 129 SSR з B. rapa та деякі з SSR з B. napus ідентифіковані, як потенційно придатні для B. juncea.

Вибрані маркери з поточної колекції авторів винаходу, а також маркери SSR і SN, отримані з відомих послідовностей геному B, використовували для підтвердження присутності вихідного оточення B. juncea при селекції зворотним схрещуванням. Для конструювання карти зчеплення B. juncea, а також порівняльної карти B. juncea і B. napus для ідентифікації загальних маркерних локусів також використовували інформативні маркери, ідентифіковані при скринінгу батьків. Вводяться локуси fad2a і fad3a картируются в B. juncea, що представляє доказ того, що вони успішно введені в геном AA B. juncea.

Використовуючи ці специфічні для B. juncea маркери, ідентифікують успадковані послідовності fad2a, fad2b, fad3a і fad3b для локалізації варіацій fad2 і fad3 в обраних лініях з поліпшеними профілями жирних кислот.

При�регулюють профіль олії в насінні з високим вмістом олеїнової і низьким вмістом ліноленової кислот, як описано раніше, піддають скринінгу з використанням маркерів, обраних для геному BB. Підтверджують присутність геному BB в конвертованих лініях. Ці мутантні лінії B. juncea також демонструють зниження (або повна відсутність) кількості позитивних маркерів геному C, обраних для B. napus. Ці профілі додатково покращують, за допомогою зворотних схрещувань і способів самозапилення, відомих в даній області, які покращують агрономічні якості лінії, наприклад, знижують затримку врожаю, знижують ламкість стручків, змінюють період дозрівання для різних зон росту, збільшують стійкість до стресів, збільшують стійкість до захворювань і т. п.

Для визначення геному B в самоопиляемом і DH потомство після міжвидових схрещувань B. napus та B. juncea, демонструє бажаний профіль олії насіння, використовують три різних способи.

A) Молекулярні маркери

Ідентифіковані молекулярні маркери, що дають можливість визначати генетичні поліморфізми у ліній B. napus та B. juncea. Всього для визначення основного набору SSR, що дозволяє розрізняти геноми B. juncea і B. napus, скринінгу піддано 1931 маркерів SSRB. napus. Крім того, як описано в прикладі 2, для ідентифікації дополнительниѱолее 2300 маркерів SSR на можливість за допомогою них розрізнятиB. junceaвідB. napus. Набір маркерів з цього скринінгу використовували для визначення накопичення геномуB. junceaв потомстві або зменшення або відсутності геномуB. napus. Інша система маркерів включає використання маркерів SNP. У співтоваристві отримані понад 3000 SNP. Проводили два високопродуктивних аналізу Illumina (тобто дві OPA (сукупність аллелеспецифичних олігонуклеотидів) з 1536 SNP). Обидві цих OPA (всього 3072 аналізів SNP) піддавали скринінгу по батьківській панелі, що складається з ліній всіх трьох тетраплоїдовB. napus, B. junceaіB. carinataі всіх трьох диплоїдних попередниківBrassica"Трикутник" (1935) -B. nigra, B. oleraceaіB. rapa. Визначають набір SNP, за допомогою якого можна однозначно відстежити фрагментиB. junceaу потомстві. Зокрема в набір включають ті SNP, за допомогою яких можна підтвердити присутність геному B в потомстві. Таким чином, використовуючи для скринінгу рослин-нащадків велика кількість інформативних SSR і SN, визначають рослини, що містять високий відсоток геному B. Після характеристики самоопиляемого і DH потомства, картированние положення маркерних локусів підтверджують по відношенню до карти зчепленняB. napusіB. juncea, ладу порівняльну карту з вико�явище або делецию маркерних локусів після міжвидового схрещування.

B) Флуоресцентна гібридизаціяin situ

Для визначення присутності або накопичення геному B в потомстві використовують спосіб флуоресцентної гібридизаціїin situ(FISH). Рослини-нащадки використовують для аналізу маркерів і для цитологічних досліджень, таких як визначення кількості хромосом, наявність анеуплоїдії, і для визначення представляють інтерес геномних сегментів. FISH є ефективним інструментом, який може додатково посилити інформацію, отриману за допомогою молекулярних маркерів. З цією метою послідовності-кандидати для маркерів SSR і SN, за допомогою яких можна однозначно визначити присутність геному B, використовують для отримання великих клонів BAC, які потім використовують в якості зондів на метафазних платівках є кандидатами рослин-нащадків, ідентифікованих як містять високий відсоток геному B. Послідовності BAC також визначають комп'ютерними засобами, за умови, що послідовності BAC доступні в базах даних. У цьому випадку BAC, визначеніsilicoможна отримувати з відповідного джерела та використовувати в експериментах FISH.

C) Геномна гібридизаціяin situ

Спосіб геномної гібридизаціїin situB. junceaв якості конкуруючого немеченого зонда. Сильна гібридизація з хромосомами геному BBB. junceaвказує на присутність геному BB в потомстві.

Зразки з бажаним профілем олії насіння і алелями, що відносяться доB. junceaвикористовують для зворотного схрещування і додаткового самозапилення. Для відновлення елітного генотипу по максимально можливій кількості поліморфних локусів при збереженні бажаного фенотипу в сегрегирующих популяціях використовують MAS. Потомство зворотного схрещування генотипируют з маркерами SSR або SNP з акцентом при виборі проти зразків, що містять алелі з геномів A і C, асоційовані зB. napus. Цей процес ефективним, коли для одержання бажаного фенотипу необхідно велика кількість локусів.

Приклад 4

Додаткові модифікації для профілів масел і тестування профілів масел

Додаткове поліпшення олійного насіння здійснюють, комбінуючи мутаціїfad2, fad3генома B, описані в публікації № US2008/0168587, або мутації, знову створювані в насінніB. nigraабоB. juncea. В одному з прикладів проводять схрещування різних ліній, що визначають обрані варіанти і, комбінуючи ці відібрані варіанти, отримують додаткові�ислоти з порівнянним агротехнічним виходом продукції.

Інші потенційні способи одержання та/або визначення інших джерел мутантних генівfad2bта/абоfad3bвключають, наприклад: на основі відомої зародкової плазми, на основі мутантів при використанні швидких нейтронів/EMS, на основі застосування РНКи, на основі опосредуемого цинковими пальцями контролю регуляції експресії гена. Рівні експресії ферментівfad2bіfad3bможна знижувати або експресію ферментівfad2bіfad3bможна усувати будь-якими з відомих способів, описаних вище.

Мутагенез мікроспорB. nigra

Одержання мутантів
15
Оцінка мутантів за допомогою NIR одного насіння

Визначення жирних кислот і глюкозинолата
20

Після отримання/визначення генів, мутантні гени FAD переносять у рослиниB. junceaчерез: (a) схрещування лініїB. junceaDAS з другим рослиноюB. nigra, B. carinataабоB. junceaз мутантним геномfad2bта/або геномfad3b; (b) з використанням молекулярних маркерів для відстеження введення генаfad2bта/або генаfad3b; (c) отримуючи насіння від скрен; (e) отримуючи насіння потомства з самоопиляющихся рослин з етапу (d); (f) тестування потомства в теплицях і польових умовах в мінливих умовах навколишнього середовища; та (g) визначаючи насіння потомства, що мають величину вмісту ліноленової кислоти <3% і величину вмісту олеїнової кислоти приблизно від 68% до приблизно 80%.

Негативну регуляцію ферментів FAD2B і FAD3B здійснюють делецією, инсерционним мутагенезом в кодують областях або регуляторних доменах в межах природних послідовностей.

Приклад 5

Профіль олії насіння гібридуB. Juncea

Профіль масла HOLL представлений в гібридах, одержуваних створенням батьківських ліній HOLL, що містять цитоплазматичні чоловічі стерильні системи (див., наприклад, Ogura,B. napusCMS 126-1) і відповідне їм відновлюючий фертильність оточення.

