Тканеспецифические біомаркери старіння

 

ПЕРЕХРЕСНІ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка претендує на пріоритет попередньої заявки на патент США серійний No. 61/209854, зареєстрованої 11 березня 2009, розкриття якої включено в справжній документ шляхом відсилання.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Область техніки, до якої належить винахід

Винахід в цілому відноситься до області підтримки з допомогою харчування здоров'я і тривалості життя тварин. Особливо винахід забезпечує способи розробки тканеспецифических універсальних біомаркерів старіння у тварин, а також набори надійних біомаркерів ідентифікованих цими способами і застосування тканеспецифических універсальних біомаркерів старіння для ідентифікації поживних речовин і інших функціональних інгредієнтів або агентів, що володіють властивостями, що омолоджують у тварин.

Рівень техніки

Було показано, що обмеження в споживанні калорій в кількостях, що значно нижче рівня ad libitum, збільшує тривалість життя, знижує або відкладає наступ багатьох вікових станів, покращує стійкість до стресу і уповільнює функціональне погіршення здоров'я у багатьох видів тварин, зокрема ссавців, таиспитания для оцінки впливу на збільшення тривалості життя в результаті обмежень в споживанні калорій (CR) у людей. Але у людей, також як і у тварин, здається малоймовірним, що CR являє собою ефективну стратегію для збільшення тривалості життя для більшості індивідуумів з-за ступеня і тривалості необхідних обмежень. З цієї причини дослідження було зосереджено на ідентифікації речовин, наприклад, фармацевтичних агентів, поживних речовин і подібних їм, здатних імітувати ефект CR без істотної зміни в харчовому раціоні.

Зусилля були спрямовані на пошук агентів, які можуть імітувати один або кілька фізіологічних або біохімічних ефектів CR (див., наприклад, Ingram et al., 2004, supra) або які можуть імітувати профіль генної експресії, асоційованих з CR в певних тканинах і органах (наприклад, Spindler, U. S. Patent 6,406,853; U. S. Patent Pub. 2003/0124540). У зв'язку з останнім, були розкриті способи аналізу генів, асоційованих з CR, і скринінгу CR-миметиков, на підставі профілю генної експресії (Spindler et al., публікація патенту США 2004/0180003, 2004/0191775 і 2005/0013776; Pan et al., публікація патенту США 2007/0231371).

Незважаючи на доступність викладених вище підходів, зберігається необхідність у більш надійних, швидких і менш дорогих способи скринінгу агентів, здатних замедлитзни. Даний винахід відповідає цій вимозі.

РОЗКРИТТЯ ВИНАХОДУ

Отже, мета цього винаходу полягає в забезпеченні надійних способів ідентифікації та універсально застосовних маркерів експресії генів старіння в обраних тканинах і в забезпеченні наборів надійних і універсально застосовних маркерів експресії генів, ідентифікованих цими способами.

Інша мета винаходу полягає в забезпеченні одного або декількох генів або сегментів гена, що диференційно експресуються в обраних тканинах старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами.

Додаткова мета винаходу полягає в забезпеченні набору, що включає безліч полінуклеотидів, що диференційно експресуються в обраних тканинах старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами.

Інша мета винаходу полягає в забезпеченні композицій з двох або кількох полінуклеотидних або поліпептидних зондів, придатних для детекції експресії генів, що диференційно експресованих в обраних тканинах старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами та пристроїв, таких як чіпи, що містять зонди на підкладці.

Додаткова мета� генів, диференційно експресованих в обраних тканинах старих суб'єктів, у порівнянні з молодими суб'єктами або стандартним контрольним зразком.

Інша мета винаходу полягає в забезпеченні способу вимірювання ефекту досліджуваного речовини на профілі експресії одного або декількох генів, що диференційно експресованих в обраних тканинах старих суб'єктів, у порівнянні з молодими суб'єктами або стандартним контрольним зразком.

Одну або декілька з цих цілей досягають, застосовуючи нові способи ідентифікації тканеспецифических біомаркерів старіння і нові комбінації полінуклеотидів або поліпептидів, що представляють собою гени і сегменти гена, що диференційно експресуються в обраних тканинах старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами. Полінуклеотиди застосовують для одержання композицій, зондів, пристроїв, заснованих на зондах, і способів визначення статусу полінуклеотидів, диференційно експресованих в обраних тканинах старих суб'єктів, у порівнянні з молодими суб'єктами або стандартним контрольним зразком, які корисні для досягнення вищевказаних цілей, наприклад, для прогнозування та діагностування вікових станів у ктом в певних тканинах. Також забезпечують різноманітні набори, що включають комбінації зондів, пристрої, в яких застосовані зонди, і речовини, а також різні комп'ютерні програми, що містять інформацію щодо застосування і засоби комунікації для передачі інформації, що має відношення до диференціально экспрессируемим генам і способів їх застосування.

Інші додаткові цілі, ознаки і переваги винаходу легко зрозумілі фахівцям у цій галузі техніки.

ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ

Визначення

Для застосування в цьому документі, діапазони вказані в скороченому вигляді, для того, щоб уникнути необхідності наводити довгий варіант і описувати всі, без винятку, величини діапазону. В залежності від ситуації може бути обрана будь-яка відповідна величина всередині діапазону, підходить в якості верхнього значення, нижнього значення або межі діапазону. Ясно, що всі без винятку, цілі або дробові числа між будь-якими діапазонами або інтервалами, наведеними в цій заявці, включені в цю заявку.

Використовується тут і в прикладеній формулі винаходу слово в однині включає множину і, навпаки, крім тих випадків, коли контекст ясн�х», «способів» або «речовин». Подібним чином, слова «включають», «включає» і «включає» слід інтерпретувати швидше включно, ніж виключно.

Термін «тварина» означає людину чи інша тварина, включаючи птахів, велику рогату худобу, собак, коней, кішок, кіз, мишей, овець і свиней. Якщо термін застосовують у контексті порівняння досліджуваних суб'єктів, то тварини, яких порівнюють, являють собою тварин одних і тих же видів і, при можливості, однієї і тієї ж раси або породи. «Тварина-компаньйон» являє собою будь-яке домашнє тварина і включає, без обмеження, кішок, собак, кроликів, морських свинок, тхорів, хом'яків, мишей, піщанок, коней, корів, кіз, овець, ослів, свиней і їм подібних. Переважно, тварина являє собою людину або тварину-компаньйона, таке як собака або кішка.

Термін «антитіло» означає будь-імуноглобулін, який зв'язується зі специфічним антигеном, і включає антитіла IgG, IgM, IgA, IgD та IgE. Термін включає поліклональні, моноклональні, моновалентні, гуманізовані антитіла, гетероконъюгати, композиції антитіл з полиэпитопной специфічністю, химерні, биспецифичние антитіла, диатела, одноцепочечние антитіла і фра�т впорядковане розташування, щонайменше, двох зондів на підкладці. Щонайменше, один зонд являє собою контрольний або стандартний зонд, і, щонайменше, один зонд являє собою діагностичний зонд. Розміщення приблизно від двох до приблизно 40000 зондів на підкладці гарантує, що розмір та інтенсивність сигналу від кожного міченого комплексу, сформованого між зондом і полинуклеотидом або поліпептидом зразка, індивідуально помітні.

Термін «комплекс зв'язування» означає комплекс, що формується, коли поліпептид у зразку специфічно зв'язується (як визначено в цій заявці) з партнером по зв'язуванню, таким як антитіло або його функціональний фрагмент.

Термін «обмеження в калоріях» або «обмеження калорійності» означає будь-який режим харчування з низьким вмістом калорій, без недоїдання. В цілому, обмеження стосується загального вмісту калорій, одержуваних з вуглеводів, жирів і білків. Обмеження зазвичай становить, хоча не обмежується, приблизно від 25% до приблизно 40% від калорійності споживаної їжі порівняно з калорійністю споживання ad libitum.

Термін «харчова добавка» означає продукт, який призначений для споживання у додатку до нормальної дієти живоѺ, капсул, порошку і їм подібних. Переважно, їх забезпечують у відповідних лікарських формах. У деяких втіленнях їх забезпечують в упаковках для великих споживачів, таких як нерозфасовані порошки або рідини. В інших втіленнях, добавки забезпечують великими партіями для включення в інші харчові продукти, такі як сухі сніданки, ласощі, батончики з добавками, напої та їм подібні.

Термін «диференційна експресія» або «диференціально экспрессируемий» означає збільшену або підвищену експресію гена чи означає ослаблену або знижену експресію гена, яку знаходять за відсутності присутності або, щонайменше, дворазовому зміни в кількості транскрибируемой інформаційної РНК або трансльованого білка в зразку.

Термін «ефективна кількість» означає кількість сполуки, матеріалу, композиції, лікарського засобу або іншого матеріалу, який ефективно для досягнення певного біологічного результату, такого як звернення або уповільнення старіння обраної тканини, як описано в цій заявці.

Термін «їжа» або «харчова композиція» означає композицію, яка призначена для поглинання живкт, розроблений для споживання людиною», являє собою будь-яку композицію, специфічно призначену для поглинання людиною. «Корм для тварин» являють собою композиції, призначені для споживання домашніми тваринами, переважно, тваринами-компаньйонами. «Повний і збалансований за поживними речовинами корм для тварин» являє собою такий корм, який містить всі відомі необхідні поживні речовини для одержувача або споживача корми, у відповідних кількостях і пропорціях, які базуються, наприклад, на рекомендаціях визнаних авторитетів у галузі живлення тварин-компаньйонів. Такі корми, отже, здатні служити в якості єдиного джерела харчового раціону для підтримки життя або стимуляції продуктивності, без додавання додаткових поживних джерел. Композиції збалансованого по поживним речовин корму для тварин широко відомі і широко застосовуються в цій галузі техніки.

Термін «фрагмент» означає (1) олигонуклеотидную або полинуклеотидную послідовність, яка являє собою частину повної послідовності і яка володіє такою ж або спорідненою акт� полипептидная послідовність, яка являє собою частину повної послідовності і яка має таку ж або подібною активністю при специфічному застосуванні, як і повна полипептидная послідовність. Такі фрагменти можуть включати будь-яку кількість нуклеотидів або амінокислот, які вважаються придатними для специфічного застосування. Зазвичай, олігонуклеотидні або полинуклеотидние фрагменти містять, щонайменше, приблизно 10, 50, 100 або 1000 нуклеотидів, і поліпептидні фрагменти містять, щонайменше, приблизно 4, 10, 20 або 50 послідовних амінокислот з повної послідовності. Термін охоплює варіанти фрагментів полінуклеотидів і поліпептидів.

Термін «ген» або «гени» означає повний або часткові сегмент ДНК, залучений до продукування поліпептиду, включаючи ділянки, що передують кодуючої області і наступні за нею (лидерний і трейлерних) і проміжні послідовності (интрони) між індивідуальними кодирующими сегментами (экзонами). Термін охоплює будь-яку послідовність ДНК, яка гибридизуется з комплементарної ланцюгом, кодуючої послідовності гена.

Термін «генний продукт» означає продукт транскрипції гена, такий як мРНК або її производниеяции, який являє собою білок. Термін «генний продукт» може бути застосований взаємозамінно з терміном «білок» в цій заявці.

Термін «гомолог» означає (1) полинуклеотид, включаючи полінуклеотиди з однакових або різних видів тварин, що має більш ніж 30%, 50%, 70% або 90% збіжності послідовності з полинуклеотидом порівняння і має однакові або істотно схожі властивості і демонструє однакову або істотно схожу з полинуклеотидом порівняння функцію, або володіє здатністю специфічно гибридизоваться з полинуклеотидом порівняння в жорстких умовах; або (2) поліпептид, включаючи поліпептиди з однакових або різних видів тварин, що має більш ніж 30%, 50%, 70% або 90% подібності в послідовності з поліпептидом порівняння і має однакові або істотно схожі властивості і демонструє однакову або істотно схожу з поліпептидом порівняння функцію, або володіє здатністю специфічно зв'язуватися з поліпептидом порівняння. При відсиланні до фрагментів повнорозмірною кодуючої послідовності, функція цих фрагментів може просто полягати в кодуванні вибраної частини поліпептиду певної послідовність або, соответстве�т поліпептид. При відсиланні до фрагментів поліпептиду, функція цих фрагментів може полягати у формуванні епітопу, придатного для генерації антитіла. Подібності в послідовності двох поліпептидних послідовностей або двох полінуклеотидних послідовностей визначають, застосовуючи способи, відомі фахівцям у цій галузі техніки, наприклад, алгоритм Karlin і Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990)). Такий алгоритм включений в програми NBLAST і XBLAST Altschul et al. (J. Mol. Товарbiol. 215:403-410 (1990)). Для отримання вирівнювань з розривами для цілей порівняння, може бути застосована програма Gapped Blast, як описано у Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). При застосуванні програм BLAST і Gapped BLAST, застосовують параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, XBLAST і NBLAST). Дивись .

Термін «гибридизационний комплекс» означає комплекс, який формується між полинуклеотидами зразка, коли пурини одного полинуклеотида утворюють водневі зв'язки з пиримидинами комплементарного полинуклеотида, наприклад, пар підстав 5'-A-G-T-C-3', 3'-T-C-A-G-5'. Ступінь комплементарності і застосування аналогів нуклеотидів визначають ефективність і жорсткість умов реакції гібридизації.

Термін «спільно» означає, що лікарський пр�і (2) окремо, з однаковою або різною частотою, застосовуючи однакові або різні шляхи введення за приблизно однаковий час або періодично. «Періодично» означає, що речовина вводять за схемою застосування, прийнятною для специфічної речовини. «Приблизно однаковий час» зазвичай означає, що речовина (їжа або лікарський препарат) вводять в однаковий час або протягом приблизно 72 годин один від одного. «Спільно» специфічно включає схеми введення, при яких речовини, такі як лікарські препарати, вводять протягом зазначеного періоду, а композиції винаходу вводять протягом невизначеного періоду часу.

Термін «індивідуальний», при посиланні на тварину, означає індивідуальне тварина будь-якого виду або типу. Цей термін може бути застосований взаємозамінно з терміном «суб'єкт».

Термін «довгожительство» зазвичай означає тривалість життя за межами середньої прогнозованої тривалості життя для певного виду або для певної лінії, породи або етнічної групи всередині цього виду, якщо існують відмінності всередині виду. «Покращена тривалість життя» або «збільшена тривалість життя» означає будь-яке суттєве подовження продов виду, до якого тварина належить.

Термін «полинуклеотид» або «олигонуклеотид» означає полімер нуклеотидів. Термін охоплює молекули ДНК і РНК (включаючи кДНК і мРНК), як одноцепочечние, так і двухцепочечниє, і, якщо одноцепочечние, то з комплементарної послідовністю як в лінійній, так в кільцевій формі. Термін охоплює також фрагменти, варіанти, гомологи і алелі, як підходящі для послідовностей, які мають однакові або істотно схожі властивості і демонструють однакову або істотно схожу з оригінальною послідовністю функцію. В особливості, термін охоплює гомологи з різних видів, наприклад, миші, собаки або кішки. Послідовності можуть бути повністю комплементарни (без помилково спарених підстав) при вирівнюванні або можуть мати аж до приблизно 30% помилково спарених підстав послідовності. Переважно, для полінуклеотидів, ланцюг містить приблизно від 50 до 10000 нуклеотидів, більш переважно приблизно від 150 до 3500 нуклеотидів. Переважно, для олігонуклеотидів, ланцюг містить приблизно від 2 до 100 нуклеотидів, більш переважно приблизно від 6 до 30 нуклеотидів. Точний розмір полинуклеотида або олигонукигонуклеотида. Термін включає нуклеотидні полімери, які синтезують, і які ізолюють і очищають з природних джерел. Термін «полинуклеотид» включає термін «олигонуклеотид».

Термін «поліпептид», «пептид» або «білок» означає полімер амінокислот. Термін охоплює природні та неприродні (синтетичні) полімери і полімери, в яких одна або кілька амінокислот замінені штучними хімічними миметиками. Термін охоплює також фрагменти, варіанти та гомологи, які мають однакові або істотно схожі властивості і демонструють однакову або істотно схожу з оригінальною послідовністю функцію. Термін охоплює полімери будь-якої довжини, переважно полімери, що містять приблизно від 2 до 1000 амінокислот, більш переважно від приблизно 5 до 500 амінокислот. Термін включає полімери амінокислот, які синтезують і які ізолюють і очищають з природних джерел.

Термін «зонд» означає (1) олигонуклеотид або полинуклеотид, як РНК, так і ДНК, або природний у вигляді очищеного після ферментативного розщеплення полинуклеотида, або отриманий з допомогою синтезу, який здатний до відпалу з полинуклеотидом з послідовностями, комплементарн� поліпептид, здатні специфічно зв'язуватися з певним білком або фрагментом білка з істотним винятком інших білків або фрагментів білків. Олигонуклеотидний або полинуклеотидний зонд може бути як одноцепочечний, так і двухцепочечний. Точна довжина зонда буде залежати від багатьох факторів, включаючи температуру, джерело і застосування. Наприклад, для діагностичного застосування, в залежності від складності цільової послідовності, олигонуклеотидний зонд зазвичай містить приблизно від 10 до 100, від 15 до 50 або від 15 до 25 нуклеотидів. У деяких діагностичних програмах, полинуклеотидний зонд містить приблизно 100-1000, 300-600 нуклеотидів, переважно приблизно 300 нуклеотидів. Зонди в цій заявці вибирають так, щоб вони були «в значній мірі» комплементарни різних ниток певній послідовності-мішені. Це означає, що зонди повинні бути в достатній мірі комплементарни для специфічної гібридизації або відпалу з їх відповідними послідовностями-мішенями в заздалегідь заданому наборі умов. Отже, послідовність-зонд не повинна бути повністю комплементарна послідовності мішені. Наприклад, некомплементарний нуклеотидний фрагмент може побут�ледовательности-мішені. Альтернативно, некомплементарние підстави або більш довгі послідовності можуть бути включені в послідовність зонда, якщо послідовність-зонд в достатній мірі комплементарна послідовності полинуклеотида-мішені для специфічного відпалу з полинуклеотидом-мішенню. Пептид або поліпептидний зонд може являти собою будь-яку молекулу, з якою білок або пептид специфічно зв'язується, включаючи ДНК (ДНК-зв'язуючих білків), антитіла, рецептори клітинної мембрани, пептиди, кофактори, лектини, цукри, полісахариди, клітини, клітинні мембрани, органели і мембрани органел.

Термін «зразок» означає будь-яку тканину або рідина тварини, що містять, наприклад, полінуклеотиди, поліпептиди, антитіла, метаболіти і їм подібних, включаючи клітини та інші тканини, що містять ДНК і РНК. Приклади включають жирову тканину, кров, хрящ, сполучну тканину, епітеліальну тканину, лімфоїдну тканину, м'язи, нерви, мокротиння і їм подібні. Зразок може бути твердим або рідким і може являти собою ДНК, РНК, кДНК, рідини організму, такі як кров чи сеча, клітини, клітинні препарати або розчинні фракції або аликвоти їх середовища, хромосоми, органели та їм подібні.

