Автоматична система для лізису мікроорганізмів, наявних у пробі, для добування і очищення нуклеїнових кислот зазначених мікроорганізмів з метою аналізу

 

Область техніки цього винаходу відноситься до галузі біологічного аналізу. Більш конкретно, даний винахід відноситься, по-перше, до пристрою для лізису мікроорганізмів, наявних в пробі з навколишнього середовища або в клінічній пробі, для вилучення і для очищення нуклеїнових кислот зазначених мікроорганізмів. Крім того, винахід відноситься до автоматичної системи для лізису мікроорганізмів для вилучення і для очищення нуклеїнових кислот зазначених мікроорганізмів з метою аналізу.

Протягом кількох років у лікарнях спостерігається зростання назокомиальних інфекцій. Дані інфекції пояснюються контамінацією госпиталізованих людей, які, внаслідок цього, виявлену иммунодепрессию, за рахунок хвороботворних мікроорганізмів, присутніх в лікарняній середовищі і не знищуваних незважаючи на значні зусилля, постійно прикладаються для дезінфекції обладнання та поверхонь і для обробки повітря. Зважаючи на ці всі більш і більш частих випадків навколишнього мікробіологічної контамінації, розробка пристроїв та способів поліпшення і полегшення заходів з охорони навколишнього середовища стає основною проблемою для працівників охорони здоров'я.

В до�л поточною проблемою в промисловості, зокрема в харчовій промисловості та фармацевтичної та косметичної промисловості. У харчовій промисловості добре відомі катастрофічні наслідки для здоров'я споживачів, які можуть статися через зараження продуктів або навіть сировини хвороботворними мікроорганізмами. Дійсно, харчове отруєння через бактерій, таких як бактерії родуListeriaабоSalmonellaв даний час стало звичайним явищем. Контроль за якістю повітря також є ключовим процесом у регулювання якості в фармацевтичній і косметичній промисловості.

Більше того, заходи контролю повинні відповідати все більш підвищуються вимогам, оскільки нормативні документи весь час стають більш жорсткими.

У розпорядженні працівників охорони здоров'я або виробників, серед інструментів для здійснення заходів з контролю за оточуючими умовами, прилади для відбору мікробіологічних проб повітря є кращими рішеннями для виявлення мікроорганізмів, які містяться в повітрі. Дані пристрої поміщають у відповідні точки в місцях, де потрібна вимірювання мікробіологічного зараження повітря. Загалом, вони складаються з приладу для відбір�оздуха, входить у контакт з культуральної середовищем; будь-які мікроорганізми, що містяться у відібраному повітрі, будуть поміщені в культуральне середовище. Потім культуральне середовище витягують і поміщають в термостат, щоб сприяти допомогти зростанню мікроорганізмів. Таким чином, стає можливим виявлення і ідентифікування зазначених мікроорганізмів за допомогою загальновизнаних мікробіологічних методик.

Тим не менше, дані пристрої мають основний недолік, який пов'язаний з використовуваною технологією. Цим недоліком є час, необхідне для одержання результату аналізу. Дійсно, щоб забезпечити можливість ідентифікації, використання загальновизнаних методик мікробіології, зокрема бактеріології, вимагає інкубаційних періодів, необхідних для клітинного росту, або навіть фаз повторного посіву на специфічній культуральному середовищі. У результаті час, потрібний для отримання результату, є відносно довгим або навіть дуже довгим, при спробі виявлення та ідентифікування патогена, який є відповідальним за назокомиальную інфекцію або за харчове отруєння.

Ще один недолік пристрою даного типу полягає в тому, що хоча вико�не дозволяє проводити розходження між штамами одного і того ж виду бактерій. В даний час відомо, що патогенності мікроорганізму може значною мірою варіювати в залежності від досліджуваного штаму.

Більш того, даний тип пристрою має недолік, що воно здатне виявляти мікроорганізми, що містяться в повітрі, є життєздатними, але які не можна культивувати.

Більше того, існують пристрої, призначені для вилучення зважених у повітрі часток, зокрема мікроорганізмів. Так, документ GB-2 254024 описує пристрій для відбору зважених у повітрі часток, принцип якого базується на циклонний ефекті. Як виявлено, незважаючи на те, що цей пристрій підходить для відбору зважених у повітрі часток, включаючи мікроорганізми, воно ніколи не розглядалася для обробки отриманих таким чином зразків, зокрема для виділення генетичного матеріалу, призначеного для використання для аналізу.

В більш загальному сенсі, методики, які найбільш релевантні для цілей ідентифікації мікроорганізмів та/або швидкості доставки результатів, по відношенню до клінічних проб, або проб з навколишнього середовища, безсумнівно, є методиками молекулярної діагностики. Дані методики, засноване�послідовностей, роблять можливим отримання дуже точної ідентифікації мікроорганізмів під час реєстрації, оскільки вони надають можливість винятку стадій культивування.

Тим не менше, використання таких методик має певні обмеження, найбільш важливим з яких є потенційно обмежена кількість мікроорганізмів, які присутні в повітрі і, внаслідок цього, можуть бути вилучені для проведення аналізу. Насправді, відомо, що проби з навколишнього середовища, а також деякі клінічні проби містять відносно невелику кількість мікроорганізмів. Отже, з такого вихідного матеріалу отримують тільки невелика кількість генетичного матеріалу. Внаслідок цього, критичним параметром стає ефективність методики, використовуваної для виділення нуклеїнових кислот, на підставі виходу.

Більш того, більшість існуючих методик для лізису мікроорганізмів не мають загального застосування для всіх мікроорганізмів та/або вимагають втручання кваліфікованого персоналу обслуговування стадій, які виконуються вручну.

Документ WO-A-2005/038025 описує спосіб виділення нуклеїнових кислот з мікроорганізмів, зокрема з пр�, �изиса за рахунок теплового удару і механічного лізису. Незважаючи на те, що подібний спосіб, безсумнівно, надає можливість оптимізації ефективності виділення нуклеїнових кислот і, внаслідок цього, збільшення кількості генетичного матеріалу, доступного для аналізу, дана ефективність все-таки залежить від кількості видобутих мікроорганізмів. Крім того, в цьому документі нічого не описано для оптимізації виділення зазначених мікроорганізмів.

Документ US-5707861 описує пристрій для руйнування живих клітин, таких як мікроорганізми. Цей пристрій робить можливим лізис клітин за допомогою використання скляних кульок, але на додаток через дії коливання завдяки зазору, який є між пробірками, що містять мікроорганізми, і отворами в опорі, що підтримує зазначені пробірки. Таким чином, пристрій даного типу забезпечує можливість оптимізації клітинного лізису і, внаслідок цього, оптимізації виділення генетичного матеріалу. Вказаний пристрій і спосіб, що використовується останнім, мають ті ж обмеження, які згадані вище, а саме, вони все-таки залежать від кількості виділених мікроорганізмів. Більш того, �ових кислот для того, щоб ізолювати їх від продуктів розпаду клітин. Насамкінець, вони вимагають ручного виділення нуклеїнових кислот в кінці стадії концентрування.

Дані проблеми також виникають з пристроєм, описаним в документі US-5567050.

Також були описані системи, які є більш інтегрованими. Так, документ WO-А-2004/018704 описує устрій та пов'язаний з ним спосіб, що використовує методику ПЛР (Полімеразної Ланцюгової Реакції) посилення, для відбору мікроорганізмів з повітря та їх ідентифікації. Ця система особливо підходить для боротьби з намаганнями нападу допомогою біологічного зараження в поштових сортувальних центрах. Дана система складається з пробовідбірника повітря, розташованого вздовж контуру для транспортування пошти, пристрої для фільтрування/сепарації частинок з допомогою циклонного дії, пристрої для концентрування/виділення частинок в пробі рідини та пристрої для перенесення фракції проби картридж GeneXpertTMдля ПЛР-аналізу від компанії Cepheid. Потім картридж вручну переносять в окремий автоматичний біологічний аналізатор для ідентифікації мікроорганізму або мікроорганізмів, підібраних з повітря.