Приклад 6

Введення агрономічних властивостей, властивостей стійкості до гербіцидів і інсектицидів в HOLLJuncea

Властивість стійкості до гербіцидів (стійкість до имидазолинону): властивість стійкості до имидазолинонуB. napus(BASF) включає ділянку мутації PM2, розташований в LG01 (геном AA, приблизно 20 сМ від ділянки вставки стійкості до глифосату), та ділянка м�участь геному CC. Swanson et al. (Theor. Appl Genet. 78:525-530, 1989) показали, що генahas3окремо забезпечує стійкість до имидазолиноновим гербіцидів. Існують два інших генаAHAS, які перебувають у геномі AA:ahas2іahas4. ГениAHAS, що знаходяться в геномі BB, можна визначати для мутагенезу, якщо для стійкості до имидазолиноновим гербіцидів необхідні два генаahas. Виявлено, що при наявності вB. junceaтільки PM2 отримують недостатню стійкість. Таким чином, вB. junceaдля забезпечення достатньої стійкості до имидазолинону вводять два або більше гена.

B. junceaсхрещуютьомега-9B. napusIMI. Фертильні насіння висаджують, і потомство міжвидового схрещування обприскують имидазолиноновими гербіцидами для аналізу на стійкість. Наявність PM2 при застосуванні аналізу Invader підтверджує присутність мутації PM2. Проводять аналіз на мутацію PM1 для визначення того, що спаровування хромосом геному BB і генома CC призводить до генетичного переносу PM1 з генома CCB. napusв геном BB. juncea.

Якщо одинична мутація в геніAHAS3забезпечує стійкість до имидазолиноновим гербіцидів, для проведення схрещування з лінієюB. junceaвикористовують лінію омега-9B. napusмістить PM2, з усуненням необхоЀкеров стійкою до имидазолинонуB. junceaпроводять одночасно з відновленням і визначенням геному BB. Після отримання лінії HOLLB. juncea, стійкої до имидазолинону, її використовують для подальшого введення властивостей в інші культивариB. juncea.

Введення нових гербіцидних властивостей HOLLB. juncea: Отримання стійкої до глифосатуB. junceaпроводять за допомогою введення вB. junceaмутації TIPS допомогою застосування технології цинкових пальців. ВB. napusідентифіковано п'ять паралогов, де один або два з них є найбільш сильно экспрессирующими варіанти гена EPSPS. Виявлено, що модифіковані гениepspsздатні призводити до фенотипом з стійкістю до глифосату, знаходяться в геномі A і за допомогою схрещування їх вводять у омега-9B. junceaз отриманням стійкою до глифосату омега-9B. juncea.

Сегрегирующее потомство (T1SI, F2 або BC1) висаджують. Збирають зразки листів для виділення ДНК. Зразки обприскують для аналізу на селективний маркер стійкості до гербіциду, з подальшим тестуванням зиготности з використанням геноспецифического маркера. Формують сукупності для аналізу об'єднаних сегрегантов (BSA) за допомогою об'єднання ДНК випадкових зразків стійких і чутливих�тивар і трансформований донорський культивар генотипируют з використанням маркерів SSR або SNP для визначення передбачуваної хромосомної вставки. На хромосомі проводили селективну генотипування з асиметричними групами для ідентифікації ділянки вставки гена. Для введення представляє інтерес гена в бажану HOLLB. junceaвикористовували введення за допомогою маркерів.

ДОДАТКОВІ ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ

З появою способів молекулярної біології дозволили виділяти та характеризувати гени, що кодують конкретні білкові продукти, у вчених у галузі біології рослин розвинувся великий інтерес до конструювання геному рослини так, щоб він містив і экспрессировал чужорідні або додаткові гени або экспрессировал модифіковані варіанти вихідних генів (можливо під контролем інших промоторів) для зміни властивостей рослин в певному напрямку. Такі чужорідні додаткові та/або модифіковані гени в цьому документі узагальнено позначають як "трансгени". Протягом останніх 20 років для різних культур розроблено кілька способів отримання трансгенних рослин, які включають опосередковану агробактерій трансформацію і бомбардування частинками. Для ознайомлення з конкретними протоколами трансформаціїBrassicaдля довідки див. патенти (патент США № 518�иданний Tulsieram et al., 2 жовтня 2001 року). Даний винахід в конкретних варіантах здійснення також відноситься до трансформованим версіями заявляються сортів і ліній.

Трансформація рослин включає конструювання экспрессирующего вектора, який буде функціонувати в рослинних клітинах. Такий вектор містить ДНК, що несе ген під контролем регуляторного елемента (наприклад, промотора) або функціонально пов'язаний з ним. Экспрессирующий вектор може містити один або кілька таких функціонально пов'язаних комбінацій ген/регуляторний елемент. Вектор(и) можуть перебувати у формі плазміди, і їх можна використовувати окремо або у комбінації з іншими плазмідами для одержання трансформованих рослинBrassicaспособами трансформації, як описано нижче, з введенням трансгенів в генетичний матеріал рослини(ий)Brassica.

Експресують вектори для трансформаціїBrassica: маркерні гени - експресують вектори включають щонайменше один генетичний маркер, функціонально пов'язаний з регуляторним елементом (наприклад, промотор), що дозволяє виділяти трансформовані клітини, що містять маркер, за допомогою негативної селекції, тобто інгібуючи ріст клітин, не содержащихий генетичним маркером. В області трансформації добре відомо безліч широко використовуваних генів селективних маркерів для трансформації рослин, і вони включають, наприклад, гени, що кодують ферменти, що забезпечують метаболічну детоксикацію обраного хімічного засобу, що може представляти собою антибіотик або гербіцид, або гени, що кодують змінену мішень, яка нечутлива до ингибитору. Способів позитивної селекції в даній області відомо мало.

Одним широко використовуваним геном селективного маркера для трансформації рослин є ген неоміцинфосфотрансферази II (nptll), який, коли він перебуває під контролем регуляторних сигналів рослини, надає стійкість до канаміцину (Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80:4803, 1983). Іншим широко використовуваним геном селективного маркера є ген гигромицинфосфотрансферази, який надає стійкість до антибіотика гигромицину (Vanden Elzen et al., Plant Mol. Товарbiol., 5:299, 1985).

Додаткові гени селективних маркерів бактеріального походження, надають стійкість до антибіотиків, включають гентамицинацетилтрансферазу, стрептомицинфосфотрансферазу і аміноглікозид-3'-аденилтрансферазу, детерминанту стійкості до блеомицину (Hayford et al., Plних маркерів, надають стійкість до гербіцидів, таким як гліфосат, глюфосинат, 2,4-D або бромоксиніл (Comai et al., Nature 317:741-744, 1985; Lira et al., WO 2008/070845; Wright et al., WO 2005/107437 і WO 2007/053482; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618, 1990; Stalker et al., Science 242:419-423, 1988). Інші гени селективних маркерів для трансформації рослин небактеріального походження включають, наприклад, дигидрофолатредуктазу миші, рослинну 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтетазу і рослинну ацетолактатсінтазу (Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67, 1987; Shah et al., Science 233:478, 1986; Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643, 1990). В якості маркера експресії гена в прокариотических і эукариотических клітинах використовували ген, що кодує зелений флуоресцентний білок (GFP) (Chalfie et al., Science 263:802, 1994). GFP і мутанти GFP можна використовувати як селективних маркерів