або пов'язані з ним і розглядаються як одиниця для виробництва, розповсюдження, продажу або застосування. Контейнери включають, але не обмежуються, мішки, коробки, пляшки, упаковки в термоусадочній плівці, скріплені металевими скріпками або іншим чином зафіксовані компоненти або їх комбінації. Разова упаковка може представляти собою контейнери з індивідуальними харчовими композиціями, фізично приєднаними так, щоб їх розглядали як одиницю для виробництва, розповсюдження, продажу або застосування.

Термін «специфічно зв'язується» означає спеціальна і точна взаємодія між двома молекулами, яка залежить від їх структури, зокрема, від бічних груп їх молекул. Наприклад, интеркаляция регуляторного білка у велику борозенку молекули ДНК, утворення водневих зв'язків уздовж вуглецевого скелета між двома одноцепочечними нуклеїновими кислотами або зв'язування між эпитопом білка і агоністом, антагоністом або антитілом.

Термін «специфічно гибридизуется» означає асоціацію двох одноланцюгових полінуклеотидів, що мають в достатній мірі комплементарні послідовності (іноді визначаються як «значною мірою комплементарні»), так щоб відбулася гібридизація в заздалегідь опреолинуклеотидного зонда значною мірою комплементарної послідовністю, яка міститься в молекулі одноланцюгової ДНК або РНК, відповідно до аспектом винаходу, з істотним винятком гібридизації полинуклеотидного зонда з одноцепочечними полинуклеотидами некомплементарной послідовності.

Термін «стандарт» означає (1) контрольний зразок, який містить тканина з суб'єкта, якому було введено контрольне речовина або речовина порівняння або не було введено жодного речовини, у порівнянні із зразком, який містить тканина з суб'єкта, якому було введено досліджуване речовина, наприклад, для визначення, чи викликає досліджуване речовина диференційну експресію гена, придбану в контексті його застосування.

Термін «жорсткі умови» означає (1) гібридизацію в 50% (об'єм/об'єм) формаміді з 0,1% бичачим сироватковим альбуміном, 0,1% Фиколлом, 0,1% полівінілпіролідоном, 50 мМ натрій-фосфатному буфері при рн 6,5 з 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрату натрію при 42°C, (2) гібридизація в 50% формаміді, 5х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрію), 50 мМ фосфату натрію (рн 6,8), 0,1% пирофосфате натрію, 5х розчині Денхардта, обробленої ультразвуком ДНК з молок лососевих (50 мкг/мл), 0,1% SDS і 10% сульфате декстрану при 42°C; з промивки при 42°C 0,2 х SSC і 0,1% SDS або з промивки з 0,015 М� іонної сили і високої температури, таких же агентів для промивок і схожих денатуруючих агентів.

Термін «тканиноспецифічний маркер» або «тканеспецифических біомаркер», застосовуваний в цій заявці, означає гени і продукти їх експресії, що диференційно експресуються в обраної тканини старого суб'єкта в порівнянні з молодим суб'єктом. Термін «тканиноспецифічний» призначений для того, щоб охопити тканини і органи. Наприклад, вибрана тканина може бути гладком'язових тканиною з серця, і тканеспецифические маркери можуть бути позначені як «специфічні для серця». В іншому прикладі, вибрана тканина може бути жировою тканиною, яка може бути не пов'язана з яким-небудь певним органом. Спеціалісту зрозумілі ці терміни в тому вигляді, як їх застосовують у контексті на всьому протязі опису.

Термін «варіант» означає (1) полинуклеотидную послідовність, що містить будь-яку заміну, зміна, модифікацію, заміщення, делецию або вставку одного або кількох нуклеотидів з полінуклеотидного послідовності або в неї, і яка має однакові або істотно схожі властивості і демонструє однакову або істотно схожу з оригінальною послідовністю функцію; (2) полипептидную посл�кілька амінокислот з поліпептидного послідовності або в неї, і яка має однакові або істотно схожі властивості і демонструє однакову або істотно схожу з оригінальною послідовністю функцію. Термін, отже, включає поліморфізм поодиноких нуклеотидів (SNP) та алельні варіанти і включає консервативні та неконсервативние заміни амінокислот у полипептидах. Термін охоплює також отримання похідних полинуклеотида або поліпептиду хімічним способом і заміну нуклеотидів або амінокислот нуклеотидами або амінокислотами, які не зустрічаються в природі.

Термін «віртуальна упаковка» означає, що компоненти набору пов'язані з допомогою настанов на одному або кількох фізичних або віртуальних компонентів набору, инструктирующих користувача, як отримати інші компоненти, наприклад, в пакеті, який містить один компонент і керівництва, розпорядчі користувачеві звернутися до веб-сайту, прослухати записане повідомлення, переглянути візуальне повідомлення або звернутися до упорядника або інструктора для отримання вказівок по застосуванню набору.

«Молодий» зазвичай означає молодого дорослого індивідуума, тобто, вийшов з пубертатного періоду або підліткового віку, що буде визначатися випожилой» або «старий», використовуваний в цій заявці, означає індивідуума, який фізично чи хронологічно знаходиться в межах останніх 30% своєї прогнозованої середньої тривалості життя, що обумовлено видом або лінією, породою або етнічною групою всередині виду, у відповідності з відомими параметрами.

Способи та композиції та інші переваги, розкриті в цій заявці, не обмежені певною методологією, протоколами та реагентами, описаними в цій заявці, оскільки, як ясно фахівця, вони можуть бути змінені. Крім того, термінологія, використана в цій заявці, призначена для цілей опису тільки конкретних втілень і не призначена для обмеження і не обмежує обсяг того, що розкрито або заявлено.

Якщо не вказано інше, всі технічні і наукові терміни, терміни області техніки і абревіатури, застосовані в цій заявці, мають значення, загальноприйняті для розуміння фахівцем середнього рівня компетенції в області(областях) техніки винаходу або в області(областях) техніки, де цей термін застосовують. Хоча будь-які композиції, способи, вироби або інші засоби чи матеріали, схожі або еквівалентні, описаним у цій заявці, можуть бути застосовані в практиці ириали.

Всі патенти, патентні заявки, публікації та інші посилання, наведені в цій заявці або на які посилаються в цій заявці, включені в цю заявку шляхом відсилання в тій мірі, в якій це дозволяється регулюючим законодавством. Обговорення цих посилань призначене тільки для підсумовування зроблених у них тверджень. Не робиться ніякого припущення, що будь-які такі патенти, патентні заявки, опублікування або посилання або будь-яка їх частина відносяться до релевантному матеріалу або до відомого рівня техніки. Право оскаржувати вірність і пертинентность будь-якого твердження, що такі патенти, патентні заявки, публікації та інші посилання є релевантним матеріалом або входять у рівень техніки, специфічно зберігається.

Винахід

Частково, даний винахід виникло способу для ідентифікації надійних маркерів експресії генів старіння в обраних тканинах, розробленого авторами. Спосіб включає стадію скринінгу для пошуку диференціально экспрессирующегося гена в обраних тканинах у більшості ліній, порід або етнічних груп у виду, і застосовують такий критерій, що кандидат на маркер експресії гена має диференційно экспрессироваться в большинсти кілька вторинних критеріїв скринінгу, були ідентифіковані набори надійних маркерів експресії генів старіння в декількох обраних тканинах.

У деяких втілень винаходу, маркери застосовують для вимірювання експресії, щонайменше, одного диференціально експресованого гена. У кращих втіленнях, маркери застосовують для вимірювання експресії двох або декількох диференційно експресованих генів. Вимірювання експресії двох або декількох диференційно експресованих генів забезпечує патерн экспрессирующихся генів або профіль генної експресії для обраної тканини. Більш переважно, може бути проведено вимірювання безлічі диференційно експресованих генів в декількох обраних тканинах, що забезпечує додаткову інформацію про паттерне экспрессирующихся генів або профілі генної експресії.

В різних втіленнях винаходу, зміни в експресії гена можуть бути виміряні за допомогою одного або обох з наступних способів: (1) вимірювання транскрипції шляхом виявлення мРНК, що продукується певним геном; і (2) вимір трансляції шляхом виявлення білка, продукованого певним транскриптом.

Зменшена або збільшена експресія може бути измеределения полінуклеотидів, такого як, наприклад, PCR (включаючи, без обмеження, RT-PCR та qPCR), захист від Рнкази, нозерн-блоттінг, микроэррей(чіп), макроэррей(чіп) та інші способи гібридизація. Гени, які досліджують або відчувають згідно з винаходом, зазвичай знаходяться в формі мРНК або назад транскрибированной мРНК. Гени можуть бути клоновані і/або амплифицировани. Клонування саме по собі, схоже, не впливає на репрезентативність генів у популяції. Однак може бути переважно в якості джерела застосовувати поліа+РНК, оскільки для її застосування потрібна менша кількість технологічних операцій.

Таким чином, в одному з аспектів винахід забезпечує способи ідентифікації маркерів експресії генів старіння вибраної тканини. Способи включають відбір одного або декількох генів, що диференційно експресованих в тканини у старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами, із застосуванням такого критерію, що ген диференціально експресується в обраної тканини у великій кількості ліній, порід або етнічних груп видів, переважно, на заздалегідь заданому рівні значущості (наприклад, p<0,10, p < 0,05 або p<0,01). У деяких втіленнях, ген диференціально експресується в 2, 3, 4,�єрій, що ген диференціально експресується в більшості протестованих ліній, порід або етнічних груп і може бути посилений так, щоб ген повинен диференціально экспрессироваться, щонайменше, в 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або 100% протестованих ліній, порід або етнічних груп.

Спосіб може бути застосований на практиці в лініях, породах або етнічних групах будь-якого виду. У конкретних втіленнях, вид являє собою ссавець і, в особливості, людину або тварину-компаньйона, таке як собака або кішка, або інших тварин-компаньйонів, як визначено вище.

Тканина, яку вибирають для практичного застосування способу, може являти собою будь-яку тканину або орган, включаючи, але не обмежуючись, жирову тканину, сечовий міхур, кров, кістки, кістковий мозок, травний тракт, мозок і центральну нервову систему, молочну залозу, бронхи, хрящ, ободову і пряму кишку, сполучну тканину, ендокринну систему, очей, жіночі репродуктивні органи, залози, серце, кишечник, нирки, печінка, легені та назальний/бронхіальну систему, лімфатичний вузол і лімфоїдні органи, чоловічі репродуктивні органи, ротову порожнину і мову, нервову тканину, відмінну від мозку/ЦНС, підшлункову желе� мозку або жирової тканини.

Описаний вище спосіб може включати додаткові критерії ідентифікації надійних маркерів старіння в обраних тканинах. Наприклад, спосіб може додатково включати той критерій, що диференційна експресія гена, диференційно експресованого у старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами, щонайменше, частково звертається шляхом обмеження калорійності. Спосіб також може додатково включати той критерій, що відомо або передбачається, що ген, диференційно экспрессируемий у старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами, асоційований з однією чи кількома пов'язаними зі старінням фізіологічними функціями. Функціональність генного продукту може бути визначена експериментально або за доступною фахівця літературі.

Описані вище способи застосовують для ідентифікації біомаркерів старіння в обраних тканинах. Відповідно, у ще одному аспекті винаходу забезпечують комбінації, що включають безліч полінуклеотидів або експресованих з них білків, що диференційно експресуються в обраних тканинах старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами, в яких полінуклеотиди вибирають з генів, що кодують �s визначення генів, назви генів і номери в базі даних «Entrez», які дозволяють отримати повне опис генів і генних продуктів у базі даних Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) Національних інститутів здоров'я.

В одному з втілень, вибрана тканина являє собою серце, і полінуклеотиди вибирають з генів, що кодують два або більше з наступного: Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casq1, Сс18, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmem16k і Vgll2. З цієї групи диференційна експресія звертається шляхом обмеження калорійності в С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmem16k і Vgl12.

В іншому втіленні, вибрана тканина являє собою жирову тканину, і полінуклеотиди вибирають з генів, що кодують два або більше з наступного: Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6a13 і Sycp3. З цієї групи диференційна експресія звертається шляхом обмеження калорійності в Aspn, Со16а2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbd13 і Slc6al3.

В іншому втіленні, вибрана тканина являє собою мозок, і полінуклеотиди вибирають з генів, що кодують два або більше з наступного: Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, Il33, Lgals3, Lyzs і Sppl. З цієї групи диференційна експресія звертається шляхом обмеження калорійності в Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, Il33, Lyzs і Spp1.

�ють два або більше з наступного: С4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Dusp26, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 і Syt9. З цієї групи диференційна експресія звертається шляхом обмеження калорійності в С4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Colla2, Col3a1, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2 і Syt9.

В одному з втілень, комбінація включає два або більше полинуклеотида або білка, экспрессируемие з цих полінуклеотидів. Переважно, комбінація включає більшість полінуклеотидів або білків, експресованих з цих полінуклеотидів, зазвичай, приблизно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 або більше полінуклеотидів або білків або їх фрагментів, в якості підходящих для певних видів, тканини та застосування. Якщо комбінація включає один або кілька фрагментів, то фрагменти можуть бути будь-якого розміру, який зберігає властивості і функцію вихідного полинуклеотида або білка, переважно, від приблизно 30%, 60% або 90% від оригіналу.

Полінуклеотиди і білки можуть бути від будь-якої тварини, включаючи людей, особливо собак і кішок, найбільшою особливості, собак. Гомологи полінуклеотидів і білків з різних видів тварин можуть бути отримані з допомогою стандартного аналізу інформації і молекулярних способів, добре відомих фахівця. Наприклад, назва, опубликованнѽих баз даних, які створять список джерел, що надають інформацію про цьому гені з різних видів, включаючи інформацію про послідовності. Одна з таких баз - це база даних information Hyperlinked over Proteins» (iHOP), яка доступна в інтернеті через URL: . Альтернативно, код доступу відкритої бази даних відомого гена або білка може бути застосований для отримання інформація про послідовності для цього гена або білка і для пошуку гомологів або ортологів в інших видах за допомогою порівняльного пошуку послідовностей. Наприклад, код доступу гена або білка з миші, отриманий у GenBank, може бути введена у базу даних Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) Національних інститутів здоров'я, і, таким способом, можуть бути отримані послідовності ДНК або поліпептидні послідовності для цього гена миші. Застосовуючи ті ж бази даних, пошук в BLAST можна провести на послідовності ДНК або білка миші або їх фрагментах, в достатній мірі довгих для визначення гена або білка, для ідентифікації послідовностей, що володіють досить гомологією з інших видів, наприклад, з собаки. Коди доступу послідовностей з інших видів, що представляють інтерес, можна потім ввестили білка, а також інший описової інформації.

У ще одному аспекті винаходу забезпечують композиції, що включають дві або більше зонда детекції диференціальної експресії гена в обраної тканини у старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами. У деяких втіленнях, вибрана тканина являє собою серце, жирову тканину, мозок або м'язову тканину, і зонди включають: (а) полінуклеотиди, які специфічно гибридизуются з двома або більше генами, кодирующими білки, перераховані в таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагменти; або (b) агенти, що зв'язують поліпептиди, які специфічно зв'язуються з двома або більше поліпептидами, обраними з білків, наведених у таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагментів.

В одному з втілень, вибрана тканина являє собою серце, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casq1, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k і Vgl12. В іншому втіленні, вибрана тканина являє собою жирову тканину, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, PvhbdB, Slc6al3 і Sycp3. В іншому втілюють� являють собою Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, I133, Lgals3, Lyzs і Sppl. Ще в одному втіленні, вибрана тканина являє собою м'язи, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою С4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Dusp26, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 і Syt9.

У конкретних втіленнях, диференційну експресію звертають шляхом обмеження калорійності, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою: (а) С3, Сс18, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k і Vgll2 в серці; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3 і Slc6al3 в жировій тканині; (з) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, 1133, Lyzs і Sppl в мозку; або (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2 і Syt9 в м'язах.

Переважно, композиція включає більшість зондів, зазвичай, приблизно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 або більше зондів детекції полінуклеотидів або білків або їх фрагментів, за необхідності, для певного виду, тканини та застосування. Фахівцю зрозуміло, що може бути застосовано безліч різних зондів для єдиного цільового гена або білка, для поліпшення чутливості або точності аналізу із застосуванням зондів. Наприклад, можуть бути застосовані деякі олігонуклеотидні зонди, які специфічно гибридизуются з різними послідовностями на поле для різних епітопів на білку-мішені.

Один або кілька олігонуклеотидних або полінуклеотидних зондів для досліджуваного зразка можуть бути отримані з допомогою інформації про послідовність для будь-якого з генів, перелічених у цій заявці, з будь-якого виду, переважно, собаки або кішки. Зонди мають бути достатньо довгими, для того щоб специфічна гібридизація проходила в значній мірі виключно з відповідними комплементарними генами або транскриптами. У деяких втіленнях, олігонуклеотидні зонди, щонайменше, мають довжину, рівну приблизно 10, 12, 14, 16, 18, 20 або 25 нуклеотидів. У деяких втіленнях, бажано застосовувати більш довгі зонди, щонайменше, приблизно в 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 нуклеотидів, і в деяких втіленнях можуть підійти зонди довжиною більш ніж приблизно 100 нуклеотидів. Зонди можуть включати повнорозмірні послідовності, що кодують функціональні білки. Зонди, що представляють собою нуклеїнові кислоти, синтезують або отримують за допомогою способів, відомих фахівців у цій галузі техніки, наприклад, з допомогою синтезу in vitro з нуклеотидів, виділення і очищення з природних джерел або ензиматичним розщепленням полінуклеотидів винаходу.

Гібрид�леотидом винаходу можуть бути виявлені за допомогою безлічі способів, відомих у цій галузі техніки. У деяких втілень винаходу, для швидкої і специфічної детекції полінуклеотидів і профілю їхньої експресії можуть бути застосовані іммобілізовані зонди, що представляють собою нуклеїнові кислоти. Зазвичай, зонд, який представляє собою нуклеїнову кислоту, закріплюють на твердій підкладці, та цільової полинуклеотид (наприклад, ген, продукт транскрипції, ампликон, або, найчастіше, суміш після ампліфікації) гибридизуется з зондом. Як зонд, так і мішень, або обидва, можуть бути помічені, зазвичай, флуороформом або інший міткою, такий як стрептавидин. Якщо позначено мішень, то гібридизацію можна виявити, реєструючи флуоресценцію пов'язаних комплексів. Якщо позначено зонд, гібридизацію зазвичай виявляють по гасінню мітки. Якщо помічені і зонд, і мішень, то детекцію гібридизації зазвичай проводять, реєструючи зміна кольору, що виникає в результаті зближення двох пов'язаних міток. У цій області техніки відомо безліч стратегій мічення, міток і їм подібного, зокрема, для додатків, заснованих на флуоресценції.

В іншому втіленні, зонди включають агенти, що зв'язують поліпептиди, які специфічно зв'язуються з поліпептидами, які виробляє �акі зв'язуючі білки зонди може бути отримано з допомогою інформації про послідовності, доступною для будь-якого з білків, визначених у таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 і таблиці 10, або їх фрагментів.