Незважаючи на те, що дана система обеспечиЂем не менш, вона має декілька основних недоліків. Перший з цих недоліків полягає в тому, що система для обробки проби (відбір, сепарація, концентрація/виділення) до переносу в картридж для аналізу є відносно складною і дорогою. Ще один недолік полягає в тому, що не існує картриджа GeneXpertTM, який може виконувати як лізис, так і очищення нуклеїнових кислот. Додатковий другий недолік полягає в тому, що відібрані мікроорганізми, виділяються в пробі рідини, тільки частина якої аналізується. Це означає, що ризик виділення не всіх мікроорганізмів і, внаслідок цього, не всіх нуклеїнових кислот є дуже великим, значно обмежуючи релевантність аналізу. Більше того, незважаючи на складність, дана система вимагає ручного перенесення картриджа автоматичний аналізатор GeneXpertTM.

Таким чином, перша мета цього винаходу полягає в тому, щоб надати устрій, систему і універсальний спосіб лізису, який є ефективним для проб з навколишнього середовища, так і клінічних, для великого різноманіття мікроорганізмів, є вони бактеріями, вірусами чи грибами, за вибором у стані вегетативного розвитку, либщее для ефективного лізису зазначених мікроорганізмів, містяться в пробі з навколишнього середовища, наприклад з повітря, або в клінічній пробі, для того щоб виділити з неї нуклеїнові кислоти з метою аналізу інтегрованим чином.

Ще одна мета цього винаходу полягає в тому, щоб надати пристрій, підходить для відбору всіх мікроорганізмів, що містяться в пробі повітря.

Ще одна мета цього винаходу полягає в тому, щоб надати пристрій простий конструкції, з мінімізацією кількості і складності ручних стадій.

Ще одна мета цього винаходу полягає в тому, щоб надати пристрій, що є надзвичайно компактним.

Ще одна мета цього винаходу полягає в тому, щоб надати замкнутий пристрій, в якому різні стадії, перераховані вище, відбуваються без ризику зовнішнього зараження.

Ще одна мета цього винаходу полягає в тому, щоб надати пристрій, в якому зазначені стадії відбуваються без перенесення проби оператором, запобігаючи, таким чином, зараження останнього.

Ще одна мета цього винаходу полягає в тому, щоб надати пристрій і систему, яка обмежує втручання людини і покращує можливість відстежувати�ть пристрій і автоматичну систему, допускають подачу намічених нуклеїнових кислот в буфер, який може бути використаний безпосередньо на стадіях молекулярної діагностики, які включають, наприклад, стадії ампліфікації та виявлення, без додаткових стадій попередньої обробки, таких як центрифугування або фільтрування.

Дані цілі, серед інших, досягаються за допомогою цього винаходу, що відноситься, по-перше, до пристрою для відбору мікроорганізмів, які містяться в повітрі, при цьому вказаний пристрій має:

- модуль для забору повітря, що включає:

1) верхній елемент, що має прохід для впуску повітря, що забезпечує надходження повітряного струменя в зазначений модуль, причому зазначений прохід має у своєму підставі засобом обурення повітряного струменя,

2) нижній елемент, що має засіб випуску повітря, що забезпечує вихід створеної повітряного струменя,

при цьому зазначені верхній і нижній елементи можуть бути виготовлені у вигляді єдиного цілого одна з одною таким чином, щоб всередині зазначеного модуля для забору повітря могла створюватися повітряна струмінь;

- картридж орієнтовно циліндричної форми, що має зону затримування мікроорганізмів, при цьому зазначена зозанного модуля для забору повітря.

Переважно, зона затримування мікроорганізмів картриджа пристрої для відбору мікроорганізмів додатково включає матеріал, який здатний затримувати мікроорганізми, утримувати на своєму місці лизирующее засіб і розчинятися в присутності рідини.

У пристрої згідно винаходу, засіб обурення повітряного струменя включає конус стрілчастої форми, розташований у центрі висвердленого отвору проходу для впуску повітря, і, щонайменше, одну лопать, що сполучає зазначену стрелообразную деталь з внутрішньою поверхнею каналу для впуску повітря.

Переважно, модуль для забору повітря призначений для з'єднання з контуром циркуляції повітря або з пристроєм для аспірації повітря.

Справжній винахід також відноситься до пристрою для лізису мікроорганізмів, при цьому вказаний пристрій має:

- картридж орієнтовно циліндричної форми, що має зону затримування для мікроорганізмів, при цьому зазначений картридж виконує роль статора;

- ротор, який може бути встановлений в картриджі, при цьому зазначений ротор має засіб обертання.

Згідно кращого варіанту здійснення, даний пристрій допо�еимущественно, засіб обертання складається з жолобків, зроблених в стінці суцільного проходу, при цьому зазначені жолобки є діаметрально протилежними і призначені для прийому кінця трансмісійного вала засоби обертання зазначеного ротора.

Згідно заслуговує згадки характеристиці пристрою для лізису мікроорганізмів, внутрішній діаметр картриджа більше, ніж зовнішній діаметр ротора, так що, коли ротор вставляють в картридж, відстань, що відокремлює внутрішню стінку картриджа від зовнішньої стінки ротора, є досить великим, щоб надати можливість розташування лікувальної кошти в даному проміжному просторі, і досить маленьким для того, щоб лизирующее засіб знаходився у контакті з однієї чи іншої з зазначених стінок.

Крім того, даний винахід відноситься до системи для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот зазначених мікроорганізмів, що має:

- засіб позиціонування пристрою для лізису мікроорганізмів згідно винаходу;

- засіб обертання ротора, коли пристрій для лізису встановлюють на засіб позиціонування;

- щонайменше, один контейнер для прийому нуклеїнових кислот;

Переважно, дана система лізису згідно з попереднім пунктом додатково включає засіб намагнічування. Вона може включати також нагріває засіб.

Згідно особливому варіанту здійснення винаходу, багатоходової клапан включає засіб аспірації-виштовхування.

Винахід відноситься до способу збору мікроорганізмів, які містяться в повітрі, при цьому зазначений спосіб включає стадії, що складаються з:

а) встановлення картриджа всередині модуля для забору повітря для того, щоб отримати пристрій для відбору мікроорганізмів згідно винаходу, при цьому зона затримування всередині зазначеного картриджа знаходиться в повідомленні з проходом для впуску повітря модуля для забору повітря,

b) викликання проходження повітря в зазначений модуль для забору повітря за допомогою будь-якого підходящого засобу,

з) накопичення мікроорганізмів, які містяться в повітрі, в зоні затримування картриджа.

Винахід відноситься до способу лізису мікроорганізмів, які містяться в повітрі, при цьому зазначений спосіб має стадії, що складаються з:

а) встановлення �гласно винаходу, при цьому зона затримування всередині зазначеного картриджа знаходиться в повідомленні з проходом для впуску повітря модуля для забору повітря,

b) викликання проходження повітря в зазначений модуль для забору повітря за допомогою будь-якого підходящого засобу,

з) накопичення мікроорганізмів, які містяться в повітрі, в зоні затримування картриджа,

d) вилучення картриджа з модуля для забору повітря,

е) встановлення ротора у картриджі для того, щоб отримати пристрій для лізису мікроорганізмів,

f) позиціонування пристрою для лізису мікроорганізмів в системі для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот,

g) введення элюирующей рідини в картридж для суспендування лікувальної кошти, розташованого в зоні затримування мікроорганізмів картриджа, і

h) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа за допомогою засобу обертання зазначеного ротора, при цьому зазначений ротор викликає обертання лікувальної кошти мікроорганізмів.