Промотори: Гени, що включаються в експресують вектори, повинні перебувати під контролем нуклеотидної послідовності, що містить регуляторний елемент, наприклад, промотор. В даний час в області трансформації добре відомі кілька типів промоторів, а також інші регуляторні елементи, які можна використовувати окремо або в комбінації з промоторами. Як застосовують в цьому документі, "промотор" включає вказівку на ділянку ДНК, �ації транскрипції. "Промотор рослини" являє собою промотор, здатний до ініціації транскрипції в рослинних клітинах. Приклади промоторів під контролем розвитку включають промотори, які переважно ініціюють транскрипцію у певних тканинах, таких як листя, коріння, насіння, жилки, судини ксилеми, трахеиди або склеренхіма. Такі промотори позначають як "з тканинним перевагою". Промотори, що ініціюють транскрипцію лише в певних тканинах, позначають як "тканеспецифические". Специфічний для "типу клітин" промотор переважно контролює експресію в певних типах клітин в одному або кількох органах, наприклад, у клітинах судин у коренях або листках. "Индуцибельним" промотором є промотор, який знаходиться під контролем умов навколишнього середовища. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть впливати на транскрипцію индуцибельними промоторами, включають анаеробні умови або наявність світла. Тканеспецифические промотори, промотори з тканинним перевагою, специфічні для типу клітин, і индуцибельние промотори складають клас неконститутивних промоторів. Конститутивна промотор являє собою промотор, який використовується при більшості условиспрессииBrassica. Необов'язково, индуцибельний промотор функціонально пов'язаний з нуклеотидної послідовністю, кодує сигнальну послідовність, яка функціонально пов'язана з геном для експресії вBrassica. З индуцибельним промотором швидкість транскрипції зростає у відповідь на індукуючу засіб. По справжньому винаходу можна використовувати будь индуцибельний промотор. См. Ward et al., Plant Mol Товарbiol. 22:361-366 (1993). Ілюстративні индуцибельние промотори включають в якості неограничивающих прикладів промотор з системи ACEI, відповідає на мідь (Mett et al., PNAS 90:4567-4571, 1993); ген In2 з кукурудзи, відповідає на антидот гербіциду бензолсульфонамида (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991); і Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994) або репрессор Tet з Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)). Особливо кращим индуцибельним промотором є промотор, що відповідає на індукуючу засіб, на яке рослина зазвичай не реагує. Ілюстративним индуцибельним промотором є индуцибельний промотор гена стероїдного гормону, транскрипционная активність якого індукується глюкокортикостероидним гормоном (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:0421 (1991)).

Конститутивні промотори: Конститутивна промотор функціонально пов'язані�довательностью, кодує сигнальну послідовність, яка функціонально пов'язана з геном для експресії вBrassica. По справжньому винаходу можна використовувати безліч різних конститутивних промоторів. Ілюстративні конститутивні промотори включають в якості неограничивающих прикладів промотори з вірусів рослин, такі як промотор 35S з CaMV (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985) і промотори таких генів, як актин рису (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); убіквітин (Christensen et al., Plant Mol. Товарbiol 12:619-632, 1989; Christensen et al., Plant Mol Товарbiol 18:675-689 (1992); pEMU (Last et al., Theor. Appl Genet. 81:581-588, 1991); MAS (Velten et al., EMBOJ. 3:2723-2730, 1984); гистона H3 кукурудзи (Lepetit et al., Mol Gen. Genetics 231:276-285, 1992; Atanassova et al., Plant Journal 2 (3):291-300, 1992). Особливо придатним конститутивним промотором є промотор ALS, 5' фрагментXba1/Nco1 структурного гена ALS3Brassica napus(або нуклеотидна послідовність, схожа з зазначеним фрагментомXba1/Nco1). См. заявки PCT WO 96/30530.

Тканеспецифические промотори або промотори з тканинним перевагою: Тканиноспецифічний промотор функціонально пов'язаний з геном для експресії вBrassica. Необов'язково, тканиноспецифічний промотор функціонально пов'язаний з нуклеотидної послідовністю, кодує сигнальну послідовність, функціонально �онально пов'язаним з тканеспецифическим промотором, продукують білковий продукт трансгену, виключно або переважно у конкретної тканини. По справжньому винаходу можна використовувати будь тканиноспецифічний промотор або промотор з тканинним перевагою. Ілюстративні тканеспецифические промотори або промотори з тканинним перевагою включають в якості неограничивающих прикладів переважний для кореня промотор, такий як промотор as гена фазеолина (Murai et al., Science 23:476-482 (1983) і Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82:3320-3324 (1985)); специфічний для листя та індукований світлом промотор, такий як промотор cab або rubisco (Simpson et al., EMBOJ. 4(11):2723-2729 (1985), і Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)); специфічний для пильовика промотор, такий як промотор LAT52 (Twell et al., Mol Gen. Genetics 217:240-245 (1989)); специфічний для пилку промотор, такий як промотор Zm13 (Guerrero et al., Mol Gen. Genetics 244:161-168 (1993)), або переважний для мікроспор промотор, такий як промотор apg (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993)).

Транспорт білка, продукованого з трансгенів у субклітинний компартмент, такий як хлоропласт, вакуолю, пероксисома, глиоксисома, клітинна стінка або мітохондрія, або для секреції в апопласт, здійснюють за допомогою функціонального зв'язування з 5'- і/або 3'-областю гена, що кодує представляюледовательности на 5'- і/або 3'-кінці структурного гена, можна протягом синтезу і процесингу білка визначати, де кодований білок, в кінцевому рахунку, буде компартментализован.

Наявність сигнальної послідовності направляє поліпептид або під внутрішньоклітинну органел або в субклітинний компартмент або для секреції в апопласт. В даній галузі відомо безліч сигнальних послідовностей. См., наприклад, Becker et al., Plant Mol Товарbiol 20:49 (1992); C. Knox et al., Plant Mol Товарbiol. 9:3-17 (1987); Lerner et al., Plant Physiol 91:124-129 (1989); Fontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991); Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991); Gould et al., J. Cell Товарbiol 108:1657 (1989); Creissen et al., Plant J. 2:129 (1991); Kalderon, et al., Cell 39:499-509 (1984); Steifel et al., Plant Cell 2:785-793 (1990).

C застосуванням трансгенних рослин по справжньому винаходу чужорідний білок можна отримувати в комерційних кількостях. Таким чином, способи селекції і вирощування трансформованих рослин, які широко поширені в даній області, що дозволяють отримувати безліч трансгенних рослин, які збирають загальноприйнятим способом, а потім представляє інтерес тканини або із загальної біомаси можна виділяти чужорідний білок. Виділення білка з біомаси рослин можна проводити відомими способами, які описані, наприклад, в Heney and Orr, Anal Biochem. 114:92-6 (1981).

У відповідності з конкретним вариаого білка, являє собою рослинаBrassica. В іншому варіанті здійснення представляє інтерес біомаса являє собою насіння. Для відносно невеликої кількості трансгенних рослин, що демонструють підвищені рівні експресії, можна отримувати генетичну карту, переважно за допомогою загальноприйнятих аналізів ПДРФ, ПЛР) та SSR, яка ідентифікує приблизне положення інтегрованої молекули ДНК в хромосомах. Для отримання інформації про ілюстративних способах у цьому відношенні див. Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993). Інформація з карти щодо становища в хромосомі придатна для патентного захисту трансгенної рослини по винаходу. Якщо робиться неправомірне вирощування і проводиться схрещування з іншого зародкової лінією, карту області інтеграції можна порівнювати з подібними картками підозрюваних рослин для визначення того, чи мають останні загальне походження з рослиною щодо винаходу. Порівняння карт може включати гібридизацію, ПДРФ, ПЛР, SSR та секвенування, які всі є загальноприйнятими способами.

Способи трансформаціїBrassica: Розроблено безліч способів трансформації рослин, включа Plants" Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick and J. E. Thompson, Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993 p.p. 67-88. Крім того, для трансформації рослинних клітин або тканин і регенерації рослин доступні експресують вектори і способи культивуванняin vitro. См., наприклад, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick and J. E. Thompson, Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993 p.p. 89-119.

Опосередкована агробактерій трансформація: Один із способів введення экспрессирующего вектора в рослини заснований на природній системі трансформаціїAgrobacterium. См., наприклад, Horsch et al., Science 227:1229 (1985).A. tumefaciensіA. rhizogenesявляють собою патогенні для рослин грунтові бактерії, які генетично трансформують рослинні клітини. Плазміди Ti і RiA. tumefaciensіA. rhizogenes,відповідно, несуть гени, відповідальні за генетичну трансформацію рослин. См., наприклад, C. I. Kado, Crit. Rev. Plant Sci. 10:1 (1991). Опису векторних системAgrobacteriumі способів опосередкованогоAgrobacteriumперенесення генів, придатних для цілей цього винаходу, надані в Bhalla and Singh, Nature Protocols 3(2):181-9 (2008), Cardoza and Stewart, Methods Mol Товарbiol. 343:257-66 (2006), Gruber et al., вище, Miki et al., вище, and Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989). Також див. патент США № 5563055 (Townsend і Thomas), виданий 8 жовтня 1996 року.

