Адъювантний менінгококовий білок, що зв'язує фактор н

 

По цій заявці заявляється пріоритет попередньої заявки США 61/162999 (поданій 24 березня 2009 р.), повне утримання якої, таким чином, наводиться в цьому документі в якості посилання.

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД

Даний винахід відноситься до області менінгококові вакцини, зокрема вакцин, що містять антиген fHBP.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Neisseria meningitidis(менінгокок) являє собою грамположительную сферичну бактерію. Існуючі в даний час менингококковие вакцини при цьому засновані на капсульних сахаридах. До них відносяться моновалентні конъюгатние вакцини проти серогрупи С і 4-валентні конъюгатние суміші проти серогруп А, С, W135 і Y. В даний час не існує використовуваної вакцини, ліцензованої для широкого застосування проти серогрупи («MenB»).

Один з антигенів, який був запропонований для застосування в імунізації проти MenB, являє собою білок, що зв'язує фактор Н (fHBP). Цей антиген також був названий білком «741» (SEQ ID 2535 і 2536 в посиланні 34), «NMB1870», «GNA1870» [посилання 1-3], «Р2086», «LP2086» або «ORF2086» [4-6]. Білок був добре вивчений. У природі він являє собою ліпопротеїн і експресується в усіх менінгококів�Ця частина білка утворює восьмицепочечную β-конформацію, ланцюги якої з'єднуються петлями змінної довжини. Конформації передує коротка α-спіраль і гнучкий N-термінальний хвіст.

Антиген fHBP представлений в трьох різних варіантах [8], і, як було виявлено, сироватка, отримана проти одного з даних сімейств, є бактерицидної для цього самого сімейства, але не активний проти штамів, які експресують одне з двох інших родин, т. е. існує перехресний імунітет всередині сімейства, але немає перехресного імунітету між родинами. Тому в посиланні 8 пропонується об'єднати різні варіанти fHBP в одну вакцинную композицію, таким чином підвищуючи охоплення штамів, або у вигляді суміші окремих білків, або у вигляді злитого білка з різних варіантів (останні є «тандемними білками»).

У засланні 9 також повідомляється про тандемному білку fHBP (сторінки 18-19 посилання 9). Цей тандемний білок очищали і змішували з фосфатом алюмінію в якості ад'юванта, але повідомляється, що він не адсорбується на адъюванте задовільно. Бажана успішна адсорбція антигенів, і було виявлено, що такі змішані білки fHBP без праці адсорбуються при використанні в якості ад'юванта гідроксиду алюмінію.

При використанні гідр�е антигени. Наприклад, у засланні 10 повідомляється, що він може гідролізувати конъюгатние вакцини протиH. influenzaeтипу навіть при низьких температурах, що призводить до зниженої ефективності. Аналогічно, у засланні 11 повідомляється про гідролізі капсульного сахаридів Vi бактеріїS. typhiпри наявності гідроксиду алюмінію. Тому може бути бажаним змішувати антигени, використовуючи ад'ювант на основі фосфату алюмінію, особливо якщо ад'ювантна вакцина може бути змішана (або в процесі виробництва, або під час застосування) з антигеном, який може бути сприйнятливим до пошкодження гідроксидом алюмінію, наприклад, конъюгированним бактеріальним капсульної сахаридом.

Таким чином, бажано створити препаративні форми білка fHBP і, зокрема, великої кількості варіантів fHBP, в яких fHBP адсорбує(ють)ся на адъюванте, але яким не потрібно гідроксид алюмінію.

ОПИС ВИНАХОДУ

Автори винаходу встановили основні техніки досягнення ефективної адсорбції білків fHBP на адъювантах гидроксифосфатах алюмінію. Застосування гидроксифосфата алюмінію може позбавити від необхідності використовувати гідроксид алюмінію, і техніки, запропоновані авторами винаходу, дозволяють уникнути неефективної�які включають велике число варіантів fHBP.

У першому аспекті винаходу адсорбція fHBP відбувається при величині рН, яка дорівнює або нижче точки нульового заряду (PZC) гидроксифосфата алюмінію. Для даного ад'юванта гидроксифосфата алюмінію, тому, водне середовище (наприклад,, буфер) вибиралася б з величиною рН, що дорівнює або нижче PZC ад'юванта. Навпаки, для даної величини рН гидроксифосфат алюмінію вибирався б з тієї самої або більшої PZC. Цей вибір величини рН і PZC може створити імуногенні композиції, в яких fHBP стійко адсорбується на гидроксифосфате алюмінію.

У другому аспекті fHBP і ад'ювант гидроксифосфат алюмінію вибирають так, щоб fHBP мав изоэлектрическую точку (pI) в діапазоні від 5,0 до 7,0 (включно), і PZC ад'юванта вибирають в тому ж діапазоні. При досягненні такого близького збігу характеристик антигену і ад'юванта можливе отримання стійко адсорбованих композицій, навіть якщо величина рН адсорбції вище PZC ад'юванта. Стійкої адсорбції сприяє наявність буфера, який може підтримувати величину рН також в діапазоні від 5,0 до 7,0.

У третьому аспекті, якщо fHBP має изоэлектрическую точку вище PZC ад'юванта гидроксифосфата алюмінію, то буфер додають до доведення величини рН до діапазону в 1,2 одиниці ого антигену fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де адсорбція відбувається при величині рН, яка дорівнює або нижче точки нульового заряду гидроксифосфата алюмінію. Адсорбований антиген fHBP може бути використаний в якості иммуногена. Адсорбція може бути здійснена великим числом способів. Змішування антигену fHBP, гидроксифосфата алюмінію і буфера може здійснюватися в будь-якому відповідному порядку, або об'єднуючи всі три компоненти, взяті окремо або попередньо змішуючи два компоненти і потім змішуючи попередню суміш з третім компонентом.

Винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP і ад'ювант гидроксифосфат алюмінію, де ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду, яка вище, ніж величина рН иммуногенной композиції.

Щодо другого аспекту винахід відноситься до способу адсорбирования менінгококового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) менінгококовий антиген fHBP має изоэлектрическую точку між 5,0 і 7,0, (ii) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,0 і 7,0, і (iii) адсорбція антигенів fHBP відбувається при величині рН між 5,0 і 7,0.

Винахід відноситься до иммуногенной компоменингококковий антиген fHBP має изоэлектрическую точку між 5,0 і 7,0, (ii) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,0 і 7,0. Композиція зазвичай включає буфер для підтримки величини рН в діапазоні від 5,0 до 7,0.

З третього аспекту винахід відноситься до способу адсорбирования менінгококового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) менінгококовий антиген fHBP має изоэлектрическую точку, яка вище, ніж точка нульового заряду ад'юванта, і (ii) адсорбція відбувається при величині рН, яка знаходиться в межах 1,2 одиниць рН від точки нульового заряду ад'юванта. Величина рН у процесі адсорбції переважно досягається включенням буфера, який підтримує величину рН в межах 1,2 одиниць рН від точки нульового заряду ад'юванта.

Винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP, адсорбованих на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) менінгококовий антиген fHBP має изоэлектрическую точку, яка вище, ніж точка нульового заряду ад'юванта, і (ii) композиція має величину рН, яка знаходиться в межах 1,2 одиниць рН від точки нульового заряду ад'юванта. Композиція може включати буфера, який підтримує величину рН в межах 1,2 одиниць рН від PZC адъюво варіанти fHBP. Як зазначено вище, раніше повідомлялося, що такі композиції не адсорбуються задовільно адъювантах на основі алюмінію з фосфатними групами.

Таким чином, винахід відноситься до способу адсорбирования двох різних менінгококових антигенів fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де адсорбція обох антигенів fHBP відбувається при величині рН, яка дорівнює або нижче точки нульового заряду гидроксифосфата алюмінію. Адсорбовані антигени fHBP можуть бути використані для імунізації проти менінгококової інфекції широкого спектру. Змішування антигенів fHBP і гидроксифосфата алюмінію (і буфера) може відбуватися в будь-якому відповідному порядку.

Винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить два різних менінгококових антигену fHBP, обидва з яких адсорбуються на адъюванте гидроксифосфате алюмінію. Композиція зазвичай включає буфер для контролювання величини рН в процесі та/або після адсорбції.

Винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить два різних менінгококових антигену fHBP і ад'ювант гидроксифосфат алюмінію, де ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду, яка вище, ніж величина рН їм�ових антигенів fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрическую точку між 5,0 і 7,0, (ii) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,0 і 7,0, і (iii) адсорбція обох антигенів fHBP відбувається при величині рН між 5,0 і 7,0. Адсорбція може відбуватися при наявності буфера.

Винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить два різних менінгококових антигену fHBP, обидва адсорбуються на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрическую точку між 5,0 і 7,0, (ii) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,0 і 7,0. Композиція зазвичай включає буфер для підтримки величини рН в діапазоні між 5,0 і 7,0.

Винахід відноситься до способу адсорбирования двох різних менінгококових антигенів fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрические точки, які вище, ніж точка нульового заряду ад'юванта, і (ii) адсорбція кожного антигену відбувається при величині рН, яка знаходиться в межах 1,2 одиниць рН від точки нульового заряду ад'юванта. Величина рН у процесі адсорбції переважно досягається включенням буфера, який підтри�я до иммуногенной композиції, містить два різних менінгококових антигену fHBP, обидва вони адсорбовані на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) кожен менінгококовий антиген fHBP має изоэлектрическую точку, яка вище, ніж точка нульового заряду ад'юванта, і (ii) композиція має величину рН, яка знаходиться в межах 1,2 одиниць рН від точки нульового заряду ад'юванта.

Винахід відноситься до иммуногенной композиції, отриманої будь-яким із зазначених вище способів.

У композиціях з винаходу кожен антиген fHBP переважно адсорбується, щонайменше, на 85%, як більш докладно описано нижче.

Білок(кі), що зв'язує(е) фактор Н

Композиції з винаходу включають щонайменше один менінгококовий білок, що зв'язує фактор Н (fHBP). При включенні в композицію двох різних fHBP вони переважно являють собою різні варіанти, як описано в посиланні 8. Різні fHBP будуть створювати відрізняються імунні відповіді, які не є повністю перехресно реактивними і які забезпечують більш широкий спектр покриття штамів щодо менінгококів.

При вмісті в композиції одного варіанта fHBP вона може включати один з наступних пунктів:

(а) перший співати містить аминокислотную послідовність, (i) має ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 1, щонайменше,а%та/або (ii) що складається з фрагмента, щонайменше,хпослідовних амінокислот з SEQ ID NO: 1;

(b) другий поліпептид, що містить другу аминокислотную послідовність, де друга амінокислотна послідовність містить аминокислотную послідовність, (i) має ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 2, щонайменше,b%та/або (ii) що складається з фрагмента, щонайменше,yпослідовних амінокислот з SEQ ID NO: 2;

(с) третій поліпептид, що містить третю аминокислотную послідовність, де третя амінокислотна послідовність містить аминокислотную послідовність, (i) має ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 3, щонайменше,з%та/або (ii) що складається з фрагмента, щонайменше,zпослідовних амінокислот з SEQ ID NO: 3.

При вмісті в композиції двох різних менінгококових антигенів fHBP вона може включати комбінацію: (i) першого і другого поліпептидів, визначених вище; (ii) першого і третього поліпептидів, визначених вище; або (iii) другого і третього поліпептидів, визначених вище. Переважно поєднання першого і третього поліпептиду. Пр�між 5,0 і 7,0 і, зокрема, якщо вони обидва мають pI в діапазоні від 5,0 до 6,0 або в діапазоні від 5,2 до 6,2.

При вмісті в композиції двох різних менінгококових антигенів fHBP, незважаючи на те, що деякі послідовності у них можуть бути однаковими, перший, другий і третій поліпептиди мають різні амінокислотні послідовності fHBP.

Поліпептид, що містить першу аминокислотную послідовність, при введенні індивідууму повинен викликати антитільний відповідь, що містить антитіла, які зв'язуються з менінгококовим білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 20 (MC58). В деяких варіантах здійснення деякі або всі ці антитіла не зв'язуються з менінгококовим білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 21, або на менінгококовий білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 22.

Поліпептид, що містить другу аминокислотную послідовність, при введенні індивідууму повинен викликати антитільний відповідь, що містить антитіла, які зв'язуються з менінгококовим білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 21 (2996). В деяких варіантах прова�ю аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 20, або менінгококовим білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 22.

Поліпептид, що містить третю аминокислотную послідовність, при введенні індивідууму повинен викликати антитільний відповідь, що містить антитіла, які зв'язуються з менінгококовим білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 22 (M1239). В деяких варіантах здійснення деякі або всі ці антитіла не зв'язуються з менінгококовим білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 20, або менінгококовим білком дикого типу, які мають зростаючу аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 21.

В деяких варіантах здійснення фрагмент, щонайменше, зхпослідовних амінокислот SEQ ID NO: 1 не присутнє при цьому в SEQ ID NO: 2 або в SEQ ID NO: 3. Аналогічно, фрагмент, щонайменше, зyпослідовних амінокислот SEQ ID NO: 2 може при цьому не бути присутнім у SEQ ID NO: 1 або в SEQ ID NO: 3. Аналогічно, фрагмент, щонайменше, зzпослідовних амінокислот SEQ ID NO: 3 може при цьому не бути присутнім у SEQ ID NO: 1 або в SEQ ID NO: 2. В деяких варіантах здійснення при вирівнюванні зазначеного фрагменту однієї з SEQ ID NO: 1-3 �з двох інших SEQ ID NO становить менше, ніж 75%, наприклад, менше, ніж 70%, менше, ніж 65%, менше, ніж 60% і т. д.

Величинааскладає, щонайменше, 80, наприклад, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або більше. Величинаbскладає, щонайменше, 80, наприклад, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або більше. Величинаcскладає, щонайменше, 80, наприклад, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або більше. Величиниа, bіможуть бути однаковими або різними. В деяких варіантах здійсненняа, bіідентичні.

Величинахскладає, щонайменше, 7, наприклад, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величинаyскладає, щонайменше, 7, наприклад, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величинаzскладає, щонайменше, 7, наприклад, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величиниx, yіzможуть бути однаковими або різними. В деяких варіантах здійсненняx, yіzідентичні.