«Элюирующая рідина» означає будь-яку рідину, придатну для здійснення лізису або навіть виділення і вилучення нуклеїнових кислот в хорошому стані. Зазначена рідина, �иделения нуклеїнових кислот і вилучення їх з метою аналізу, зазначений буфер повинен надавати можливість збереження зазначених нуклеїнових кислот. Рідини даного типу добре відомі кваліфікованим фахівцям в даній області.

Винахід відноситься до способу виділення нуклеїнових кислот з мікроорганізмів, що містяться в повітрі, при цьому зазначений спосіб має стадії, що складаються з:

а) встановлення картриджа всередині модуля для забору повітря для того, щоб отримати пристрій для відбору мікроорганізмів згідно винаходу, при цьому зона затримування всередині зазначеного картриджа знаходиться в повідомленні з проходом для впуску повітря модуля для забору повітря,

b) викликання проходження повітря в зазначений модуль для забору повітря за допомогою будь-якого підходящого засобу,

з) накопичення мікроорганізмів, які містяться в повітрі, в зоні затримування картриджа,

d) вилучення картриджа з модуля для забору повітря,

е) встановлення ротора у картриджі,

f) введення элюирующей рідини в картридж з допомогою кошти аспірації-випускання для суспендування лікувальної кошти, що міститься у картриджі, і

g) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа за допомогою с) аспірації элюирующей рідини, останньою в собі нуклеїнові кислоти зазначених мікроорганізмів, вивільнені в процесі лізису, і

i) перенесення элюирующей рідини в контейнер для прийому та очищення нуклеїнових кислот.

Переважно, способи лізису мікроорганізмів і виділення нуклеїнових кислот, описані вище, включають додаткову стадію d'), що складається з вирощування мікроорганізмів, локалізованих у зоні затримування картриджа.

Переважно, вирощування досягається шляхом інкубування картриджа в термостаті протягом періоду часу в діапазоні від 2 до 24 годин.

Переважно, стадії з f) i) способів лізису мікроорганізмів і виділення нуклеїнових кислот, описані вище, здійснюють в системі для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот.

Винахід відноситься до способу лізису мікроорганізмів, при цьому зазначений спосіб має стадії, що складаються з:

а) отримання картриджа, в якому мікроорганізми локалізовані в зоні затримування зазначеного картриджа,

b) встановлення ротора у картриджі,

з) введення цікавить рідини в картридж для суспендування лікувальної кошти, розташованого в зоні затримування мікроорганізмів картриджа, і

d) р викликає обертання лікувальної кошти мікроорганізмів.

Винахід відноситься до способу виділення нуклеїнових кислот з мікроорганізмів, при цьому зазначений спосіб має стадії, що складаються з:

а) отримання картриджа, в якому мікроорганізми локалізовані в зоні затримування,

b) встановлення ротора у картриджі,

з) введення элюирующей рідини в картридж для суспендування лікувальної кошти, розташованого в зоні затримування мікроорганізмів картриджа, і

d) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа, при цьому зазначений ротор викликає обертання лікувальної кошти мікроорганізмів, і

е) аспірації элюирующей рідини, що містить нуклеїнові кислоти зазначених мікроорганізмів, вивільнені в процесі лізису, і

f) перенесення элюирующей рідини в контейнер для прийому та очищення нуклеїнових кислот.

Крім того, даний винахід відноситься до способу лізису мікроорганізмів, що містяться в пробі рідини, при цьому зазначений спосіб має стадії, що складаються з:

а) введення проби рідини, що містить зазначені мікроорганізми, в картридж поблизу від зони затримування таким чином, щоб вказана проба рідини призводила до суспендированию лікувальної средстдже,

з) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа, при цьому зазначене обертання призводить до суспендированию лікувальної кошти, розташованого в зазначеній зоні затримування мікроорганізмів картриджа, причому зазначений ротор викликає обертання лікувальної засобу, на якому затримуються мікроорганізми.

«Проба рідини» означає будь-яку пробу рідини, яка може містити в собі мікроорганізми. Вона може являти собою пробу рідини людського або тваринного походження. Зазначеної пробій може бути, наприклад, сеча, цільна кров, плазма або будь-яка інша текуча середовище організму. Проба рідини може бути харчового походження, як, наприклад, напій. Також вона може мати походження з навколишнього середовища, як, наприклад, вода. Більш того, проба рідини може також являти собою так звану переносящую рідина, в якій будь-які мікроорганізми, присутні на поверхні пристрої для взяття проб, типу тампона на стержні, такого як тампони на стержні, що продаються компанією COPAN під назвою flockedSWABS, були ресуспендировани допомогою струшування зазначеного тампона на стержні у зазначеній переносить жи�ихся в пробі рідини, при цьому зазначений спосіб має стадії, що складаються з:

а) введення проби рідини, що містить зазначені мікроорганізми, в картридж, поблизу від зони затримування, таким чином, щоб вказана проба рідини призводила до суспендированию лікувальної кошти, розташованого в зазначеній зоні затримування мікроорганізмів картриджа,

b) встановлення ротора у картриджі,

з) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа, при цьому зазначене обертання призводить до суспендированию лікувальної кошти, розташованого в зазначеній зоні затримування мікроорганізмів зазначеного картриджа, причому зазначений ротор викликає обертання лікувальної засобу, на якому затримуються мікроорганізми,

d) аспірації проби рідини, що містить нуклеїнові кислоти зазначених мікроорганізмів, вивільнені в процесі лізису, і

е) перенесення проби рідини в контейнер для прийому нуклеїнових кислот.

Крім того, даний винахід відноситься до способу виділення нуклеїнових кислот з проби клітинної тканини, при цьому зазначений спосіб має стадії, що складаються з:

а) введення проби клітинної тканини в картридж у присутності элюирующей рідини,

b) Ѱ всередині картриджа, при цьому зазначений ротор викликає обертання лікувальної кошти, що міститься у картриджі,

d) аспірації элюирующей рідини, що містить нуклеїнові кислоти, зазначених клітин, вивільнені в процесі лізису, і

е) перенесення элюирующей рідини в контейнер для прийому та очищення нуклеїнових кислот.

«Тканинна проба» означає будь-яку тканинну пробу людського або тваринного походження, з якої є можливість виділити нуклеїнові кислоти. Подібний зразок може бути отриманий за допомогою біопсії, наприклад, органу, м'язи або шкіри. Дані тканини можуть бути здоровими або патологічними, а саме пухлинними.