Прямий перенос гено�сформации рослин, спільно позначаються як прямий перенос генів. Общеприменимий спосіб трансформації рослин являє собою опосередковану мікрочастинками трансформацію, де ДНК знаходиться на поверхні мікрочастинок з розмірами від 1 до 4 мкм. Экспрессирующий вектор вводять в тканини рослини допомогою биолистического пристрій, що прискорює мікрочастинки до швидкостей від 300 до 600 м/сек, яких достатньо для проходження через клітинні стінки і мембрани рослин. Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), J. C. Sanford, Trends Biotech. 6:299 (1988), Klein et al., Bio/Technology 6:559-563 (1988), J. C. Sanford, Physiol. Plant 7:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992). Також див. патент США № 5015580 (Christou, et al.), виданий 14 травня 1991 року; патент США № 5322783 (Tomes, et al.), виданий 21 червня 1994 року.

Іншим способом фізичної доставки ДНК у рослини є обробка клітин-мішеней ультразвуком. Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991). Альтернативно, для введення експресують векторів у рослини можна використовувати злиття ліпосом та сферопластов. Deshayes et al., EMBOJ. 4:2731 (1985), Christou et al., Proc Natl Acad. Sci. U. S. A. 84:3962 (1987). Також повідомлялося про прямому захоплення ДНК в протопласти з використанням осадження CaCl2, полівініловим спиртом або полі-L-орнитином. Hain et al., Mol Gen. Genet. 199:161 (1985) і Draper et al., Plant Cell Physiol 23:451 (1982). Також описана елект�90); D Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992), і Spencer et al., Plant Mol Товарbiol 24:51-61 (1994).

Після трансформації тканин-мішенейBrassicaекспресія описаних вище генів селективних маркерів дозволяє переважну селекцію трансформованих клітин, тканин і/або рослин з використанням способів регенерації і селекції, в даний час добре відомих в даній області.

Зазначені способи трансформації, як правило, можна використовувати для отримання трансгенного сорту. Потім трансгенний сорт можна схрещувати з іншим (нетрансформированним або трансформованим) сортом для отримання нового трансгенного сорту. Альтернативно генетичний ознака, введений в конкретну лініюBrassicaзазначеними вище способами трансформації, можна переносити в іншу лінію традиційними способами зворотного схрещування, які добре відомі в області селекції рослин. Наприклад, підхід зворотного схрещування можна використовувати для перенесення введеного ознаки загального, неэлитного сорту в елітний сорт або сорту, містить чужорідний ген у своєму геномі, сорт або сорти, які не містять цього гена. Як застосовують в цьому документі, в залежності від контексту "схрещування" може ставитися до простого снийB. junceaможна здійснювати шляхом самозапилення або за допомогою тканинної культури і регенерації. Тканинна культура різних тканинBrassicaі регенерація з неї рослин відомі. Наприклад, вирощування культиваруBrassicaза допомогою тканинної культури описано в будь-якому з наступного, але не обмежуючись нічим з наступного: Chuong et al., "A Simple Culture Method forBrassicaHypocotyl Protoplasts", Plant Cell Reports 4:4-6 (1985); T. L. Barsby et al., "A Rapid and Efficient Alternative Procedure for the Regeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts ofBrassica napus", Plant Cell Reports (Spring, 1996); K. Kartha et al., "In vitroPlant Formation from Stem Explants of Rape", Physiol. Plant, 31:217-220 (1974); S. Narasimhulu et al., "Species Specific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants ofBrassicas", Plant Cell Reports (Spring 1988); E. Swanson, "Microspore Culture inBrassica"Methods in Molecular Biology, Vol. 6, Розділ 17, p. 159 (1990).

Таким чином, у іншому аспекті даний винахід відноситься до клітин, які при зростанні і диференціювання дають рослиниBrassicaз фізіологічними і морфологічними характеристиками лінійB. junceaпо справжньому винаходу.

Як застосовують у цьому документі, термін "тканинна культура" означає склад, що містить виділені клітини одного або різних класів або групи таких клітин, організованих у частині рослини. Ілюстративними типами тканинних культур являюкультуру, інтактні рослини або частини рослин, таких як зародки, пилок, квіти, насіння, стручки, листя, стебла, корені, кореневі кінчики, пильовики, маточки і т. п. Способи отримання і підтримки тканинної культури рослини добре відомі в цій галузі. Як приклад, для отримання регенерованих рослин використовували тканинну культуру, що містить органи. Деякі способи описані в патентах США №№ 5959185, 5973234 і 5977445.

Даний винахід відноситься до способів одержання рослиниBrassicaза допомогою схрещування першого батьківської рослиниBrassicaз другим батьківською рослиноюBrassica, де перше або друге батьківська рослинаBrassicaявляє собою рослинаBrassica, яке містить щонайменше один мутантний генFAD(тобтоFAD2та/абоFAD3). Таким чином, будь-які такі способи з застосуванням лініїBrassica junceaпо справжньому винаходу являють собою частину цього винаходу: самозапилення, зворотні схрещування, отримання гібридів, схрещування з отриманням популяцій і т. п.

Гени чужорідних білків і агрономічні гени

З застосуванням трансгенних рослин по справжньому винаходу чужорідний білок можна отримувати в комерційних количестнной області, дають безліч трансгенних рослин, які збирають загальноприйнятим способом, а потім чужорідний білок можна виділяти із представляє інтерес тканини або із загальної біомаси. Виділення білка з біомаси рослин можна проводити відомими способами, які описані, наприклад, в Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981).

За кращого варіанту здійснення трансгенна рослина, що надається для комерційного отримання чужорідного білка, являє собою рослина каноли. В іншому варіанті здійснення представляє інтерес біомаса являє собою насіння. Для відносно невеликої кількості трансгенних рослин, що демонструють підвищені рівні експресії, можна отримувати генетичну карту, переважно за допомогою загальноприйнятих аналізів ПДРФ, ПЛР) та SSR, яка ідентифікує приблизне положення інтегрованої молекули ДНК в хромосомах. Для отримання інформації про ілюстративних способах у цьому відношенні див. Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993). Інформація з карти щодо становища в хромосомі придатна для патентного захисту трансгенної рослини по винаходу. Якщо робиться неправомірне виращив�вими картами підозрюваних рослин для визначення того, мають останні загальне походження з рослиною щодо винаходу. Порівняння карт може включати гібридизацію, ПДРФ, ПЛР, SSR та секвенування, які всі є загальноприйнятими способами.

Подібним чином, у трансформованих рослинах способами по справжньому винаходу можна експресувати агрономічні гени. Більш конкретно, рослини можна сконструювати генетично з експресією різних фенотипів, що представляють агрономічний інтерес. Ілюстративні гени, що відносяться до цього, включають в якості неограничивающих прикладів гени, згруповані нижче:

1. Гени, що надають стійкість до паразитів або захворювання і кодують:

A. Гени стійкості до захворювань рослин. Захист рослин часто активується специфічною взаємодією між продуктом гена стійкості до захворювань (R) в рослині і продуктом відповідного гена авирулентности (Avr) в патогене. Сорт рослини можна трансформувати клонованими генами стійкості з конструюванням рослини, яке стійке до конкретних штамів патогенів. См., наприклад Jones et al., Science 266:789 (1994) (клонування гена Cf-9 томата для стійкості доCladosporium fulvum); Martin et al., Science 262:1432 (1993) (ген Pto томата для устойчти доPseudomonas syringae).

B. Ген, що надає стійкість до шкідників, таких як нематода соєвих бобів. См. наприклад, заявки PCT WO 96/30517; заявки PCT WO 93/19181.

C. БілокBacillus thuringiensis, його похідний або моделюючий його синтетичний поліпептид. См., наприклад, Geiser et al., Gene 48:109 (1986), де описано клонування і нуклеотидна послідовність гена δ-ендотоксину Bt. Крім того, молекули ДНК, що кодують гени δ-ендотоксину, можна придбати в American Type Culture Collection, Manassas, Va., наприклад, під інвентарними номерами ATCC 40098, 67136, 31995 і 31998.