Фрагменти переважно містять епітоп з відповідної послідовності SEQ ID NO. В інших використовуваних фрагментів відсутня одна або кілька аминокисл4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 або більше) з N-кінця відповідної SEQ ID NO, в той же час зберігаючи щонайменше один з таких епітопів.

Амінокислотні послідовності, використовувані щодо винаходу, порівняно з SEQ ID NO: 1, 2 або 3 можуть включати одну або декілька (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10і т. д.) консервативних замін амінокислот,т. е. замін однієї амінокислоти на іншу, яка має споріднену бічний ланцюг. Генетично амінокислоти кодуються, як правило, підрозділяють на чотири родини: (1) кислотні,тобтоаспартат, глутамат; (2) основні,т. е. лізин, аргінін, гістидин; (3) неполярні,т. е. аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан; і (4) незаряджені полярні,тобтогліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин. Фенілаланін, триптофан і тирозин іноді класифікують разом як ароматичні амінокислоти. В цілому, заміна поодиноких амінокислот у межах цих сімейств не впливає суттєво на біологічну активність. Поліпептидів можуть мати одну або декілька (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10і т. д.) делецій одиничних амінокислот щодо еталонної послідовності. Поліпептиди також можуть включати одну або кілька (напѽой послідовності.

Використовується перша амінокислотна послідовність має ідентичність з SEQ ID NO: 1, щонайменше 85% (наприклад,, >95% або 100%). Інша використовувана перша амінокислотна послідовність має ідентичність з SEQ ID NO: 4, щонайменше, 95% (наприклад,, >98% або 100%). Інша використовувана перша амінокислотна послідовність має ідентичність з SEQ ID NO: 5, щонайменше, 95% (наприклад,, >98% або 100%).

Використовувана третя амінокислотна послідовність має ідентичність з SEQ ID NO: 3, принаймні, 85% (наприклад,, >95% або 100%). Інша використовувана третя амінокислотна послідовність має ідентичність з SEQ ID NO: 6, щонайменше, 95% (наприклад,, >98% або 100%).

Зокрема, можна використовувати комбінації, що містять суміш першої і третьої послідовностей на основі SEQ ID NO: 4 і 6 (або близьких до них варіантів). Інша використовується комбінація містить суміш першої і третьої послідовностей на основі суміші SEQ ID NO: 5 і 6 (або близьких до них варіантів). Таким чином, композиція може містити поліпептид, що містить аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 23, і поліпептид, що містить аминокислотную послідовність SEQ ID NO: 25.

При включенні в композицію двох менингоко�вух різних антигенів fHBP,наприклад,у трехвалентной або чотирьохвалентної композиції fHBP.

В деяких варіантах здійснення поліпептид(и) fHBP липидируют,наприклад,, N-кінцевого цистеїну. В інших варіантах здійснення, тим не менш, поліпептид(и) fHBP не липидируют. Щодо липидированних fHBP, ліпіди, приєднані до цистеинам, звичайно, будуть включати пальмитоиловие залишки,наприклад,у вигляді трипальмитоил-S-глицерилцистеина (Pam3Cys), дипальмитоил-S-глицерилцистеина (Pam2Cys), N-ацетилу (дипальмитоил-S-глицерилцистеина)і т. д. Прикладами зрілих липидированних послідовностей fHBP є SEQ ID NO: 23 (включає SEQ ID NO: 4), SEQ ID NO: 24 (включає SEQ ID NO: 5) і SEQ ID NO: 25 (включає SEQ ID NO: 6).

Введення fHBP переважно буде викликати вироблення антитіл, які можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1, 2 або 3. Переважні антигени fHBP для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів.

Сумарна кількість поліпептидів fHBP зазвичай має знаходитися між 1 і 500 мкг/доза,наприклад,між 60 і 200 мкг/доза або між 120 і 500 мкг/мл Для кожного поліпептиду fHBP в дозі вак�оби включити це кількість кожного fHBP.

При вмісті в композиції різних менінгококових антигенів fHBP вони можуть бути у вигляді окремих поліпептидів, описаних вище (наприклад,, першого і другого поліпептидів), або вони можуть бути у вигляді частини одного «гібридного» поліпептиду,тобтоколи щонайменше два (наприклад,, 2, 3, 4, 5 або більше) антигену fHBP експресуються у вигляді однієї поліпептидного ланцюга, як описано для менінгококових антигенів в посиланні 12.

Гібридний поліпептид може містити два або три пункти з наступних: першу аминокислотную послідовність, певну вище; другу аминокислотную послідовність, певну вище; та/або третю аминокислотную послідовність, певну вище.

Гібридні поліпептидів можуть бути представлені формулою NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH, де: Х являє собою першу, другу або третю аминокислотную послідовність, певну вище; L являє собою необов'язкову линкерную аминокислотную послідовність; А являє собою необов'язкову N-кінцеву аминокислотную послідовність; являє собою необов'язкову С-кінцева аминокислотную послідовність;nявляє собою ціле числве з першої, другий і третій амінокислотних послідовностей.

При наявності у-Х-фрагмента в його формі дикого типу лідерної пептидної послідовності вона може бути включена в гібридний білок або опущена. В деяких варіантах здійснення лидерние пептиди повинні бути видалені за винятком лидерних пептидів-Х-фрагмента, локалізованого на N-кінці гібридного білка,т. е. лидерний пептид фрагмента Х1повинен бути збережений, але лидерние пептиди фрагментів Х2... Xnповинні бути опущені. Це рівнозначно видалення всіх лидерних пептидів і використання лидерного пептиду фрагмента Х1як фрагмента-А-.

Для кожногоnприклад {-X-L} линкерная амінокислотна послідовність-L - може бути присутнім або відсутнім. Наприклад, приn=2 гібрид може представляти собою NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOHі т. д. Линкерная(і) амінокислотна(і) послідовність(і) -L - зазвичай(ут) короткої(ними) (наприклад,, 20 або менше амінокислот,т. е. 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). До прикладів відносяться короткі пептидні послід� деn=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше) і гистидиновие хвости (т. е. Hisn, деn=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше). Інші відповідні линкерние амінокислотні послідовності будуть очевидні фахівця в даній області. Використовується лінкером є GSGGGG (SEQ ID NO: 15) або GSGSGGGG (SEQ ID NO: 16), причому дипептид Gly-Ser утворюється з сайту рестрикціїBamHI, таким чином сприяючи клонування і впливу, і типовим полиглициновим лінкером є тетрапептид (Gly)4. Іншим підходящим лінкером, зокрема для застосування в якості кінцевого Lnє дипептид Leu-Glu.

-А - являє собою необов'язкову N-кінцеву аминокислотную послідовність. Зазвичай вона повинна бути короткою (наприклад,, 40 або менше амінокислот,т. е. 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). До прикладів відносяться лидерние послідовності для спрямованого транспорту білка або короткі пептидні послідовності, які сприяють клонування або очищення (наприклад,, гистидиновие хвости,т. е. Hisn, деn=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше). Інші відповідні N-кінцеві амінокислотні послідовності будуть очевидні фахівцям в даній облаолигопептид (наприклад,з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 амінокислотами), який створює N-кінцевий метіонін,наприклад,, Met-Ala-Ser, або один залишок Met.

- - Являє собою необов'язкову С-кінцева аминокислотную послідовність. Зазвичай вона повинна бути короткою (наприклад,, 40 або менше амінокислот,т. е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). До прикладів відносяться послідовності для спрямованого транспорту білка, короткі пептидні послідовності, які сприяють клонування або очищення (наприклад,, містять гистидиновие хвости,т. е. Hisn, деn=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше, такі як SEQ ID NO: 17), або послідовності, які посилюють стабільність білка. Інші підходящі С-кінцеві амінокислотні послідовності будуть очевидні фахівцям в даній області.

Ад'юванти гидроксифосфати алюмінію та адсорбція

Композиції з винаходу включають ад'ювант гидроксифосфат алюмінію. Такі ад'юванти часто позначаються для зручності як «фосфат алюмінію» [13], незважаючи на те, що гидроксифосфати можуть відрізнятися від суворого AlPO4наявністю гідроксильних груп. Наприклад, IR смуга спектра при 3164 см-1(т. е. гидроксифосфат-сульфат алюмінію), а також може включати іони натрію і/або хлориду [14]. Ад'ювант може бути отриманий осадженням.

Гидроксифосфат алюмінію не є стехіометричним з'єднанням і його гідроксильний і фосфатний склад залежить від реактантов і умов осадження. Цей гідроксильний/фосфатний склад впливає на точку нульового заряду ад'юванта (PZC; величина рН, при якій поверхня має нульовий заряд). PZC обернено пропорційна ступеню заміщення фосфату гидроксилом (молярне співвідношення Р/Al). Заміна фосфатних гідроксильних аніонів аніонами знижує PZC. Таким чином, PZC може бути змінена за рахунок зміни концентрації вільних фосфатних іонів в розчині (більше фосфату = більш кисла PZC) або додати буфера, такого як гистидиновий буфер (робить PZC більш основний). Гидроксифосфати алюмінію за винаходу зазвичай мають PZC між 5,0 і 6,6,наприклад,між 5,4 і 6,2.

Молярне співвідношення Р/Al ад'юванта гидроксифосфата алюмінію, як правило, буде перебувати між 0,3 і 1,2, переважно між 0,8 і 1,2 або між 0,85 і 1,0 і більше бажано близько 0,9. Молярне співвідношення Р/Al, щонайменше 0,5 може призвести до отримання ад'юванта з великим терміном придатності.

він буде дисперсним (наприклад,, пластинчастої морфології, як видно на мікрофотографіях, отриманих за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа). Типові діаметри пластин складають 10-100 нм, і вони утворюють агрегати розміром 0,5-20 мкм (наприклад,близько 1-10 мкм). Для ад'ювантів гидроксифосфатов алюмінію було повідомлено про адсорбційної здатності між 0,7-1,5 мг білка на мг Al+++при величині рН 7,4.

Характерний ад'ювант являє собою аморфний гидроксифосфат алюмінію з молярним співвідношенням Р/Al між 0,84 і 0,92, і цей ад'ювант може бути включений в кількості 0,6 мг Al3+/мл

Концентрація Al+++у композиції для введення пацієнту переважно становить менше, ніж 5 мг/мл,наприклад,, ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 мг/мл, ≤1 мг/млі т. д. Переважний діапазон становить між 0,2 і 1 мг/мл Краща максимальна концентрація Al+++0,85 мг/доза.

У композиції по винаходу на гидроксифосфате алюмінію адсорбується, принаймні, 85% (мас.) fHBP,наприклад,, ≥90%, ≥95% або навіть 100%. Частка адсорбованого fHBP може контролюватися по зміні концентрації солі і/або величини рН в процесі змішування,наприклад,в цілому, більш висока концентрація NaCl може знижувати адсЀим відносяться PZC ад'юванта, концентрація солі і величина рН у процесі змішування, концентрація ад'юванта, концентрація антигену і pI антигену. Внесок кожного з цих параметрів в адсорбцію може бути без праці оцінений. Ступінь адсорбції може бути визначена порівнянням сумарної кількості антигену fHBP в композиції (наприклад,, виміряного перед адсорбцією, або виміряного за десорбції адсорбованого антигену) з кількістю, яка залишається в супернатанте після центрифугування (наприклад,див. главу 4 посилання 15). Відсутність детектованого антигену в супернатанте після центрифугування вказує на те, що відбулася повна адсорбція, тобто весь fHBP знаходиться в осаді, який містить нерозчинний ад'ювант і адсорбированное на ньому вміст.

Відомо про застосування в одній вакцині сумішей різних солей алюмінію,наприклад,див. посилання 16. Незважаючи на те, що з fHBP можуть бути використані ад'юванти, включаючи як гидроксифосфат, так і гідроксид алюмінію, переважно, щоб композиція взагалі не включала ад'юванта гідроксиду алюмінію, оскільки, як описано вище, він може руйнувати деякі антигени, які можуть бути змішані з fHBP (зокрема, кон'юговані бактеріальні капсульні сахарид� адъюванте гидроксифосфате алюмінію, якщо забезпечити, щоб адсорбція відбувалася за величиною рН, яка дорівнює або нижче PZC ад'юванта. Таким чином, може бути обраний ад'ювант з PZC, що дорівнює або вище бажаної величини рН змішування, або інакше може бути обрана величина рН, що дорівнює або нижче бажаної PZC ад'юванта. Ад'ювант і антиген об'єднують при цих умовах, і відбувається адсорбція. Величина рН не повинна бути такою низькою, щоб запобігти адсорбцію або необоротно денатурувати fHBP. Таким чином, оптимально адсорбція відбувається в 2 одиницях рН (оптимально в 1,2 одиницях рН) від PZC.

Щодо другого аспекту автори винаходу виявили, що білки fHBP можуть бути ефективно адсорбовані на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, використовуючи менінгококовий антиген fHBP з ізоелектричної точкою між 5,0 і 7,0 і ад'ювант гидроксифосфат алюмінію з точкою нульового заряду також між 5,0 і 7,0. Адсорбція відбувається при величині рН між 5,0 і 7,0, і рН може підтримуватися (перед, в процесі та/або після адсорбції) включенням буфера для підтримки рН в діапазоні між 5,0 і 7,0. У діапазоні рН між 5,0 і 7,0 кращий піддіапазон становить від 5,0 до 6,0. Другий аспект не підходить для всіх fHBP, оскільки деякі з них (наприклад,, SEQ ID NO: 20) HBP може бути визначена емпірично з допомогою техніки, такий як изоэлектрическое фокусування. Більш прийнято, тим не менш, щоб изоэлектрическая точка являла собою теоретичну изоэлектрическую точку. Вона може бути розрахована, використовуючи величини рКа амінокислот, описані в посиланні 17,наприклад,, використовуючи відповідний засіб ExPASy [18]. Наприклад, зростаюча амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 20 має передбачувану pI 7,72, тоді як SEQ ID NO: 21 і 22 мають передбачувані pI 5,87 і 6,15. Всі зрілі послідовності SEQ ID NO: 23, 24 і 25 (містять SEQ ID NO: 4, 5 і 6, відповідно) мають передбачувану pI у відповідному діапазоні: 5,46, 5,72 і 5,86, відповідно. Поправка на заблокований N-кінцевий амін (наприклад,при липидировании) знижує величину pI на близько 0,1, але SEQ ID NO: 23, 24 і 25 все ж мають передбачувані pI в діапазоні від 5,0 до 6,0. Кращі комбінації, коли кожен відмінний менінгококовий антиген fHBP має pI між 5,0 і 7,0 і, зокрема, коли вони обидва мають pI в діапазоні від 5,0 до 6,0 або в діапазоні від 5,2 до 6,2.