Необхідно зауважити, що всі способи виділення нуклеїнових кислот згідно винаходу можуть мати, згідно кращого варіанту здійснення, додаткову стадію очищення даних нуклеїнових кислот з метою подальшої обробки, такий як ампліфікація. Дана стадія очищення забезпечує можливість поділу між нуклеїновими кислотами та іншими клітинними складовими, обессоленними на стадії лізису. Дана стадія в цілому робить можливим концентрування нуклеїнових кислот і може бути пристосована для очищення ДНК і РНК. Вона мнеобязательно вкриті олигонуклеотидами, за рахунок адсорбції або ковалентних зв'язків (див. патенти США 4675040 і 5750338), і таким чином очищати нуклеїнові кислоти, які прилипли до даними магнітних частинок, за допомогою стадії очищення. Дана стадія очищення нуклеїнових кислот особливо корисна, якщо потрібно подальша ампліфікація зазначених нуклеїнових кислот. Особливо цікавий варіант здійснення даних магнітних частинок описаний в патентних заявках WO-A-97/45202 і WO-A-99/35500. Ще одним цікавим прикладом способу очищення нуклеїнових кислот є використання діоксиду кремнію або у вигляді колони, або у виді інертних часток (Boom R. Et al., J. Clin. Microbiol., 1990, № 28(3), p. 495-503) або магнітних частинок (Merck: MagPrep®Silica, Promega: MagneSilTMParamagnetic particles). Інші широко використовувані способи засновані на іонообмінних смолах у колоні або у форматі парамагнітних частинок (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Ще одним способом, який є дуже підходящим, але не ексклюзивним для винаходу, що є адсорбція на підкладці з оксиду металу (від компанії Xtrana: Xtra-BindTMmatrix).

Більш того, в різних способів, описаних вище, всі стадії, наступні за відтворенням пристрої для лізису мікроорганізмів, тобто як тільки ротор був встанов�еинових кислот.

Крім того, даний винахід відноситься до використання пристрою для лізису мікроорганізмів згідно винаходу для лізису клітин проби клітинної тканини.

Крім того, даний винахід відноситься до використання системи для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот зазначених мікроорганізмів згідно винаходу для лізису клітин проби клітинної тканини і очищення нуклеїнових кислот зазначених клітин з метою аналізу.

Мікроорганізми взяті з групи, що включає бактерії, віруси, дріжджі, цвіль і паразитів.

Проби, з яких ізолюють мікроорганізми, що мають походження з навколишнього середовища. Таким чином, це може бути проба повітря або рідини, такої як вода; або проби з поверхні. Проби також можуть мати клінічне походження, тобто будь-яка проба людського або тваринного походження, яка може бути об'єктом аналізу для виявлення та ідентифікації мікроорганізму, необов'язково хвороботворного.

Наявність намічених нуклеїнових кислот може бути продемонстровано з допомогою візуалізації реакцій гібридизації. Реакція гібридизації означає будь-яку реакцію між зареєстрованою нуклеїнової кислотою і наміченої нуктипа NASBA (Ампліфікація, Заснована на Послідовності Нуклеїнових Кислот) або ПЛР (Полімеразна Ланцюгова Реакція).

Нуклеїнова кислота передбачає олигонуклеотиди, деоксирибонуклеиновие кислоти і рибонуклеїнових кислоти, а також їх похідні. Термін олигонуклеотид позначає послідовність, щонайменше, двох нуклеотидів (деоксирибонуклеотидов, або рибонуклеотидов, або обох), натуральних або модифікованих, допускає гібридизацію, у відповідних умовах гібридизації, з олигонуклеотидом, який є, щонайменше, частково комплементарним. Модифікований нуклеотид передбачає, наприклад, нуклеотид, що має модифіковане підстава та/або має модифікацію межнуклеотидной зв'язку та/або остова. В якості прикладу модифікованого підстави можна привести інозин, метил-5-деоксицитидин, диметиламіно-5-деоксиуридин, диамино-2,6-пурин і бромо-5-деоксиуридин.

Для ілюстрації модифікованої межнуклеотидной зв'язку можна навести фосфоротиоат, N-алкилфосфорамидат, алкилфосфонат і алкилфосфодиэфирние зв'язку.

Альфа-олигонуклеотиди, такі як альфа-олигонуклеотиди, описані в FR-A-2 607507, ЗНК, такі як фосфоротиоат-ЗНК і 2'-тво-ЗНК, описані в Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 114, 1895-1897, є прикладами олігонуклеотидів, складових нуклеотиди з модифікованим остовом.

Реакції гібридизації можуть бути наочно представлені за допомогою будь-якого засобу виявлення, такого як пряме або опосередковане засіб.

У разі прямого виявлення, тобто без застосування введення міток, реакції гібридизації спостерігають за допомогою плазмонного резонансу або за допомогою циклічної вольтамперометрії на електроді, що несе проводить полімер.

У випадку опосередкованого виявлення, тобто за допомогою введення міток, введення мітки може бути здійснено або безпосередньо на намічених нуклеїнових кислотах, або через специфічного зв'язує партнера зазначених нуклеїнових кислот, які були заздалегідь помічені.

Специфічний зв'язувальний партнер намічених нуклеїнових кислот передбачає будь-партнер, допускає зв'язування з наміченої нуклеїнової кислотою, а в якості прикладу можна навести нуклеїнові кислоти, олигонуклеотиди або полінуклеотиди і ферментні субстрати.

«Введення мітки» передбачає прикріплення маркера, що допускає генерування, безпосередньо або опосередковано, помітного сигналу. Неисчерпива�заходів, з допомогою електрохімії, колориметрії, флуоресценції, люмінесценції, ензимів, таких як пероксидаза хрону (HRP), лужна фосфатаза (ALP), α-галактозидаза, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа; інгібіторів ензимів; кофакторів ензимів; часток, таких як частинки золота, магнітні латекси, ліпосоми; хромофоров, таких як люмінесцентні сполуки, барвників, радіоактивних молекул, таких як32P,35S або125I, флуоресцентних молекул, таких як флуоросцеин, родамін, Alexa®, умбеліферон, люмінол або фикоцианини. У разі флуоресценції, це може бути флуоресцентний продукт реакції ензим-субстрат, комбінація флуорофор-погашувач флуоресценції, затухання флуоресценції або будь-яка інша система, заснована на властивостях флуоресценції.

Також можуть бути використані непрямі системи, наприклад, за допомогою ще однієї пари ліганд/антилиганд. Пари ліганд/антилиганд добре відомі кваліфікованим фахівцям в даній області, і можна привести, наприклад, такі пари: біотин/стрептавидин, цукор/лектин, полинуклеотид/комплементарний полинуклеотид. В даному випадку, це ліганд, який несе зв'язуючий агент. Антилиганд може бути виявлений безпосередньо за допомогою маркерів, опие непрямі системи виявлення в певних умовах можуть призводити до посилення сигналу. Дана методика посилення сигналу добре відома кваліфікованим фахівцям в даній області, і можна послатися на попередню патентну заявку заявників FR-A-2 781802 або WO-A-95/08000 або на статтю J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491,1997.

Намічені нуклеїнові кислоти можуть бути завчасно позначені допомогою прямого або опосередкованого включення мітки з допомогою полімерази, кінази, випадково або певним чином, на кінцях або за допомогою включення «всередину» молекул.

Введення мітки специфічним зв'язує партнерам намічених речовин, що визначаються при аналізі, широко відомо кваліфікованим фахівцям в даній області і описано, наприклад, Greg T. Hermanson в Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 USA.