D. Лектин. Наприклад, див. опис Van Damme et al., Plant Molec. Товарbiol. 24:25 (1994), де описані нуклеотидні послідовності декількох генів зв'язують маннозу лектинівClivia miniata.

E. Зв'язує вітаміни білок, такий як авідін. См. заявки PCT US93/06487. У заявці описано застосування авидина і гомологів авидина як ларвицидов проти комах-шкідників.

F. Інгібітор ферменту, наприклад, інгібітор протеази або протеїнази або інгібітор амілази. См., наприклад, Abe et al., J. Товарbiol Chem. 262:16793 (1987) (нуклеотидна послідовність інгібітора цистеиновой протеїнази рису); Huub et al., Plant Molec. Товарbiol 21:985 (1993) (нуклеотидна послідовність кДНК, що кодує інгібітор протеїнази тютюну 1); Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 ( виданий 27 лютого 1996 року).

G. Специфічний для комахи гормон або феромон, такий як экдистероид або ювенільний гормон, їх варіант, миметик на їх основі або їх антагоніст або агоніст. См., наприклад, опис Hammock et al., Nature 344:458 (1990), бакуловирусной експресії клонованої естерази ювенільного гормону, инактиватора ювенільного гормону.

H. Специфічний для комах пептид або нейропептид, який при експресії порушує фізіологію піддається дії шкідника. Наприклад, див. опису Regan, J. Товарbiol Chem. 269:9 (1994) (экспрессионное клонування, дає ДНК, що кодує рецептор діуретичного гормону комах); Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989) (аллостатин, ідентифікований уDiploptera puntata). Також див. патент США № 5266317 Tomalski et al., в якому описані гени, що кодують специфічні для комах паралітичні нейротоксини.

I. Специфічний для комах отрута, що продукується в природі зміями, осами і т. д. Наприклад, див. Pang et al., Gene 116:165 (1992), де описана гетерологическая експресія в рослинах гена, що кодує инсектотоксичний пептид скорпіона.

J. Фермент, відповідальний за гипернакопление монотерпена, сесквітерпенів, стероїду, гидроксамовой кислоти, фенилпропаноидного похідного або інший небілкової молекули з инсектогически активної молекули; наприклад, гликолитический фермент, протеолітичний фермент, ліполітичний фермент, нуклеаза, ціклаза, трансаминаза, естераза, гідролаза, фосфатаза, кіназа, фосфорілаза, полімераза, еластаза, хитиназа і глюканаза, природні або синтетичні. См. заявки PCT WO 93/02197 на ім'я Scott et al., в якій описана нуклеотидна послідовність гена каллази. Молекули ДНК, які містять кодують хитиназу послідовності, можна отримати, наприклад, з ATCC під інвентарними №№ 39637 і 67152. Також див. Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Товарbiol. 23:691 (1993), в якій описана нуклеотидна послідовність кДНК, що кодує хитиназу бражника тютюну, і Kawalleck et al., Plant Molec. Товарbiol. 21:673 (1993), в якій описана нуклеотидна послідовність гена полиубиквитина ubi4-2 петрушки.

L. Молекула, стимулююча передачу сигналу. Наприклад, див. опис Botella et al., Plant Molec. Товарbiol. 24:757 (1994) нуклеотидних послідовностей клонів кДНК кальмодуліну золотистої квасолі; і Griess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994), де описана нуклеотидна послідовність кДНК клону кальмодуліну кукурудзи.

M. Пептид з гідрофобним моментом. См. заявки PCT WO 95/16776 (опис пептидних похідних тахиплезина, що інгібують грибкові патогенні організми рослин) і заявку PCT WO 95/18855 (описує синователь каналів або блокатор каналів. Наприклад, див. опис Jaynes et al., Plant Sci. 89:43 (1993) гетерологической експресії цекропина-β, литичеського пептидного аналога, що трансгенні рослини тютюну стійкими доPseudomonas solanacearum.

O. Вірусний інвазивний білок або отримується з нього комплексний токсин. Наприклад, накопичення білків вірусної оболонки в трансформованих рослинних клітинах надає стійкість до розвитку вірусної інфекції та/або вірусного захворювання, здійснюваного вірусом, з якого отримано білок вірусної оболонки, а також родинними вірусами. См. Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 (1990). Опосередковану білками оболонки стійкість надають трансформованим рослинам проти вірусу мозаїки люцерни, вірусу мозаїки огірка, вірусу смугастості тютюну, вірусу X картоплі, вірус Y картоплі, вірус гравіювання тютюну, вірусу плямистості тютюну і вірусу тютюнової мозаїки. Там же.

P. Специфічне для комах антитіло або отримується з нього иммунотоксин. Таким чином, антитіло, спрямоване на вирішальну метаболічну функцію травного каналу комахи, може інактивувати піддається впливу фермент, вбиваючи комахи. См. Taylor et al., Abstract #497, Seventh int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994) (ферител).

Q. Вирусоспецифичное антитіло. См., наприклад, Tavladoraki et al., Nature 366:469 (1993), де показано, що трансгенні рослини, що експресують рекомбінантні гени антитіл, захищені від ураження вірусами.

R. Затримує розвиток білок, що продукується в природі патогеном або паразитом. Таким чином, грибкові ендо-α-1,4-D-полигалактуронази полегшують грибкову колонізацію і вивільнення рослинних поживних речовин допомогою розчинення гомо-α-1,4-D-галактуронази клітинної стінки рослин. См. Lamb et al., Bio/Technology 10:1436 (1992). У Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992) описано клонування та характеристика гена, що кодує інгібуючий эндополигалактуроназу квасолі білок.

S. Затримує розвиток білок, що продукується в природі рослинами. Наприклад, Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992) показали, що трансгенні рослини, що експресують инактивирующий рибосому ячменю ген, володіють збільшеною стійкістю до грибкових захворювань.

2. Гени, що надають стійкість до гербіцидів:

A. Гербіцид, інгібуючий точку росту або меристему, такий як имидазолинон або сульфонилкарбамид. Ілюстративні гени в цій категорії кодують мутантні ферменти ALS і AHAS, як описано, наприклад, в Lee et al., EMBOJ. 7:1241 (1988) і Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1пирувилшикимат-3-фосфатсинтетазой (EPSP) (за допомогою введення рекомбінантних нуклеїнових кислот і/або різних форм мутагенезуin vivoприродних генів EPSP), гени aroA і гени глифосатацетилтрансферази (GAT), відповідно), гени стійкості до інших фосфоновим сполук, таких як глюфосинат (гени фосфинотрицинацетилтрансферази (PAT) з видівStreptomyces, включаючиStreptomyces hygroscopicusіStreptomyces viridichromoгени) і пиридинокси - або феноксипропионовая кислоти і циклогексани (гени, що кодують інгібітор ACC-ази). См., наприклад, патент США № 4940835 Shah et al. і патент США № 6248876 Barry et al., в яких описані нуклеотидні послідовності форм EPSP, які можуть надавати рослинам стійкість до глифосату. Молекулу ДНК, що кодує мутантний ген aroA, можна отримувати під інвентарним номером ATCC 39256, а нуклеотидна послідовність мутантного гена описана в патенті США № 4769061 Comai. В європейській патентній заявці № 0333033 Kumada et al. і в патенті США № 4975374 Goodman et al. описані нуклеотидні послідовності генів глутаминсинтетази, які надають стійкість до гербіцидів, таких як L-фосфинотрицин. В європейській заявці № 0242246 Leemans et al. надана нуклеотидна послідовність гена PAT. DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989) описують отримання трансгенних рослин, які експресують химерні гениbar, що кодують активність PAT. Приклади генів, які надають устойй гени Acc1-S1, Acc1-S2 і Acc1-S3, описані Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992). В WO 2005012515 Castle et al. описані гени GAT, здатні надавати стійкість до глифосату. В WO 2005107437 і патентній заявці США з серійним № 11/587893, обидві належать Dow AgroSciences LLC, описані гени, надають стійкість до гербіцидів 2,4-D, fop і пиридилоксиауксину.