Використана комбінація антигенів fHBP з величинами pI у відповідному діапазоні може містити суміш першої і третьої послідовностей на основі SEQ ID NO: 4 і 6 (або близьких до них варіантів) або суміш першої і третьої последовательнос�дложени вище. Наприклад, комбінація SEQ ID NO: 23 і 25 є особливо використовуваної, і ці два білка можуть бути липидировани (як описано вище).

З третього аспекту автори винаходу виявили, що менінгококовий антиген fHBP з величиною pI вище, ніж PZC ад'юванта гидроксифосфата алюмінію, може бути ефективно адсорбований за умови, якщо адсорбція буде відбуватися при величині рН в межах 1,2 одиниць рН від PZC. Адсорбція може відбуватися при величині рН вище або нижче PZC ад'юванта, тим не менш рН не повинен бути настільки граничним, щоб безповоротно зруйнувати fHBP. Величина рН у процесі адсорбції переважно досягається включенням буфера, який підтримує рН в межах 1,2 одиниць рН від PZC ад'юванта. При знаходженні величини рН в межах 1,2 одиниць рН вона може знаходитися в межах 1 одиниці рН або менше,наприклад,в межах 0,8 одиниць рН, в межах 0,6 одиниць рН або в межах 0,5 одиниць рН.

Порядок змішування

Як зазначено вище, винахід відноситься до способу адсорбирования менінгококового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію. Змішування антигену(ів) fHBP, гидроксифосфата алюмінію і будь-якого буфера може відбуватися в будь-якому відповідному порядку або об'єднання�ням попередньої суміші з третім компонентом.

Таким чином, наприклад, в одному з варіантів здійснення винахід відноситься до способу отримання иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP, що містить стадію об'єднання менінгококового антигена fHBP і ад'юванта гидроксифосфата алюмінію, де: (i) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду; і (ii) стадія об'єднання відбувається при величині рН нижче, ніж дана точка нульового заряду, так що антиген fHBP адсорбується на адъюванте.

В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способу отримання иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP, що містить стадію об'єднання менінгококового антигена fHBP і ад'юванта гидроксифосфата алюмінію, де: (i) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду; і (ii) композиція має величину рН нижче, ніж дана точка нульового заряду, так що антиген fHBP адсорбується на адъюванте.

В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способу отримання иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP, який містить стадії: (i) отримання водної композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP і має величину рН; (ii) отримання ад'юванта р�вання водної композиції з адъювантом гидроксифосфатом алюмінію для отримання иммуногенной композиції.

В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способу отримання иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP, який містить стадії: (i) отримання водної композиції, що містить ад'ювант гидроксифосфат алюмінію і має величину рН, де ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду, яка вище, ніж зазначена величина рН; і (ii) об'єднання водної композиції з менінгококовим антигеном fHBP для отримання иммуногенной композиції.

В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способу отримання иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP, який містить стадії: (i) отримання першої водної композиції, що має рН; (ii) отримання другої водної композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP і ад'ювант гидроксифосфат алюмінію, має точку нульового заряду, яка вище, ніж зазначена величина рН; і (iii) об'єднання першої та другої водних композицій для отримання иммуногенной композиції.

В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способу отримання иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP, який містить стадії: (i) отримання першої водної композиції, що має величину рН; (ii)сифосфата алюмінію, має точку нульового заряду, яка вище, ніж зазначена величина рН; і (iv) об'єднання в будь-якому порядку першої водної композиції, другий водної композиції і гидроксифосфата алюмінію для отримання иммуногенной композиції.

Винахід відноситься до способу адсорбирования двох різних менінгококових антигенів fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де адсорбція обох антигенів fHBP відбувається при величині рН, яка дорівнює або нижче точки нульового заряду гидроксифосфата алюмінію. І в цьому випадку змішування антигенів fHBP, гидроксифосфата алюмінію і буфера може відбуватися в будь-якому відповідному порядку.

Таким чином, в одному з варіантів здійснення два різних антигену fHBP роздільно адсорбують на гидроксифосфате алюмінію за відповідною величиною рН, і два адсорбованих антигену потім можуть бути змішані.

В іншому варіанті здійснення два різних антигену fHBP змішують один з одним і потім суміш додають до гидроксифосфату алюмінію, де гидроксифосфат алюмінію або перебуває при підходящої для адсорбції величиною рН, або рН доводять після додавання суміші.

В іншому варіанті здійснення два різних антигену fHBP додають до гидроксифосфату а�Н, або рН доводять після додавання одного або обох антигенів fHBP.

В іншому варіанті здійснення один антиген fHBP змішують з гидроксифосфатом алюмінію і потім до суміші додають інший антиген fHBP, де гидроксифосфат алюмінію або перебуває при підходящої для адсорбції величиною рН до додавання першого антигену fHBP, або рН доводять після додавання першого антигену fHBP, або рН доводять перед додаванням другого антигену fHBP, або рН доводять після додавання другого антигену fHBP.

Ці та інші можливості доступні фахівця в даній галузі для всіх варіантів здійснення винаходу.

Альтернативний ад'ювант

В якості альтернативи застосуванню ад'юванта гидроксифосфата алюмінію винахід може використовувати дисперсний комплекс імуностимулюючої олигонуклеотида і поликатионного полімеру, такий як «IC31». Визначення, дані вище, можуть бути доповнені відповідно. Наприклад, винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить менінгококовий антиген fHBP і дисперсний комплекс імуностимулюючої олигонуклеотида і поликатионного полімеру. Винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить два різних менінгококових �ностимулирующие олигонуклеотиди відомі в якості використовуваних ад'ювантів. Вони часто містять повтор CpG (динуклеотидную послідовність, що містить неметилированний цитозин, пов'язаний з гуанозином), і вплив їх в якості ад'ювантів обговорюється в посиланнях 19-24. Олигонуклеотиди, містять повтори TpG, палиндромние послідовності, мультиплетние безперервні тимидиновие нуклеотиди (наприклад,, ТТТТ), мультиплетние безперервні цитозиновие нуклеотиди (наприклад,, Велесова книга) або послідовності полі(dG) також являють собою відомі імуностимулятори, як і двухцепочечниє РНК. Незважаючи на те, що по винаходу можуть бути використані будь-які з великого числа цих імуностимулюючих олігонуклеотидів, переважно застосування олигодезоксинуклеотида, що містить дезоксиинозин та/або дезоксіурідіна, і оптимально олигодезоксинуклеотида, що містить дезоксиинозин та/або дезоксицитозин. Містять інозин олигодезоксинуклеотиди можуть включати повтор CpI (динуклеотидную послідовність, що містить цитозин, пов'язаний з инозином). Олигодезоксинуклеотид може включати більше одного повтору CpI (наприклад,, 2, 3, 4, 5, 6 або більше), і вони можуть бути повторені безпосередньо друг за іншому (наприклад,, олигодезоксинуклеотид, що містить последов�игодезоксинуклеотид, містить послідовність (CIN)х, дехдорівнює 2, 3, 4, 5, 6 або більше і де кожен N незалежно являє собою один або кілька нуклеотидів). Цитозиновие залишки оптимально не метилируются.

Олигонуклеотид зазвичай буде мати між 10 і 100 нуклеотидами,наприклад,, 15-50 нуклеотидів, 20-30 нуклеотидів або 25-28 нуклеотидів. Зазвичай він буде одноцепочечним.

Олигонуклеотид може включати тільки природні нуклеотиди, тільки неприродні нуклеотиди або суміш тих і інших. Наприклад, він може включати одну або кілька фосфоротиоатних зв'язків, та/або один або кілька нуклеотидів можуть мати 2'-О-метильної модифікацію.

Переважний олигонуклеотид являє собою одноцепочечний дезоксинуклеотид, містить 26-мірну послідовність 5'-(IC)13-3' (SEQ ID NO: 18). Цей олигодезоксинуклеотид утворює стабільні комплекси з поликатионними полімерами з утворенням хорошого ад'юванта.

Поликатионний полімер оптимально являє собою поликатионний пептид. Полімер може включати один або кілька лейцинових амінокислотних залишків та/або один або кілька лизинових амінокислотних залишків. Полімер може включати один або кілька аргининових аминоЀ одну або кілька дипептидних послідовностей Leu-Leu, одну або кілька дипептидних послідовностей Lys-Lys або одну або кілька дипептидних послідовностей Arg-Arg. Він може включати щонайменше одну (і переважно більшу кількість, наприклад, 2 або 3) дипептидних послідовностей Lys-Leu і/або щонайменше одну (і переважно більшу кількість, наприклад, 2 або 3) трипептидних послідовностей Lys-Leu-Lys.

Пептид може містити послідовність R1-XZXZxXZX-R2, де:хдорівнює 3, 4, 5, 6 або 7; кожен Х незалежно являє собою позитивно заряджений природний та/або неприродний амінокислотний залишок; кожен Z незалежно являє собою амінокислотний залишок L, V, I, F або W; і R1і R2незалежно вибирають із групи, що складається з-H-NH2, -COCH3або-COH. В деяких варіантах здійснення Х-R2може являти собою амід, складний ефір або тиоэфир С-кінцевого амінокислотного залишку пептиду.

Поликатионний пептид зазвичай буде мати між 5 і 50 амінокислотами,наприклад,, 6-20 амінокислот, 7-15 амінокислот або 9-12 амінокислот.

Пептид може включати тільки природні амінокислоти, тільки неприродні амінокислоти та�тід може мати N-кінець (NH2-) або модифікований N-кінець,наприклад,, гідроксил, ацетилі т. д. Пептид може мати природний С-кінець (-СООН) або модифікований З-кінець,наприклад,, гідроксил, ацетилі т. д. Такі модифікації можуть покращувати стабільність пептиду.

Переважний пептид для застосування винаходу являє собою 11-заходів KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 19) з усіма L-амінокислотами. N-кінець може бути деаминирован, і З-кінець може бути гидроксилирован. Переважний пептид являє собою Н-KLKL5KLK-OH зі всіма L-амінокислотами. Цей олигопептид утворює стійкі комплекси з імуностимулюючими олигонуклеотидами з отриманням хорошого ад'юванта.

Найбільш доцільною сумішшю імуностимулюючої олигонуклеотида і поликатионного полімеру є агоніст TLR9, відомий як IC31TM[25-27], який являє собою адсорбує комплекс олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 18 поликатионного олігопептиду SEQ ID NO: 19.

Олигонуклеотид і олигопептид можуть бути змішані разом у великому числі співвідношень, але, як правило, вони будуть змішані так, щоб у молярного надлишку виявився пептид. Молярний надлишок може становити, щонайменше, 5:1, " наприклад,, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1і т. д

Олигонуклеотид і олигопептид зазвичай будуть змішуватися у водному середовищі,наприклад,, розчин олигонуклеотида може бути змішаний з розчином олігопептиду в потрібному співвідношенні. Два розчину можуть бути отримані розчиненням сухих (наприклад,, ліофілізованих) матеріалів у воді або буфері з утворенням матричних розчинів, які потім можуть бути змішані. Комплекси можуть бути проаналізовані, використовуючи способи, розкриті в посиланні 30.

Полиаргининовие і CpG олигодезоксинуклеотиди аналогічним чином формують комплекси [31], які можуть бути використані.

Комплекси можуть зберігатися у водній суспензії,наприклад,у воді або буфері. Характерними буферами для застосування з комплексами є фосфатні буфери (наприклад,, фосфатний забуференний сольовий розчин), трис-буфер, трис/сорбитольние буфери, боратного буфери, сукцинатние буфери, цитратні буфери, гистидиновие буфериі т. д. В якості альтернативи комплекси іноді можуть бути лиофилизировани.

Може бути використано велику кількість концентрацій олигонуклеотида і поликатионного полімеру,наприклад,будь-яка з концентрацій, використаний�кМ, 350 мкМ, 220 мкМ, 200 мкМ, 110 мкМ, 100 мкМ, 11 мкМ, 10 мкМі т. д. Олигонуклеотид може бути присутнім в концентраціях 44 нМ, 40 нМ, 14 нМ, 4,4 нМ, 4 нМі т. д. Типова концентрація поликатионного олігопептиду менше, ніж 2000 нМ. Для SEQ ID NO: 18 і 19, змішаних у молярному співвідношенні 1:25, концентрації, виражені в мг/мл, в трьох варіантах здійснення винаходу, таким чином, можуть становити 0,311і1,322, або 0,109 і 0,463, або 0,031 і 0,132.

У варіантах здійснення винаходу, які включають дисперсний комплекс імуностимулюючої олигонуклеотида і поликатионного полімеру, його можна використовувати, якщо цей комплекс являє собою єдиний ад'ювант,наприклад,композиція може бути вільна від солей алюмінію і емульсій масло в воді.

У конкретному варіанті здійснення винахід відноситься до иммуногенной композиції, що містить: дисперсний комплекс імуностимулюючої олигонуклеотида і поликатионного полімеру (наприклад,, IC31); менінгококовий антиген fHBP; та кон'юговані капсульні сахариди 1, 2, 3 або 4 менінгококових серогруп А, С, W135 та/або Y. Додаткові подробиці відповідних кон'югованих сахаридів наводяться нижче.

Додатковий(е) антиген(и)

Крім Ђогенов,наприклад,, інших бактерій, таких як пневмокок.