Методики аналізу, які можуть бути застосовані для визначення кількості білка в зразку, також добре відомі фахівцям в цій області техніки. Такі способи аналізу включають радіоімунологічні аналізи, аналізи з конкурентного зв'язування, вестерн-блоттінг і аналізи методом ELISA. У способах аналізу з застосуванням антитіл, для застосування у винаході підходять як поліклональні, так і моноклональні антитіла. Такі антитіла можуть бути імунологічно специфічними для певного білка або епітопа білка або фрагмента білка, що зрозуміло фахівцям у цій галузі техніки. Способи отримання поліклональних та моноклональних антитіл, імунологічно специфічних для білка або пептиду також добре відомі в цій галузі техніки.

У кращих втілень винаходу можуть бути застосовані антитіла для детекції та кількісного визначення білків, які продукуються в результаті експресії генів, описаних в цій заявці. Хоча білки можуть бути виявлені за допомогою иммунопреципитации, афінного поділу, вестерн-блот та подібних способів, припущення і цільовий білок або пептид інкубують з іммобілізованим антитілом. Як зонд, так і мішень, або обидва, можуть бути помічені. У цій області техніки відомо безліч стратегій мічення, міток і їм подібних.

У ще одному аспекті винаходу забезпечують пристрої, що включають тверду підкладку, до якої прикріплена панель, що включає безліч зондів для детекції диференціальної експресії гена в обраної тканини у старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами. У деяких втіленнях, вибрана тканина являє собою серце, жирову тканину, мозок або м'язову тканину, і зонди включають: (а) полінуклеотиди, які специфічно гибридизуются з двома або більше генами, кодирующими білки, перераховані в таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагменти; або (b) агенти, що зв'язують поліпептиди, які специфічно зв'язуються з двома або більше поліпептидами, обраними з білків, наведених у таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагментів. У кращому втіленні, пристрій застосовують для виявлення диференційної експресії генів у собак і кішок.

В одному з втілень, вибрана тканина являє собою серце, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Amyl, Apod, Bdhl, Совую тканина, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6al3 і Sycp3. В іншому втіленні, вибрана тканина являє собою мозок, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, 1133, Lgals3, Lyzs і Sppl. Ще в одному втіленні, вибрана тканина являє собою м'язи, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою С4, Cdkn2c, Cdsl, Col1al, Col1a2, Col3a1, Dusp26, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 і Syt9.

У конкретних втіленнях, диференційну експресію звертають шляхом обмеження калорійності, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою: (а) С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k і Vgl12 в серці; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3 і Slc6al3 в жировій тканині; (з) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs і Sppl в мозку; або (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2 і Syt9 в м'язах.

В одному з втілень, можуть бути застосовані чіпи з олигонуклеотидними або полинуклеотидними зондами, тоді як в іншому втіленні можна застосувати чіпи з антитілами або іншими білками, які зв'язуються з диференціально экспрессируемими генними продуктами. Такі чіпи можуть бути з�вердой підкладці або прикріплення заздалегідь синтезованих зондів на твердій підкладці за допомогою методики микропринтирования. У кращих втіленнях чіпи з зондами, що представляють собою нуклеїнові кислоти, або білок-зв'язуючі зонди виготовляють за індивідуальним замовленням для специфічної детекції транскриптів або білків, які продукуються двома або більше з наступного: диференціально экспрессируемими генами або фрагментами генів, описаними в цій заявці.

У ще одному аспекті винаходу забезпечують способи детекції диференціальної експресії одного або декількох генів, що диференційно експресованих в обраної тканини у старих суб'єктів в порівнянні зі стандартом або з молодими суб'єктами. У конкретних втіленнях тканина являє собою серце, жирову тканину, мозок або м'язи, і способи зазвичай включають: (а) забезпечення зондів, що включають (i) полінуклеотиди, які специфічно гибридизуются з двома або більше генами, кодирующими білки, перераховані в таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагменти; або (ii) агенти, що зв'язують поліпептиди, які специфічно зв'язуються з двома або більше поліпептидами, обраними з білків, наведених у таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагментів; (b) додавання зондів до зразка, що включає мРНК або білки з старЀмируя таким способом комплекси гібридизації або зв'язування в зразку; (с) необов'язково, додавання зондів до іншого зразком, що включає мРНК або білки з молодого суб'єкта, так, щоб зробити можливим гібридизацію або зв'язування зондів з мРНК або білками у другому зразку, формуючи таким способом комплекси гібридизації або зв'язування в іншому зразку; (d) детекцію гибридизационних комплексів у зразку або зразках; та (е) порівняння комплексів гібридизації або зв'язування з першого зразка з комплексами гібридизації або зв'язування з стандарту або, необов'язково, з іншого зразка, в якому, щонайменше, одна різниця між кількістю гібридизації або зв'язування в зразку в порівнянні зі стандартом або необов'язковим іншим зразком вказує на диференційну експресію одного або декількох генів, що диференційно експресованих у старих суб'єктів.

Спосіб може бути застосований для виявлення диференційної експресії генів, що кодують генні продукти, наведені у таблицях 2, 5, 8 або 10 або доповнюють їх таблицях. Таким чином, в одному з втілень, вибрана тканина являє собою серце, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Amyl, Apod, Bdhl, С3, Casql, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k �ьно экспрессируемими генами, являють собою Aspn, Clec4n, Со16а2, Col18al, Сох8b, Crip2, Earll, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB, Slc6al3 і Sycp3. В іншому втіленні, вибрана тканина являє собою мозок, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, 1133, Lgals3, Lyzs і Sppl. Ще в одному втіленні, вибрана тканина являє собою м'язи, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою С4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Col1a2, Col3al, Dusp26, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 і Syt9.

У конкретних втіленнях, диференційну експресію звертають шляхом обмеження калорійності, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою: (а) СЗ, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k і Vgl12 в серці; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB і Slc6al3 в жировій тканині; (з) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs і Sppl в мозку; або (d) C4, Cdkn2c, Cds1, Col1al, Col1a2, Col3a1, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2 і Syt9 в м'язах.

У кращому втіленні, спосіб застосовують для детекції диференційної експресії генів у собак і кішок. У конкретних втіленнях зонди пов'язують з підкладкою, переважно, у формі чіпа.

Стадія (з) і частина стадій (d) і (е) необов'язкові, і їх застосовують, якщо необхідно провести щодо одночасне порівняння двох або кількох �няемий для порівняння, заснований на даних, отриманих раніше із застосуванням способу. В цьому втіленні, зонди приводять у контакт зі зразком для формування комплексів гібридизації або зв'язування, які знаходять і порівнюють з комплексами стандарту. Відмінності між комплексами гібридизації або зв'язування з зразка і стандарту вказують на диференційну експресію полінуклеотидів і, отже, генів, що диференційно експресованих в тканини старого суб'єкта порівняно зі стандартом, який може включати мРНК, попередньо виділену з молодого суб'єкта або «стандартного» суб'єкта іншого типу. У кращому втіленні, зонди виготовляють для специфічної детекції полінуклеотидів або їх фрагментів, що продукуються одним або кількома генами або фрагментами генів, ідентифікованих за допомогою винаходу. Способи детекції гибридизационних комплексів відомі фахівцям в цій області техніки.

Аналізи, описані в цій заявці, в яких застосовують тканеспецифические біомаркери для виявлення пов'язаних зі старінням продуктів транскрипції і трансляції, можуть бути застосовані в способах визначення фізіологічного віку тканини у суб'єкта. Такі способи можуть бути п�алорийности, та/або дієти. Такі способи включають отримання зразка обраної тканини з суб'єкта, що проходить курс лікування. Зразок тканини потім аналізують на змінену експресію одного або декількох генів, асоційованих з молодим порівняно зі старим фенотипом, застосовуючи генний або білковий чіп або інший спосіб детекції, як описано в цій заявці. Результати аналізу виявлять, чи ефективний курс лікування в уповільненні або зверненні процесу старіння в тканини.

У ще одному аспекті винаходу забезпечують способи виявлення того, чи дійсно досліджуване речовина корисно для звернення або уповільнення процесу старіння, щонайменше, в одній обраної тканини при введенні тварині. Способи включають (а) визначення першого профілю експресії генів шляхом вимірювання продуктів транскрипції або трансляції двох або декількох полінуклеотидів, які вибирають з генів, що кодують білки, перераховані в таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагменти, в досліджуваної системі у відсутності досліджуваного речовини; (b) визначення другого профілю експресії генів шляхом вимірювання продуктів транскрипції або трансляції двох або декількох полінуклеотидів, які вибирають з ируемой системі в присутності досліджуваного речовини; і (з) порівняння першого профілю експресії генів з другим профілю експресії генів, при якому зміна у другому профілі експресії генів у порівнянні з першим профілю експресії генів вказує на те, що досліджуване речовина ймовірно корисно для звернення або уповільнення процесу старіння при введенні тварині. При порівнянні першого профілю експресії генів з другим профілю експресії генів, порівняння може бути проведене як на рівні індивідуального продукту транскрипції або трансляції, так і як середнє зміна ознак старіння для всіх продуктів транскрипції або трансляції. Цей спосіб корисний для визначення показника уповільнення старіння.

В одному з втілень, вибрана тканина являє собою серце, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casql, Сс18, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k і Vgl12. В іншому втіленні, вибрана тканина являє собою жирову тканину, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Earl1, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, RhbdB, Slc6a13 і Sycp3. В іншому втіленні, вибрана тканина являє собою мозок, і білки, що кодуються диференціально експ�вибрана тканина являє собою м'язи, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою С4, Cdkn2c, Cds1, Col1a1, Col1a2, CoBal, Dusp26, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 і Syt9.

У конкретних втіленнях, диференційну експресію звертають шляхом обмеження калорійності, і білки, що кодуються диференціально экспрессируемими генами, являють собою: (а) С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k і Vgll2 в серці; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB і Slc6al3 в жировій тканині; (з) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs і Sppl в мозку; або (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Colla2, Col3a1, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2 і Syt9 в м'язах.

У деяких втіленнях, спосіб може додатково включати стадію порівняння, щонайменше, другого профілю експресії генів з контрольним або стандартним профілем експресії генів, отриманим шляхом вимірювання продуктів транскрипції або трансляції двох або декількох полінуклеотидів, які вибирають з генів, що кодують білки, перелічені в таблицях 2, 5, 8 або 10, або їхні фрагменти, у досліджуваній системі в присутності еталонного речовини або композиції, про яких відомо, що вони звертають або уповільнюють старіння у визначеній тканини або тканинах при введенні тваринам.

В одному з втілень, досліджувана система включає популяції культивованих клітин. Конструкт нукЂок-господарів. Клітини-господарі можуть представляти собою лінії клітин ссавців, такі як, але не обмежуючись, NIH3T3, СНТ, HELA і COS, хоча також можуть бути застосовані клітини, що не належать ссавцям, такі як клітини дріжджів, бактерій і комах. Кодують послідовності генів функціонально пов'язані з відповідними регуляторними елементами експресії, які підходять для застосування в певних клітинах-хазяїнах. Конструкти нуклеїнової кислоти можуть бути введені в клітини-господарі у відповідності з будь-яким способом, застосовуваним у цій галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись, трансфекцію, трансформацію, осадження фосфатом кальцію, электропорацию і липофекцию. Такі методики добре відомі і рутинно застосовуються в цій галузі техніки. Трансформовані клітини також можуть бути застосовані для ідентифікації з'єднань, модулюючих експресію пов'язаних зі старінням генів.

Аналізи експресії гена можуть бути проведені за допомогою генного конструкта, що включає промотор селективно пов'язаного зі старінням гена, функціонально пов'язаний з геном-репортером. Конструкт репортера може бути введений у відповідну культуру клітин, включаючи, без обмеження, описані вище стандартн�ві клітини. Аналіз проводять шляхом реєстрації експресії гена-репортера в присутності чи у відсутності досліджуваного компонента.

У кращому втіленні, досліджувана система включає тварин. Зазвичай, досліджуваний компонент вводять суб'єкту і аналізують профіль експресії генів у обраної тканини суб'єкта для визначення ефекту досліджуваного компонента на транскрипцію або трансляцію пов'язаних зі старінням генів або генних продуктів по винаходу. Для визначення ефекту досліджуваного компонента експресія гена може бути проаналізована in situ або ex vivo. В іншому втіленні, досліджуваний компонент вводять суб'єкту і аналізують активність білка, експресованого з гена in situ або ex vivo у відповідності з будь-яким способом, застосовуваним у цій галузі техніки для визначення ефекту досліджуваного компонента на активність білків, що представляють інтерес. Крім того, якщо досліджуваний компонент вводять суб'єкту, то можна також оцінити фізіологічний, системний і фізичний ефекти сполуки, а також потенційну токсичність сполуки.

Досліджувані речовини можуть являти собою будь-яку речовину і комбінацію речовин, які можуть мати вплив на полінуклеотиди або гени, дифференѵстируемие речовини включають, але не обмежуються, амінокислоти; білки, пептиди, поліпептиди, нуклеїнові кислоти, олигонуклеотиди, полінуклеотиди, малі молекули-макромолекули, вітаміни, мінерали, прості цукру; складні цукру; полісахариди; вуглеводи; тригліцериди з середньою довжиною ланцюга (МСТ); триацилглицериди (TAGs); n-3 (омега-3) жирні кислоти, включаючи DHA, ЕРА, ALA; n-6 (омега-6) жирні кислоти, включаючи LA, γ-ліноленову кислоту (GLA) і ARA; SA, кон'юговану лінолеву кислоту (CLA); джерела холіну, такі як лецитин; жиророзчинні вітаміни, зокрема вітамін А та його предшественнники, такі як каротиноїди (наприклад, (β-каротин), джерела вітаміну D, такі як вітамін D2 (ергокальциферол) і вітамін D3 (холекальциферол), джерела вітаміну Е, такі як токофероли (наприклад, α-токоферол) і токотрієноли, і джерела вітаміну К, такі як вітамін К1 (філохінон) і вітамін К2 (менадион); водорозчинні вітаміни, включаючи вітаміни В, такі як рибофлавін, ніацин (включаючи нікотинамід і нікотинову кислоту), піридоксин, пантотенову кислоту, фолевую кислоту, біотин і кобаламін; і вітамін С (аскорбінову кислоту); антиоксиданти, включаючи деякі з перерахованих вище вітамінів, особливо вітаміни Е і С, біофлавоноїди, такі як катерол; і α-ліпоєвої кислоти; L-карнітин; D-лімонен; глюкозамін; S-аденозилметионин; і хітозан. У кращому втіленні, тестовані речовини являють собою поживних речовин, які можуть бути додані до їжі або спожиті в якості харчової добавки. Речовини, ідентифіковані за допомогою викладеного способу, також розглядають як частину винаходу.

У ще одному аспекті винаходу забезпечують набори, що включають, в окремих контейнерах у разовій упаковці або в окремих контейнерах у віртуальній упаковці, два або більше зонди для детекції диференціальної експресії гена в обраної тканини у старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами. У деяких втіленнях, тканина являє собою серце, жирову тканину, мозок або м'язову тканину, і зонди включають (а) полінуклеотиди, які специфічно гибридизуются з двома або більше генами, кодирующими білки, перераховані в таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагменти; або (b) агенти, що зв'язують поліпептиди, які специфічно зв'язуються з двома або більше поліпептидами, обраними з білків, наведених у таблиці 2, таблиці 5, таблиці 8 або в таблиці 10, або їх фрагменти; в яких набір додаток для детекції диференціальної експресії гена в обраних тканинах суб'єктів, (2) реагенти та обладнання для використання зондів і (3) композицію, про яку відомо, що вона звертає або уповільнює процес старіння в обраної тканини при введенні суб'єкту.

Якщо набір включає віртуальну упаковку, то обмежений набір інструкцій у віртуальному середовищі в комбінації з одним або декількома фізичними компонентами набору. В одному з втілень, набір містить зонди та/або інші фізичні компоненти та інструкції по застосуванню зондів, а інші компоненти доступні через інтернет. Набір може містити додаткові одиниці обладнання, такі як пристрій для перемішування зразків, зондів та реагентів і пристрій для застосування набору, наприклад, пробірки або приладдя для перемішування.

У ще одному аспекті винаходу забезпечує комп'ютерні системи, що включають бази даних, що містить інформацію про полинуклеотидах, що диференційно експресуються в обраної тканини старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами. Ця база даних може містити інформацію, що визначає рівень експресії одного або декількох полінуклеотидів, які вибирають з генів, що кодують білки, перелічені в таблицях 2, 5, 8 або 10, і/або поліпептидів, котомпьютером, для того щоб скористатися базою даних, зокрема, для того, щоб ввести, обробити і ознайомитися з інформацією для різних тварин або категорій тварин. В одному з втілень, база даних додатково містить інформацію про рівень активності одного або декількох поліпептидів, перелічені в таблицях 2, 5, 8 або 10. В іншому, база даних додатково включає інформацію про послідовностях для одного або декількох полінуклеотидів або поліпептидів, таких як ті, що перелічені в таблицях 2, 5, 8 або 10, переважно, з різних видів. В інших втіленнях, база даних містить додаткову інформацію, що має відношення до опису генів в одному або декількох видах тварин. Комп'ютерна система являє собою будь-який електронний пристрій, здатний зберігати й обробляти дані і взаємодіяти з користувачем, наприклад, звичайний комп'ютер або аналітичний інструмент, розроблений так, щоб полегшувати застосування винаходу і виводить результати стосовно до статусу тварини.

У ще одному аспекті винаходу забезпечує носій інформації для передачі інформації про одній чи декількох композиціях і способи, описаних у цій заявці, і�звукові презентації, візуальні зображення або їм подібні, які містять інформацію чи інструкції. Наприклад, засоби передачі даних можуть представляти собою висновок даних на веб-сайт, інтерактивний термінал, брошуру, ярлик на виробі, листок-вкладиш в упаковці, рекламне повідомлення, роздатковий інформаційний матеріал, аудіозапис з публічним повідомленням, відеозапис, DVD, CD, читаний комп'ютером чіп, читаний комп'ютером карта, читаний комп'ютером диск, пам'ять комп'ютера або будь-яка їх комбінація. Корисна інформація включає один або кілька з наступного: (1) способи стимуляції здоров'я і гарного стану тварин і (2) контактна інформація для використання особами, які доглядають за тваринами, якщо у них виникне питання про винахід і його застосування. Корисні інструкції включають методики для застосування зондів, інструкції для проведення аналізу експресії генів і за кількістю введених речовин і частоті їх введення. Засоби сполучення корисні для отримання інформації щодо переваг застосування винаходу.

ПРИКЛАДИ

Різні аспекти винаходу можуть бути додатково проілюстровано такими прикладами. Зрозуміло, що ці приклади призначені тільки для ілюстрації і не обме�ример коротко описує дослідження, проведене для тестування здатності деяких комбінацій речовин імітувати ефекти збільшення тривалості життя, що викликаються обмеженнями в споживанні калорій (CR) без зменшення харчового раціону. Мишей C57BL6 містили на контрольній дієті, заснованій на формулою AIN93M (Американський інститут харчування (AIN)), синтетична дієтична формула для утримання зрілих гризунів) або на дієті з схожою композицією поживних речовин, але містить 25%-ве обмеження в калоріях (CR)

Тканини збирали від мишей, які перебували на контрольній дієті на п'ятому і 25-му місяцях життя; тканини від мишей, які отримували додаткові поживні речовини, збирали на 25-му місяці життя. З тканини виділяли і РНК визначали зміни в експресії гена за допомогою qPCR, застосовуючи прилад «realplex2» компанії «Eppendorf». Дані для індивідуальних генів наведено в деяких з таких прикладів.