C. Гербіцид, інгібуючий фотосинтез, такий як триазин (гени psbA і gs+) або бензонитрил (ген нитрилази). У Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991) описана трансформаціяChlamydomonasплазмідами, кодирующими мутантні гениpsbA. Нуклеотидні послідовності генів нитрилази описані в патенті США № 4810648 Stalker, а молекули ДНК, що містять ці гени, доступні під інвентарними номерами ATCC 53435, 67441 і 67442. В Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992) описані клонування та експресія ДНК, що кодує глутатіон-S-трансферазу.

3. Гени, що забезпечують або вносять внесок у властивість з поліпшеною характеристикою, такі як:

A. Метаболізм модифікованої жирної кислоти, наприклад, за допомогою трансформації рослини антисмисловим геном стеарил-ACP-десатурази, для збільшення вмісту стеаринової кислоти в рослинах. См. Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:2624 (1992).

B. Знижений вміст фитата 1) Введення коду фитазу гена може посилити разруше�27:87 (1993) для опису нуклеотидної послідовності гена фітазоюAspergillus niger. 2) Можна вводити ген, який знижує вміст фитата. Наприклад, для кукурудзи-це можна здійснювати, клонувати, а потім повторно вводячи ДНК, асоційовану з одним аллелем, відповідальним за мутантную кукурудзу, характеризується низькими рівнями фитиновой кислоти. См. Raboy et al., Maydica 35:383 (1990).

C. Модифікований вуглеводний склад, здійснюється, наприклад, за допомогою трансформації рослин геном, кодирующим фермент, змінює профіль розгалуження крохмалю. См. Shiroza et al., J. Bacteriol. 170:810 (1988) (нуклеотидна послідовність мутантного гена фруктозилтрансферазиStreptococcus), Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 20:220 (1985) (нуклеотидна послідовність гена левансахаразиBacillus subtilis), Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992) (одержання трансгенних рослин, які експресують α-амілазиBacillus lichenifonnis), Elliot et al., Plant Molec. Товарbiol. 21:515 (1993) (нуклеотидні послідовності генів інвертази томату), Sogaard et al., J. Товарbiol. Chem. 268:22480 (1993) (сайт-специфічний мутагенез гена α-амілази ячменю) і Fisher et al., Plant Physiol. 102:1045 (1993) (фермент розгалуження крохмалю ендосперму II кукурудзи).

Депозит Dow AgroSciences, Inc. патентованою лініїBrassica juncea________, описаної вище і наведеної в прикладеній формулі винаходу, зроблено в American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boul Inc., до дати подання цієї заявки. Всі обмеження на депозит усунені і мається на увазі, що депозит задовольняє всім вимогам 37 C. F. R. 1.801-1.809. Інвентарний номер ATCC являє собою PTA -_____. Депозит підтримується в депозитарії протягом періоду 30 років або 5 років після останнього запиту, або протягом терміну дії патенту, в залежності від того, що довше, і протягом цього періоду в разі необхідності буде замінюватися.

Хоча в цьому документі описано різні варіанти здійснення винаходу, обсяг винаходу можна включати безліч адаптацій та модифікацій в відповідності із загальним рівнем знань спеціалістів в даній області. Такі модифікації включають заміну відомими еквівалентами будь-якого аспекту винаходу з досягненням того ж результату по суті тим же способом. Числові діапазони включають числа, що визначають діапазон. Винахід включає всі варіанти здійснення та варіації, по суті, як описано раніше в цьому документі та з посиланням на приклади і фігури.

1. Трансгенна рослина Brassica juncea, ендогенне вміст жирних кислот насіння якого містить приблизно від 70% до 78% олеїнової кислоти за масою і від приблизно 2% до 3% ліноленової кислоти за масою, аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO:5-7.

2. Трансгенна рослина Brassica juncea за п. 1, ендогенне вміст жирних кислот насіння якого містить приблизно від 70,0% до 77,8% олеїнової кислоти за масою.

3. Трансгенного насіння рослини Brassica juncea за п. 1, що містить fad2 або fad3 алель, що кодує мутантний білок дельта-12-десатураз жирних кислот, має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO:5-7, де насіння має ендогенне вміст жирних кислот, що включає приблизно від 70% до 78% олеїнової кислоти за масою і від приблизно 2% до 3% ліноленової кислоти за масою.

4. Насіння по п. 3 з усіма виділеними маслами, вміст олеїнової кислоти яких становить від 70,0% до 77,8% по масі.

5. Насіння по п. 3 з усіма виділеними маслами, вміст ліноленової кислоти яких становить приблизно від 2% до 3% за масою.

6. Олія насіння Brassica juncea за п. 3, вміст жирних кислот якого включає приблизно 70,0% до 78% олеїнової кислоти за масою і від приблизно 2% до 3% ліноленової кислоти за масою, в іншому має властивості олії насіння Brassica juncea.

7. Олія по п. 6, що має вміст олеїнової кислоти від 70,0% до 77,8% по масі.



 

Схожі патенти:

Стійкі до гербіцидів рослини соняшнику

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу боротьби з бур'янами поблизу від рослини соняшнику. При цьому спосіб включає нанесення на бур'яни і рослина соняшника ефективного кількості будь-якого з гербіцидів, вибраних з групи, що складається з гербіциду імідазолінона, гербіциду сульфонілсечовини, гербіциду триазолопиримидина, гербіциду пиримидинилоксибензоата і їх сумішей. Зазначене рослина соняшника містить у своєму геномі принаймні одну копію принаймні гена синтази ацетогидроксикислоти (AHAS), що кодує стійкий до гербіциду білок, що має аминокислотную послідовність, представлену SEQ ID NO:2. Винахід дозволяє ефективно боротися з бур'янами поблизу від рослини соняшнику. 8 з.п. ф-ли, 13 іл., 14 табл.

Иммуногенний епітоп вірусу грипу

Винахід відноситься до галузі біотехнології і вірусології. Запропоновано спосіб отримання вирусоподобних частинок вірусу грипу (ВПЛ) в рослині або його частини. Спосіб включає експресію нового білка НА вірусу грипу в рослинах та його очищення. Винахід також спрямовано на ВПЛ, що включають НА білок вірусу грипу і рослинні ліпіди. Винахід відноситься до нуклеїнової кислоти, кодує вдосконалений НА вірус грипу, а також до векторів. Такі ВПЛ можуть бути використані при розробці вакцин проти грипу або для збагачення вже існуючих вакцин. Запропонована група винаходів може бути використана в медицині. 6 н. і 12 з.п. Ф-ли, 44 іл., 1 пр.

Системи експресії білка

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до конструкції для експресії генів, що містить: (a) послідовність енхансера експресії, отриману з сегменту геному RNA-2 двокомпонентного РНК-вірусу родини Comoviridae, b) полилинкер для полегшення вбудовування гена в систему для експресії генів. Розкрито вектор для експресії генів, що містить зазначену конструкцію і гетерологичний ген. Також описаний вектор для експресії генів, що містить: (a) послідовність енхансера експресії, отриману з сегменту геному RNA-2 двокомпонентного РНК-вірусу родини Comoviridae, (b) гетерологичний ген, який кодує представляє інтерес білок, а також спосіб експресії представляє інтерес білка з його використанням. Розкрито спосіб підвищення активності посилення трансляції представляє інтерес гетерологічного білка з гетерологічного гена, що кодує зазначений білок, спосіб посилення трансляції представляє інтерес гетерологічного білка з гетерологічного гена або гетерологичной відкритої рамки зчитування, кодує зазначений білок. Також описаний організм-господар, трансформований вищевказаним вектором, а також спосіб отримання представляє інтерес білка, включтавляющего інтерес гетерологічного білка з гетерологічного гена. 8 н. і 18 з.п. ф-ли, 15 іл., 4 табл., 6 пр.

Інсектицидні білки

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до сконструйованому гібридному инсектицидному білку, що володіє активністю проти європейського кукурудзяного метелика, а також до виділеної молекули нуклеїнової кислоти, його кодує. Розкрито экспрессионная касета, рекомбінантний вектор, насіння рослина, що містять зазначену виділену молекулу нуклеїнової кислоти, а також клітина-господар і рослина, що містять зазначену експресійної касету. Винахід відноситься до використання зазначеного гібридного білка в інсектицидної композиції і способі боротьби з європейським кукурудзяним метеликом, а також способу його одержання. Також розкрито спосіб виробництва трансгенної рослини, стійкого до європейського кукурудзяному до метелика, з використанням вищевказаної гібридного білка. Винахід дозволяє отримувати рослини, стійкі до європейського кукурудзяному до метелика. 20 н. і 19 з.п. ф-ли, 8 іл., 9 табл., 45 пр.