Додаткові менингококковие поліпептидні антигени

Крім включення менінгококового(их) поліпептидного(их) антигену(ів) fHBP композиція може включати один або кілька додаткових менінгококових поліпептидних антигенів. Таким чином, композиція може включати поліпептидний антиген, обраний із групи, що складається з: 287, NadA, NspA, HmbR, NhhA, App і/або Omp85. Ці антигени будуть успішно використовуватися у вигляді очищених поліпептидів,наприклад,рекомбінантних поліпептидів. Після введення індивідууму антиген переважно повинен викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококу. При включенні в композицію антигену PorA в деяких варіантах здійснення включають лише один сероподтип менінгококового PorA. В деяких варіантах здійснення в композицію не включають менінгококового білка зовнішньої мембрани PorA.

Композиція щодо винаходу може включати антиген 287. Антиген 287 був включений в опубліковану послідовність генома менінгококового штаму серогрупи В МС58 [32] у вигляді гена NMB2132 (номер доступу Генбанка GI:7227388; в цьому документі SEQ ID NO: 9). Пізніше були опубліковані послідовності � прикладі 13 і на фіг.21 посилання 34 (в цьому документі SEQ ID NO: 3179-3184). Також було повідомлено про великому числі імуногенних фрагментів антигену 287. Кращі антигени 287 для застосування винаходу містять аминокислотную послідовність, (а) має ідентичність з SEQ ID NO: 9 50% або більше (наприклад,, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% або більше; та/або (b) містить фрагмент, щонайменше, з 'n' послідовних амінокислот SEQ ID NO: 9, де 'n' дорівнює 7 або більше (наприклад,, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 або більше). Кращі фрагменти пункту (b) містять епітоп з SEQ ID NO: 9. Найбільш використовувані антигени 287 щодо винаходу можуть викликати вироблення антитіл, які після введення індивідууму можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 9. Переважні антигени 287 для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів.

Композиція щодо винаходу може включати антиген NadA. Антиген NadA був включений в опубліковану послідовність генома менінгококового штаму серогрупи В МС58 [32] у вигляді гена NMB1994 (номер доступу Генбанка GI:7227256; в цьому документі SEQ ID NO: 10). Пізніше були опуий була успішно запротокольована. Також було повідомлено про великому числі імуногенних фрагментів антигену NadA. Кращі антигени NadA для застосування винаходу містять аминокислотную послідовність, (а) має ідентичність з SEQ ID NO: 10 50% або більше (наприклад,, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% або більше; та/або (b) містить фрагмент, щонайменше, з 'n' послідовних амінокислот SEQ ID NO: 10, де 'n' дорівнює 7 або більше (наприклад,, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 або більше). Кращі фрагменти пункту (b) містять епітоп з SEQ ID NO: 10. Найбільш використовувані антигени NadA щодо винаходу можуть викликати вироблення антитіл, які після введення індивідууму можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 10. Переважні антигени NadA для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів. SEQ ID NO: 6 являє собою один з таких фрагментів.

Композиція щодо винаходу може включати антиген NspA. Антиген NspA був включений в опубліковану послідовність генома менінгококового штаму серогрупи В МС58 [32] у вигляді гена NMB0663 (номер доступу Генбан послідовності антигену NspA великого числа штамів. Також було повідомлено про великому числі імуногенних фрагментів антигену NspA. Кращі антигени NspA для застосування винаходу містять аминокислотную послідовність, (а) має ідентичність з SEQ ID NO: 11 50% або більше (наприклад,, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% або більше; та/або (b) містить фрагмент, щонайменше, з 'n' послідовних амінокислот SEQ ID NO: 11, де 'n' дорівнює 7 або більше (наприклад,, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 або більше). Кращі фрагменти пункту (b) містять епітоп з SEQ ID NO: 11. Найбільш використовувані антигени NspA щодо винаходу можуть викликати вироблення антитіл, які після введення індивідууму можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 11. Переважні антигени NspA для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів.

Композиції з винаходу можуть включати менінгококовий антиген HmbR. Повнорозмірна послідовність HmbR була включена в опубліковану послідовність генома менінгококового штаму серогрупи В МС58 [32] у вигляді гена NMB1668 (в цьому документі SEQ ID і 8 розрізняються по довжині на 1 амінокислоту і мають ідентичність 94,2%. Щодо винаходу може використовуватися поліпептид, який містить повнорозмірну послідовність HmbR, але часто буде використовуватися поліпептид, який містить часткову послідовність HmbR. Таким чином, в деяких варіантах здійснення послідовність HmbR, використовувана по винаходу, може містити аминокислотную послідовність, що має ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 7, щонайменше,i%, де величинаiстановить 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 або більше. В інших варіантах здійснення послідовність HmbR щодо винаходу може містити фрагмент, щонайменше, зjпослідовних амінокислот SEQ ID NO: 7, де величинаjстановить 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 або більше. В інших варіантах здійснення послідовність HmbR щодо винаходу може містити аминокислотную послідовність, (i) має ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 7, щонайменше,i% та/або (ii) містить фрагмент, щонайменше, зjпослідовних амінокислот SEQ ID NO: 7. Кращі фрагментиjамінокислот містять епітоп з SEQ ID NO: 7. Такі епітопи зазвичай містять амінокислоти, які розташовані на поверхні HmbR. До испоЃ антитіла, які зв'язуються з цими эпитопами, можуть блокувати здатність бактерії зв'язуватися з гемоглобіном господаря. Топологія HmbR і його критичні функціональні залишки вивчалися в посиланні 38. Найбільш використовувані антигени HmbR щодо винаходу можуть викликати вироблення антитіл, які після введення індивідууму можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 7. Переважні антигени HmbR для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів.

Композиція щодо винаходу може включати антиген NhhA. Антиген NhhA був включений в опубліковану послідовність генома менінгококового штаму серогрупи В МС58 [32] у вигляді гена NMB0992 (номер доступу Генбанка GI:7226232; в цьому документі SEQ ID NO: 12). Пізніше були опубліковані послідовності антигену NhhA великої кількості штамів,наприклад,посилання 33 і 39, і було повідомлено про великому числі імуногенних фрагментів NhhA. Він також відомий як Hsf. Кращі антигени NhhA для застосування винаходу містять аминокислотную послідовність, (а) має ідентичність з SEQ ID NO: 12 50% або більше (наприклад,, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%�ьних амінокислот SEQ ID NO: 12, де 'n' дорівнює 7 або більше (наприклад,, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 або більше). Кращі фрагменти пункту (b) містять епітоп з SEQ ID NO: 12. Найбільш використовувані антигени NhhA щодо винаходу можуть викликати вироблення антитіл, які після введення індивідууму можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 12. Переважні антигени NhhA для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів.

Композиція щодо винаходу може включати антиген App. Антиген App був включений в опубліковану послідовність генома менінгококового штаму серогрупи В МС58 [32] у вигляді гена NMB1985 (номер доступу Генбанка GI:7227246; в цьому документі SEQ ID NO: 13). Пізніше були опубліковані послідовності антигену App великого числа штамів. Також було повідомлено про великому числі імуногенних фрагментів App. Кращі антигени App для застосування винаходу містять аминокислотную послідовність, (а) має ідентичність з SEQ ID NO: 13 50% або більше (наприклад,, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% або більше; та/або (b) містить фрагмент, п4, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 або більше). Кращі фрагменти пункту (b) містять епітоп з SEQ ID NO: 13. Найбільш використовувані антигени App щодо винаходу можуть викликати вироблення антитіл, які після введення індивідууму можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 13. Переважні антигени App для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів.

Композиція щодо винаходу може включати антиген Omp85. Антиген Omp85 був включений в опубліковану послідовність генома менінгококового штаму серогрупи В МС58 [32] у вигляді гена NMB0182 (номер доступу Генбанка GI:7225401; в цьому документі SEQ ID NO: 14). Пізніше були опубліковані послідовності антигену Omp85 великого числа штамів. Додаткову інформацію про Omp85 можна знайти в посиланнях 40 і 41. Також було повідомлено про великому числі імуногенних фрагментів Omp85. Кращі антигени Omp85 для застосування винаходу містять аминокислотную послідовність, (а) має ідентичність з SEQ ID NO: 14 50% або більше (наприклад,, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% або більше; та/або (b) содержащѼер, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 або більше). Кращі фрагменти пункту (b) містять епітоп з SEQ ID NO: 14. Найбільш використовувані антигени Omp85 щодо винаходу можуть викликати вироблення антитіл, які після введення індивідууму можуть зв'язуватися з менінгококовим поліпептидом, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 14. Переважні антигени Omp85 для застосування щодо винаходу після введення індивідууму можуть викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококів.

Менінгококовий липоолигосахарид

Крім включення менінгококового(их) поліпептидного(их) антигену(ів) fHBP композиція може включати один або кілька менінгококових липоолигосахаридних (LOS) антигенів. Менінгококовий LOS являє собою фосфолипид на основі глюкозаміну, який виявляють у зовнішньому монослое зовнішньої мембрани бактерії. Він включає ділянку ліпіду А і коровий регіон олігосахариду, причому ділянка ліпіду А діє в якості гідрофобного якоря в мембрані. Гетерогенність всередині корової регіону олігосахариду створює структурний і антигенна різноманітність серед різних штамів менінгокока, що було використано для підрозділу штамів L7 і/або L8.

α-ланцюга L2 і L3 в природі включають лакто-N-неотетраозу (LNnT). При використанні винаходу LOS иммунотипа L2 або L3 ця LNnT може бути відсутнім. Це відсутність може бути досягнуто зручним способом, використовуючи мутантні штами, які створюють, порушуючи їх здатність синтезувати тетрасахарид LNnT в α-ланцюга. Відомо про досягнення цієї мети за допомогою нокауту ферментів, які відповідають за відповідні биосинтетические реакції приєднання [42, 43]. Наприклад, нокаут ферменту LgtB запобігає приєднання термінальній галактози LNnT, також запобігаючи приєднання нижче термінальній сиаловой кислоти α-ланцюга. Нокаут ферменту LgtA запобігає приєднання N-ацетилглюкозаміну LNnT, а також реакції приєднання нижче. Нокаут LgtA може супроводжуватися нокаутом LgtC. Аналогічно, нокаут LgtE та/або ферменту GalE запобігає приєднання внутрішньої галактози, і нокаут LgtF запобігає приєднання глюкози до залишку Нер1. Для руйнування тетрасахаріда LNnT в штамі иммунотипа L2, L3, L4, L7 або L9 може бути використаний будь-який з цих нокаутів самостійно або в поєднанні. Кращий нокаут, щонайменше, LgtB, оскільки це створює LOS, який зберігає використовувану імуногенність, в той же вр�OS також створюється нокаутом генаgalEі аналогічним чином може бути видалений ген ліпід А-ацил-трансферази [44]. З LOS може бути видалена щонайменше одна первинна Про-пов'язана жирна кислота [45]. Також може бути використаний LOS, має зменшену кількість вторинних ацильних ланцюгів на молекулу LOS [46]. LOS зазвичай буде включати структуру, щонайменше, GlcNAc-Hep2фосфоэтаноламин-KDO2-ліпід А [47]. LOS може включати трисахарид GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, в той час як тетрасахарид LNnT буде відсутній.

LOS може бути включений в композиції щодо винаходу у великому числі форм. Він може бути використаний в очищеній формі як такої. Він може бути конъюгирован з білком-носієм. При кон'югації LOS кон'югація може бути здійснена через ділянку ліпіду А в LOS або за допомогою будь-якого іншого відповідного фрагмента,наприклад,його залишків KDO. Таке альтернативне зв'язування необхідно при відсутності фрагмента ліпіду А LOS. Техніки кон'югації LOS відомі,наприклад,, з посилань 45, 47, 48, 49і т. д. Використовувані білки-носії цих кон'югатів описані нижче,наприклад,, бактеріальні токсини, такі як дифтерійний і правцевий токсин або токсоїди або їх мутанти.

LOS може відбуватися із штаму (наприклад,, менингококковогоот стадії) иммунотипом LOS, як описано в посиланні 50. Наприклад, иммунотипи LOS L2 і L3 можуть бути фіксованими. Такі штами можуть володіти ступенем перемикання між иммунотипами, яка знижена більш ніж в 2 рази (навіть >50 разів) стосовно вихідного штаму дикого типу. У засланні 50 описано, як цей результат може бути досягнутий шляхом модифікації генних продуктівlgtAта/абоlgtG.

LOS може бути Про-ацетилирован за залишком GlcNac, приєднаному до його залишку гептози II,наприклад,для L3 [51]. Иммуногенная композиція може включати більше ніж один тип LOS,наприклад,LOS менінгококових иммунотипов L2 і L3. Наприклад, можуть бути використані комбінації LOS, описані в посиланні 52.

Антиген LOS після введення індивідууму переважно може викликати вироблення бактерицидних антитіл проти менінгококу.

Тим не менш, кращі композиції з винаходу не містять менінгококового липоолигосахарида.

Менінгококовий(е) антиген(и) капсульного сахаридів

Крім включення менінгококового(их) поліпептидного(их) антигену(ів) fHBP композиція може включати один або кілька кон'югатів менінгококового капсульного сахарида. Композиція щодо винаходу може включати один або кілька конъ�35+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+W135+Y, A+C+W135+Yі т. д. Можна використовувати композиції, що включають кон'югований капсульний сахарид серогрупи С, і оптимальні композиції, що включають сахариди всіх чотирьох серогруп А, С, W135 і Y.

Капсульний сахарид менінгокока серогрупи А являє собою гомополімер (α1→6)-пов'язаногоN-ацетил-D-маннозамин-1-фосфату з частковим Про-ацетилированием в позиціях С3 і С4. Ацетилування у позиції С-3 може становити 70-95%. Умови, які використовуються для очищення сахаридів, можуть призводити до де-Про-ацетилювання (наприклад,в основних умовах), але її можна використовувати для збереження ОАс у цій позиції С-3. В деяких варіантах здійснення, щонайменше, 50% (наприклад,щонайменше 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або більше) залишків маннозамина в сахаридах серогрупи А є Про-ацетилированними в позиції С-3. Ацетильние групи можуть бути заміщені блокуючими групами для запобігання гідролізу [53], і такі модифіковані сахариди все-таки являють собою сахариди серогрупи А щодо винаходу.