В залежності від типу введення мітки використовуваного кон'югату, наприклад, з використанням ензиму, кваліфікований спеціаліст у цій галузі додасть реагенти, що надають можливість візуалізації введення мітки. Дана стадія відповідає виявленню. Вона передує використанню промивающего буфера для вилучення фракцій речовин, що визначаються при аналізі, або елементів, не залучених у реакцію або приєднаних слабо і неспецифічна, для того, щоб ограни� з прикладу, наведеного нижче, який жодним чином не є обмеженням, з посиланням на креслення, на яких:

Фіг.1 показує зображення в поздовжньому перерізі картриджа, використовуваного для відбору і лізису мікроорганізмів;

Фіг.2 показує зображення в поздовжньому перерізі пристрої для відбору містяться в повітрі мікроорганізмів згідно окремого варіанту здійснення;

Фіг.3 показує збільшене часткове зображення в поздовжньому перерізі пристрої для відбору мікроорганізмів, яке показано на Фіг.1;

Фіг.4 показує перспективне зображення внутрішньої частини верхнього елемента пристрою для відбору мікроорганізмів;

Фіг.5 показує часткове перспективне зображення внутрішньої частини верхнього елемента пристрою для відбору мікроорганізмів, яке показано на Фіг.3;

Фіг.6 показує зображення в поздовжньому перерізі пристрої для лізису мікроорганізмів;

Фіг.7 показує зображення в поздовжньому перерізі вузла, що складається з пристрою для лізису мікроорганізмів і многоходового клапана;

Фіг.8А показує часткове зображення в поздовжньому перерізі системи для лізису мікроорганізмів на рівні многоходового клапана, у першій конфігурації �мов на рівні многоходового клапана, у другій конфігурації останнього.

Картридж 10, показаний в поздовжньому перерізі на Фіг.1, має загальну форму циліндра орієнтовно круглого поперечного перерізу. Верхній кінець циліндра є вільним, тоді як нижній кінець складається з стінки з отвором в центрі, на протязі якого є прохід 12, тягнеться в картридж 10. Можна бачити, що внутрішній перетин проходу має тенденцію до зменшення по мірі наближення до його верхнього кінця.

Як можна бачити на Фіг.1, внутрішня поверхня нижньої стінки 14 картриджа 10 є похилій, при цьому сама нижня точка нахилу розташована там, де вона входить у контакт з проходом 12, а сама верхня точка знаходиться в контакті з вертикальною стінкою 16 картриджа 10. Дана стінка 14 служить в якості опори для лікувальної кошти 18 і становить зону затримування мікроорганізмів. Дане лизирующее засіб складається в даному випадку з кульок однакового розміру. Згідно кращого варіанту здійснення, дані кульки є скляними. Однак вони можуть складатися з будь-якого іншого рівноцінного матеріалу, такого як залізо. Дані кульки переважно мають діаметр від 200 до 800 мікрометрів (мкм).

Згідно підприє�про доречно використовувати, суміш кульок з діаметром між 200 і 300 мкм з шарами, чий діаметр знаходиться між 400 і 600 мкм. Подібні кульки продаються, наприклад, компанією SIGMA під назвою кислотопромитие скляні кульки, 425-600 мкм, посилання: G8772.

Кульки утримуються на своєму місці у вигляді одного або більше накладених шарів допомогою шару желированного матеріалу 19, переважно розташованого на кульках. Желированний матеріал повинен відповідати деяким вимогам. Перше полягає в тому, що він повинен бути інертним, для того щоб не впливати на процеси, які відбуваються всередині картриджа. Друге полягає в тому, що він має володіти здатністю розчинення в рідині для здійснення лізису мікроорганізмів. Зазначеним матеріалом, наприклад, може бути агарозний гель (Sigma Aldrich, Agarose-Type I-B Low EEO, посилання: A0576-25G). Желированний матеріал може також мати у своєму складі гліцерол.

В якості альтернативи, желированний матеріал може бути переважно культуральної середовищем для мікроорганізмів. Дійсно, агаровая культуральна середовище довго загальновизнано використовувалася в області діагностики in vitro. Використання зазначеної культурального середовища пропонує кілька переваг. Основними� лізису. Навіть якщо пристрій згідно винаходу ставить метою відповідність необхідності, пов'язаної з швидким виявленням хвороботворних мікроорганізмів, тим не менш, ростова фаза від декількох хвилин до декількох годин повинна надавати можливість розмноження мікроорганізмів, що має безпосередній ефект, що складається в тому, що в розпорядження користувача потрапляє більша кількість нуклеїнових кислот (це робить можливим використання з вигодою неминучих перерв у виділенні і передачі повітряних проб, зібраних в приміщеннях, які потребують контролі, до початку власне аналізу). Другою перевагою використання культурального середовища є те, що остання може бути селективної для одного або більше заданих видів. У результаті використання даних середовищ може надати можливість селективного зростання і, внаслідок цього, виявлення певних хвороботворних мікроорганізмів за рахунок інших мікроорганізмів, які не представляють інтересу і які, можливо, можуть бути перешкодою для аналізу. Таким чином, може бути передбачено надання декількох різних картриджів, причому кожен виконаний з можливістю виявлення специфічних видо�редпочтительно 12 мм. Загальна товщина шарів кульок, як правило, знаходиться між 1 і 2 мм, що відповідає кількості скляних кульок між 0,1 і 1 г, переважно 0,3 р.

Картридж 10 переважно виготовляють за допомогою технології інжекційного формування. Використовуваним матеріалом є, наприклад, поліпропілен, полістирол, полікарбонат, циклічні циклоолефини (CCOs) або ПММА; причому найкращим є полікарбонат.

На Фіг.2 показано пристрій 20 збору мікроорганізмів. Цей пристрій складається з модуля для відбору повітря, в якому встановлений картридж 10. Даний модуль для відбору повітря складається з верхнього елемента 22 і нижнього елемента 24.

Верхній елемент 22 в цілому має циліндричну форму. Його перспективне зображення показано на Фігурах 4 і 5. Нижній кінець даного циліндра є вільним, тоді як верхній кінець частково щільно закритий з допомогою горизонтальної стінки 26. Дана стінка 26 має в своєму центрі висверленное отвір, який простягається в верхній елемент 22 за рахунок проходу 28. Дана частина насправді становить прохід для введення повітря в модуль 20 для відбору повітря. Згідно окремого варіанту здійснення, даний прохід для впуску ве підстави даного проходу розташований стрелообразний конус 30. Цей конус 30 об'єднаний зі стінкою проходу 28 з допомогою лопатей 32. Дані лопаті 32 можна ясно бачити на Фігурах 4 і 5. У варіанті здійснення, який представлений на даних схематичних зображеннях, їх кількість становить три. Проте їхня кількість може змінюватися. Як показано на Фіг. 2, роль вузла конус 30 - лопаті 32 полягає у створенні на підставі проходу 28, обурення повітряного струменя, що входить в пристрій для відбору мікроорганізмів таким чином, щоб дана обурена струмінь входила в контакт з желированним матеріалом зони затримування мікроорганізмів, призводячи до поглиблення останнього. Дане вигинання значно покращує уловлювання містяться в повітрі мікроорганізмів.

Як показано на Фігурах 2 і 4, верхній елемент 22 також має три центруючих штиря 34 і три стопорних фіксатора 38. Центруючі штирі 34 призначені для забезпечення правильного центрування картриджа 10 щодо верхнього елемента 22. Стопорні фіксатори 38 забезпечують блокування картриджа центрированном положенні, на верхньому елементі 22. Це чітко показано на Фіг.2.

Верхній елемент 22 має у своїй нижній частині плече і жолобок, зроблені по всьому периметру вертикальної стінки і зазначена�має в цілому циліндричну форму. Верхній кінець даного циліндра є вільним, тоді як нижній кінець частково щільно закритий за допомогою горизонтальної стінки 40, має в своїй центральній частині орієнтовно циліндричні отвори 42 для випуску повітря. Нижній елемент 24 додатково включає штир для підтримки і позиціонування картриджа 10. Нижній елемент 24 потім буде розміщений на верхній елемент 22. Картридж 10 також розташовують з опорою на нижній елемент 24 допомогою штиря 44. Насправді, коли картридж 10 встановлюють у нижньому елементі 24, елемент 44 входить в прохід 12 картриджа, встановлюючи і фіксуючи таким чином, останній в правильному положенні.