Приклад 2

Цей приклад описує ідентифікацію біомаркерів старіння в серцевої тканини.

Для ідентифікації зміни експресії гена в серці семи ліній мишей (129, C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA і B6C3HF1) застосовують чіп «Mouse Genome 430 2.0» компанії «Affymetrix». Значна зміна експресії визначають за допомогою двосторонніх t-критеріїв�му місяці життя, старих мишей тестують на 25-му місяці життя. В таблиці 1 наведено ряд генів, експресія яких значно змінюється з віком в кожній лінії (Р < 0,05), та у таблиці 2 перераховані генів, експресія яких змінюється, щонайменше, у чотирьох з семи лініях.

Таблиця 1
ЛініяЧисло транскриптів
1294954
B62190
Balbc2137
C3H3236
CBA1118
DBA1521
Fl1287

фактор росту сполучної тканини="c3" nameend="c4">10256675581
Таблиця 2
Символ генаНазва гена11522
Agtrl1ангіотензин рецептор-подібний 123796
Akrlb8альдо-кето-редуктаза сімейства 1, член В814187
Aldhla1альдегидцегидрогеназа сімейства 1, субсемейства А111668
Alox5apбілок, що активує арахидонат-5-ліпоксигеназу11690
Amy1амілаза 1, слина11722
Angpt12ангиопоэтин-подібний 226360
Ankrd1анкириновий повтор 1 домен (серцеві м'язи)107765
Anxa1�gn="left">аполіпопротеїн D11815
Apoeаполіпопротеїн Е11816
Asah31N-ацилсфингозин-амидогидролаза 3 - подібний230379
Asphаспартат-бета-гидроксилаза65973
Atp6v0e2АТРаза, Н+-транспортуюча, липосомальная, V0 субодиниця Е276252
Atp6vlclАТРаза, Н+-транспортуюча, липосомальная, VI субодиниця С166335
Atp9aАТРаза, клас II, тип 9А11981
Atxn10атаксин 1054138
ВС023892Bckdhbдегідрогеназа кетокислот з розгалуженою ланцюгом Е1, бета-поліпептид12040
Bdhl3-гідроксибутират-дегідрогеназа, тип 171911
Breбілок, экспрессирумий в мозку і в репродуктивних органах107976
Byslбистин-подібний53414
Clrкомпонент комплементу 1, r - субкомпонент50909
C3компонент комплементу 312266
Cacna2dlальфа-2-дельта-субодиниця 1 потенціал-залежних кальцієвих каналів12293
Camk2nlінгібітор 1 кальцій/кальмодулін-зав="1">Casqlкальсеквестрин 112372
Ccdc72містить биспиральний домен 7266167
Ccl6хемокина ліганд (З-З мотиву) 620305
Ccl8хемокина ліганд (З-З мотиву) 820307
Ccndlциклін D112443
Cdl63CD 163 антиген93671
Cdh22кадгерин 22104010
CebpdССААТ/енхансер зв'язуючий білок (З/ЕВР), дельта12609
Cfbфактор комплементу В50883
Churclмістить черчілль-домен 1211151
Cilpбілок проміжного шару хряща, нуклеотид-пирофосфогидролаза214425
Ckbкреатинкінази, мозок12709
Clic5внутрішньоклітинний хлоридний канал 5224796
Col3alпроколаген, тип III, альфа 112825
Col8alпроколаген, тип VIII, альфа 112837
Cpцерулоплазмин12870
Cpxm2карбоксипептидаза X 2 (сімейства Ml4)14219
Ctssкатепсин S13040
Cxcll4хемокин (З-Х-мотив) ліганд 1457266
Cyb5r3цитохром-b5-редуктаза 3109754
Cyp27alцитохром-Р450, сімейства 27, субсемейства а, поліпептид 1104086
Dalrd3DALR-антикодон-зв'язуючий домен, що містить 367789
Dbnlдребрин-подібний13169
Dhrslдегідрогеназа/редуктаза (сімейства SDR), член 152585
Dhrs7cDpeplдипептидаза 1 (нирки)13479
EG665317який пророкують ген, EG665317665317
EhbplllЄП домен-зв'язуючий білок 1-подібний 1114601
Ehmt2лізин-N-метилтрансфераза 2 эухроматического гистона110147
Enpp2эктонуклеотид-пирофосфатаза/фосфодиэстераза 218606
Fadslдесатураза жирних кислот 176267
Fbln2фибулин 214115
Fcgr3рецептор Fc, IgG, низкоаффинний III14131
225020
Fgfrlop2партнер онкогена FGFR1 267529
Fkbp5РК506-зв'язуючий білок 514229
Fmo2флавін-містить монооксигеназа 255990
Ftl2легка ланцюг феритину 214337
Fxyd6FXYD домен-містить регулятор іонного транспорту 659095
Fzrlзупинка (fizzy) клітинного поділу 20-родинний 1 (Дрозофіла)56371
Gcdhглутарил-коензиму А-дегідрогеназа270076
Gdaгуаниндезаминаза14758
HlxlH2.0-подібний гомеобокс 1 (Дрозофіла)15284
Hodгомеобокса єдиний домен74318
Hplbp3білок гетерохроматину 1, зв'язуючий білок 315441
Icamlвнутрішньоклітинної молекула адгезії15894
Ier3негайно-ранній відповідь 315937
Ifitlінтерферон-індукований білок з тетратрикопептидними повторами 115957
I14raрецептор інтерлейкіну 4, альфа16190
Isoclмістить домен изохоризматаз�an="1">інтегральний мембранний білок 2А16431
Jph2джанктофилин 259091
Kbtbd2kelch-повтор і ВТВ (POZ) домен-містить 2210973
Kcnd2калієвий потенціал-залежний канал, що належить до сімейства Shal, член 216508
Kcnelкалієвий потенціал-залежний канал, Isk-спорідненого підродини, член 116509
Klhdclkelch-містить домен 1271005
Lcn2липокалин 216819
Lectlлейкоцитарний хемотаксин 116840
56384
Lgals3bpлектин, галактозид-зв'язуючий, розчинний, 3-зв'язуючий білок19039
Lrplбілок, споріднений рецептора ліпопротеїну низької щільності 116971
Lrpllбілок, споріднений рецептора ліпопротеїну низької щільності 11237253
Ly6aлімфоцитарний антигенний комплекс 6, локус А110454
Man2alманнозидаза 2, альфа 117158
Mef2aенхансерний фактор міоцитів 2А17258
Mfge8білок жирових глобул молока-EGF фактор 817304
st="c0" nameend="c1">Mier3мезодермальний индуцирующий ранній відповідь 1, член сімейства 3218613
Mlf1фактор 1 мієлолейкозу17349
Mrclрецептор З маннози, тип 117533
Mt2металлотионеин 217750
Mybpc3міозин-зв'язуючий білок, серцевий17868
Myom2миомезин 217930
Myotмуотилин58916
Ndrg4N-myc ген, що регулює наступні ланки сигнальних каскадів 4234593
Nfkbia18035
Npr3рецептор натрійуретичного пептиду 318162
Nt5c25'-нуклеотидаза, цитозольная II76952
Oas22'-5' олигоаденилатсинтетаза 2246728
Osmrрецептор онкостатина М18414
Pahфенилаланингидроксилаза18478
Pbxiplбілок, що взаємодіє з фактором 1 транскрипції пре-В-клітинної лейкемії229534
Pdelcфосфодиэстераза 1С18575
Pdlim4PDZ і LIM домен 430794t="c3" nameend="c4">226041
Phldalподібний гомологу плекстрина домен, сімейства А, член 121664
Pkn2протеїнкіназа N2109333
Pld3фосфоліпаза сімейства D, член 318807
Plp2білок протеолипид 218824
Postnпериостин, специфічний фактор остеобластів50706
Ppplr3bбілок фосфатаза 1, регулятор (інгібітор) субодиниці ЗВ244416
Prg4протеогликан 4 (мегакариоцит-стимулюючий фактор, білок поверхневої зони суглобів)96875
Prkarla
Prkcqпротеїнкіназа С, тета18761
Ranbp5RAN-зв'язуючий білок 570572
Rnf5білок RING пальців 554197
Rpl31рибосомальний L3-подібний білок66211
RrasОнкоген саркоми пацюків Харві, підгрупа R20130
Rtn2ретикулон 2 (асоційований з Z-бендом білок)20167
Rtn4ретикулон 468585
Scnlbнатрієвий канал, потенціал-залежний, тип I, бета20266
399548
Serpina3nінгібітор серинової (або цистеиновой) пептидази, А гілка, член 3N20716
Serpine2інгібітор серинової (або цистеиновой) пептидази, гілка Е, член 220720
Skap2фосфобелок асоційований з 2згс-сімейством54353
Slc6a6член 6 сімейства переносників розчинених речовин 6 (переносник нейромедіаторів, таурин),21366
Snx10сортирующий нексин 1071982
Socs3супресор цитокинного сигналу 312702
Srfфактор відповіді сироватки20807
64817
Tbcld10cсімейство ТВС1 домен, член 10108995
Tfpiінгібітор тканинного фактора21788
Tgfb2трансформуючий фактор росту бета 221808
Tgm2трансглутаміназа 2, поліпептид З21817
Thbs2тромбоспондин 221826
Thbs4тромбоспондин 421828
Timp2тканинний інгібітор металопротеїнази 221858
Tlnlталлін 121894
Tmeml76aтрансмембранний білок 176А66058
Tmem43трансмембранний білок 4374122
Tnfaip8фактор некрозу пухлини альфа-індукований білок 8106869
Tomm40транслоказа гомолога 40 зовнішньої мітохондріальної мембрани (дріжджі)53333
Tpte2трансмембранная фосфоинозитид-3-фосфатаза та гомолог тензіна 257914
Trim47білок 47 з трехчастним мотивом217333
Tspanl3тетраспанин 1366109
Tspanl7тетраспанин 17="1">UDP-N-ацетілглюкозамін-пирофосфорилаза 1 - подібний 1227620
Ube2zубіквітин-конъюгирующий ензим E2Z (передбачуваний)268470
Uchllубіквітин-карбоксиконцевая гідролаза L122223
Vgll2рудимент-подібний гомолог 2 (Дрозофіла)215031
Vwfгомолог фактора фон Віллебранда22371
Wdrl3WD-повторяющися домен 1373447
Wisp2WNTl-индуцибельний білок сигнального шляху 222403
Wtapбілок, асоційований з пухлиною Вільмса 160532
Zadh2цинк-зв'язує алкогольдегідрогеназа, що містить домен 2225791
Zfp697білок цинкових пальців 697242109

Шістнадцять потенційних маркерів старіння серця відбирають для підтвердження даних, отриманих на чіпі, з допомогою qPCR. Гени відбирають на підставі численних факторів, включаючи (але не обмежуючись): рясна експресія в експерименті з мікрочіпом, явне зміна в експресії в лінії В6, попередні відомості про зв'язок гена зі старінням серця. З допомогою зразків RNA з В6, застосованих у дослідженні з чіпом, qPCR-аналіз виявив, що всі 16 генів показали зміни в експресії з віком. Ці гени наведені в таблиці 3. Для дев'яти маркерів з 16 підтверджених за допомогою qPCR маркерів старіння серця, qPCR додатково виявив, що їх вікова експресія зразка звертається за допомогою CR, по меншою мірою, приблизно на 32%. Ці дев'ять маркерів - С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmem16k і Vgl12.

Номер в базі
генаданих «Entrez Gene»
Amylамілаза 1, слина11722
Apodаполіпопротеїн D11815
Bdhl3-гідроксибутират дегідрогеназа, тип 171911
С3Компонент комплементу 312266
Casq1кальсеквестрин 112372
Сс18хемокин ліганд (З-З мотиву) 820307
Kcnd2калієвий потенціал-залежний канал, що належить до сімейства Shal, член 216508
Lcn2липокалин 216819
Mt2металлотионеин 217750
n="left">фенилаланингидроксилаза18478
Prkcqпротеїнкіназа С, тета18761
Serpina3nінгібітор серинової (або цистеиновой) пептидази, А гілка, член 3N20716
Skap2фосфобелок асоційований з src-сімейством 254353
Tmem 16kтрансмембранний білок 16К102566
VgH2рудимент-подібний гомолог 2 (Дрозофіла)215031

Ефекти наведеного в прикладі 1 застосування дієти на специфічні маркери старіння серця описані нижче, разом з опублікованою функцією (опублікованими функціями) кожного маркера.

Реакція на стрес

Металлотионеин 2 (Mt2): Відомо, що гени металлотионеина індукуються у відповідь на окислювальний стрес, і трансгенні миші, сверхэкспрессирующие металлотионеин 2А людини зі специфічного для серця промотору, захищені від доксорубициновой кардіотоксичності. З� окисного стресу. Слід зазначити, що цей ген за даними аналізу мікрочіпа був ідентифікований як можливий супермаркер старіння скелетної м'язи, але зміна експресії цього гена не було підтверджено з допомогою qPCR. В серці, ми спостерігали збільшення експресії цього гена з віком, яке частково предотвращалось CR.

Аполіпопротеїн D (Apod): Аполіпопротеїн D являє собою член сімейства генів липокалина, він залучений в імунну відповідь і відповідь на стрес.Apod індукується у відповідь на стрес у мозку, і раніше ми ідентифікували цей ген як супермаркера старіння неокортексу миші. У серце миші експресія этото гена збільшується в ~2,5 рази з віком, але CR не попереджає це збільшення.

Липокалин 2 (Lcn2). Ряд повідомлень вказують на те, що липокалин 2 індукується запаленням і окислювальним стресом, і його збільшення перешкоджають пастки активних форм кисню, цистеамін і DMSO. Отже, Lcn2 може бути корисним биомаркером для ідентифікації окисного стресу як in vitro, так і in vivo. У серце миші експресія цього гена збільшується приблизно в три рази з віком і CR повністю запобігає збільшення.

Імунна відповідь/Запалення

Компонент комплементу 3 (С3): Компо�класичного, так і для альтернативного шляху активація комплементу. Раніше ми ідентифікували близькоспоріднений ген (С4) в якості супермаркера старіння в скелетних м'язах миші; ці дані знаходяться у відповідності з багатьма повідомленнями про збільшення імунної активації з віком. У серце миші, експресія С3 збільшується приблизно в два рази з віком, і CR попереджає це збільшення.

Хемокин ліганд (С-С мотив) 8 (Сс18): Цей цитокін проявляє хемотаксическую активність стосовно моноцитів, лімфоцитів, базофілів і еозинофілів і приваблює лейкоцити у ділянки запалення, цей цитокін може вносити внесок в асоційовану з пухлиною інфільтрацію лейкоцитів і антивурусное стан щодо ВІЛ-інфекції. У серце миші експресія цього гена значно збільшується (приблизно в шість разів) з віком, і CR частково попереджає це збільшення.

Протеїнкіназа С, тета (Prkcq): Члени родини протеїнкінази С (РКС) фосфорилируют велика різноманітність білків-мішеней, і відомо, що вони залучені в різноманітні клітинні сигнальні шляхи. Кожен член сімейства РКС володіє специфічним профілем експресії, і вважається, що він відіграє певну роль. Prkcq необхідна для активації Т-лимфоци� мишей, хоча це було не підтверджено методом qPCR. В серці, експресія збільшується приблизно в три рази з віком, і цьому слабо перешкоджає CR.

Інгібітор серинової (або цистеиновой) пептидази, А гілка, член 3N (Serpina3n): Було показано, що цей ген пригнічує опосредуемий гранзимом В апоптоз у цитотоксичних Т-лімфоцитах, і загальний ефект збільшення експресії цього гена може призвести до інгібування апоптозу в імунних клітинах. У серце миші експресія цього гена збільшується в чотири рази з віком, і CR практично повністю попереджає це збільшення.

Фосфобелок 2, асоційований з src-сімейством (Skap2): Білок, який кодується цим генів, сприяє адгезії імунної клітини в ділянках запалення. У серце миші експресія цього гена збільшується приблизно в два рази з віком, і CR не впливає на це збільшення.

Метаболізм

3-Гидроксибутиратдегидрогеназа, тип 1 (Bdh1): Цей ген кодує члена сімейства генів коротко дегідрогеназ/редуктаз, і залучений в продукцію кетонових тіл шляхом каталізу взаємоперетворення ацетоацетата і 3-гидроксибутирата, основних кетонових тіл, що продукуються в ході катаболізму жирних кислот. У серце миші ми спостерігали слабке збільшення в експрес� (Pah):Pah кодує фермент фенилаланингидроксилазу, яка являє собою лімітує швидкість стадію в катаболізм фенілаланіну до тирозину. Недолік активності цього ферменту призводить до фенілкетонурії, порушення з аутосомно-рецесивним типом успадкування. У серце миші експресія цього гена збільшується приблизно в десять разів з віком, і CR знижує експресію цього гена до приблизно в половину від реєстрованої в старих контролях.

Серцева функція

Амілаза 1 (Amyl). Амілази являють собою секретируемие білки, які гідролізують 1,4-альфа-глікозидні зв'язки в олигосахаридах і полисахаридах, і, таким чином, каталізує першу стадію розщеплення надходять з їжею крохмалю і глікогену. Білок, який кодується цим геном, може бути пов'язаний із серцевою функцією, оскільки повідомлялося про збільшення рівня цього білка в плазмі крові у людей з хронічною серцевою недостатністю. Раніше ми спостерігали збільшення експресії цього гена в скелетних м'язах у безлічі ліній мишей, хоча цей ген не був ідентифікований як супермаркера в м'язах. У серце миші, експресія цього гена збільшується в ~2,5 рази з віком, і CR помітно на неї не впливає.

Гомолог рудимент-подібного 2 (Дрозофіла) (Vgl12): Цей ген кодує т� серце, ймовірно, пов'язана з підтриманням серцевих м'язів в цілому. У серце миші експресія цього гена збільшується в ~7,5-раз з віком, і CR попереджає приблизно половину від вікового збільшення експресії.

Миотилин (Myot): Цей ген кодує білок, виявлений в області z-дисків поперечносмугастих м'язів і залучений у підтримання структури м'язів і організацію саркомера. У людей, мутація в цьому гені пов'язана з однією з форм м'язової дистрофії. Експресія цього гена не сильно збільшується з віком у серце миші, і CR не перешкоджає цьому збільшення.

Кальсеквестрин (Casql): Кальсеквестрин являє собою основний кальцій-зв'язуючий білок в саркоплазматическом ретикулумі, і вивільнення іонів кальцію, пов'язаних з Casql, призводить до скорочення м'язів. Експресія цього гена знижується з віком, що, можливо, відображає зниження м'язового скорочення з віком в цілому. Експресія цього гена не змінюється під дією CR.