Капсульний сахарид серогрупи С являє собою гомополімер (α2→9)-пов'язаної сиаловой кислоти (N-ацетилнейрамінової кислоти або 'NeuNAc'). Структура сахаридів записується як →�ків сиаловой кислоти, але у близько 15% клінічних ізолятів відсутні такі Про-ацетильние групи [54, 55]. Наявність або відсутність груп ОАс створює унікальні епітопи, і специфічність зв'язування антитіла з сахаридом може впливати на бактерицидну активність відносно Про-ацетилированних (ОАс+) і де-Про-ацетилированних (ОАс-) штамів [56-58]. Сахариди серогрупи С, використані щодо винаходу, можуть бути отримані або з ОАс+, або ОАс - штамів. Ліцензовані конъюгатние вакцини MenC включають сахариди як ОАс- (NEISVAC-C), так і ОАс+ (MENJUGATETMі MENINGITECTM). В деяких варіантах здійснення штами для продукції кон'югатів серогрупи З являють собою штами ОАс+,наприклад,серотипу 16, сероподтипа Р1.7а,1і т. д. Таким чином, можуть бути використані ОАс+ штами З:16:Р1.7а,1. Також можна використовувати ОАс+ штами сероподтипе Р1.1, такі як штам С11.

Сахарид серогрупи W135 являє собою полімер дисахаридних одиниць сіалова кислота-галактоза. Подібно сахариду серогрупи С він має варіабельне Про-ацетилування, але в позиціях сиаловой кислоти 7 і 9 [59]. Структуру записують як: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.

Сахарид серогрупи Y подібний сахариду серогрупи W135, за винятком того, що повторює�лирование в позиціях сиаловой кислоти 7 і 9 [59]. Структуру серогрупи Y записують як: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→.

Сахариди, використані щодо винаходу, можуть бути Про-ацетилировани, як описано вище (наприклад,з таким же паттерном Про-ацетилювання, як показаний в нативних капсульних сахаридах), або вони можуть бути частково або повністю де-Про-ацетилировани по одній або декількох позиціях сахаридних кілець, або вони можуть бути гіпер-Про-ацетилировани щодо нативних капсульних сахаридів.

Сахаридние фрагменти в конъюгатах можуть містити повнорозмірні сахариди, отримані з менінгококів, та/або можуть містити фрагменти повнорозмірних сахаридів,т. е. сахариди можуть бути коротше, ніж нативні капсульні сахариди, що знаходяться у бактеріях. Сахариди, таким чином, можуть бути деполимеризовани, причому деполімеризація відбувається в процесі або після очищення сахаридів, але перед конъюгацией. Деполімеризація зменшує довжину ланцюга сахаридів. Один із способів деполімеризації включає застосування перекису водню. Перекис водню додають до сахариду (наприклад,, до одержання кінцевої концентрації Н2Про21%) і потім суміш інкубують (наприклад,при близько 55°С) до досягнення бажаного уменьшгие способи деполімеризації. Сахариди, використані для отримання кон'югатів для застосування щодо винаходу, можуть бути отримані будь-яким з цих способів деполімеризації. Деполімеризація може бути використана для отримання оптимальної довжини ланцюга для імуногенності та/або зменшення довжини ланцюга можливості для фізичного маніпулювання сахаридами. В деяких варіантах здійснення сахариди мають наступний діапазон середніх ступенів полімеризації (Dp): A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. У перерахунку на молекулярну масу замість Dp використовуються діапазони становлять для всіх серогруп: <100 кДа; 5 кДа - 75 кДа; 7 кДа - 50 кДа; 8 кДа - 35 кДа; 12 кДа - 25 кДа; 15 кДа - 22 кДа.

В деяких варіантах здійснення середня молекулярна маса сахаридів кожної з менінгококових серогруп А, С, W135 і Y може становити більше ніж 50 кДа,наприклад,≥75 кДа, ≥100 кДа, ≥110 кДа, ≥120 кДа, ≥130 кДаі т. д. [60] і навіть до 1500 кДа, зокрема, визначена з допомогою MALLS. Наприклад, сахарид MenA може перебувати в діапазоні 50-500 кДа,наприклад,, 60-80 кДа; сахарид MenC може перебувати в діапазоні 100-210 кДа; сахарид MenW135 може перебувати в діапазоні: 60-190 кДа,наприклад,, 120-140 кДа; та/або сахарид MenY може перебувати в діапазоні: 60-190 кДа,наприклад,, 150-160 кДа.

Маса ме�між 2 і 10 мкг на серогруппу, або близько 4 мкг, або близько 5 мкг, або близько 10 мкг. При включенні кон'югатів більше ніж однієї серогрупи вони можуть бути представлені по суті рівних масах,наприклад,, маса сахаридів кожної серогрупи знаходиться в межах +10% від кожної іншої. В якості альтернативи дорівнює співвідношенню може бути використана подвійна маса сахаридів серогрупи А. Таким чином, вакцина може включати сахарид MenA в кількості 10 мкг і сахариди MenC, W135 і Y в кількості 5 мкг кожного.

До використовуваних білків-носіїв для менінгококових кон'югатів належать бактеріальні токсини, такі як дифтерійний або правцевий токсини, або токсоїди або їх мутанти. Вони широко використовуються в конъюгатних вакцинах. Наприклад, можна використовувати мутант дифтерійного токсину CRM197 [61]. До іншим відповідним білків-носіїв відносяться синтетичні пептиди [62, 63], білки теплового шоку [64, 65], коклюшна білки [66, 67], цитокіни [68], лімфокіни [68], гормони [68], фактори росту [68], штучні білки, що містять велику кількість CD4+Т-клітинних епітопів людини з великої кількості патогенних антигенів [69], такі як N19 [70], білок D бактеріїH. influenzae[71-73], пневмолизин [74] або його нетоксичні похідні [75], пневмококовий поверхностнийактерииPseudomonas aeruginosa(rEPA) [79]і т. д. Кращий CRM197.

При включенні в композицію кон'югатів більше ніж однієї менінгококової серогрупи можливе застосування одного і того ж білка-носія для кожного окремого кон'югату або застосування різних білків-носіїв. В обох випадках, проте, суміш різних кон'югатів зазвичай буде утворюватися шляхом отримання кон'югату кожного серотипу окремо і потім змішування їх для утворення суміші окремих кон'югатів.

Можуть бути використані кон'югати з співвідношенням (мас./мас.) сахарид:білок між 1:5 (т. е. надлишок білка) і 5:1 (т. е. надлишок сахаридів),наприклад,з співвідношеннями між 1:2 і 5:1 і співвідношеннями між 1:1,25 і 1:2,5. Як описано в посиланні 80, кон'югати різних менінгококових серогруп в суміші можуть мати різні співвідношення сахарид:білок,наприклад,один може мати співвідношення між 1:2 і 1:5, тоді як інший має співвідношення між 5:1 і 1:1,99.

Білок-носій може бути ковалентно конъюгирован з менінгококовим сахаридом безпосередньо або через лінкер. Відомо велика кількість линкеров. Наприклад, приєднання може бути здійснене через карбоніл, який може бути утворений за допомогою реакції сво�разованием карбаматной зв'язку. Може бути використана карбодиимидная конденсація [83]. Може бути використаний лінкер адипиновая кислота, який може бути утворений поєднанням вільної групи-NH2(наприклад,, введеної в сахарид допомогою амінірованіе) з адипінової кислоти (використовуючи, наприклад, диимидную активацію) і потім поєднанням білка з отриманим проміжним продуктом сахарид-адипиновая кислота [84, 85]. До інших линкерам відносяться β-пропионамидо [86], нитрофенилэтиламин [87], галоацилгалогениди [88], глікозидні зв'язки [89], 6-амінокапронова кислота [90], N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропіонат (SPDP) [91], дигидразид адипінової кислоти ADH [92], фрагменти З412[93]і т. д.

Може бути використана кон'югація допомогою відновного амінірованіе. Сахарид спочатку може бути окислен з допомогою перйодата для введення альдегідної групи, яка потім може утворити пряму ковалентную зв'язок з білком-носієм за рахунок відновлювального амінірованіе,наприклад,з ε-аміногрупою лізину. При включенні в сахарид великої кількості альдегідних груп на молекулу ця техніка зв'язування може призвести до перехресно сшитому продукту, де велика кількість альдегідів взаємодіє з більшість�ід/білок та іншої кон'югат зі зв'язком через лінкер. Ця схема застосовується, зокрема, при використанні кон'югатів сахаридів різних менінгококових серогруп,наприклад,, сахариди MenA і MenC можуть бути конъюгировани через лінкер, тоді як сахариди MenW135 і MenY можуть бути конъюгировани безпосередньо з білком-носієм.

Менінгококовий сахарид може містити повнорозмірний інтактний сахарид, отриманий з менінгокока, та/або може містити фрагменти повнорозмірних сахаридів,т. е. сахариди можуть бути коротше, ніж нативні капсульні сахариди, представлені в бактеріях. Сахариди, таким чином, можуть бути деполимеризовани, причому деполімеризація відбувається в процесі або після очищення сахаридів, але перед конъюгацией. Деполімеризація зменшує довжину ланцюга сахаридів. Деполімеризація може бути використана для отримання оптимальної довжини ланцюга для імуногенності та/або зменшення довжини ланцюга можливості для фізичного маніпулювання сахаридами.

Кон'югований(е) пневмококовий(е) капсульний(е) сахарид(и)

Композиції з винаходу можуть включати пневмококовий капсульний сахарид, кон'югований з білком-носієм.

До винаходу може ставитися капсульний сахарид одного або декількох ра�а їх переважно отримують окремо, кон'югують окремо і потім об'єднують. У цій області відомі способи очищення пневмококових капсульних сахаридів (наприклад,див. посилання 95), і давно були відомі вакцини на основі очищених сахаридів 23 різних серотипів. Також були описані удосконалення цих способів,наприклад,для серотипу 3, описаного в посиланні 96, або для серотипів 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F і 19А, описаних в посиланні 97.

Пневмококовий(е) капсульний(е) сахарид(и) зазвичай(ут) вибиратися з наступних серотипів: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F та/або 33F. Таким чином, в цілому композиція може включати капсульний сахарид з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або більше різних серотипів.

Використовується поєднання серотипів являє собою 7-валентну комбінацію,наприклад,, що включає капсульний сахарид кожного з серотипів 4, 6В, 9V, 14, 18C, 19F та 23F. Інше використовується поєднання серотипів являє собою 9-валентну комбінацію,наприклад,, що включає капсульний сахарид кожного з серотипів 1, 4, 5, 6В, 9V, 14, 18C, 19F та 23F. Інше використовується поєднання серотипів являє собою 10-валентну комбінацію,наприклад,, що включає капсульний сахарид кожного з серотипів 1, 4, 5, 6Вция може додавати до 10-валентної суміші: серотипи 6А і 19А; 6А і 22F; 19A і 22F; 6A і 15B; 19A і 15B; або 22F і 15B. 13-валентна комбінація може додавати до 11-валентної суміші: серотипи 19A і 22F; 8 і 12F; 8 і 15B; 8 і 19A; 8 і 22F; 12F і 15B; 12F і 19A; 12F і 22F; 15B і 19A; 15B і 22F; 6A і 19Aі т. д.

Таким чином, використовувана 13-валентна комбінація включає капсульний сахарид серотипів 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19, 19F та 23F,наприклад,, отриманий, як описано в посиланнях 98-101. Одна з таких комбінацій включає сахарид серотипу 6В в концентрації близько 8 мкг/мл і інші 12 сахаридів у концентраціях кожного близько 4 мкг/мл Інша така комбінація включає сахариди серотипу 6А і 6В в концентрації кожного близько 8 мкг/мл і інші 11 сахаридів в концентрації близько 4 мкг/мл кожного.

Відповідні білки-носії для кон'югатів описані вище стосовно менінгококових кон'югатів. Особливо використовуваними білками-носіями для пневмококових конъюгатних вакцин є CRM197, правцевий токсоид, дифтерійний токсоид і білок DH. influenzae. CRM197 використовується в препараті PREVNARTM. У 13-валентної суміші CRM197 може використовуватися в якості білка-носія для кожного з 13 кон'югатів, і CRM197 може бути присутнім в концентрації близько 55-60 мкг/мл

При включенні в композицію кон'югатів більше ніж одного пневмококової сіро�особистих білків-носіїв. В обох випадках, проте, суміш різних кон'югатів зазвичай буде утворюватися шляхом отримання кон'югату кожного серотипу окремо і потім змішування їх з утворенням суміші окремих кон'югатів. У засланні 102 описані можливі переваги використання різних білків-носіїв в полівалентних пневмококових конъюгатних вакцинах, але в продукті PREVNARTMуспішно використовується один і той же носій для кожного з семи різних серотипів.

Білок-носій може бути ковалентно конъюгирован з пневмококові сахаридом безпосередньо або через лінкер, як обговорюється вище стосовно менінгококових кон'югатів. Техніки перехресно сшивающей кон'югації можна використовувати, зокрема, щонайменше відносно пневмококових серотипів 4, 6В, 9V, 14, 18C, 19F та 23F.

Як описано вище стосовно менінгококових сахаридів, пневмококовий сахарид може містити повнорозмірний інтактний сахарид, отриманий з пневмокока, та/або може містити фрагменти повнорозмірних сахаридів. При використанні більше ніж одного пневмококової серотипу, можливо застосовувати інтактні сахариди кожного серотипу, фрагменти кожного серотипу або застосовувати інтактні сахариди деяких с3F ці цукри переважно є інтактними. Навпаки, при включенні в композицію сахаридів серотипу 18С його переважно деполимеризуют.

Сахарид серотипу 3 також може бути деполимеризован. Наприклад, сахарид серотипу 3 може бути підданий кислотного гідролізу для деполімеризації [98], " наприклад,, використовуючи оцтову кислоту. Отримані фрагменти потім можуть бути окислені з метою активації (наприклад,, перйодатним окисленням, можливо, при наявності двовалентних катіонів,наприклад,з допомогою MgCl2), конъюгировани з носієм (наприклад,, CRM197) у відновлювальних умовах (наприклад,, використовуючи цианборогидрид натрію), і потім (необов'язково) будь нереакционноспособние альдегіди в сахариде можуть бути кэппировани (наприклад,, використовуючи боргидрид натрію) [98]. Кон'югація може бути здійснена на лиофилизованном матеріалі,наприклад,після спільної ліофілізації активованого сахаридів та носія.