Верхній кінець вертикального округлої стінки нижнього елемента 24 може мати на своїй внутрішній поверхні виступ, зроблений по всьому периметру даної стінки. Даний виступ призначений для взаємодії з плечем і жолобком, представленими у верхньому елементі 22, для того щоб забезпечити фіксацію між верхнім елементом 22 і нижнім елементом 24. Пригін разом верхнього 22 і 24 елементів нижнього стає можливою за рахунок комплементарної форми їх нижнього і верхнього кінця, відповідно. Необхідно, щоб подібне з'єднання разом було про� рахунок нагвинчування одного елемента на інший. З цією метою, кінець стінки одного з елементів 22 або 24 може мати зовнішню різьбу, а кінець стінки другого елемента - відповідну внутрішню різьбу.

Важливим є те, щоб засіб для відбору було герметично закритим для того, щоб уникнути всякого паразитарного проникнення повітря.

Згідно особливому способу використання повітрозабірного кошти, нижній кінець проходу 22 для випуску повітря може бути з'єднаний з насосом для аспірації повітря (не показаний) або будь-яким рівноцінним насосних засобом. Даний насос використовують для аспірації навколишнього повітря в сітка засіб, коли, наприклад, необхідно виконати аналіз навколишнього повітря в окремому навколишньому просторі, такому як лікарняне приміщення або приміщення для виготовлення лікарських засобів або продуктів харчування. З цією метою може бути кращим мати насосне засіб, що діє автономно і безперервно.

Модуль 22 і 24 для відбору повітря може, наприклад, мати зовнішній діаметр між 10 і 40 мм, переважно 20 мм Внутрішній діаметр проходу для впуску повітря становить, наприклад, 6 мм.

Модуль 10 для відбору повітря може краще бути виготовлений з матеріалу, який�ческим, наприклад з алюмінію або сталі. Також він може бути з полімеру, такого як полікарбонат, циклічні циклоолефини (CCO) або ПММА.

На Фіг.2 стрілками показано шлях, по якому слід повітря, при включенні циркуляції повітря в пристрої для відбору мікроорганізмів. Таким чином, можна бачити, що повітря надходить у пристрій для відбору мікроорганізмів по проходу 28 для впуску повітря. Прохід 12 картриджа 10 частково поміщений в прохід 28 для впуску повітря, більш конкретно в конус 30. Повітряна струмінь на підставі проходу 28 трансформується, на вершині конуса 30, в круговий потік. Більш того, наявність конуса також запобігає надходження повітря в прохід 12. Як описано вище, обурена повітряна струмінь досягає желированного матеріалу 19 (кульки 18 не показані), що призводить до задерживанию в даній точці за рахунок наголоси мікроорганізмів, які переносяться в повітряному струмені. Даний процес, таким чином, щодо схожий на те, що відбувається в мікробіологічних пробоотборниках повітря.

Що стосується повітря, він продовжує свій рух за рахунок аспірації насосних засобом. Він піднімається уздовж внутрішньої поверхні вертикальної стінки 16 картриджа 10. Далі він знову йде вниз вздовж зовнішньої �шний потік, відбирається в модулі 20 для забору повітря, може становити, наприклад, між 20 і 100 літрів/хвилину (л/хв). Переважно, він складає 50 л/хв

Після завершення стадії затримування/концентрації мікроорганізмів у картриджі, останній витягують з модуля для забору повітря, за рахунок від'єднання верхнього 22 і нижнього 24 елементів від вказаного засобу, або розбираючи на частини, або развинчивая.

На цій стадії є можливість інкубування картриджа в термостаті при 37°С, якщо є необхідність винесення культури мікроорганізмів, сконцентрованих у зазначеному картриджі. Як вже зазначалося вище, вказане період інкубації триває, загалом, від декількох десятків хвилин до декількох годин з тим, щоб надмірно не подовжувати час аналізу. Однак якщо немає терміновості в отриманні результату аналізу, може бути передбачено інкубування картриджа протягом більш тривалого періоду, більш відповідного вимогам розмноження бактерій, тобто приблизно двадцять чотири години.

Аналогічним чином, також може бути передбачено збереження картриджа в навколишніх умовах, які підходять для зазначеного зберігання, таких як холодне приміщення, якщо є необхідний� встановленим безпосередньо в модулі для забору повітря. Даний тип надання має ту перевагу, що користувачеві не потрібно встановлювати картридж модулі для забору повітря, зменшуючи за рахунок цього ризик зараження під час даної стадії. Це особливо переважно в тому випадку, якщо модуль для забору повітря виготовлений з такого ж матеріалу, що і картридж, а саме з поліпропілену, полікарбонату або ПММА. Тоді виготовлення допомогою інжекційного формування є особливо придатним.

Коли відбір мікроорганізмів і, можливо, інкубування завершено, картридж 10 з'єднують з ротором 50 для того, щоб скласти пристрій для лізису мікроорганізмів, яке показано на Фіг.6. З цією метою, ротор 50 вставляють в картридж 10 на вільному кінці останнього через вертикальне поступальний рух.

Ротор 50, показаний на Фіг.6 в поздовжньому перерізі, має корпус циліндричної форми з круглим поперечним перерізом. Корпус має на верхній частині його зовнішньої стінки фланець 52, функцією якого є забезпечення того, щоб вузол картридж 10 - ротор 50 був непроникну для рідин, коли ротор повністю вставляють в картридж 10, з припиненням руху на верхньому кінці вертикальної стінки картриджа 10.

Для усилЂого, щоб утримувати ротор 50 у вигляді єдиного цілого з картриджем. Наприклад, кришка 54 може бути прикріплена за рахунок взаємної підгонки або за рахунок прикручування. Кришка має орієнтовно круглу форму і буде накручуватися зверху на ротор, утворюючи глухий прохід 56, наданий в роторі. На верхньому кінці цього глухого проходу, в стінці зроблені два діаметрально протилежних жолобка 57. Дані жолобки виконують функцію прийому кінця трансмісійного вала 90 кошти 92 обертання зазначеного ротора, як показано на Фігурах 8А і 8В. Таким чином, кінець даного валу має форму, комплементарну з даними жолобками, у вигляді ребра, яке буде вставлятися в дані жолобки. Приводним валом може бути вал електричного двигуна. В якості альтернативи, він може бути частиною пристрою для обертання вручну.

Як показано на Фіг.6, ротор 50 має у своїй нижній частині зовнішніми формами, які повністю комплементарни з внутрішніми формами картриджа 10. В результаті, ротор 50 буде повністю поміщатися всередині картриджа 10, при цьому прохід 12 виконує роль направляючої за рахунок введення в порожнину 58, передбачену на підставі ротора 50. Дана порожнину 58 має орієнтовно цилиндрическанавливают до тих пір, поки його нижня стінка 59 не буде спиратися на вузол, що складається з кульок 18 і желированного матеріалу 19.

Ротор 50 і кришка 54 переважно виготовлені з того ж самого полімерного матеріалу, що і картридж, а саме з поліпропілену, полікарбонату або ПММА. Переважно, ці деталі виготовляють допомогою інжекційного формування прозорого полікарбонату (Makrolon®2858, Bayer).

Вузол картридж 10 - ротор 50 - кришка 54, внаслідок цього, становить пристрій для лізису мікроорганізмів 60 згідно винаходу і буде далі в цій роботі називатися «пристрій для лізису».