Калієвий потенціал-залежний канал, що належить до сімейства Shal, член 2 (Kcnd2): Білок, який кодується цим геном, відповідальний за вихід калію в серце, і експресія цього гена регулюється іншими генами, чутливими до рівня кальцію. Експресія цього гена снижаетс�сований про його функціях, однак згідно з базою даних «Gene Ontology consortium» (Консорціум з генної онтології), він являє собою інтегральний мембранний білок. Експресія цього гена збільшується на ~50% з віком, і CR знижує експресію цього гена до такого низького рівня, який спостерігають у молодих контрольних мишей.

Для оцінки загальної ефективності втручання, розробленого для протидії вікових змін в експресії гена, корисно створити показник, який дозволить порівнювати ефективність втручання у протидії експресії маркерів старіння серця. Нижче описані два показника, хоча також можуть бути розроблені інші аналізи. Кожен показник являє собою середнє від ефектів впливу режиму харчування у протидії вікових змін в експресії гена; перший показник розглядає всі 16 універсальних маркерів старіння серця, описаних у цьому повідомленні; другий показник розглядає тільки дев'ять універсальних маркерів, які змінюються як при старінні, так і під дією CR. Для кожного гена «відсоток запобігання» розраховують як відсоток зміни при старінні, якому протидіє втручання. Наприклад, величина, рівна «100%», буде у молодих контролях. Оцінка попередження, що дорівнює більш ніж 100%, буде вказувати на зрушення в експресії гена до рівня, який «молодше» того, що спостерігають у молодих контролях; навпаки, негативний відсоток запобігання буде вказувати на посилення експресії гена порівняно з спостережуваної в старих контрольних групах. Величини для кожного гена потім усереднюють по всій обробці, і результуючий показник виявляє ступінь, в якій вплив може протистояти віковим змінам в експресії маркерів старіння серця. Для обох показників помірне CR володіє найбільшою здатністю протистояти віковим змінам в експресії маркерів старіння серця.

Приклад 3

Цей приклад описує ідентифікацію транскрипційних маркерів старіння в жировій тканині.

Для ідентифікації змін в експресії гена в эпидидимальной жирової тканини семи ліній мишей (129, C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA і B6C3HF1) застосовують чіп «Mouse Genome 430 2.0» компанії «Affymetrix». Значна зміна експресії визначають за допомогою двосторонніх t-критеріїв для молодих проти старих мишей (Р<0,05, п=7 мишей на лінію на вікову групу). Молодих мишей тестують на п'ятому місяці життя, старих мишей тестують на 25-му місяці життя. Таице 5 перераховані всі гени, експресія яких змінюється, принаймні у п'яти із семи ліній.

Таблиця 4
ЛініяЧисло транскриптів
1292420
B61980
Balbc1646
С3Н5391
СВА5993
DBA3788
F14187

Таблиця 5
Символ генаНазва генаНомер в базі даних «Entrez gene»
Amotllангиомотин-подібний 175723
104445
Chkbхолинкиназа, бета12651
AI597468экспрессируемая послідовність AI597468103266
Flnaфиламин, альфа192176
Mstlrмакрофаги-стимулюючий рецептор 1 (пов'язана з с-met тирозинкиназа)19882
Nmbнейромедін68039
Nsdlзв'язує ядерний рецептор SET-домен, білок 118193
Nap 115білок складання нуклеосом 1 - подібний 558243
Otoplотопетрин 121906
Osbpl8оксистерол-/td>фосфоліпаза А2, група HD18782
Polr2dполімераза (РНК) II (ДНК-спрямована), поліпептид D69241
Pcdhb22протокадгерин бета 2293893
4921524J17RikRIKEN кДНК 4921524J17 ген66714
Rc3h2RING пальця і СССН-типу домени цинкових пальців 2319817
Rbms3РНК-зв'язувальна мотив, який взаємодіє з одноцепочечними послідовностями білок207181
Akap2кіназа A (PRKA), якірний білок 211641
Aco2Аконитаза 2, мітохондріальна11429
Acsfiчлен сімейства ацил-СоА-синтет�цил-коензим-А-дегідрогеназа, довголанцюгові11363
Acadvlацил-коензим А-дегідрогеназа, дуже длинноцепочечная11370
Arf2фактор ADP-рибозилирования 211841
Arl5bподібний фактору ADP-рибозилирования 5В75869
Ankiblанкириновий повтор і IBR домен містить 170797
Anxa2анексії А212306
AspnАспорин66695
Abcd4АТР-зв'язує касета, суб-сімейства D (ALD), член 419300
Bmplкістковий морфогенентический білок 112153
ClgaltlclCideaиндуцирующий загибель клітин фактор фрагментації ДНК, альфа-субодиниця-подібний ефектор А12683
Coq9гомолог коензиму Q9 (дріжджі)67914
Col5a2колаген, тип V, альфа 212832
Col6alколаген, тип VI, альфа 112833
Col6a2колаген, тип VI, альфа 212834
Col18a1колаген, тип XVIII, альфа 112822
Clec4nдомен лектину З-типу, сімейства 4, член n56620
Crip2збагачений цистеїном білок 268337
Cyb5r1цитохром Ь5 редуктаза 17а IV, ізофрома 112857
Сохбсцитохром з оксидаза, субодиниця VIc12864
Dnmt3aДНК-метилтрансфераза 3А13435
Dnaja3гомолог DnaJ (Hsp40), субсемейство А, член 383945
Emilin2роздільник еластинових микрофибрил 2246707
Earllэозинофил-асоційований, сімейства рибонуклеази А, член 1193726
Efemplмістить епідермальний фактор росту, фибулин-подібний білок позаклітинного матриксу 1216616
Fbxo6F-бокс білок 650762
Fndc3bмістить домен фібронектину типу III - 3В69823
Gcnt2глюкозаминил-(N-ацил)-трансфераза 2,1-ветвящий ензим14538
Gpd2глицеролфосфатдегидрогеназа 2, мітохондріальна14571
Gnb4гуаниннуклеотид-зв'язуючий білок (G-білок), бета 414696
Hddc3містить HD домен 368695
HfeГемохроматоз15216
Hadhaгидросиацил-коензим A дегідрогеназа/3-кетоацил-коензим А тиолаза/еноил-коензим А гидратаза (трифункциональний білок), альфа-субодиниця97212
C130006E23гіпотетичний білок С130006Е23331563
Hiflaіндукований гипоtga6интегрин альфа 616403
Irf7фактор регуляції інтерферону 754123
Ldhbлактатдегідрогеназа16832
Lacelпідвищує лактацію 1215951
LxnЛатексин17035
Lenepбілок епітеліальної тканини кришталика57275
LimslLIM і старіючих клітин антиген-подібний домени 1110829
Macrodlмістить домен MACRO 1107227
MslnМезотелин56047
Myadmмаркер, ассоциирова� GnptgN-ацилглюкозамин-1-фосфотрансфераза, гамма субодиниця214505
Ndufa10NADH дегідрогеназа (убіхінон) 1 альфа, субкомплекс 1067273
Ndufa5NADH дегідрогеназа (убіхінон) 1 альфа, субкомплекс 568202
Ntn4нетрин 457764
Ntrk3нейротрофическая тирозинкиназа, рецептор, тип 318213
Nmnat3никотинамиднуклеотидаденилилтрансфераза 374080
Nidiнидоген 118073
Ogdhоксоглутаратдегидрогеназа (липоамид)18293
Ptcd3домен з пентатрикопептидним повтором 319038
Pxdnгомолог перосидазина (Дрозофіла)69675
Kcnjl5калієвий канал внутрішнього очищення, підродини J, член 1516516
EG665378який пророкують ген, EG665378665378
Prss23протеаза, сериновая, 2376453
Pimlділянка провирсной інтеграції 118712
Rmndlгомолог, необхідний для мейотичного ядерного ділення 1 (S. cerevisiae)66084
Rp2hгомолог пігментного ретиніту 2 (осіб)19889
ArhgeflOфактор обміну Rho-гуаниннуклеотида (GEF) 10234094
246104
1810013D10Rikген RIKEN кДНК 1810013D1066278
2010005J08Rikген RIKEN кДНК 2010005J0872046
2810482I07Rikген RIKEN кДНК 281048210767243
4933439C20Rikген RIKEN кДНК 4933439С2066776
9530058B02Rikген RIKEN кДНК 9530058 В0268241
D830012I24Rikген RIKEN кДНК D830012124320070
Sec23aSEC23A (S. cerevisiae)20334
Sema4asema-домен, імуноглобуліну домен (Ig), трансмембранний домен (ТМ) і короткий20351
цитоплазматичний домен (семафорин) 4A20716
Serpinflінгібітор серинової (або цистеиновой) пептидази, гілка F, член 120317
Serhlподібний серинової гидролазе68607
LOCI 00047339схожий з лизилоксидаза-подібним 2100047339
LOCI 00046998схожий з атрофією зорового нерва 1 (аутосомная домінанта)100046998
LOCI 00046740схожий з секретируемим кислим багатим цистеїном гликобелоком100046740
Smcr7гомолог кандидата 7области хромосоми синдрому Сміта-Магениса, (осіб)237781
Slc46a3сімейства переносників розчинених речовин 46, член 371706
14412
Stard3nlSTARD3 N-кінцевий подібний76205
Sdhbсукцинатдегидрогеназний комплекс, субодиниця В, залізо-сірчаний (Ір)67680
Suclglсукцинат-СоА-лигаза, GDP-утворює, альфа-субодиниця56451
Sucla2сукцинат-коензим А-лигаза, ADP-твірна, бета-субодиниця20916
Supv311супресор varl, 3-подібний 1 (S. cerevisiae)338359
Syngr1синаптогирин 120972
Sycp3білок синаптонемалього комплексу 320962
Tspan2тетраспанин 270747
66860
Timm44транслоказа внутрішню мітохондріальну мембрану 4421856
Usp47убіквітин-специфічна пептідаза 4774996
Uckl1уридин-цитидинкиназа 1-подібний 168556
Vpsl3aвакуолярний білок сортирующий 13А (дріжджі)271564
Vashlвазохибин 1238328
VcanВерсикан13003
WwtrlWW-містить домен, регулятор транскрипції 197064
Zkscanl7цинковий палець з ОНКОХВОРИМ та SCAN доменами 17268417

Для підтвердження даних, отриманих на чіпі методо�підтвердження методом RT-PCR, в першу чергу тестували генів, експресія яких змінилася у всіх лініях. Інші фактори, які необхідно враховувати, включають виключення генів з низькою експресією (яку оцінюють за середньої інтенсивності сигналу в експерименті з микропанелью) і виключення генів, які не демонструють зміни в експресії, щонайменше, на 50% (<1,5 або>1,5-кратне зміна). Чотири гени, які змінилися у всіх семи лініях, не мали доступного для придбання праймера і, таким чином, ці гени не могли бути піддані скринінгу методом qPCR. Бета-актин (Actb) не змінювався ні в одній з ліній і служив в якості конститутивної гена для qPCR-аналізів.

Для решти 27-ми генів, ідентифікованих в якості кандидатів-маркерів старіння жирової тканини, застосовують qPCR-аналіз для тестування зразків з дослідження по годівлі поживними речовинами з прикладу 1 для підтвердження вікових змін та протидії віковим змінам в умовах помірної CR. Статистично значуща зміна в експресії з віком при аналізі методом qPCR спостерігали для 13 з 27 генів. Дані наведені в таблиці 6. Було додатково визначено, що вісім з цих 13-ти генів змінюються в� собою: Aspn, Соl6а2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB і Slc6al3.

Таблиця 6
Символ генаНазва генаНомер в базі даних «Entrez gene»
AspnАспорин66695
Clec4nДомен сімейства лектину З-типу 4, член n56620
Соl6а2Колаген, тип VI, альфа 212834
Col18a1Колаген, тип XVIII, альфа 112822
Cox8bЦитохром з оксидаза, субодиниця VIIIb12869
Crip2Збагачений цистеїном білок 268337
EarllЭозинофил-асоційований, сімейства рибонуклеаз А, член 1193726
Emilin2Разделител�"1">Отопетрин 121906
Pla2g2dФосфоліпаза А2, група IID18782
RhbdBРомбоид, жилко-подібний 3 (Дрозофіла)246104
Slc6al3Сімейства переносників розчинених речовин 6 (переносник нейромедіаторів, GAB А), член 1314412
Sycp3Синаптонемального комплексу білок 320962

Функціональна значимість маркерів старіння жирової тканини обговорюється нижче. Гени, що відповідають на фактор зростання

Аспорин (Aspn): Трансформуючий фактор росту бета (TGF-бета) являє собою секретируемий білок, який грає роль в підтримці позаклітинного матриксу (ЄСМ), регулюючи експресію генів, залучених в підтримку цитоскелета (1). Аспорин являє собою компонент ЄСМ, і було показано, що експресія аспорина індукується TGF-бета (2) в суглобовому хрящі; ми спостерігали зниження експресії аспорина (2-кратне) в жировій тканини з віком. Розглянуті разом, ці дані пре�у CR практично повністю запобігає вікове зниження експресії Aspn (1,8-кратне збільшення в старих CR проти старих контрольних мишей).

Збагачений цистеїном білок 2 (Crip2): Хоча мало що відомо про функції Crip2, схоже, що він належить до сімейства білків, залучених до ремоделювання цитоскелета (3), і як з аспорином (вище), було показано, що експресія Crip2 індукується TGF-бета (4). Рівень експресії Crip2 був дуже схожий з тим, що спостерігали з аспорином, включаючи значні зміни в експресії з віком (у 2,3 рази), яке попереджає CR (в 2,0 рази).

Ромбоид, жилко-подібний 3 (Rhbdl3): Білок, який кодується геном Rhbdl3, характеризується як найбільш еволюційно консервативна кДНК гена rho дрозофіли, яка модулюється сигналом епідермального фактора росту, і відіграє певну роль у розвитку нервової системи у мишей. Експресія цього гена сильно знижується з віком, і CR повністю попереджає вікові зміни в експресії цього гена (зміна в 6,2 рази з віком і збільшення в 7,2 рази з CR).

Таким чином, наведені вище три гени являють собою універсальні маркери старіння жирової тканини, які регулюються факторами росту, експресія яких може модулюватися режимом харчування.

Зниження в ЄСМ в збірці микрофибрилл з віком

Колаген, тип VI, альфа 2 (Соl6а2): Колаген VI представляє собою та з-за порушеного освіти микрофибрилл (6, 7). Раніше, в нашому дослідженні універсальних маркерів старіння в скелетних м'язах миші ми показали, що експресія деяких генів колагену (Col1al, Col1a2 і Соl3а1) знижується з віком, і що цьому перешкоджає зниженню CR. Значне зниження (зниження в 2,1 рази) в Соl6а2 в жировій тканині припускає падіння в підтримці ЄСМ з віком через зниження в збірці микрофибрилл.

Роздільник еластинових микрофибрилл 2 (Emilin2). Мало що відомо про функції Emilin2, хоча повідомлялося про те, що він синтезується і локалізується в ЄСМ. Emilin2 може виконувати деяку роль в клітинній смерті через зовнішній апоттичний шлях, оскільки зв'язування апоптических факторів з Emilin2 призводить до активація каспази. Альтернативно, інші дослідники припускають, що підвищений рівень в сироватці білка, кодованого цим геном, може бути биомаркером раку яєчників. У будь-якому випадку, спостерігали значне зниження експресії Emilin2 з віком у жировій тканині (-2,1 рази зміна з віком), і CR запобігає вікове зміна на ~35%.

Збільшення запалення з віком

Фосфоліпаза А2, група IID (Pla2g2d): Фосфоліпази А2 (PLA2) добре відомі з-за їх здатності приводити до мобілізації жирні кислоти з фосфолипидо� рівень PLA2 може мати наслідки поза мобілізації ліпідів, оскільки збільшення позаклітинного PLA2 пов'язано зі збільшеним рівнем прозапальних цитокінів TNFcc та інтерлейкіну 1 (12). Експресія гена Pla2g2d збільшується в 3,1 рази з віком і частково (але незначно) попереджається CR (зміни в експресії в 1,4 рази).

Менш охарактеризовані гени

Отопетрин 1 (Otopl): Єдине повідомлення, що стосується функція Otopl, говорить про те, що він важливий для освіти отолітів, структур внутрішнього вуха, які відповідальні за сприйняття сили тяжіння і навантаження (13). Оскільки ці структури формуються шляхом кристалізації карбонату кальцію, ймовірно, що функція цього гена в жировій тканині має відношення до гомеостазу кальцію. Експресія Otopl збільшується в 3,0 рази з віком і частково (але не значно) попереджається CR (зміни в експресії в 1,5 рази).

Сімейства переносників розчинених речовин 6, член 13 (Slc6al3): Не існує повідомлень щодо функції цього гена у мишей або людей. Однак по єдиному дослідження на щурах (14) можна припустити, що білок, який кодується геном Slc6al3, залучений в транспорт глутамату, гамма-аміномасляної кислоти (GABA). Експресія Slc6al3 знижується (зміна в 1,8 разів) з віком і це зниження частково (бщей ефективності впливу, розробленого для протидії віковим змінам в універсальних маркерах старіння, корисно створити показник, який дозволить порівнювати, як вплив протидіє експресії універсальних маркерів старіння. Відповідно, «показник попередження старіння » розраховують для опису середнього ефекту впливу на вікові зміни в експресії восьми універсальних маркерів старіння жирової тканини.

Для кожного з восьми універсальних маркерів старіння жирової тканини, розраховували «відсоток запобігання» як відсоток зміни у старінні, якому протидіє вплив. Наприклад, величина, рівна «100%» буде вказувати на те, що вплив режиму харчування підтримує експресію гена тому ж рівні, що спостерігають у молодих контролях. Оцінка попередження, що перевищує 100%, буде вказувати на зрушення в експресії гена до рівня, який «молодше» того, що спостерігають у молодих контролях; навпаки, негативний відсоток запобігання буде вказувати на те, що експресія гена посилилась порівняно з спостережуваної в старих контрольних групах. Величини для кожного гена потім усереднюють по всій обробці, і результуючий показник виявляє

Приклад 4

Цей приклад описує ідентифікацію транскрипційних маркерів старіння в мозковій тканині.

Для ідентифікації змін в експресії гена в неокортексі шести ліній мишей (C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA і B6C3HF1) застосовують чіп «Mouse Genome 430 2.0» компанії «Affymetrix». Значна зміна експресії визначають за допомогою двосторонніх t-критеріїв для молодих проти старих мишей (Р < 0,05, n=7 мишей на лінію на вікову групу). Молодих мишей тестують на п'ятому місяці життя, старих мишей тестують на 25-му місяці життя.

Таблиця 7 показує число генів, які значно змінюються з віком в кожній лінії. У таблиці 8 наведено всі гени, експресія яких змінюється, щонайменше, в трьох з шести ліній.