Метаболизирующий гербіцид білок, його ген та їх застосування

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу знищення бур'янів, що передбачає стадію нанесення гербіциду РРО-пригнічувальної типу на культивовану частина рослини, де зазначене рослина володіє стійкістю до зазначеного гербіциду та экспрессирует білок зі здатністю перетворювати вищевказаний гербіцид в гербіцид з більш низькою гербіцидної активністю. Розкрито спосіб оцінки резистентності клітини рослини або рослини до гербіциду РРО-пригнічувальної типу, що включає приведення в контакт гербіциду РРО-пригнічувальної типу з кліткою рослини або рослиною, в які введена і експресується ДНК, що кодує білок, здатний перетворювати вищевказаний гербіцид в гербіцид з більш низькою гербіцидної активністю, а також спосіб відбору клітини рослини або рослини, стійкі до гербіциду РРО-пригнічувальної типу, що передбачає стадію відбору клітини рослини або рослини на основі вищевказаного способу оцінки стійкості. Також розкрито клітина рослини, рослина, культура клітин рослини, стійкі до гербіциду РРО-пригнічувальної типу, а також спосіб обробки гербіциду РРО-пригнічувальної типу і застосування білка або ДНК, що кодує зазначений білок для � з більш низькою гербіцидної активністю. Винахід дозволяє селективно знищувати лише бур'яни на культивованої частини рослини. 8 н. і 2 з.п. ф-ли, 66 іл., 35 табл., 75 пр.

Нова мутація, залучена в підвищену толерантність рослин до гербіцидів имидазолиноновим

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до рослини, що володіє підвищеною стійкістю до AHAS-інгібуючої гербіциду, що включає, принаймні, одну Shiloh-8 IMI нуклеїнову кислоту, його частини, рослинній клітині і насіння. Описана нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид, що забезпечує збільшення гербіцидної стійкості рослини. Розкрито экспрессионная касета і рослинний вектор трансформації, що включають зазначену нуклеїнову кислоту. Описані способи контролю бур'янів, які ростуть поблизу рослини, що володіє підвищеною стійкістю до AHAS-інгібуючої гербіциду. Розкрито спосіб отримання рослини, що має підвищену стійкість до AHAS-інгібуючої гербіциду, а також спосіб підвищення активності AHAS в рослині. Описаний спосіб відбору клітини, трансформованої вектором, що містить IMI нуклеїнову кислоту. Також розкрито спосіб підвищення стійкості до AHAS-інгібуючої гербіциду, а також спосіб боротьби з небажаною рослинністю, що включає обробку AHAS-інгібуючим гербіцидом. Винахід дозволяє отримати рослина, стійка до AHAS-інгібуючої гербіциду, що дозволяє ефективно боротися з бур'янами, які ростуть поблизу від н�
(57) Винахід відноситься до галузі біотехнології і генної інженерії. Листові експланти, вичлененние з тридцятиденних асептичних рослин вихідних сортів, вирощених в судинах 1 л, поміщають в чашки Петрі з рідким середовищем певного складу і прединкубируют, кокультивируют і культивують на поживних середовищах певного складу. При появі регенерантів розміром не менше 10 мм, їх зрізають і переносять на середовище певного складу. Проводять перший етап добору форм, стійких до збудників фітофторозу та альтернаріозу, шляхом культивування зрізаних регенерантів на середовищі МС з 50 мл/л канаміцину сульфату протягом 30-45 днів при 22-25°C і освітленості 6000-10000 лк при 16-годинному фотопериоде з подальшим відбором укорінених регенерантів картоплі з зеленим листям і стеблами. Проводять другий етап добору форм, стійких до возбудитялям фітофторозу і альтернаріозу, що включає перевірку укорінених рослин методом ПЛР на наявність цільової ДНК і розмноження регенерантів з підтвердженою ПЛР вставкою цільової ДНК микрочеренкованием. Використання заявленого способу дозволяє отримати стійкі до збудників фітофторозу та альтернаріозу форми картоплі. 5 табл.

Рослини із зміненим зростанням і/чи розвитком і спосіб їх створення

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу збільшення біомаси або поліпшення проліферації клітин, розвитку аркуша та/або репродуктивного розвитку рослини, що містить збільшення в рослині експресії нуклеїнової кислоти, кодує Убіквітин-Специфічну Протеазу, а також до рослини, частини рослини і насіння рослини, біомаса яких збільшена або проліферація клітин, розвиток листків та/або репродуктивне розвиток яких поліпшені вказаним способом. Описані вектор для застосування в способі отримання рослин з збільшеною біомасою або покращеної проліферацією клітин, розвитком листків і/або репродуктивним розвитком, а також рослина та частина рослини, трансформовані зазначеним вектором. Розкрито застосування нуклеїнової кислоти, кодує Убіквітин-Специфічну Протеазу. Також розкрито спосіб отримання трансгенної рослини із збільшеною біомасою або поліпшеними проліферацією клітин, розвитком листків і/або репродуктивним розвитком, а також трансгенна рослина із збільшеною біомасою або поліпшеними проліферацією клітин, розвитком листків і/або репродуктивним розвитком порівняно з контрольними рослинами, отримане в результаті збільшеної ек�про отримувати рослина, біомаса якого збільшена або проліферація клітин, розвиток листків та/або репродуктивне розвиток якого покращені. 11 н. і 6 з.п. ф-ли, 11 іл., 3 табл., 28 пр.

Трансгенні рослини

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до генетичної конструкції для експресії нечутливою до треонину аспартаткинази в рослині, де конструкція містить специфічний для фази старіння промотор, функціонально пов'язаний з кодує послідовність, яка кодує поліпептид, що володіє активністю нечутливою до треонину аспартаткинази, і в якій специфічний до старіння промотор обраний із групи, що складається з SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 і SAG18, або їх функціональних варіантів, або фрагментів. Розкрито вектор, рослинна клітина, трансгенна рослина, матеріал для розмноження рослини, зібраний лист, курильний тютюн, містять вищевказану генетичну конструкцію. Також розкрито спосіб отримання трансгенної рослини, яке має здатність накопичувати треонін в в'янучих листках у більшій кількості, ніж у листках відповідного рослини дикого типу, і спосіб підвищення рівня треоніна в листі старіючого рослини до рівнів треоніна, що перевищують вміст треоніна у листках рослини дикого типу без погіршення пристосованості рослини з використанням вищевказаної генетичної конструкції. Винахід дозволяє отримувати т�даль, ніж у листках рослини дикого типу. 9 н. і 13 з.п. ф-ли, 16 іл., 2 табл., 4 пр.

Гени і способи забезпечення стійкості до фітофторозу пасльонових

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до генами стійкості Rpi для підвищення стійкості до фітофторозу пасльонових рослин сімейства пасльонових, а також до білків, здатним опосередкувати відповідь проти Р.infestans. Розкрито трансгенні рослини сімейства пасльонових, що володіють підвищеною стійкістю до фітофторозу пасльонових, що містять вищевказані гени, а також спосіб отримання таких рослин. Описані вектори для експресії білка, що містять вищевказані гени. Також розкрито способи забезпечення тривалої стійкості до захворювання у картоплі з використанням вищевказаних генів. Використання винаходу дозволяє отримати рослини сімейства пасльонових, що володіють підвищеною стійкістю до фітофторозу пасльонових порівняно з рослиною сімейства пасльонових дикого типу. 9 н. і 6 з.п. ф-ли, 12 іл., 6 табл., 7 пр.