Після того як пристрій для лізису виконано, його поміщають на 4-ходовий клапан, який показано на Фіг.7. Даний клапан 70 має перший хід 701, призначений для прийому пристрою 60 для лізису. Вказаний пристрій з'єднано з клапаном за допомогою підстави проходу 12 картриджа 10. Другий хід має з'єднувальний отвір 702, призначене для з'єднання з першим засобом аспірації-виштовхування, частиною системи для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот, згідно винаходу. Переважно, це засіб аспірації-виштовхування являє собою насос, також з'єднаний з контейнерействие буде пояснено нижче. Третій хід має з'єднувальний отвір 703, на якому закріплений знімний конус 72. В ув'язнення, четвертий хід складається із другого кошти аспірації-виштовхування 704. Дане друге засіб являє собою шприц, який є єдиним цілим з клапаном. Даний шприц 704 призначений для взаємодії із засобом поступального приведення в рух, що утворює частину системи для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот згідно винаходу і призначеного для переміщення поршня зазначеного шприца. У підсумку, клапан 70 має центральний вал 74, володіє двома рідинними каналами. Як показано на Фіг.7, дані два канали забезпечують з'єднання відповідно, з одного боку, між пристроєм 60 для лізису і сполучним отвором 702, а з іншого боку, між шприцом 704 і сполучним отвором 703, на якому закріплений знімний конус 72. Вал 74 можна повертати в чверть обороту, так щоб змінювати рідинні з'єднання. Потім з'єднувальний отвір 702 з'єднують з з'єднувальним отвором 703, а пристрій 60 для лізису потім з'єднують зі шприцом 704.

Вузол, що складається з пристрою 60 для лізису і клапана 70, складає витратну частину. Потім його поміщають нтему, має три окремі основні функції: функцію лізису, функцію переносу рідини і функцію очищення. Дані функції описані нижче.

Вузол пристрій 60 для лізису - клапан 70 встановлюють у системі для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот наступним чином. По-перше, є спеціалізоване місце для підгонки даного сайту. Дане місце розташування характеризується тим, що воно має засіб кріплення клапана 70. Даний засіб може, наприклад, складатися з важелів або кулачків, між якими з зусиллям вставляють клапан.

Після того як вузол пристрій 60 для лізису - клапан 70 перебуває у своєму становищі, для клапана створюють різні сполуки. Це схематично показано на фігурах 8А і 8В. Таким чином, перше з'єднання створюють за допомогою з'єднувального отвору 702 клапана 70. Воно являє собою заключне з'єднання кошти для аспірації-виштовхування 80, яке постійно знаходиться на автоматичній системі, з'єднаної з з'єднувальним отвором 702. Як пояснювалося вище, даний засіб аспірації-виштовхування 80 переважно знаходиться у вигляді нерухомого насоса, вбудованої частини автоматичної системи, не показаної повністю на фіг�томатической системі. Більш того, даний нерухомий клапан 82 знаходиться в рідинному з'єднанні, з одного боку, з клапаном 70 через з'єднувальний отвір 702, а з іншого боку, з резервуаром 84, містило у собі так званий элюирующий буфер. Таким чином, нерухомий клапан 82 надає можливість з'єднання нерухомого насоса 80 або з клапаном 70, або з резервуаром 84, в залежності від його положення.

Вузол пристрій для лізису - клапан також з'єднаний з трансмісійним валом 90 кошти 92 обертання ротора пристрої для лізису. Необхідно зауважити, що після того, як дане з'єднання створено, трансмісійний вал 90 прикладає тиск на ротор уздовж вертикальної складової згідно стрілці А на Фіг.8А, так щоб цей тиск передавалося від ротора на вузол, що складається з кульок 18 і желированного матеріалу 19.

Третє з'єднання між вузлом пристрій для лізису - клапан і автоматичною системою складається із з'єднання між шприцом 704 клапана 70 і засобом 94 приведення в дію зазначеного шприца. Даний засіб приведення в дію являє собою засіб приведення в поступальний рух, як, наприклад, вузол, що складається з крокового двигуна і нескінченного гвинта, і пріти в шприц, або виштовхувати рідина, укладену в шприці.

На закінчення, четверте з'єднання між вузлом пристрій для лізису - клапан і автоматичною системою відноситься до засобу обертального приведення в дію валу 74 клапана 70. Даний засіб не показано на Фігурах 8А і 8В. Воно являє собою двигун, який здатний викликати обертання трансмісійного вала, при цьому зазначений трансмісійний вал з'єднаний з валом 74 клапана 70.

У процесі здійснення протоколу лізису мікроорганізмів, відібраних у картриджі 10, клапан 70 конфігурують таким чином, щоб пристрій 60 для лізису знаходилося в рідинному з'єднання з вузлом, що складається з насоса 80 і нерухомого клапана 82. Тоді шприц 704 знаходиться в рідинному з'єднанні з з'єднувальним отвором 703, на якому закріплений знімний конус. Нерухомий клапан 82 спочатку конфігурують таким чином, щоб насос 80 перебував у рідинному з'єднанні з резервуаром 84 для элюирующего буфера. Потім насос 80 аспирирует попередньо задану кількість элюирующего буфера. Потім конфігурацію нерухомого клапана 82 змінюють таким чином, щоб насос 80 увійшов в рідинне з'єднання з пристроєм 60 для лізису через клапан 70. Потім�онкретно у проміжний простір між внутрішньою стінкою картриджа 10 і зовнішньою стінкою ротора 50 (див. Фіг.6). Потім элюирующий буфер зволожує желированний матеріал 19 і кульки 18. Потім желированний матеріал 19 розчиняється за рахунок об'єднаного дії элюирующего буфера і повільного обертання ротора 50. Потім кульки знаходяться в суспензії в останньому. Дана дія суспензії в поєднанні з дією тиску, що прикладається на ротор, і обертанням останнього призводить до переміщення частини кульок 18 у проміжний простір між внутрішньою стінкою картриджа 10 і зовнішньою стінкою ротора 50. Необхідно зауважити, що дане проміжний простір переважно має ширину між 600 і 800 мкм. Дана ширина безпосередньо пов'язана з діаметром використовуваних кульок 18. Насправді, кульки повинні бути здатні одночасно легко циркулювати в даному просторі і бути в змозі обертатися допомогою обертання ротора 50. З цією метою вертикальна зовнішня стінка ротора може мати грубу поверхню, яка полегшує обертання кульок.

Після того як кульки розподілилися в зоні затримування картриджа і вздовж вертикальної стінки ротора, останній може бути повністю введений в картридж.

Звичайно, мікроорганізми, затрималися як на желированном матеріалі, так�ного буфера.

Після того як кульки 18 розподілилися уздовж вертикальної стінки ротора 50, починається власне стадія лізису. Тоді за рахунок обертання засоби обертання/двигуна 92 і за допомогою трансмісійного вала 90 викликається обертання ротора 50. Тим не менш, можна передбачити обертання ротора вручну, у спрощеному протоколі без використання системи для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот.

В якості прикладу, значення швидкості обертання можуть перебувати між 200 та 3000 об/хв. Переважно, спочатку ротор обертається з низькою швидкістю, що становить 200 об/хв з метою розподілу та забезпечення однорідності кульок і элюирующего буфера в проміжному просторі. Дане повільне обертання триває приблизно 15 секунд.

Потім швидкість обертання збільшується, досягаючи значення між 1000 і 3000 об/хв протягом періоду часу між 1 і 5 хвилинами. Саме протягом цього періоду відбувається лізис мікроорганізмів, підібраних з повітря.

Цілком зрозуміло, що вибір швидкості та часу обертання ротора залежить від типу мікроорганізмів, які підлягають лизированию.