Сахарид серотипу 1 може бути, щонайменше, частково де-Про-ацетилирован,наприклад,з допомогою обробки буфером з лужною рН [99], таким як бікарбонатно/карбонатний буфер. Такі (частково) де-Про-ацетилированние сахариди можуть бути окислені з метою активації (наприклад,, перйодатним окисленанборогидрид натрію), і потім (необов'язково) будь нереакционноспособние альдегіди в сахариде можуть бути кэппировани (наприклад,, використовуючи боргидрид натрію) [99]. Кон'югація може бути здійснена на лиофилизованном матеріалі,наприклад,після спільної ліофілізації активованого сахаридів та носія.

Сахарид серотипу 19А може бути окислен з метою активації (наприклад,, перйодатним окисленням), конъюгирован з носієм (наприклад,, CRM197) в DMSO у відновлювальних умовах, і потім (необов'язково) будь нереакционноспособние альдегіди в сахариде можуть бути кэппировани (наприклад,, використовуючи боргидрид натрію) [103]. Кон'югація може бути здійснена на лиофилизованном матеріалі,наприклад,після спільної ліофілізації активованого сахаридів та носія.

Пневмококковие кон'югати оптимально можуть викликати вироблення антикапсульних антитіл, які зв'язуються з відповідним сахаридом,наприклад,, викликати вироблення рівня антитіл проти сахаридів ≥0,20 мкг/мл [104]. Антитіла можуть бути оцінені за допомогою ферментного иммуноанализа (EIA) та/або вимірювання опсонофагоцитарной активності (ОРА). Широко був визнаний спосіб EIA, і існує зв'язок між концентрацією антитіл і ефект�ію можуть включати антиген(и) додаткового(их) патогена(ів). У разі таких комбінацій переважно застосування ад'юванта гидроксифосфата алюмінію і відмова від ад'юванта гідроксиду алюмінію, оскільки, як описано вище, додаткові антигени (зокрема, бактеріальні капсульні цукри) можуть бути чутливими до основної солі.

Наприклад, композиція може містити один або декілька наступних додаткових антигенів:

- антиген вірусу гепатиту В, такої як поверхневий антиген HBsAg,

- антигенBordetella pertussis, такий як кашлюковий голотоксин (РТ) і ниткоподібний гемаглютинін (FHA)B. pertussisнеобов'язково також у поєднанні з пертактином та/або агглютиногенами 2 і 3,

- дифтерійний антиген, такий як дифтерійний токсоид,

- правцевий антиген, такий як правцевий токсоид,

- сахаридний антигенHaemophilus influenzaeB (Hib), зазвичай кон'югований,

- інактивований(е) антиген(и) поліовіруса.

При включенні в композицію дифтерійного антигена переважно також включити правцевий антиген і антигени збудника кашлюку. Аналогічно, при включенні в композицію правцевого антигену переважно також включити дифтерійний і містить антигени. Аналогічно, при включенні коклюшного антигену переважно та�мпоральний препарат

Винахід відноситься до набору, містить: (i) перший компонент, що містить щонайменше один антиген fHBP, адсорбованих на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, як описано вище; та (ii) другий компонент, що містить неменингококковий иммуноген. Компоненти набору можуть бути змішані, щоб отримати імуногенну композицію для введення пацієнту з метою захисту проти великого числа патогенів.

Винахід відноситься до способу отримання комбінованої вакцини, що містить стадію змішування: (i) першого компонента, що містить щонайменше один антиген fHBP, адсорбованих на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, як описано вище; та (ii) другого компонента, що містить неменингококковий иммуноген. Змішаний матеріал потім може бути введений пацієнту. Другий компонент може бути лиофилизован, так що водний перший компонент відновлює його.

Фармацевтичні композиції

Винахід відноситься до иммуногенним композицій для введення пацієнту. Ці композиції є фармацевтично прийнятними і звичайно будуть включати відповідний носій. Детальний опис фармацевтично прийнятних носіїв доступно в посиланні 105.

Ефективні об'є�5 мл.

Величина рН композиції з винаходу зазвичай знаходиться між 6 та 8 і більш переважно між 6,5 і 7,5 (наприклад,близько 7). Як вже обговорювалося вище, композиції можуть включати буфер,наприклад,, трис-буфер, цитратний буфер, фосфатний буфер, сукцінатний буфер (такий як натрій-сукцінатний буфер) або гистидиновий буфер.

Щодо першого аспекту винаходу до і/або під час адсорбції використовується певна величина рН, що пояснювалося вище. При стабільній адсорбції, тим не менш, ця величина рН не повинна підтримуватися після адсорбції, але може бути підвищена,наприклад,ближче до нейтральної. Після адсорбції, тому така композиція може бути забуферена при величині рН вище PZC ад'юванта.

Аналогічно, величина рН композиції з другого аспекту повинна знаходитися в діапазоні від 5,0 до 7,0 перед та/або під час адсорбції, але може перебувати поза цього діапазону (наприклад,у діапазоні від 7,0 до 8,0) після адсорбції. Оптимально, тим не менш, композиції з другого аспекту підтримують, використовуючи буфер, величиною рН після адсорбції в діапазоні від 5,0 до 7,0.

При проведенні адсорбції при величині рН вище PZC ад'юванта і при стійкій адсорбції величина рН не повинна підтримуватися,бути забуферена при величині рН нижче PZC ад'юванта.

Величина рН композиції з третього аспекту знаходиться в межах 1,2 одиниць рН від PZC ад'юванта перед та/або під час адсорбції, але може перебувати поза цього діапазону після адсорбції. Оптимально, тим не менш, щоб композиції з третього аспекту підтримувалися на величині рН після адсорбції в межах 1,2 одиниць рН від PZC ад'юванта.

В деяких варіантах здійснення композиція щодо винаходу включає буфер з величиною рКа між 3,5 і 6,5, зокрема, при використанні в поєднанні з сольовим розчином. У засланні 106 вважають, що ця препаративна форма повинна використовуватися з fHBP. Можна використовувати сукцінатний буфер з концентрацією сукцинату 1-10 мМ (наприклад,, 5 мМ) з величиною рН між 5,8 і 6,0. Композиція може включати MgCl2, KCl та/або NaCl.

Композиція може бути стерильною і/або вільної від пірогенів. Композиції з винаходу можуть бути изотоничними по відношенню до людей.

Композиції з винаходу можуть включати солі натрію (наприклад,, хлорид натрію) для додання тоничности. Типова концентрація NaCl 10±2 мг/мл,наприклад,близько 9 мг/мл

Композиції з винаходу для введення пацієнтам є імуногенними і, більш переважно, вакцинними композиціями. Вакцитерапевтическими (т. е. лікувати інфекційне захворювання), але зазвичай будуть профілактичними. Імуногенні композиції, що використовуються в якості вакцин, що містять імунологічно ефективне кількість антигену(ів), а також будь-які інші необхідні компоненти. Під «імунологічно ефективним кількістю» розуміють, що введення цієї кількості індивідууму або в одній дозі, або у вигляді частини серії ефективно для лікування або профілактики. Це кількість варіює в залежності від здоров'я і фізичного стану індивіда, що одержує лікування, віку, таксономічної групи індивідуума, що одержує лікування (наприклад,, примат, відмінний від людини, приматі т. д.), здатності імунної системи індивідуума синтезувати антитіла, ступеня бажаною захисту, препаративної форми вакцини, оцінки лікарем медичної ситуації та інших пов'язаних факторів. Передбачається, що кількість буде перебувати у відносно широкому діапазоні, що може бути визначено шляхом прийнятих випробувань. Зміст антигену композицій щодо винаходу, як правило, буде виражатися в перерахунку на кількість білка на дозу.

Менінгококи впливають на багато сфер організму, і тому композиѲ вигляді ін'єкційних композицій або у вигляді розчинів, або суспензій. Композиція може бути отримана для введення в легені,наприклад,за допомогою інгалятора, використовуючи дрібнодисперсний аерозоль. Композиція може бути отримана для введення в ніс, вухо або око,наприклад,у вигляді спрею або крапель. Найбільш типовими є ін'єкційні препарати для внутрішньом'язового введення.

Композиції з винаходу можуть включати антимікробний засіб, зокрема упакований у велику кількість форматів дози. Антимікробні засоби, такі як тиомерсал і 2-феноксіетанол, широко використовуються у вакцинах, але переважно або застосування консерванту, що не містить ртуть, або взагалі відсутність консерванту.

Композиції з винаходу можуть містити детергент,наприклад,, твін (полісорбат, Твін 80. Детергенти, як правило, присутні у низьких кількостях,наприклад,, <0,01%, але для стабілізації препаративних форм антигену були запропоновані більш високі рівні [106], " наприклад,до 10%. Приблизна композиція може включати полісорбат в концентрації від 0,01 до 0,05%, і це можна використовувати, зокрема, при застосуванні липидированного(их) антигену(ів) fHBP.

Способи лікування

Винахід відноситься до способу одержанн�ї відповідь переважно являє собою захист проти менінгокока та переважно включає антитіла. Спосіб може викликати бустерну реакцію у пацієнта, який вже був примирован.

Ссавець переважно представляє собою людину. При використанні вакцини для профілактичного застосування осіб переважно представляє собою дитину (наприклад,, грудного або дитини ясельного віку) або підлітка; при використанні вакцини для терапевтичного застосування осіб переважно представляє собою дорослої людини. Вакцина, призначена для дітей, також може бути введена дорослим людям,наприклад,для оцінки безпеки, дози, імуногенностіі т. д.

Винахід відноситься до композицій щодо винаходу для застосування в якості медикаменту. Медикамент переважно використовують, як описано вище, для отримання імунної відповіді у ссавця (т. е. він є иммуногенной композицією), і більш переважно він являє собою вакцину.

Винахід відноситься до застосування щонайменше одного антигену fHBP і ад'юванта гидроксифосфата алюмінію у виробництві медикаментів для отримання імунної відповіді, як описано вище, у ссавця.

Ці застосування і способи переважно призначені для протно менінгококового) менінгіту або сепсису.

До одного із способів перевірки ефективності терапевтичного лікування відноситься моніторинг менінгококової інфекції після введення композиції з винаходу. До одного із способів перевірки ефективності профілактичного лікування відноситься моніторинг імунних відповідей на антигени після введення композиції. Імуногенність композицій щодо винаходу може бути визначена шляхом введення їх тестованим індивідуумам (наприклад,дітям у віці 12-16 місяців або твариною моделей) і потім визначення стандартних параметрів, до яких відносяться сироваткові бактерицидні антитіла (SBA) і титри ELISA (GMT) менінгокока. Ці імунні відповіді, як правило, повинні бути визначені протягом близько 4 тижнів після введення композиції і порівнюються з величинами, визначеними перед введенням композиції. Переважно підвищення SBA, щонайменше, в 4 або 8 разів. При введенні більше ніж однієї дози композиції може бути здійснено більше ніж одне визначення після введення.

Композиції з винаходу, як правило, повинні вводитися безпосередньо пацієнту. Пряма доставка може бути здійснена за допомогою парентерального введення (наприклад,, підшкірного, внутрибрюшинного, внутрішньовенно�ок в ток може бути використано для отримання системного імунітету та/або імунітету слизових оболонок. Переважно внутрішньом'язове введення в стегно або плече. Ін'єкція може бути здійснена за допомогою голки (наприклад,, гиподермальной голки), але альтернативно може бути використана безголкові ін'єкція. Типова внутрішньом'язова доза становить 0,5 мл.

Схема лікування може представляти собою схему з однією дозою або схему з великим числом доз. Велике число доз може бути використано в схемі первинної імунізації та/або в схемі реиммунизации. Схема первинної дози може бути з наступною схемою бустерної дози. Відповідний інтервал між первинними дозами (наприклад,між 4-16 тижнями) і між первинною імунізацією та реиммунизацией може бути визначений прийнятим способом.

Загальні положення

При здійсненні цього винаходу повинні використовуватися, якщо не зазначено іншого, прийняті способи хімії, біохімії, молекулярної біології, імунології та фармакології, відомі фахівцям в даній області. Такі техніки докладно пояснюються в літературі. См.,наприклад,посилання 107-113і т. д.

Термін «містить» охоплює «включає», а також «складається», " наприклад,, композиція, «містить» Х, може складатися тільки з Х або може включати що-т�риантное і середнє, наприклад,х±10%.

При описі у винаході «епітопу» цей епітоп може представляти собою В-клітинний епітоп та/або Т-клітинний епітоп, але зазвичай буде В-клітинним эпитопом. Такі епітопи можуть бути ідентифіковані емпірично (наприклад,, використовуючи PEPSCAN [114, 115] або аналогічні способи), або вони можуть бути передбачені (наприклад,, використовуючи антигенний індекс Джеймсона-Вольфа [116], підходи на основі матриць [117], MAPITOPE [118], TEPITOPE [119, 120], нейронні мережі [121], OptiMer & EpiMer [122, 123], ADEPT [124], Т сайти [125], гідрофільність [126], антигенний індекс [127] або способи, описані в посиланнях 128-132і т. д.). Епітопи являють собою ділянки антигену, які розпізнаються і зв'язуються з антигенсвязивающими сайтами антитіл або Т-клітинними рецепторами, і вони також можуть бути позначені як «антигенні детермінанти».

При використанні у винаході «очищеного» антигену цей антиген відокремлюють від його природного оточення. Наприклад, антиген повинен бути по суті вільним від інших менінгококових компонентів, відмінних від будь-яких інших очищених антигенів, які присутні. Суміш очищених антигенів зазвичай будуть отримувати шляхом очищення кожного антигену окремо і потім їх повторного об'єднання між двома амінокислотними послідовностями означають, що при вирівнюванні - це відсоток однакових амінокислот при порівнянні двох послідовностей. Це вирівнювання і відсоток гомології або ідентичності послідовностей можуть бути визначені, використовуючи програмне забезпечення, відоме в даній області, наприклад, описане в розділі 7.7.18 посилання 133. Бажане вирівнювання визначають за допомогою алгоритму пошуку гомології Сміта-Ватермана, використовуючи пошук афінних пропусків зі штрафом за відкриття пропуску 12 і штрафом за подовження пропуску 2, матриця BLOSUM 62. Алгоритм пошуку гомології Сміта-Ватермана описаний в посиланні 134.