Таблиця 7
ЛініяЧисло транскриптів
В61029
Balbc415
СЗН2151
СВАF11957

�диница 1В
Таблиця 8
Символ генаНазва генаНомер в базі даних «Entrez gene»
Abca8aАТР-зв'язує касета, підродина А (АВС1), член 8а217258
Adamts14ADAMTS-подібний 4229595
Agxt211аланін-глиоксилат-амінотрансфераза 2-подібний 171760
AI465270экспрессируемая послідовність AI465270102097
AI838057экспрессируемая послідовність AI838057101160
Ак311аденилаткиназа 3 альфа-подібний 111639
Alkbh3alkB, репарація після алкілування, гомолог 3 (Е. coli)69113
Ankrdl7Анкириновий повтор домен 1781702
Ankrd39Анкириновий повтор домен 39109346
Anlnаниллин, актин-зв'язуючий білок (scraps-гомолог, Дрозофіла)68743
Anxa4анексії А411746
Anxa5анексії А511747
Apodаполіпопротеїн D11815
Arid4aАТ-збагачений домен взаємодіє 4А (Rbp 1 - подібний)238247
Arl2подібний фактору ADP-рибозилирования 256327
11867
Aspaаспартоацилаза (аминоацилаза) 211484
Atp2b1АТРаза, Са++ - транспортуюча, плазматична мембрана 167972
B2mбета-2 мікроглобуліну12010
BC035295послідовність кДНК ВС035295207785
BC061194послідовність кДНК ВС061194381350
Bcorкорепрессор, що взаємодіє з Вс1671458
Bidдомен, який взаємодіє з ВНЗ, агоніст загибелі12122
BokРодинний Вс1-2 білок-кілер яєчників51800
C130006E23гіпотетичний білок С130006Е23331563
Clqaкомпонент комплементу 1, q субкомпонент, альфа-поліпептид12259
Clqbкомпонент комплементу 1, q субкомпонент, бета-поліпептид12260
Clqcкомпонент комплементу 1, q субкомпонент, З-ланцюг12262
C330006P03Rikген RIKEN кДНК С330006Р03320588
Calb2кальбиндин 212308
CamsaplllКальмодулін-регульований спектрин-асоційований білок 1 - подібний 167886
Capnslкальпаин, мала субодиниця 112336
CastКальпас� циклін D212444
Ccsмідний шаперон для супероксиддисмутази12460
Cdl4CD 14 антиген12475
Cd52CD52 антиген23833
Cd59aCD59a антиген12509
Cd68CD68 антиген12514
Cd74CD74 антиген (інваріантний поліпептид основного комплексу гістосумісності, клас II антиген-асоційований)16149
Cd81CD 81 антиген12520
Cd9CD9 антиген12527
Cdhllкадгерин 1112552
Cdkl2циклін-залежна киназоподобний 2 (CDC2-споріднена кіназа)53886
CebpdССААТ/енхансер-зв'язуючий білок (З/ЕВР), дельта12609
Cendlвихід з клітинного циклу і нейрональная диференціація 157754
Chkbхолинкиназа бета12651
Cited 1Cbp/рЗОО-взаємодіючий трансактиватор з Glu/Asp-збагаченим карбоксиконцевим доменом 112705
Clec7aдомен лектину З-типу, сімейства 7, член а56644
Cmtm3CKLF-подібний MARVEL трансмембранний домен містить 368119
Cmtm5CKLF-подібний MARVEL трансмембранний домен соді�="1">конектор енхансер супресора кінази Ras 2245684
Cnn3кальпонин 3, кислий71994
Cntn6контактний 653870
Commd9містить домен СОММ 976501
Comtdlмістить домен катехол-О-метилтрансферази 169156
Copeбілковий комплекс коатомер, епсилон-субодиниця59042
Corolbкоронин, актин-зв'язуючий білок 1В23789
CrimlЗбагачений цистеїном трансмембранний BMP регулятор 1 (хордин-подібний)50766
Cst7цистатин F (лейкоцистатин)13011
td align="left">Ctssкатепсин S13040
Ctszкатепсин Z64138
Cyb5rlцитохром b5 редуктаза 172017
Cybaцитохром b-245, альфа-поліпептид13057
Cyp20alцитохром Р450, сімейства 20, підродини А, поліпептид 177951
Cyp27alцитохром Р450, сімейства 27, підродини а, поліпептид 1104086
D12Ertd647eДНК сегмент, Chr 12, ERATO Doi 647, экспрессируемий52668
D19Wsul2eДНК сегмент, Chr 19 Wayne State University 12, экспрессируемая226090
DlErtd471eДНК сегмент, Chr 1, ERATO"c2">допа-декарбоксилаза13195
DdtD-допахром таутомераза13202
Dhrslдегідрогеназа/редуктаза (SDR сімейства) член 152585
Diap2гомолог диафана 2 (Дрозофіла)54004
Dnalclдінєїн, аксонема, легка ланцюг 1105000
Dusp6подвійний специфічності фосфатаза 667603
E330009J07Pvikген RIKEN кДНК E330009J07243780
Efhalдомен EF-хенд, сімейства А168514
EG434128який пророкують ген, EG434128434128
Egrlотвt="c1" nameend="2">відповідь на початковій стадії росту 313655
Epha4Eph-рецептор А413838
Ephx1епоксид-гідролаза 1, мікросомальна13849
Егоl1bEROl-подібний бета (S. cerevisiae)67475
Eya4гомолог безокий 4 (Дрозофіла)14051
Fahd2aдомен, що містить фумарилацетоацетат-гидролазу 2А68126
Fbxo39F-бокс білок 39327959
FcerlgFc рецептор, IgE, високоаффинний I, гамма-поліпептид14127
Fcgr3Fc рецептор, IgG, низкоаффинний III14131
Fnbpl1Fndc3bдомен, що містить фібронектин типу III ЗВ72007
Foxglforkhead-бокс G115228
Fxydlрегулятор іонного транспорту, що містить домен 1FXYD56188
Gabrb3рецептор гамма-аміномасляної кислоти (GABA-A), субодиниця бета 314402
GalГаланін14419
Gatmгліцин-амидинотрансфераза (b-аргінін:гліцин амидинотрансфераза)67092
Gdaгуанін-дезаминаза14544
Gfapглиофибриллярний кислий білок14580
Golph2Гольджи фосфобелок 2243385
Gpx3Глутатіон-пероксидаза 314778
Grhprглиоксилат-редуктаза/гидросипируват-редуктаза76238
Gria3глутаматний рецептор, ионотрофний, AMP A3 (альфа 3)53623
Gstm1глутатіон S-трансфераза, mu 114862
Gstm6глутатіон S-трансфераза, mu 614867
Gstm7глутатіон S-трансфераза, mu 768312
Gsto1глутатіон S-трансфераза, омега 114873
Gstt3глутатіон S-трансфераза, тета 3103140
Gtf2fl�D1гістосумісності 2, D область локус 114964
H2-M3гістосумісності 2, М область локус 314991
Hapln2гіалуронан і протеогликан-зв'язаний білок 273940
Hebp2гем-зв'язуючий білок 256016
Hectd2НЕСТ-містить домен 2226098
Helzхеликаза з доменом цинкових пальців78455
Homer 1homer-гомолог 1 (Дрозофіла)26556
Hsdl7bllгидросистероид-(17-бета)-дегідрогеназа 11114664
Hsd3b7гидроси-дельта-5-стероїд-дегідрогеназа, 3 бета - і стероїд-rowspan="1">Изоцитратдегидрогеназа 2 (NADP+), мітохондріальна269951
Ier3негайно-ранній відповідь 315937
Ifit3інтерферон-індукований білок з тетратрикопептид повторами 315959
Ifitm3інтерферон-індукований трансмембранний білок 366141
Ikbkgінгібітор каппаВ кінази гамма16151
I133інтерлейкін 3377125

56048
Imp4IMP4, U3 малий ядерний рибонуклеобелок, гомолог (дріжджі)27993
Itih3інтер-альфа інгібітор трипсину, важка ланцюг 316426
Jmjdlcjumonji-містить домен 1С382571
Kcnj16калієвий канал внутрішнього очищення, підродини J, член 1616517
Kcnvlкалієвий канал, підродини V, член 167498
Klf10Kruppel-подібний фактор 1021847
Klf9Kruppel-подібний фактор 916601
Klk6калікреїн-родственнная пептидаза 619144
Lcatлецитин-холестерин-ацилтрансфераза16816
Lcplлімфоцитарний цитозольний білок 118826
Lefty1визначення лівий/правий фактор 113590
Lgals3лектин, галактоза-зв'язуючий, розчинні 316854
LhfpHMGIC партнер злиття ліпоми108927
LOC629605гіпотетичний білок LOC629605629605
LOC672274схожий з фактором транскрипції SOX-4672274
Lohllcr2aвтрата гетерозиготності, 11, хромосомний ділянка 2, ген А гомолог (осіб)67776
LyzsЛізоцим17105
M6prbplбілок, що зв'язує рецептор маноза-6-фосфату 166905
Malatlасоційований з метастазами аденокарциноми легені транскрипт 1 (некодирующая РНК)72289
Marcksмиристоилированний збагачений аланіном субстрат протеїнкінази С17118
Mccc2метилкротоноил-коензим А � мидкин17242
Mfhas1Злоякісної фіброзної гистиоцитоксантоми амплифицированная послідовність 152065
Mrpl10мітохондріальний рибосомальний білок L10107732
Mysmlmyb-подібний, SWIRM і MPN домени 1320713
Nfybядерний транскрипційний фактор-Y бета18045
Nol4ядерний білок 4319211
Ntsr2Нейротензина рецептор 218217
OptnОптинейрин71648
Рапк3пантотенаткиназа 3211347
Pcdhl7протокадгерин 17219228
Pcdh8протокадгин бета 293873
Pcdhb21протокадгерин бета 2193892
Pcdhb9протокадгерин бета 993880
Pcolce2проколаген З-эндопептидаза енхансер 276477
Peciпероксисомальная дельтаЗ, дельта2-енол-коензим А изомераза23986
Phldalподібний гомологічних плекстрину домен, сімейства А, член 121664
PlekПлекстрин56193
Plekhflмістить гомологичний плекстрину домен, сімейство F (з FYVE-доменом) член 172287
Plxna2плекстрин A218845
Pmp22периферичний білок мієліну18858
Ppmldбілок фосфатаза 1D магній-залежна, дельта ізофрома53892
Ppp5cбілок фосфатаза 5, каталітична субодиниця19060
Prdm5PR-містить домен 570779
Psmb8протеосома (просома, макропаин) субодиниця, бета, тип 8 (велика багатофункційна пептидаза 7)16913
Psmb9субодиниця протеосоми (просома, макропаин), бета, тип 9 (велика багатофункційна пептидаза 2)16912
Ptpnl2білок тирозин-фосфатаза, нерецепторная, тип 1219248
Pvrl3родинний рецептора поліовіруса 358998
Rabllfip2білок, що взаємодіє з сімейством RAB11 2 (клас I)74998
Ra Rcbtb2регулятор конденсації хромосом (RCC1) і ВТБ (РОZ)-містить домен білок 2105670
Sbno1sno, strawberry notch-гомолог 1 (Дрозофіла)243272
Shox2низькорослості гомеобокс 220429
Slcl4a1сімейства переносників розчинених речовин 14 (переносник сечовини), член 1108052
Slcl5a4сімейства переносників розчинених речовин 15, член 4100561
Slit2гомолог slit 2 (Дрозофіла)20563
Slit3гомолог slit 3 (Дрозофіла)20564
SordСорбитолдегидрогеназа20322
Sos2гомолог Son of sevenless 2 (Дрозофіла)20663
SparcSpp1секретируемий фосфобелок 120750
Spred2sprouty-споріднений, EVH1 містить домен 2114716
Ssbp3Одноцепочечную ДНК-зв'язувальний білок 372475
Sstr4соматостатину рецептор 420608
Stl8супресор онкогенності 18240690
Suhw4супресора волохатого крила гомолог 4 (Дрозофіла)235469
Tcea2фактор елонгації транскрипції A (SII), 221400
Thтирозин-гидроксилаза21823
Tmbimlмістять трансмембранний мотив інгібітора ВАХ 169660
Tmeml44трансмембранний білок 14466058
Tmeml76bтрансмембранний білок 176В65963
Tnntlтропонин Т1, скелетний, повільний21955
Tnnt2тропонин Т2, серцевий21956
TrfТрансферрин22041
Tspan4тетраспанин 464540
Tspoбілок-транслокатор12257
Ube2j1убіквітин-кон'югований ензим Е2, Л56228
Ubtd2убіквітин-містить домен 2327900
VimВіментин22352

WwoxWW-домен-містить оксидоредуктаза8070730046
Zmat5цинкові пальці, матрин тип 567178
Zswim6цинкових пальців, SWIM-містить домен 667263
ZwilchZwilch, асоційований з кинетохором, гомолог (Дрозофіла)68014

Вісімнадцять потенційних маркерів старіння мозку відбирають для підтвердження даних чіпа методом qPCR. Гени відбирають на підставі безлічі факторів, включаючи але не обмежуючись: надмірну експресію в експерименті з мікрочіпом, надійні зміни в експресії в лінії В6, попередню інформацію про гени, асоційованих зі старінням мозку. За допомогою РНК-зразків з мишей В6, застосованих у дослідженні з чіпом, qPCR-аналіз виявив, що 13/18 генів показали зміни в експресії з віком. Ці 13 генів наведені в таблиці 9. Було додатково встановлено, що вісім із 13-ти генів змінюються з віком, і CR попереджає, щонайменше, приблизно 33% вікових змін; ці вісім генів являють собою: Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs і Sppl.

Назва гена
Номер в базі даних «Entrez gene»
ApodАполіпопротеїн D11815
B2mбета-2 мікроглобуліну12010
Clqaкомпонент комплементу 1, q субкомпонент, альфа-поліпептид12259
Clqbкомпонент комплементу 1, q субкомпонент, бета-поліпептид12260
Cd68CD68 антиген12514
Clec7aдомен лектину З-типу, сімейства 7, член а56644
Cst7Цистатин F (лейкоцистатин)13011
Ctsdкатепсин D13033
Gfapглиофибриллярний кислий білок14580
1133лектин, галактоза-зв'язуючий, розчинні 316854
LyzsЛізоцим17105
Spplсекретируемий фосфобелок 120750

Маркери старіння мозку, ідентифіковані вище, застосовують для оцінки ефективності CR у протидії вікових змін при старінні мозку. Ступінь, в якій CR може протистояти віковим змінам в експресії («відсоток запобігання»), визначають за допомогою показників, наведених в попередніх прикладах.

Багато з тих генів, про яких раніше повідомлялося, що вони являють собою біомаркери старіння, були ідентифіковані в дослідженнях на чіпі і підтверджені методом qPCR, включаючи Cd68, Ctsd та Gfap. CR протидіє змінам в експресії для Ctsd, але тільки помірно ефективно для Cd68 та Gfap.

Для деяких генів було показано, що вони мають нейропротективним дією, якщо експресія різко посилюється, але згубно діють, якщо оверэкспрессируются тривалий час (наприклад, при старінні). Деякі з цих генів включають Apod, Clqa і Clqb. Помірна CR-дієта противосчавших добавки.

Спостерігали помітне збільшення експресії генів, залучених в імунну відповідь і запальні відповіді (наприклад, B2m, Сlec71, Cst7, I133, Lgals3). Це знаходиться в строгій відповідності з попередніми повідомленнями про збільшення нейровоспаления з віком. Повідомляли про те, CR протистоїть вікових змін в експресії нейровоспалительних генів, хоча, схоже, CR протистоїть тільки віковим збільшення експресії В2 т. В цілому, зміни в експресії запальних супермаркеров було великим (в особливості, Clec7а і Cst7) і стійким до впливу режиму харчування в цьому дослідженні. Проте було показано, що значне обмеження калорійності споживаної їжі (~40%) протидіє вікових змін в генах, відповідальних за нейровоспаление, таким чином, альтернативні впливу володіють потенціалом для протидії віковим змінам в цих супермаркерах.

Нарешті, багато маркерів асоційоване з порушеннями страждають нейродегенеративними, такими як хвороба Альцгеймера (наприклад, Apod, Clqa, Clqb, Ctsd, Lyzs, Sppl). Припускають, що обмеження в калоріях протидіє прогресії хвороби Альцгеймера у людей і в моделях захворювання на мишах. Відповідно, помірне CR, примененноея про що повідомляються або передбачуваних функції генів, представляють собою маркери, наведена нижче.

Apod: Повідомляли про збільшення експресії аполіпопротеїну D при різних неврологічних порушеннях, включаючи хворобу Альцгеймера, шизофренію та інсульт, і при старінні мозку. Apod може представляти собою білок, що відповідає на стрес, оскільки повідомлялося, що оверэкспрессия цього гена в дрозофиле призводить до нейропротекции і подовження тривалості життя. Таким чином, рівень Apod корелює з рівнем ендогенного стресу.

В2М: бета-2-мікроглобулін (частина класу I молекул комплексу основної гістосумісності) також являє собою відомий маркер запалення, і раніше було показано його збільшення з віком у спинномозковій рідині літніх людей і в мозку людей з хворобою Паркінсона.

Clqa і Clqb: За наявними даними ці гени задіяні під вроджений імунітет і являють собою маркери запалення, які, як ми показали раніше, активуються з віком в мозку миші, і було також показано, що вони активуються при нейродегенеративних захворюваннях людини, таких як хвороба Альцгеймера.

Cd68: також відомий як макросиалин, Cd68 являє собою макрофаги-специфічний білок, експресія якого, за наявними дан�уется в мікроглії.

С1ес7а: також відомий як Dectin-1, за наявними даними, цей рецептор може індукувати безліч клітинних відповідей в макрофагах, включаючи фагоцитоз, окислювальний вибух і продукцію цитокінів. Цей ген кодує члена суперсімейства С-тип лектин/С-тип лектин-подібний домен (CTL/CTLD). Кодований гликобелок являє собою невеликий, типу II, мембранний рецептор зі складкою позаклітинного лектин-такого домену-типу і з цитоплазматичних доменом з тірозіновим мотивом активації иммунорецептора. За наявними даними, він функціонує як розпізнає структуру рецептор, який розпізнає безліч бета-1,3-пов'язаних та бета-1,6-пов'язаних глюканів з грибів і рослин, і, таким чином, відіграє певну роль у природженому імунній відповіді. Охарактеризовано альтернативні транскрипционние сплайсированние варіанти, що кодують різні ізоформи. Цей ген тісно пов'язаний з іншими членами суперсімейства CTL/CTLD на хромосомі 12р13 в природному ділянці комплексу ген-кілер.

Cst7: Цистатин F являє собою глікозильований низькомолекулярний інгібітор цистеиновой протеїнази людини. Цистатини являють собою важливі природні інгібітори цистеинових протеаз, націлені на спочатку �парагиниловие эндопептидази ссавців. Цистатин F ссавців, який експресується практично виключно в гемопоетичних клітинах і акумулюється в лизосомо-подібних органелах, залучений в регуляцію презентації антигену та інші імунні процеси. Він являє собою незвичайний цистатин, член суперсімейства з описаним редокс-регульованим механізмом активація і обмеженим профілем специфічності.