Спосіб прискорення отримання нерасщепляющихся гібридних популяцій льону олійного із зниженою реакцією на довжину дня

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу прискорення отримання нерасщепляющихся гібридних популяцій льону олійного із зниженою реакцією на довжину дня. Зазначений спосіб включає підбір батьківських пар сортів, посів насіння у ранньовесняні оптимальні терміни, гібридизацію, відбір гібридних рослин по селектируемим ознаками, збирання врожаю і використання його для отримання наступного покоління, пересівши гібридної популяції до одержання насіння. Заявлений спосіб дозволяє прискорити процес розщеплення і досягнення високої гомозиготності гібридних популяцій льону олійного шляхом отримання двох гібридних поколінь протягом одного року в польових умовах і добору селекційних еліт в гібридній популяції F4. 4 з.п. ф-ли, 3 табл., 5 іл.

Спосіб оздоровлення від вірусів рослин малини, вирощуваних in vitro

Винахід відноситься до галузі сільського господарства і селекції, зокрема до оздоровлення від вірусів рослин малини, вирощуваних in vitro. Спосіб включає заготівлю експлантів вегетативних частин рослин, висаджування їх на поживне середовище і шестикратну обробку періодичною послідовністю різноспрямованих імпульсів магнітної індукції. При цьому обробку експлантів проводять через кожні 48 годин імпульсами з часом наростання 0,25 мс та експоненціальним спадом протягом 3 мс в напрямку, перпендикулярному осі експлантів, при безперервному лінійному наростання частоти імпульсів в діапазоні від 3,2 до 51,2 Гц і квазилинейном зміні амплітудних значень імпульсів від 15 до 5 мТл. Далі обробку проводять імпульсами з безперервним лінійним спадом частоти в діапазоні від 51,2 до 3,2 Гц і зміні амплітудних значень імпульсів від 15 до 5 мТл протягом 8 хвилин для кожного частотного діапазону відповідно. Спосіб дозволяє підвищити ефективність оздоровлення від вірусів рослин малини, вирощуваних in vitro. 2 табл., 2 пр.

Спосіб відбору сокопродуктивних дерев клена траутветтера (acer trautvetteri medw.)

Винахід відноситься до сільського господарства і харчової промисловості, а також може знайти застосування для виготовлення лікарських, ветеринарних та косметичних препаратів. Винахід являє собою спосіб відбору сокопродуктивних дерев клена Траутветтера (Acer trautvetteri Medw.), включає відбір за віком і широті крони, де дерева з високою сокопродуктивностью виділяють з поодиноко ростуть в діапазоні висот над рівнем моря 1100-1800 м в першій половині дня, причому подсочку здійснюють кожні 2 години на 15-20 модельних деревах, а інтенсивність соковиделения визначають за кількістю соку в межах 120 мл/годину і більше. Винахід дозволяє підвищити ефективність відбору сокопродуктивних дерев клена Траутветтера. 1 табл., 1 пр.

Спосіб прогнозування вилягання стеблових культур в умовах лісостепу центрального чорнозем'я

Винахід відноситься до галузі сільського господарства, зокрема рослинництва. Спосіб включає відбір апробаційної снопа рослин та визначення у них ознак міцності головного стебла. Апробационний сніп відбирають у фазу появи репродуктивних органів у рослин. В якості ознак міцності головного стебла вимірюють максимальний di max і мінімальний di min розміри в горизонтальній площині другого знизу кожного вузла i стебла. За значенням величини λ, яка визначається виразом: λ = ∑ i = 1 n d i min ∑ i = 1 n d i max , де n - число стебел в апробационном снопі, прогнозують: при λ менше 1,1 - вилягання немає, при λ=1,1÷1,7 - слабке вилягання, при λ=1,7÷2,2 - середнє вилягання, при λ=2,2÷3,0 - сильне вилягання, при λ більш 3,0 - дуже сильне вилягання. Спосіб дозволяє знизити трудомісткість та підвищити достовірність прогнозу вилягання сільськогосподарських культур в польових умовах в ранні фази розвитку рослин. 3 табл., 1 пр.
Винахід відноситься до сільського господарства. В якості вихідного матеріалу, що містить полиэмбриональние насіння, використовують самофертильние популяції. Збільшують концентрацію полиэмбриональних насіння у популяції двох і більше кратним відбором, а після їх пророщування і поділу близнецових проростків рослини дорощують до фази кущіння, відбирають з розвиненою кореневою системою і подвоюють набір хромосом колхіцінірованіем. Винахід дозволяє збільшити продуктивність і продуктивність при зниженні трудомісткості отримання гомозиготних ліній на основі гаплоидов, що виникають у рослин при полиэмбрионии. 1 табл.

Спосіб визначення схожості насіння льону-довгунця з урахуванням оцінки ступеня розвитку проростків

Винахід відноситься до галузі сільського господарства. Винахід являє собою спосіб визначення схожості насіння льону-довгунця з урахуванням оцінки ступеня розвитку проростків, що включає відбір проб насіння, виділення насіння з наважок при визначенні чистоти, відлік чотирьох проб по 50 насінин в кожній, пророщування насіння між смугами фільтрувального паперу, згорнуті в рулон в термостаті при температурі 20°С протягом 5 діб, де пророщування насіння проводять при ширині покривної смуги фільтрувального паперу 2 див. Винахід дозволяє скоротити час проведення аналізу насіння на двоє діб та знизити витрату матеріалів на 27%. 2 іл., 1 табл.
Винахід відноситься до галузі фітопатології, сільського господарства та екології. Спосіб включає передпосівну обробку насіння пшениці м'якої диспергованої суспензією. При цьому суспензія містить наночастинки заліза діаметром 80±5 нм. Причому в перший день обробки проводиться одноразовий полив насіння пшениці 5 мл суспензії наночастинок заліза в концентраціях 0,5·10-3-1·10-6 мг/л і полив дистильованою водою в наступні 14 днів. Спосіб дозволяє підвищити стійкість пшениці м'якої до хлорозу за рахунок підвищення вмісту фотосинтетичних пігментів. 1 табл.

Спосіб вирощування ячменю

Винахід відноситься до біотехнології. Винахід являє собою спосіб вирощування ячменю із застосуванням обробки захисно-стимулюючою комплексом, де насіння ячменю замочують водним розчином комплексу біологічно активних речовин кормової добавки Флоравит® з концентрацією 1*10-4 мг/мл і витраті 10 л/т насіння і рослин ячменю у фазу кущіння обприскують водним розчином комплексу біологічно активних речовин кормової добавки Флоравит® з концентрацією 1*10-4 мг/мл і витраті розчину 200-250 л/га. Винахід дозволяє підвищити врожайність та якісні показники ячменю. 1 іл., 4 табл.

Спосіб визначення продуктивності фотосинтетичного потенціалу сортів сої

Винахід відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до фізіології сільськогосподарських рослин і селекції. Спосіб включає відбір проб, визначення площі листя, біометричних показників шляхом визначення кількості та маси окремих органів рослин за фазами росту та розвитку, облік накопичення вегетативної маси всього рослини та насіння за період розвитку, фотосинтетичного потенціалу. Показник продуктивності фотосинтетичного потенціалу розраховують за виразом П Ф П = Б П Ф П , де БП - біологічна урожайність насіння з 1 га; ФП - фотосинтетичний потенціал, сформований за весь період вегетації на 1 га посіву. Спосіб дозволяє визначати величину накопичення органічної речовини у вегетативних і репродуктивних органах на одиницю фотосинтетичного потенціалу. 1 іл., 1 табл., 1 пр.
Винахід відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до селекції. Винахід являє собою спосіб підвищення коефіцієнта розмноження капусти білоголової в умовах in vitro, включає вирощування експлантів, культирование їх на живильному середовищі Мурасіге-Скуга, внесення регуляторів росту тидиазурон в концентрації 1 мг/л у поєднанні з індол-3-оцтової кислотою - 0,5 мг/л, при використанні цветолож розміром 0,2-0,3 мм, ізольованих з бутонів довжиною 0,5-0,7 мм, де квітколоже використовують за 1-2 дні до розпускання квіток і після вирощування їх на поживних середовищах культивують до утворення нирок протягом 14-21 діб. Спосіб дозволяє отримати велику кількість рослин-регенерантів з ознаками ЦМС і отримати генетично стабільний урожай селекційних зразків. 3 табл.
Up!