Фраза «по суті» не виключає «повністю», " наприклад,, композиція, яка «по суті вільна» від Y, може бути повністю вільна від Y. При необхідності фраза «по суті» може бути опущена з визначення винаходу.

СПОСОБИ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ

Ад'юванти, що містять алюміній

Вивчалася адсорбція fHBP на різних адъювантах, що містять алюміній, при різних умовах. Використовувалося велике число антигенів fHBP, включаючи один fHBP (прогнозована величина pI 7,4) або гібридні суміші 2 або 3 антигенів fHBP. Деякі експерименти включали додаткові менингококковие а�ь 100% адсорбція fHBP з усіма одиничними і змішаними антигенами. Повна адсорбція також спостерігалася при трохи більш високою величиною рН при наявності гистидинового буфера в концентрації 10 мМ. Наявність додаткових ад'ювантів менінгококового поліпептиду не зменшило ступінь адсорбції fHBP.

Навпаки, з адъювантом гидроксифосфатом алюмінію при величині рН 7,0 спостерігалася лише 50% адсорбція fHBP. Ця величина рН нижче прогнозованої величини pI антигену і вище PZC ад'юванта.

Ад'юванти гідроксиди алюмінію, як правило, мають PZC близько 11,4. Таким чином, нейтральна величина рН нижче PZC ад'юванта. Навпаки, нейтральна величина рН вище PZC ад'юванта гидроксифосфата алюмінію.

Адсорбцію fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію вивчали при великому числі величин рН. Наступні дані представляють дані за величиною рН та адсорбції, отримані через 24 години після змішування. У цих трьох препаративних формах є однакові концентрація білка (50 мкг/мл) і концентрація ад'юванта (0,5 мг/мл), але використовується 10 мМ натрій-фосфатний буфер при різних величинах рН:

не адсорбується
рН% адсорбції
7,0~50%

Таким чином, ~95% адсорбція досягалася в композиції з величиною рН 5,8. Ця величина рН приблизно дорівнює PZC ад'юванта (трохи вище), але значно нижче величини pI антигену. Навпаки, при підвищеній рН (на 1,2 одиниці рН вище) або зниженою рН (на 2,3 одиниці рН нижче) адсорбція виявилася слабкою.

Високий рівень адсорбції також міг бути досягнутий підвищенням кількості ад'юванта в 4,5 рази.

Вплив буфера і величини рН досліджували у додаткових експериментах, використовуючи ад'ювант у концентрації 1 мг/мл і антиген в концентрації 100 мкг/мл Отримані наступні результати:

БуферрН% адсорбції
Натрій-фосфатний 10 мМ7,1~80%
5,9~95%
5,5~95%
4~80%
Натрій-фосфатний 5 мМ6,9n="center">~95%
Гистидиновий 5 мМ7~96%
5,9~98%
5,2~95%

Таким чином, висока адсорбція (≥95%) на гидроксифосфате алюмінію могла бути досягнута вибором відповідної величини рН. Рівні адсорбції вище 85% спостерігалися при цьому лише при величині рН в межах 1,2 одиниць рН від PZC ад'юванта (у відповідному буфері).

Як зазначено вище, ці дослідження здійснювали з fHBP, мають величину pI 7,4. Цей fHBP позначається в цьому документі далі як fHBP-v1. Додаткові дослідження здійснювали з fHBP більш ніж двох менінгококових штамів. Прогнозована величина pI для fHBP-v2 становить 5,8 і для fHBP-v3 вона становить 6,1. Більш того, досліджували злиття з об'єднанням усіх трьох v1, v2 і v3. Кожен з цих чотирьох білків змішували в концентрації 100 мкг/мл з адъювантом в концентрації 0,222 мг/мл і NaCl в концентрації 9 мг/мл Вивчали три різних величини рН препаративної форми, а саме рН 5, рН 6 і рН 7. Потім визначали ступінь адсорбції білків fHBP на гидроксифосфате алюмінію. Отримані наступні результати:

< namest="c2" nameend="c4">Адсорбція при рНpI567v 17,420-40%90-95%40-60%v 25,8>95%>95%<25%v 36,190-95%>95%80-85%v1+v2+v3->95%>95%85-90%

Ці результати підтверджують, що комбінація v1/v2/v3, яка включає один fHBP з величиною pI 5,8 і інший з величиною pI 6,1 (т. е. обидві між 5,0 і 7,0), могла досягти рівнів адсорбції ≥85%, використовуючи ад'ювант гидроксифосфат алюмінію з PZC між 5,0 і 7,0. Більш того, найвищі рівні адсорбції цієї комбінації спостерігалися при величині рН в межах 1,2 одиниць рН від тЕключением (i) v1 і v2 при величині рН більше ніж на 1,2 одиниці вище, чим PZC ад'юванта, (ii) v1 при величині рН нижче, ніж PZC ад'юванта, і величиною pI fHBP поза діапазону 5,0-7,0. Відносно низька адсорбція fHBP v2 при рН 7 могла бути подолана додаванням другого fHBP з величиною рі в діапазоні 5,0-7,0.

Таким чином, суміші великого числа варіантів fHBP з різними величинами pI можуть бути успішно змішані з високими рівнями адсорбції без потреби в гідроксиді алюмінію.

Ад'ювант імуностимулюючий олигонуклеотид + поликатионний полімер

В якості альтернативи застосування ад'ювантів на основі алюмінію з винаходу може використовуватися дисперсний комплекс імуностимулюючої олигонуклеотида і поликатионного полімеру, такий як IC31.

Три поліпептидів, які складають вакцину '5CVMB', описану в посиланні 12 (також див. посилання 135), наповнювали гідроксидом алюмінію та/або IC31. Один з цих трьох поліпептидів включає антиген fHBP.

У першій серії експериментів дев'ять груп мишей отримували антигени в кількості 10 мкг, гідроксид алюмінію в кількості 3 мг/мл і велике число доз IC31. Групи отримали наступні дев'ять композицій, причому групи 7-9 отримали ті антигени, що і групи 1-6, але змішані інакше:

Al-Н (мг/мл)
51003
6101000
71003
9101000
*Використовувалася стандартна суспензія IC31. 100 мкл цієї суспензії давало максимальну концентрацію. Більш низькі обсяги давали більш низькі концентрації. Для збереження обсягу композицій з низькими концентраціями додавали буфер до 100 мкл.

Сироватку мишей тестували проти панелі менінгококових штамів щодо бактерицидної активності.

Бактерицидні титри експерименту МР03 виявилися наступними проти шести різних штамів, А-F:

AB
5>6553620484096819225632768
6>655364096>819281921024>65536
7>655362048409640962564096
9327688192>8192>81924096>65536

Таким чином, титри, отримані з допомогою IC31, зазвичай були краще, ніж отримані зAl-Н.

Вакцину '5CVMB' об'єднували з чотирьохвалентної сумішшю менінгококових кон'югатів проти серогруп А, С, W135 і Y. Суміш наповнювали з допомогоюAl-Н або IC31 (при високій або низькій концентрації). Бактерицидні титри оказарасіпд="0" frame="all">АЗW135YНеиммунизированние<16<16<16<16Без ад'юванта1024256128512IC31високий327681638440964096IC31низький16384819210242048Al-гідроксид16384819210244096

Таким чином, найкращі титри спостерігалися з IC31.

В окремих експериментах злитий з трьох поліпептид, що містить три варіанти fHBP в порядку II-III-I (як описано в сситиген в кількості 20 мкг (при наявності або відсутність хвоста для очищення), гідроксид алюмінію в кількості 3 мг/мл і IC31 в кількості 100 мкл. Групи отримали наступне:

Доза антигену (мкг)Антигенна міткаОбсяг IC31 (мкл)Al-H (мг/мл)
120Немає1000
220Так1000
520Немає03
620Так03

Сироватку мишей тестували проти панелі менінгококових штамів щодо бактерицидної активності.

Сироватку з експерименту МР05 повторно тестували проти панелі штамів (25 в цілому). 56% штамів у групі 1 (ІСмели титр ≥1:128, тоді як у групі 5 цей титр спостерігався лише у 64% штамів. При вивченні немечених антигенів 84% штамів у групі 2 (IC31) мали титр ≥1:128 проти 76% у групі 6 (Al-H). Таким чином, більш високі бактерицидні титри досягалися, використовуючи IC31.

У додаткових експериментах по імуногенності використовували антиген fHBPII-III-Iу поєднанні з NadA і антигенами 287-953 в експерименті МР04 з тими ж угрупованнями і панеллю штамів. В групі 1 спостерігався бактерицидний титр ≥1:128-у 100% штамів порівняно лише з 84% у групі 5. При більш жорсткому порозі ≥1:1024 сироватка групи 1 виявилася бактерицидної проти 88% штамів порівняно лише з 56% у групі 5. Аналогічні результати спостерігалися з міченими антигенами, де 88% групи 2 мало бактерицидний титр ≥1:128 порівняно з 80% в групі 6. Тому кращі імунні відповіді проти менінгокока отримували знову ж таки з IC31.

В аналогічних експериментах комбінацію fHBPII-III-I, NadA і 287-953 наповнювали з допомогою Al-H або IC31. Ці композиції порівнювали з композицією, що містить вакцину 5CVMB, що включає бульбашки зовнішньої мембрани, наповнену з допомогою Al-H. Вакцина, наповнена IC31, забезпечила більш високий % покриття серед 12 протестованих штамів, ніж будь-яка інша композиція.

Такиписано лише шляхом прикладу, і можуть бути створені модифікації, в той же час залишаючись в рамках і сутності винаходу.

ПОСИЛАННЯ

[1] Masignaniet al.(2003)J Exp197:789-799.

[2] Welschet al. (2004)J Immunol172:5605-15.

[3] Houet al. (2005)J Infect Dis192(4):580-90.

[4] WO03/063766.

[5] Fletcheret al. (2004)Infect Immun72:2088-2100.

[6] Zhuet al. (2005)Infect Immun73(10):6838-45.

[7] Cantiniet al. (2006)J. Товарbiol. Chem. 281:7220-7227.

[8] WO2004/048404.

[9] WO03/020756.

[10] Sturgesset al. (1999)Vaccine17:1169-1178.

[11] US patent 7404960.

[12] Giulianiet al. (2006)PNAS USA103:10834-9.

[13] Hem & HogenEsch (2007) Chapter 4 ofVaccine Adjuvantsand Delivery Systems(ed. Singh).

[14] Burrellet al. (2001)Vaccine19:275-81.

[15]Methods in Molecular Medicine, Vol. 42 (ed. O Hagan)Vaccine Adjuvants...

[16] WO01/22992.

[17] Bjellqvistet al. (1993)Electrophoresis14:1023-31.

[18] Gasteigeret al. (2005)Protein Identification andAnalisys Tools on the ExPASy ServerinThe Proteomics ProtocolsHandbook(ed. John M. Walker), Humana Press (2005).

[19] Krieg (2003)Nature Medicine9:831-835.

[20] McCluskie et al. (2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32:179-185.

[21] WO98/40100.

[22] US 6207646.

[23] US 6239116.

[24] US 6429199.

[25] Schellacket al. (2006)Vaccine24:5461-72.

[26] Lingnauet al. (2007)Expert Rev Vaccines6:741-6.

[27] WO2004/084938.

[28] Kamathet al. (2008)Eur J Immunol38:1247-56.

[29] Riedlet al. (2008)Vaccine26:3461-8.

[30] Kritschet al. (2005)J Chromatography B822:263-70.

[3artinet al. (1997)J Exp Med185(7):1173-83.

[36] WO96/29412.

[37] US-5698438.

[38] Perkins-Baldinget al. (2003)Microbiology149:3423-35.

[39] WO01/55182.

[40] WO01/38350.

[41] WO00/23595.

[42] Ramet al. (2003)J Товарbiol Chem278:50853-62.

[43] WO2004/014417.

[44] WO98/53851.

[45] US-6531131.

[46] WO00/26384.

[47] US-6645503.

[48] WO03/070282.

[49] WO94/08021.

[50] WO2004/015099.

[51] WO2007/144316.

[52] WO2007/144317.

[53] WO03/080678.

[54] Glodeet al. (1979)J Infect Dis139:52-56.

[55] WO94/05325; US patent 5425946.

[56] Arakere & Frasch (1991)Infect. Immun. 59:4349-4356.

[57] Michonet al. (2000)Dev. Товарbiol. 103:151-160.

[58] Rubinstein & Stein (1998)J. Immunol. 141:4357-4362.

[59] WO2005/033148.

[60] WO2007/000314.

[61]Research Disclosure, 453077 (Jan 2002).

[62] EP-A-0378881.

[63] EP-A-0427347.

[64] WO93/17712.

[65] WO94/03208.

[66] WO98/58668.

[67] EP-A-0471177.

[68] WO91/01146.

[69] Falugiet al. (2001)Eur J Immunol31:3816-3824.

[70] Baraldoet al. (2004)Infect Immun72(8):4884-7.

[71] EP-A-0594610.

[72] Ruanet al. (1990)J Immunol145:3379-3384.

[73] WO00/56360.

[74] Kuoet al. (1995)Infect Immun63:2706-13.

[75] Michonet al. (1998)Vaccine.16:1732-41.

[76] WO02/091998.

[77] WO01/72337.

[78] WO00/61761.

[79] WO00/33882.

[80] WO2007/000341.

[81] Bethell G. S.et al.,J. Товарbiol. Chem., 1979,254, 2572-4.

[82] Hearn M. T. W.,J. Chromatogr., 1981,218,509-18.

[83] WO2007/000343.

[84]Mol. Immunol., 1985,22,907-919.

[85] EP-A-0208375.