Ctsd: Катепсин D являє собою основну липосомальную протеазу, і нещодавно повідомлялося про мутації в Ctsd, які роблять її энзиматически дефектною, в підгрупах нейронного восковидні липофусциноза/хвороби Баттена. Фенотип цього захворювання не потребує Вах-опосредуемого апоптозу, а навпаки, ймовірно, опосередковується через аутофагию. Катепсин D-опосредуемий протеоліз аполіпопротеїну Е може брати участь у хвороби Альцгеймера. Повідомлялося також про активацію липосомальной системи в експериментальних моделях нейронального ушкодження.

Gfap: Глиофибриллярний кислий білок являє собою класичний маркер активація астроцитів і, можливо, найбільш добре вивчений маркер старіння мозку. Цей ген кодує один з основних бєлов проміжних філаментів зрілих астроцитів. Його застосовують якостей�викликають хворобу Александера, рідкісне порушення астроцитів в центральній нервовій системі.

I133: Погано охарактеризований цитокін, повідомлялося, що IL-33 являє собою білок з подвійною функцією, яка може функціонувати і як прозапальний цитокін, і як внутрішньоклітинний ядерний фактор з властивостями регулятора транскрипції.

Lgals3: Галектин-3 являє собою мульти-функціональний білок і, за наявними даними, бере участь в опосередкуванні запальних реакцій. За повідомленнями, галектин-3 активується в микроглиальних клітинах. Цікаво, що галектин-3, за наявними відомостями активує адгезію нейрональних клітин і зростання нейритов.

Lyzs: Також відомий як лізоцим, він являє собою погано охарактеризований і, імовірно, липосомальний білок, який широко поширений в лейкоцитах і залучений в запальні реакції.

Spp1: Секретируемий фосфобелок-1, також відомий як остеопонтин, являє собою секретируемий аргінін-гліцин-аспартат (RGD)-містить фосфобелок. Схоже, що Spp1 оверэкспрессируется при хворобі Паркінсона. Остеопонтин (OPN) залучений до запальні процеси і процеси загоєння ран, включаючи аутоімунний увеїт.

Приклад 5

Цей приклад описує идентифик�складають собою надійні маркери старіння в скелетних м'язах миші, проводять аналіз транскрипційного профілю з допомогою чіпа «Mouse Genome 430 2.0» компанії «Affymetrix» в литкових м'язах мишей з семи ліній: 129/J, C57BL/6, CBA/J, DBA2J, С3Н/HeJ, Balb/c та B6C3HF1. Аналіз профілю проводять на семи молодих (п'ять місяців життя) і семи старих (28-30 місяців) мишах з кожної лінії. Двосторонні t-критерії виконують для тестування на статистичну значимість зміни в експресії гена з віком. З -21000 транскриптів, представлених на панелі, 172 транскриптів значно (Р < 0,05) змінилися з віком, щонайменше, в шести з семи ліній (таблиця 10).

Таблиця 10
Символ генаНазва генаНомер в базі даних «Entrez gene»
Acsl6ацил-Коа-синтетаза, динние ланцюга, член сімейства 6216739
ActrlaAPvPl актин-родинний білок 1 гомолог А (дріжджі)54130
Adcy2аденилатциклаза 2210044
Akrlb8альдо-кето-редуктаза сімейства 1, член В814187
Aldhla1альдегід дегідрогеназа сімейства 1, підродини А111668
Amylамілаза 1, слина11722
Ankrd32анкириновий повтор домен 32105377
Antxr2рецептор сибіреязвенного токсину 271914
Apodаполіпопротеїн D11815
Arrdc4аррестин-містить домен 466412
Atpl3a5АТРаза, тип 13А5268878
AU018740экспрессируемая послідовність AU01874098528
B3gntlUDP-GlcNAc:6eTaGal бета-1,3-N-ацилглюкозаминилтрансфераза 15er">12268
Cd209bантиген CD209b69165
Cdkl2циклін-залежної киназе-подібний 2 (CDC2-споріднена кіназа)53886
Cdkn2cінгібітор циклін-залежної кінази 2С (р18, інгібує CDK4)12580
CdslCDP-диацилглицерол-синтаза 174596
Ces2 /// LOC546098карбоксилэстераза 2 /// схожий з карбоксилэстеразой 2234671 /// 546098
ChadХондроадгерин12643
ChodlХондролектин246048
Chrnalхолінергічний рецептор, нікотиновий, альфа-поліпептид 1 (м'язи)11435
Chrnblхолінергічний рецептор, нікотиновий, бета-поліпептид 1 (м'язи)1144368709
Clyblцітратліаза бета-подібна69634
Col11a1проколаген, тип XI, альфа 112814
Col1a1проколаген, тип I, альфа 112842
Col1a2проколаген, тип I, альфа 212843
Col3a1проколаген, тип III, альфа 112825
Col4alпроколаген, тип IV, альфа 112826
Col5a2проколаген, тип V, альфа 212832
Col6a1проколаген, тип VI, альфа 112833
Cpne2копії II234577
Csprsкомпонент Sp100-rs114564
CtnnbllCUB і вителлинового шару-подібний домен 116433
Cytlцитокін-подібний 1231162
Ddx6DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)-бокс поліпептид 613209
Dhx36DEAH (Asp-Glu-Ala-His)-бокс поліпептид 3672162
DmnДесмулин233335
Dmxl2Dmx-подібний 2235380
Dnajbl4гомолог DnaJ (Hsp40), підродини, член 1470604
Dusp26подвійний специфічності фосфатаза 26 (передбачувана)66959
E030025D05Rikген RIKEN кДНК E030025D05216613
Edg2ендотеліальної диференціації, лизофосфатидиловой кислоти G-білок-зв'язані рецептор, 214745
Egfl6EGF-подібний домен, множинний 654156
Eif2c2эукариотический фактор ініціації трансляції 2С, 2239528
Embэмбигин13723
Fbxl4F-бокс і збагачений лициновими повторами білок 4269514
Fmo2флавін-містить монооксигеназа 255990
FmodФибромодулин14264
Fscnlгомолог фасцина 1, білок пучкування актину (Strongylocentrotus purpuratus)14086
Fut8фукозилтрансфераза 853618
Gadd45aблокування росту та індукований поврежениями ДНК 45 альфа13197
Gcaгр�ссоциированний з індуційованої диференціацією ганглиозида 1014546
Gnal4гуаниннуклеотид-зв'язуючий білок, альфа 1414675
Gtl2 /// LphnlGTL2, импринтинговий по материнській лінії17263///33081
экспрессируемая, нетранслируемая мРНК /// латрофилин 14
Histlh3iгистон 1, H3i (Histlh3i), мРНК319153
Hnlгематологічна і неврологічна экспрессируемая послідовність 115374
Homer2homer-гомолог 2 (Дрозофіла)26557
Hook1hook-гомолог 1 (Дрозофіла)77963
Ноок3hook-гомолог 3 (Дрозофіла)320191
Hsdl7b7гидросистероид-(17-бета)-дегідрогеназа 71549015894
Високу-6важка ланцюг імуноглобуліну 6 (важка ланцюг IgM)16019
Itih5інтер-альфа (глобулін) інгібітор Н5209378
Jaridlbjumonji, АТ-збагачений домен взаємодіє IB (Rbp2-подібний)75605
Jmjd3Jumonji-містить домен 3, мРНК (кДНК-клон IMAGE:4037702)216850
Kcnablкалієвий потенціал-залежний канал, споріднений підродини shaker, бета член 116497
KeraКератосан16545
Krtl-18комплекс кератину 1, кислий, ген 1816668
Lgals3лектин, галактоза-зв'язуючий, розчинний 316854
LOC241944білок подібний до ZNF43241944545323
Lpgatlлизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1226856
Lip 11рецептору ліпопротеїну низької щільності-родинний білок 11237253
Mfap4асоційований з микрофибриллами білок 476293
Mgstlмікросомальна глутатіон-Б-трансфераза 156615
Mia3інгібуючий активність меланоми 3338366
M113мієлоїдною/лімфоїдної тканини або недиференційований лейкоз 3231051
M115мієлоїдною/лімфоїдної тканини або недиференційований лейкоз 569188
Mt2металлотионеин 217750
Mtap7асоційований з мікротрубочками білок 717918
Nipalгомолог, не импринтинговий у синдромі Прадера-Віллі/Ангельмана 1 (осіб)233280
NxnНуклеоредоксин18230
Opcmlопіоїд-зв'язуючий білок/молекули клітинної адгезії-подібний330908
Pblпередбачуваний: ген Mus musculus RIKEN кДНК 2310032М22 (Pbl)76748
Pcgf4polycomb групи RING пальця 412151
Pdcd6ipпрограмованої клітинної загибелі 6, взаємодіє білок18571
Pkp2плакофилин 267451
Plekhblдомен, що містить гомолог плекстрина, сімейства (эвектини) член 127276
Plk2polo-подібна кіназа 2 (Дрозофіла)18824
Prkczпротеїнкіназа С, зета18762
Рига /// 633041 lE07Rikбілок А, який зв'язує збагачений пуринами елемент /// ген RIKEN кДНК 6330411Е0719290 /// 70733
Purbбілок, що зв'язує збагачений пуринами елемент (Purb), мРНК19291
Pvrl3рецептору поливируса-родинний 358998
Rgs5регулятор сигнального шляху G-білка 519737
Rhpn2рофилин, Rho ОТРаза-зв'язуючий білок 252428
Rnf125RING пальця білок 12567664
Sbnolsno, гомолог strawberry notch 1 (Дрозофіла)243272
Serpina3nінгібітор серинової (або цистеиновой) пептидази, А гілка, член 3N20317
Sh3bp5білок, що зв'язує SH3домен 5 (ТТК-асоційований)24056
Slc4al0переносників розчинених речовин сімейства 4, бікарбонату натрію сопереносчик-подібний, член 1094229
Smc411SMC4 підтримання структури хромосоми 4-подібний 1 (дріжджі)70099
Spint2інгібітор серинової протеази Кунитца, тип 220733
Supt3hгомолог супресора Ту 3 (S. cerevisiae)109115
Syt9синаптотагмин IX60510
Taf91ТАР9-подібна РНК полімераза II, фактор асоційований з TATA box-зв'язуючим білком (ТВР)407786
Tekt1тектин 121689
Tnmdтричленної мотив-зі тримає 41211007
Ttcl4домен тетратрикопептидний повторів 1467120
Ttc9cдомен тетратрикопептидний повторів 9С70387
Ubnlубинуклеин 1170644
Vsig4V-set і імуноглобулін містить домен 4278180
Vtnвитронектин22370
WiflWnt-інгібуючий фактор 124117
Zdhhc21цинкові пальці, DHHC-містить домен 2168268

З 172 транскриптів, які були ідентифіковані в аналізі з мікрочіпом, методом qPCR аналізують 21 ген для визначення змін в експресії з віком і під дією CR. Гени вибирають за допомогою декількох критеріїв - гени відбирають на підставі відомої біологічної функції, есл�естижних журналах, припускають його участь у старінні м'язів. RT-PCR аналіз проводять, застосовуючи прилад «Applied Biosystems 7000» з допомогою наявних у продажу PCR-праймерів, розроблених компанією «Applied Biosystems». TATA box-зв'язуючий білок (Tbp) застосовують в якості внутрішнього контролю для всіх RT-PCR аналізів, оскільки раніше було показано, що цей ген не змінюється з віком або під дією CR. З 21-го протестованого гена, 13 генів показали зміни в експресії з віком, щонайменше, в шести з семи ліній (таблиця 11). З 13-ти генів, одинадцять продемонстрували обіг під дією CR. Ці одинадцять генів являють собою: С4, Cdkn2c, Cds1, Col1a1, Col1a2, Col3a1, Edg2, Високу-6, Mt2, Р1к2 і Syt9.

Таблиця 11
Символ генаНазва генаНомер в базі даних «Entrez gene»
С4компонент комплементу 4 (всередині H-2S)12268
Cdkn2cінгібітор циклін-залежної кінази 2С (р18, інгібує CDK4)12580
Cdslпроколаген, тип I, альфа 112842
Col1a2проколаген, тип I, альфа 212843
Col3a1проколаген, тип III, альфа 112825
Dusp26подвійний специфічності фосфатаза 26 (передбачувана)66959
Edg2ендотеліальної диференціації, лизофосфатидиловой кислоти G-білок-зв'язані рецептор,214745
Високу-6важка ланцюг імуноглобуліну 6 (важка ланцюг IgM)16019
Mt2металлотионеин 217750
Plk2polo-подібна кіназа 2 (Дрозофіла)20620
Rhpn2рофилин, Rho ОТРаза-зв'язуючий білок 252428
Syt9синаптотагмин IX

Після того як відповідна панель біомаркерів була підтверджена за допомогою qPCR (щодо змін з віком і, в більшості випадків, звернення зміна під дією CR), експресію цих генів аналізують у зразках mRNA з дослідження по поживним речовинам з прикладу 1. Нижче обговорюються результати, що мають відношення до специфічних маркерів, поряд з описом відомої за даними літератури функціональної значущості цих маркерів.

Комплемент С4: Четвертий компонент каскаду комплементу являє собою істотний фактор у вроджений імунітет. Його активацію спостерігають при нормальному старінні мозку у людей, а також в мозку людей з хворобою Альцгеймера. Різні алелі С4 у людей пов'язані зі здоров'ям і тривалістю життя, можна передбачити/p>

Високу-6: Igh6 являє собою антиген В-клітин, необхідний для дозрівання В-клітин. Дефіцитних за Igh6 мишей зазвичай застосовую в якості моделі дефіциту В-клітин. Таким чином, збільшення Високу-6 у скелетних м'язах з віком може бути вторинним по відношенню до збільшення інфільтрації В-клітин цієї тканини, яка в цих дослідженнях повністю попереджається CR.

Cdkn2C (р18): CdKn2C, також відомий як pl8INK4c, являє собою інгібітор циклинкинази (CKI) Gl-фази. Він являє собою один з декількох CKI, залучених до арешт клітинного циклу у відповідь на пошкодження ДНК. Інгібітори CKI являють собою гени-супресори пухлини, оскільки мутації як в р18, так і в родинному р16, призводять до утворення пухлин. Зокрема р16 пов'язаний з клітинним старінням компартмента популяції стовбурових клітин. Ймовірно, наблюдамая вікова активація р18 відображає накопичення ушкоджень ДНК.

Plk2: Polo-кіназа 2 являє собою polo-подібну кіназу, экспрессируемую в G1 в культивованих клітинах і деяких тканинах тварин, яка функціонує у відповідь на пошкодження ДНК. Polo, «засновник» цього сімейства генів, був ідентифікований у дрозофиле і бере участь у контролі клітинного поділу.

M�ялинки, виявлені у широкого кола організмів, про яких відомо, що вони індукуються в самих різноманітних стресових станах. Оскільки ці білки контролюють внутрішньоклітинного перенесення цинку, вважається, що контроль рівня цинку з допомогою металотіонеїнів являє собою важливий аспект захисту клітини від стресу.

Dusp26: DUSP (тирозин-фосфатази з подвійною специфічністю) схожі на тирозинфосфатази, оскільки володіють характерним для тирозинфосфатаз доменом (I/V)HCXAGXGR(S/T), залученим в їх каталітичну активність. Були ідентифіковані багато членів цього класу, включаючи DUSP1-9, DUSP16 і DUSP-26, також відомі як МКР 8. Всі ці білки дефосфорилируют сериновий/треониновий і тирозиновий залишки на різних членів родини МАР-кінази, що призводить до їх інактивації. DUSP активуються стимулами, які запускають МАР-киназние шляху, такі як тепловий шок, мітогени і гіпоксія. Нещодавно було показано, що Dusp26 асоційований з фактором транскрипції теплового шоку 4b, що пов'язало цей DUSP з відповіддю на тепловий шок. Дивно, але CR не здатне попередити вікову індукцію Dusp26 Cdsl: CDP-диацилглицерол-синтаза являє собою швидкість-обмежувальний фермент, залучений в біосинтез глицеролипидо CDP-диацилглицерол-синтази регулюють активність шляхів біосинтезу фосфоліпідів.

Edg2: Експресія Edg2 (ендотеліальної диференціації, лизофосфатидиловой кислоти G-білок-зв'язані рецептор, 2) знижується з віком, і це зниження повністю попереджається CR. Лизофосфатидиловая кислота індукує перебудову цитоскелета, і оскільки Edg2 являє собою рецептор для цієї молекули, ці результати узагальнюють загальну закономірність, показану в цьому дослідженні, що ремоделювання цитоскелета являє собою звичайний ознака старіння в скелетних м'язах миші.

Col1a1, Col1a2, Col3a1: Col1a і Соl1а2 кодують ланцюга проколагену типу I. Мутації в цих генах пов'язані із захворюванням, недосконалий остеогенез у людини. Наскільки нам відомо, цей результат являє собою перше виявлення скоординованої негативної регуляції генів колагену при старінні. Три гена про-колагену (Col1a1, Col1a2, Соl3а1) продемонстрували зміни з віком, яким протидіяв CR.

Rhpn2: Рофилин 2 являє собою Rho ОТРаза-зв'язувальний білок. Передбачається, що він відіграє певну роль у эндоцитозе і на підставі скринінгу двугибридних дріжджів було зроблено припущення, що компоненти цитоскелету є партнерами рофилина 2.

Syt9: Кальцій входить в пресинаптичні �гміни, включаючи Syt9, являє собою кальцій-зв'язуючі білки, які, як вважається, являє собою кальцієві сенсори для екзоцитозу.

Опис розкриває типові кращі втілення винаходу. Хоча застосовують специфічні терміни, їх застосовують лише в загальному і описовому сенсі і не для цілей обмеження, обсяг винаходу викладено у формулі винаходу. Зрозуміло, що можливі модифікації та варіації винаходу у світлі вищенаведених відомостей винаходу. Отже, зрозуміло, що в рамках обсягу додається формули винаходу винахід може бути застосоване на практиці інакше, ніж конкретно описано.

1. Спосіб ідентифікації змін в експресії генів, характерних для старіння, обраної тканини, де вибрана тканина являє собою серцеву, м'язову, мозкову або жирову тканину, що включає
відбір одного або декількох генів, що диференційно експресованих в тканини старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами, застосовуючи перший критерій, що
(i) один або кілька генів, що диференційно експресуються щонайменше 50% ліній, порід або етнічних груп досліджуваних видів на заздалегідь визначеному рівні значущості в p<0.10, і другим�одими суб'єктами щонайменше частково звертається шляхом обмеження калорійності.

2. Спосіб за п. 1, у якому обраний ген диференціально експресується в трьох або більше лініях, породах або етнічних групах.

3. Спосіб за п. 1, у якому обраний ген диференціально експресується в п'яти або більше лініях, породах або етнічних групах.

4. Спосіб за п. 1, у якому обраний ген диференціально експресується, щонайменше, 75% протестованих ліній, порід або етнічних груп.

5. Спосіб за п. 1, додатково включає той критерій, що відомо або передбачається, що ген, диференційно экспрессируемий у старих суб'єктів порівняно з молодими суб'єктами, асоційований з однією чи кількома пов'язаними зі старінням фізіологічними функціями.

6. Спосіб за п. 1, в якому вид являє собою собаку або кішку.

7. Спосіб детектування диференціальної експресії одного або декількох генів, що диференційно експресованих в обраної тканини у старих суб'єктів в порівнянні зі стандартом або з молодими суб'єктами, де вибрана тканина являє собою серцеву, м'язову, мозкову або жирову тканину, що включає:
(a) забезпечення зондів, що містять
(i) полінуклеотиди, які специфічно гибридизуются з двома або більше генами, кмере один з наступних: Amy1, Apod, Bdh1, C3, Casq1, Ccl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmem16k і Vgll2; де тканина являє собою жирову тканину, а білки містять щонайменше один з таких Aspn, Clec4n, Col6a2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6a13 і Sycp3; де тканина являє собою мозкову тканину, а білки містять щонайменше один з наступних: Apod, B2m, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, Il33, Lyzs і Spp1; де тканина являє собою м'язову тканину, а білки містять щонайменше один з наступних: С4, Cdkn2c, Cds1,, Col1a2,, Dusp26, Edg2, Високу-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 і Syt9; або
(ii) зв'язують поліпептиди агенти, які специфічно зв'язуються двома або більше білками, обраними з білків Adh1, Agtrl1, Akr1b8, Aldh1a1, Alox5ap, Amy1, Angptl2, Ankrd1, Anxa1, Apod, Apoe, Asah3l, Asph, Atp6v0e2, Atp6v1c1, Atp9a, Atxn10, BC023892, Bckdhb, Bdh1, Bre, Bysl, C1r, C3, Cacna2d1, Camk2n1, Casq1, Ccdc72, Ccl6, Ccl8, Ccnd1, Cd163, Cdh22, Cebpd, Cfb, Chek2, Churc1, Cilp, Ckb, Clic5, Col3a1, Col8a1, Cp, Cpxm2, Ctgf, Ctss, Cxcl14, Cyb5r3, Cyp27a1, Dalrd3, Dbnl, Dhrs1, Dhrs7c, Dpep1, EG665317, Ehbp1l1, Ehmt2, Enpp2, Fads1, Fbln2, Fcgr3, Fez2, Fgfr1op2, Fkbp5, Fmo2, Ftl2, Fxyd6, Fzr1, Gcdh, Gda, Gpm6b, Hlx1, Hod, Hp1bp3, Icam1, Ier3, Ifit1, Il4ra, Isoc1, Itm2a, Jph2, Kbtbd2, Kcnd2, Kcne1, Klhdc1, Lcn2, Lect1, Letm1, Lgals3bp, Lrp1, Lrp11, Ly6a, Man2a1, Mef2a, Mfge8, Mgp, Mier3, Mlf1, Mrc1, Mt2, Mybpc3, Myom2, Myot, Ndrg4, Nfkbia, Npr3, Nt5c2, Oas2, Osmr, Pah, Pbxip1, Pde1c, Pdlim4, Pgm5, Phlda1, Pkn2, Pld3, Plp2, Postn, Ppp1r3b, Prg4, Prkar1a, Prkcq, Ranbp5, Rnf5, Rpl3l, Rras, Rtn2, Rtn4, Scn1b, Scn4b, Serpina3n, Serpine2, Skap2, Slc6a6, Snx10, Socs3, Srf, Svep1, Tbc1d10c, Tfpi, Tgfb2, Tgm2, Thbs2, Thbs4, Timp2, Tln1, Tmem16k, Tmem176a, Tmem43, Tnfaip8, Tomm40, Tpte2, Trim47, Tspan13, Tspak, Rc3h2, Rbms3, Akap2, Aco2, Acsf3, Acadl, Acadvl, Arf2, Arl5b, Ankib1, Anxa2, Aspn, Abcd4, Bmp1, C1galt1c1, Cidea, Coq9, Col5a2, Col6a1, Col6a2, Col18a1, Clec4n, Crip2, Cyb5r1, Cox4i1, Сох6, Dnmt3a, Dnaja3, Emilin2, Ear11, Efemp1, Fbxo6, Fndc3b, Fyttd1, Gcnt2, Gpd2, Gnb4, Hddc3, Hfe, Hadha, C130006E23, Hif1a, Itga6, Irf7, Ldhb, Lace1, Lxn, Lenep, Lims1, Macrod1, Msln, Myadm, Gnptg, Ndufa10, Ndufa5, Ntn4, Ntrk3, Nmnat3, Nid1, Ogdh, Ptcd3, Ppic, Pxdn, Kcnj15, EG665378, Prss23, Pim1, Rmnd1, Rp2h, Arhgef10, Rhbdl3, 1810013D10Rik, 2010005J08Rik, 2810482I07Rik, 4933439C20Rik, 9530058B02Rik, D830012I24Rik, Sec23a, Sema4a, Serpina3n, Serpinf1, Serhl, LOC100047339, LOC100046998, LOC100046740, Smcr7, Slc46a3, Slc6a13, Stard3nl, Sdhb, Suclg1, Sucla2, Supv3l1, Syngr1, Sycp3, Tspan2, Tanc1, Timm44, Usp47, Uckl1, Vps13a, Vash1, Vcan, Wwtr1, Zkscan17, Abca8a, Adamtsl4, Agxt2l1, AI465270, AI838057, Ak3l1, Alad, Alkbh3, Ankrd17, Ankrd39, Anln, Anxa4, Anxa5, Apod, Arid4a, Arl2, Arpc1b, Aspa, Atp2b1, B2m, BC035295, BC061194, Bcor, Bid, Bok, C030017B01Rik, C130006E23, C1qa, C1qb, C1qc, C330006P03Rik, Calb2, Camsap1l1, Capns1, Cast, Ccnd2, Ccs, Cd14, Cd52, Cd59a, Cd68, Cd74, Cd81, Cd9, Cdh11, Cdh8, Cdkl2, Cebpd, Cend1, Chkb, Cited1, Clec7a, Cmtm3, Cmtm5, Cnksr2, Cnn3, Cntn6, Commd9, Comtd1, Cope, Coro1b, Crim1, Cst7, Ctsd, Ctss, Ctsz, Cyb5r1, Cyba, Cyp20a1, Cyp27a1, D12Ertd647e, D19Wsu12e, D1Ertd471e, Ddc, Ddt, Dhrs1, Diap2, Dnalc1, Dusp6, E330009J07Rik, Efha1, EG434128, Egr1, Egr3, Epha4, Ephx1, Ero1lb, Eya4, Fahd2a, Fbxo39, Fcer1g, Fcgr3, Fnbp1l, Fndc3b, Foxg1, Fxyd1, Gabrb3, Gal, Gatm, Gda, Gfap, Golph2, Gprin3, Gpx3, Grhpr, Gria3, Gstm1, Gstm6, Gstm7, Gsto1, Gstt3, Gtf2f1, H2-D1, H2-M3, Hapln2, Hebp2, Hectd2, Helz, Homer1, Hsd17b11, Hsd3b7, Idh2, Ier3, Ifit3, Ifitm3, Ikbkg, Il33, Imp4, Itih3, Jmjd1c, Kcnf1, Kcnj16, Kcnv1, Klf10, Klf9, Klk6, Lcat, Lcp1, Lefty1, Lgals3, Lgals8, Lhfp, LOC629605, LOC672274, Loh11cr2a, Lyzs, M6prbp1, Malat1, Marcks, Mccc2, Mdk, Mfhas1, Mrpl10, Mysm1, Nfyb, Nol4, Ntsr2, Optn, Pank3, Pcdh17, Pcdh8, Pcdhb2, Pcdhb21, Pcdhb9, Pcolce2, Peci, Phlda1, Plek, Plekhf1, Plxna2, Pmp22, Ppap2c, Ppm1d, Ppp5c, Prdm5, Psmb8, Psmb9, Ptpn12, Pvrl3, Rab11fip2, Rable2j1, Ubtd2, Vim, Wwox, Zfp292, Zmat5, Zswim6, Zwilch, Acsl6, Actr1a, Adcy2, Agtrl1, Akr1b8, Aldh1a1, Amy1, Ankrd32, Antxr2, Apod, Arrdc4, Atp13a5, AU018740, B3gnt1, C4, Cd209b, Cdkl2, Cdkn2c, Cds1, Ces2 /// LOC546098, Chad, Chodl, Chrna1, Chrnb1, Cilp2, Clybl, Col11a1, Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col4a1, Col5a2, Col6a1, Cpne2, Csprs, Ctnnbl1, Cuzd1, Cyt1, Ddx6, Dhx36, Dmn, Dmxl2, Dnajb14, Dusp26, E030025D05Rik, Edg2, Efha1, Egfl6, Eif2c2, Emb, Fbxl4, Fmo2, Fmod, Fscn1, Fut8, Gadd45a, Gca, Gdap10, Gna14, Gtl2 /// Lphn1, Hist1h3i, Hn1, Homer2, Hook1, Hook3, Hsd17b7, Icam1, Високу-6, Itih5, Jarid1b, Jmjd3, Kcnab1, Kera, Krt1-18, Lgals3, LOC241944, LOC545323, Lpgat1, Lrp11, Mfap4, Mgst1, Mia3, Mll3, Mll5, Mt2, Mtap7, Myo5a, Nipa1, Nxn, Opcml, Pb1, Pcgf4, Pdcd6ip, Pkp2, Plekhb1, Plk2, Plp2, Prkcz, Pura /// 6330411E07Rik, Purb, Pvrl3, Rgs5, Rhpn2, Rnf125, Sbno1, Serpina3n, Serpinf1, Sh3bp5, Slc4a10, Smc4l1, Spint2, Supt3h, Syt9, Taf9l, Tekt1, Tnmd, Trim41, Ttc14, Ttc9c, Ubn1, Vsig4, Vtn, Wif1, Zdhhc21, Ces2, або їх фрагментами;
(b) додавання зондів до зразка, що містить мРНК або білки з старого суб'єкта, так, щоб могла здійснитися гібридизація або зв'язування зондів з мРНК або білками в зразку, формуючи таким способом комплекси гібридизації або зв'язування в зразку;
(с) необов'язково, додавання зондів до іншого зразком, що включає мРНК або білки з молодого суб'єкта, так щоб могла здійснитися гібридизація або зв'язування зондів з мРНК або білками у другому зразку, формуючи тим самим комплекси гібридизації або зв'язування в іншому зразку;
(d) детекцію гибридизационних комплексів у зразку або зразках;
(e) порівняння комплекси, необов'язково, з іншого зразка, в якому, щонайменше, одна різниця між кількістю гібридизації або зв'язування в зразку в порівнянні зі стандартом або необов'язковим іншим зразком вказує на диференційну експресію одного або декількох генів, що диференційно експресованих у старих суб'єктів;
де вид являє собою собаку або кішку.



 

Схожі патенти:

Набір синтетичних олігонуклеотидів для визначення нуклеотидної послідовності кодуючої частини гена des і виявлення мутацій, асоційованих з десминовими кардіоміопатіями

Винахід відноситься до галузі молекулярної біології і може бути використано в діагностиці кардіоміопатій різної природи. Запропонований набір синтетичних олігонуклеотидів для виявлення мутацій кодуючої частини гена десмина (DES), асоційованих з кардіоміопатіями. Мутації виявляють шляхом визначення повної нуклеотидної послідовності кодуючої частини гена DES. Здійснюють ампліфікацію кодуючої частини гена DES з допомогою 7 пар синтетичних олігонуклеотидів при одній температурі та часу відпалу, з подальшим секвенированием отриманих продуктів ампліфікації за допомогою однієї пари універсальних праймерів. Запропоноване винахід дозволяє чутливо і специфічно визначати мутації гена DES, при цьому скорочуються час реакції ампліфікації, кількість маніпуляцій, час внесення реактивів для реакції секвенування і знижується ймовірність помилки при постановці реакції. 2 з.п. ф-ли, 1 іл.

Інгібування axl сигналізації в антиметастатической терапії

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до інгібіторів сигнального шляху AXL, і може бути використане в медицині. Отримують розчинну варіант поліпептиду AXL без трансмембранного домену AXL, який містить щонайменше одну модифікацію амінокислоти в положенні номер n, де n обраний 32, 72, 87, 92 або 127 або їх поєднання, де n+7 відповідає нумерації SEQ ID NO: 1 - послідовності AXL дикого типу, в якому зазначена модифікація підвищує спорідненість зв'язування поліпептиду AXL зі специфічно затримує зростання білком 6 (GAS6), яке, по меншою мірою, приблизно в 2 рази сильніше, ніж спорідненість поліпептиду AXL дикого типу. Поліпептид може бути злитий з Fc фрагментом і використаний в способі лікування, зниження або запобігання метастазування або інвазії пухлини у пацієнта-ссавця. Винахід дозволяє ефективно інгібувати сигнальні шляхи AXL/GAS6. 6 н. і 2 з.п. ф-ли, 15 іл., 6 табл., 3 пр.

Набір олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації burkholderia pseudomallei

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до набору олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації Burkholderia pseudomallei і диференціації від збудника сапу методом полімеразної ланцюгової реакції з флуоресцентною детекцією. Заявлений винахід дозволяє в короткий термін з високою чутливістю і специфічністю детектувати збудника меліоїдоза і диференціювати його від збудника сапу в пробах чистих культур та біологічному матеріалі. 1 іл., 1 табл., 3 пр.

Спосіб визначення генотипу людини з поліморфною позиції rs1613662 в гені gp6, кодує глікопротеїн vi

Винахід відноситься до галузі медицини, молекулярної біології та біотехнології. Запропоновано спосіб визначення поліморфізму гена GP6 людини, що кодує глікопротеїн VI, з поліморфною позиції rs 1613662, заснований на зняття кривих плавлення з флуоресцентно-міченими алель-специфічними олигонуклеотидними пробами. Завдяки збільшенню надійності визначення варіабельних позицій і можливості проводити визначення в одній пробірці на стандартному обладнанні спосіб може бути ефективно використаний для діагностики спадкових схильностей людини з реєстрацією результатів ПЛР в реальному часі. 1 іл.

Пептиди, які проникають у клітини, і їх застосування

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до інтерналізації терапевтичних молекул всередину клітини, і може бути використане в медицині. Отримують композицію для доставки молекул нуклеїнових кислот в клітини, що містить щонайменше один пептид з щонайменше 92% ідентичністю до GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); або YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), приєднаний до однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот. Винахід дозволяє підвищити ефективність доставки молекул нуклеїнових кислот всередину клітини ссавця за рахунок пептиду, здатного интернализироваться всередину клітини ссавця з ефективністю, що становить щонайменше 200% від ефективності інтерналізації пептиду ТАТ, має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1). 5 н. і 3 з.п. ф-ли, 16 іл., 1 табл., 8 пр.

Спосіб аналізу рнк

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до способу аналізу придатності РНК, екстрагованої з тканини або клітини (клітин), фіксованих за допомогою фіксатора, для аналізу експресії генів. Спосіб включає проведення електрофорезу з зазначеної РНК. Визначають, чи відповідає зазначена РНК наступному рівнянню: В/А≤1, де А являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні від 1000 до 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом, а являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні більш ніж 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом. Якщо зазначена РНК, экстрагированная з тканини або клітини (клітин), що задовольняє вказаним рівнянню, то вона придатна для аналізу експресії генів. Запропоноване винахід дозволяє швидко і з високою ефективністю визначити придатність РНК для аналізу експресії генів. 6 з.п. ф-ли, 3 іл., 11 табл., 7 пр.

Виборчий лізис клітин

Група винаходів відноситься до області лізису клітин. Запропоновано спосіб виборчого лізису клітин тварин, а також прилад для виявлення мікроорганізмів. Спосіб виборчого лізису тварин клітин в пробі води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, включає етапи забезпечення проби води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, додавання в згадану пробу неіоногенної детергенту і буферного розчину для одержання розчину зі значенням pH близько 9,5 або вище, інкубації цього розчину протягом періоду, достатнього для лізису клітин тварин. Прилад для виявлення мікроорганізмів у пробі складається з лизисной камери для прийняття проби води з тваринами клітинами, посудини з лужним буферним розчином із значенням pH 9,5 або вище і неіоногенним детергентом, або посудини з лужним буферним розчином із значенням pH близько 9,5 або більше і посудини з неіоногенним детергентом, фільтра, сполученого з лизисной камерою для фільтрування проби після лізису клітин тварин, камери індикації для аналізу присутності ДНК мікроорганізмів. Запропоновані винаходу забезпечують обробку зразка без його значного брабативать більш значні обсяги зразка і визначати низькі концентрації хвороботворних мікроорганізмів у зразку. 2 н. і 11 з.п. ф-ли, 12 іл., 8 пр.

Спосіб диференціації токсигенних генетично змінених штамів vibrio cholerae біовару ель-тор з різним епідемічним потенціалом методом мультиплексного полімеразної ланцюгової реакції та тест-система для його здійснення

Винаходи належать до галузі медичної мікробіології і стосуються способу диференціації токсигенних генетично змінених штамів V. cholerae біовару Ель-Тор і тест-системи. Охарактеризований спосіб включає проведення ПЛР з використанням специфічних праймерів до генам vc0497, vc0502 і vc0514 з острова пандемичности VSP-II. Охарактеризована тест-система містить компоненти для виділення ДНК, компоненти для проведення ПЛР, що включають, зокрема, суміш праймерів VSPIIreg-F - 5'-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3', VSPIIreg-R - 5'-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3' ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5'-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3', VSPIIpilin-R - 5'-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3' ген vc0502, VSPIIchem-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3', VSPIIchem-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3' ген vc0514, взятих у співвідношенні 1:1:1:1:1:1 відповідно. Винаходи дозволяють швидко і достовірно диференціювати токсигенні генетично змінені штами V. cholerae біовару Ель-Тор на геноварианти з низьким і високим епідемічним потенціалом. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 2 табл.

Спосіб виявлення мутацій в гені myo7a, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти і синдромом ушера

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу виявлення мутацій в гені MYO7A, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти або синдром Ушера. Спосіб включає виділення ДНК з лімфоцитів периферичної крові методом фенольно-хлороформною екстракції, проведення ПЛР, ампліфікацію 18 ділянок гена MYO7A, детекцію в денатурирующем акриламидном гелі і секвенування. ПЛР проводять з використанням спеціально підібраних послідовностей олігонуклеотидів, фланкують області 18 екзонів гена MYO7A з можливим вмістом різних мутацій. Винахід дозволяє спростити спосіб і підвищити точність визначення мутацій гена MYO7A, а також скоротити час дослідження. 3 іл., 1 пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується специфічних олігонуклеотидних праймерів. Представлені праймери включають сайти эндонуклеазного розщеплення, фланкуючі ділянки геному, що кодують глікопротеїни Gn і Gc, а також нуклеопротеин N, для отримання бібліотеки генів, що кодують глікопротеїни Gn і Gc і нуклеопротеин N вірусу лихоманки долини Ріфт. Охарактеризованное винахід може бути використаний у створенні банку нуклеотидних послідовностей, що кодують імунодомінантні білки вірусу лихоманки долини Ріфт Gn, Gc і N, які можна використовувати при створенні діагностичних і вакцинних препаратів на основі рекомбінантних технологій. 3пр.
Up!