[86] WO00/10599.

[87] Geveret al., Med. Microbiol. Immunol, 165:p>[93] US patent 4663160.

[94] WO2007/000342.

[95]WHO Technical Report SeriesNo. 927, 2005. Pages 64-98.

[96] US-2008/0102498.

[97] US-2006/0228381.

[98] US-2007/0231340.

[99] US-2007/0184072.

[100] US-2006/0228380.

[101] WO2008/143709.

[102] WO2007/071707.

[103] US-2007/0184071.

[104] Jodaret al. (2003)Vaccine21:3265-72.

[105] Gennaro (2000)Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20thedition, ISBN: 0683306472.

[106] WO2007/127665.

[107]Methods In Enzimology(S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.).

[108]Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications).

[109] Sambrooket al. (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rdedition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[110]Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(Birdi, K. S. ed., CRC Press, 1997).

[111] Ausubelet al. (eds) (2002)Short protocols in molecular biology,5thedition (Current Protocols).

[112]Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course,(Reamet al., eds., 1998, Academic Press).

[113] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nded. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag).

[114] Geysen et al. (1984)PNAS USA81:3998-4002.

[115] Carter (1994)Methods Mol Товарbiol36:207-23.

[116] Jameson, BAet al. 1988,CABIOS4(1):181-186.

[117] Raddrizzani & Hammer (2000)Brief Bioinform1(2):179-89.

[118] Bublilet al. (2007)Proteins68(1):294-304.

[119] De Lallaet al. (1999)J. Immunol.163:1725-29.

[120] Kwoket al.(2001)Trends Immunol22:583-88.

[121] Brusicet al.(1998)Bioinformatics14(2):121-30.

[122] Meisteret al. (1995)Vaccine13(6):581-91.

; e la Cruz (1991)Nature349(6311):720-1.

[126] Hopp (1993)Peptide Research6:183-190.

[127] Wellinget al. (1985)FEBS Lett. 188:215-218.

[128] Davenportet al. (1995)Immunogenetics42:392-297.

[129] Tsurui & Takahashi (2007)J Pharmacol Sci. 105(4):299-316.

[130] Tonget al. (2007)Brief Bioinform. 8(2):96-108.

[131] Schirleet al. (2001)J Immunol Methods. 257(1-2):1-16.

[132] Chenet al. (2007)Amino Acids33(3):423-8.

[133]Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubelet al., eds., 1987) Supplement 30.

[134] Smith & Waterman (1981)Adv. Appl. Math. 2:482-489.

[135] WO2004/032958.

1. Забуференная иммуногенная композиція для профілактики та/або лікування захворювання, спричиненого N. meningitidis, що містить щонайменше два різних менінгококових антигену fHBP, кожен з яких щонайменше на 85% адсорбується на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) кожен з двох різних антигенів fHBP має изоэлектрическую точку між 5,0 і 7,0, і (ii) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,0 і 7,0.

2. Композиція з п. 1, де величина pH забуференной композиції знаходиться в діапазоні від 5,0 до 7,0.

3. Композиція з п. 1, де (i) обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрическую точку між 5,0 і 6,0 (ii) гидроксифосфат алюмінію має изоэлектрическую точку між 5,0 і 6,0.

4. Композиція з п. 3, де иммуногенная кмпозиция включає буфер для підтримки рн у діапазоні від 5,0 до 6,0.

6. Композиція з п. 3, де композиція не включає ад'юванта гідроксиду алюмінію.

7. Композиція з п. 6, що містить кон'югований бактеріальний капсульний сахарид.

8. Композиція з п. 3, де два різних антигену fHBP являють собою: (a) перший поліпептид, що містить аминокислотную послідовність, яка має щонайменше 95% ідентичності послідовності з SEQ ID NO:4; та (b) другий поліпептид, що містить аминокислотную послідовність, яка має щонайменше 95% ідентичності послідовності з SEQ ID NO:6.

9. Композиція з п. 8, де перший являє собою поліпептид ліпопротеїн, має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:23, і другий поліпептид являє собою ліпопротеїн, має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:25.

10. Композиція з п. 1, де два різних антигену fHBP являють собою: (i) перший і другий поліпептид; (ii) перший і третій поліпептид; або (iii) другий і третій поліпептид, вибрані з:
(a) першого поліпептиду, що містить аминокислотную послідовність, (i) має щонайменше 84% ідентичності послідовності з SEQ ID NO:1 та/або (ii) що складається з фрагмента щонайменше з 20 послідовних амінокислот SEQ ID NO:1;
(b) другого поліпептиду, з� з SEQ ID NO:2 і/або (ii) що складається з фрагмента щонайменше з 20 послідовних амінокислот SEQ ID NO:2;
(c) третього поліпептиду, що містить аминокислотную послідовність, (i) має щонайменше 84% ідентичності послідовності з SEQ ID NO:3, та/або (ii) що складається з фрагмента щонайменше з 20 послідовних амінокислот SEQ ID NO:3.

11. Композиція з п. 1, де два різних антигену fHBP являють собою: (i) перший і другий поліпептид; (ii) другий і третій поліпептид, вибрані з:
(a) першого поліпептиду, що містить аминокислотную послідовність, яка має щонайменше 95% ідентичності послідовності з SEQ ID NO:4;
(b) другого поліпептиду, що містить аминокислотную послідовність, яка має щонайменше 95% ідентичності послідовності з SEQ ID NO:6;
(c) третього поліпептиду, що містить аминокислотную послідовність, яка має щонайменше 95% ідентичності послідовності з SEQ ID NO:5.

12. Композиція з п. 1, в яких поліпептиди fHBP липидировани за N-кінцевого цистеїну, де ліпід містить пальмитоил.

13. Композиція з п. 1, де гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,4 і 6,2.

14. Композиція з п. 1, де гидроксифосфат алюмінію має молярне співвідношення Р/Al між 0,85 і 1,0.

15. Композиція з п. 1, де гидроксифосфат алюмінію являє собою амотавляет <2 мг/мл

17. Иммуногенная композиція для профілактики та/або лікування захворювання, спричиненого N. meningitidis, що містить два різних менінгококових антигену fHBP, кожен з яких адсорбується на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрическую точку між 5,0 і 7,0, і (ii) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,0 і 7,0.

18. Композиція з п. 17, включає буфер для підтримки величини pH в діапазоні від 5,0 до 7,0.

19. Композиція з п. 17, де обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрическую точку між 5,0 і 6,0.

20. Композиція з п. 17, де гидроксифосфат алюмінію має изоэлектрическую точку між 5,0 і 6,0.

21. Композиція з п. 17, де композиція має pH, який знаходиться в межах 0,5 одиниць pH від точки нульового заряду ад'юванта.

22. Композиція з п. 17, включає буфера, який підтримує pH в межах 0,5 одиниць pH від точки нульового заряду ад'юванта.

23. Забуференная иммуногенная композиція для профілактики та/або лікування захворювання, спричиненого N. meningitidis, що містить два різних менінгококових антигену fHBP, кожен з яких адсорбується на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) кожен менінгококовий антиген fHBPину pH, яка знаходиться в межах 1,2 одиниць pH від точки нульового заряду ад'юванта.

24. Композиція з п. 23, включає буфера, який підтримує pH в межах 1,2 одиниць pH від точки нульового заряду ад'юванта.

25. Спосіб адсорбції двох різних менінгококових антигенів fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію для отримання иммуногенной композиції, де (i) обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрическую точку між 5,0 і 7,0, (ii) ад'ювант гидроксифосфат алюмінію має точку нульового заряду між 5,0 і 7,0, і (iii) адсорбція обох антигенів fHBP відбувається за величиною pH між 5,0 і 7,0.

26. Спосіб адсорбції двох різних менінгококових антигенів fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де (i) обидва менінгококових антигену fHBP мають изоэлектрические точки, які вище, ніж точка нульового заряду ад'юванта, і (ii) адсорбція кожного антигену відбувається при забуференному pH, який знаходиться в межах 1,2 одиниць pH від точки нульового заряду ад'юванта.

27. Спосіб адсорбції двох різних менінгококових антигенів fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюмінію, де адсорбція обох антигенів fHBP відбувається за величиною pH, яка дорівнює або нижче точки нульового заряду гидроксифосфата алюмінію.



 

Схожі патенти:

Комбінації, що включають сахарид пневмокока серотипу 14

Група винаходів відноситься до медицини і стосується ад'ювантної иммуногенной композиції, що містить липоолигосахарид менінгокока (LOS) та капсулярних сахарид пневмокока серотипу 14 (CS14), де CS14 містить тетрасахарид Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, a LOS не містить тетрасахарид Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc. Група винаходів також стосується способу індукції імунної відповіді у ссавця, що включає введення зазначеної композиції. Група винаходів забезпечує більш сильний відповідь на CS14 порівняно з OMV дикого типу, що включає LNnT. 2 н і 13 з.п. ф-ли, 4 іл., 1 пр.

Нелипидизированние варіанти антигенів neisseria meningitidis orf2086

Група винаходів відноситься до галузі біохімії, зокрема до имунногенной композиції, яка індукує перехресні бактеріальні антитіла до ряду штамів Neisseria meningitidis серотипу Ст. Иммуногенная композиція містить в якості активного компонента варіанти нефункционализированного піровиноградної кислоти, нелипидизированного поліпептиду ORF2086 і складається з амінокислотної послідовності, обраної з групи SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 20 і SEQ ID NO: 21, де поліпептид включає делецию N-термінального Cys порівняно з відповідним нелипидизированним поліпептидом ORF2086 дикого типу. Також розкрито плазміда, яка экспресирует нефункционализированний піровиноградної кислоти, нелипидизированний поліпептид ORF2086. Розкрито спосіб продукування бактерицидних антитіл, специфічних до ORF2086 підродини серогрупи В Neisseria meningitidis у ссавців. Розкрито спосіб отримання нефункционализированного піровиноградної кислоти, нелипидизированного поліпептиду ORF2086. Винахід дозволяє ефективно індукувати перехресні бактеріальні антитіла до Neisseria meningitidis серотипу 15 Ст. н. і 17 з.п. ф-ли, 8 іл., 14 табл., 13 пр.

Вакцини на основі солюбилизированних і комбінованих капсулярних полісахаридів

Винахід відноситься до біохімії і являє собою набір для профілактики або лікування бактеріального менінгіту, що містить: (а) кон'югований капсулярних сахарид, що відбувається з N. meningitidis серогрупи А, в ліофілізованої формі; і (b) капсулярние сахариди, що відбуваються з N. meningitidis серогруп, W135 і Y, в рідкій формі, в якому співвідношення (мас./мас.) сахаридів серогрупи А і сахаридів серогрупи С перевищує 1. Винахід дозволяє отримувати ефективні вакцини на основі зазначеного набору. 2 н. і 27 з.п. ф-ли, 19 іл.

Композиції, які включають антигени neisseria meningitidis з серогруп в і с, і додатковий антиген

Винахід розкриває імуногенну композицію, що має імуногенну активність відносно Neisseria meningitidis з серогруп В і С, що містить (а) олігосахарид N. meningitidis серогрупи С (Nmc), (в) протеолипосомние везикули зовнішньої мембрани N.meningitidis серогрупи (NmB) і (з) білок NmB, що містить аминокислотную послідовність, наведену в описі, або иммуногенний фрагмент зазначеній послідовності, або послідовність щонайменше на 80% ідентичною зазначеній послідовності. Компонент (а) може бути конъюгирован з носієм, наприклад білком, CRM197, дифтерійним токсоидом або токсоидом правця. Иммуногенная композиція може містять в якості ад'юванта гідроксид алюмінію або MF59. Описана вакцина проти N.meningitidis з серогруп В і С, що містить описану імуногенну композицію. Використання винаходу дозволяє отримати комбіновану вакцину, що викликає імунну відповідь на обидві серогрупи збудника. 2 н. і 4 з.п. ф-ли, 4 іл., 5 табл., 6 пр.

Набір для отримання иммуногенной композиції проти neisseria meningitidis серологічної групи в

Винахід відноситься до області імунології і стосується приготування менінгококових вакцин. Представлений набір для отримання иммуногенной композиції проти Neisseria meningitidis серологічної групи B, що містить: (i) перший контейнер, що містить ад'ювант, що включає емульсію типу " масло в воді; і (ii) другий контейнер, що містить лиофилизированную антигенну композицію, що включає иммуноген для індукції імунної відповіді проти Neisseria meningitidis серологічної групи B. Ліофілізовані антигени Men-B можуть бути відновлені в рідку ад'ювантну форму, готову для введення пацієнту на момент використання. Ліофілізований компонент також може включати один або кілька кон'югованих сахаридов з N. meningitidis серологічних груп A, C, W135 та/або Y. Представлене винахід дозволяє отримати стабільні при зберіганні та ефективні композиції. 6 з.п. ф-ли, 3 іл.

Нейссериальние вакцинні композиції, що містять комбінацію антигенів

Даний винахід відноситься до медицини, біофармацевтики і може бути використане для приготування вакцин. Для цього иммуногенная композиція містить: 1) антиген нейссериальний аутотранспортерний білок, який представляє собою NadA або Hsf; 2) антиген нейссериальний білок, що бере участь в засвоєнні заліза, який представляє собою Lipo28 або низькомолекулярний та високомолекулярний TbpA і 3) препарат везикул зовнішньої мембрани, що включає нейссериальний ліпополісахарид (LPS) иммунотипа L3; і де зазначені антигени, у тих випадках, коли вони присутні в везикуле зовнішньої мембрани, позитивно відрегульовані рекомбінантним чином у зазначеній везикуле зовнішньої мембрани. При використанні даної вакцини - комбінації нейссериальних антигенів з різних класів, генерується імунну відповідь, який є більш сильним в одиницях бактерицидної активності. 16 з.п.ф-ли, 11 іл., 21 пр.

Менингококковие поліпептиди fhbp

Винахід відноситься до галузі біохімії

Вакцини, що містять алюмінієві ад'юванти і гістидин

Винахід відноситься до фармакології і стосується иммуногенной композиції, що містить антиген Neisseria meningitidis, сіль алюмінію і гістидин, де рН композиції становить від 6,3 до 7,0
Up!