У процесі цієї стадії, кульки 18 обертаються навколо своєї осі симетрії за рахунок тренияращение призводить до механічного лізису мікроорганізмів, захоплених між кульками 18 і відповідними поверхнями ротора або картриджа. Результатом цього є вивільнення нуклеїнових кислот в элюирующий буфер.

Після того як стадія лізису завершена і були вивільнені нуклеїнові кислоти, необхідно всмоктати элюирующий буфер, що містить у собі нуклеїнові кислоти. Потім за рахунок обертання його вала 74 змінюється конфігурація клапана 70, так щоб пристрій 60 для лізису і шприц 704 знову перебували в рідинному повідомленні, як показано на Фіг.8В. Потім поршень шприца 704 поступально переміщається засобом 94 приведення в дію, для того щоб всмоктати элюирующий буфер, що містить у собі нуклеїнові кислоти, в зазначений шприц 704. Дана стадія аспірації відбувається в той час, як ротор 50 все ще обертається, але з низькою швидкістю (приблизно 200 об/хв).

Потім клапан 70 повертається назад до своєї вихідної конфігурації, яка показана на Фіг.8А, таким чином, щоб шприц 704 перебував у рідинному повідомленні з з'єднувальним отвором 703. Потім элюирующий буфер, що містить у собі нуклеїнові кислоти, готовий до перенесення в пробірку через конус 72 з метою очищення зазначених нуклеїнових кислот. Насправді, лізат, заключби це здійснити, пробірку 96 для аналізу переносять впритул до конусу 72. Переважно, автоматична система має тримач для прийому зазначеної пробірки. В даному випадку, зазначений держатель може бути з'єднаний з важелем, який можна переміщати між нижнім положенням або положенням спокою, в якому пробірку можна вставляти в утримувач і верхнім становищем або робочим положенням, в якому пробірка знаходиться близько конуса 72 (як показано на Фігурах 8А і 8В). Звичайно, бажано, щоб конус 72 входив у пробірку 96. Пробірка 96 має так званий лізуючі буфер і магнітні частинки діоксиду кремнію, що вимагаються для очищення нуклеїнових кислот. Дані частинки мають діаметр від 1 до 3 мкм. Більш того, на отвір пробірки 96 поміщена попередньо проколотая діафрагма для того, щоб уникнути зараження пробірки. По мірі підняття пробірки 96, конус 72 проходить через діафрагму через попередньо проколене отвір. Потім элюирующий буфер з лізатів переносять в пробірку для аналізу. На цій стадії переважно використовувати шприц 704 для виконання декількох аспираций/виштовхувань, для того щоб гомогенізувати лізат з лизирующим буфером і магнітними частинками. Функція лікувальної буф�начения для фази уловлювання.

Якщо суміш гомогенизирована правильно, то пробірку можна залишити в спокої з метою надати можливість пасивного уловлювання нуклеїнових кислот магнітними частинками. Час спокою може становити, наприклад, 2 хвилини. У разі коли гомогенізація проведена неправильно, або у відсутність гомогенізації, уловлювання нуклеїнових кислот буде здійснюватися активно. Насправді, пробірка і магнітні частинки, які вона укладає в собі, будуть піддаватися дії магнітних полів різних орієнтацій. Для цього пробірку поміщають в нижнє положення, а потім вводять в контакт з магнітами через несе її важіль. Дані магніти можуть бути розташовані на двох паралельних пластинах, що становлять єдине ціле з важелем, несучим пробірку. Дані дві пластини є рухомими за рахунок горизонтального поступального руху допомогою спеціалізованого засоби переміщення і, у зв'язку з цим, зміщуються таким чином, щоб пробірка в результаті знаходилася між зазначеними пластинами. Кількість магнітів на кожній пластині може коливатися. Переважно, щоб магніти перебували на пластинах на різних висотах. Більше того, важливо, щоб магніти на одній пластин�я пробірки у відповідності з певною послідовністю. Таким чином, в процесі зміщення пластин пробірка поступово піддається дії або магнітного поля магніту на першій пластині, або магнітного поля магніту на другій пластині. Дані поля можуть бути розташовані на іншій висоті по відношенню до траєкторії пластин. В результаті, магнітні частинки, ж притягуємося даними магнітами, утворюють кластер, причому даний кластер змушений переміщатися в пробірці, у вигляді функції притягання, що викликається магнітами і, головним чином, їх положення по відношенню до пробірці. Необхідно зауважити, що таке відносне розташування магнітів щодо пробірки для аналізу також може бути досягнуто за рахунок зміщення пробірки уздовж вертикальної осі; причому у цьому випадку всі магніти встановлюють на одній і тій же висоті і згідно певній послідовності. У разі активного уловлювання нуклеїнових кислот, час, призначений для зазначеного уловлювання, буде більш тривалим (між 4 і 6 хвилинами).

Після того як було зроблено уловлювання нуклеїнових кислот, здійснюють одну або більше послідовних стадій промивання. З цією метою пробірку поміщають навпаки магніту у верхньому положенні для того, щоб аккумѵнки. Потім пробірку пересувають у верхнє положення таким чином, щоб конус 72 увійшов у контакт з рідиною, що міститься усередині пробірки. Потім рідина, укладена в пробірці, аспірується в шприц 704 допомогою приведення в дію поршня. Тоді шприц 704 служить в якості контейнера для зберігання рідких відходів, закачаних у пробірку. Для того щоб почати промивання нуклеїнових кислот, клапан 74 поміщають в конфігурацію, в якій з'єднувальний отвір 702 і, внаслідок цього, насос 80 знаходяться у рідинному повідомленні з з'єднувальним отвором 703. Клапан 82 поміщають в положення, що дозволяє аспірацію элюирующего буфера насосом 80. Обсяг всмоктуваного элюирующего буфера складає, наприклад, 300 мкл. Потім положення клапана 82 змінюється, щоб забезпечити перенесення элюирующего буфера насосом 80 в пробірку 96. З метою забезпечення оптимального промивання пробірку повертають у нижнє положення, а пластини, що несуть магніти, знову переміщують для того, щоб оптимізувати обмін між частинками і элюирующим буфером. Пластини здатні здійснювати кілька зворотно-поступальних рухів з різною швидкістю в залежності від вимог. Потім элюирующий буфер, укладений в пробірці, аспирируе� промивання. Необхідно зауважити, що на стадіях поршень шприца 704 приводиться в дію таким чином, щоб шприц 704 поступово наповнювався рідиною, всасиваемой в пробірку для аналізу, чи то це лізуючі буфер або элюирующий буфер використовується для промивань. Після того як нуклеїнові кислоти були переміщені в пробірку для аналізу, шприц 704 призначається тільки для ролі сховища рідких відходів, що представляє значну перевагу. Більше того, необхідно зауважити, що насос 80 служить тільки для перенесення элюирующего буфера і ніколи не знаходиться у контакті з зараженим» речовиною. Даний аспект також є особливо важливим, оскільки насос 80 і клапан 82 постійно залишаються на автоматичній системі на відміну від шприца 704, який являє собою складову частину клапана 74, призначеного для одноразового використання.

Після того, як були зроблені промивання нуклеїнових кислот, остання аспірація элюирующего буфера в пробірці 72 є лише частковою. В дійсності, певний обсяг элюирующего буфера залишається в пробірці і становить элюирующий обсяг, в якому нуклеїнові кислоти будуть элюировани, тобто дисоційований від магнітних частинок. Элюирующиспирации, на дні пробірки утворюється кластер магнітних частинок за рахунок розташування пробірки навпаки магніту в нижньому положенні. У вигляді відмінності, аспірація проводиться з поверхні рідини з метою уникнення будь-яких аспірації частинок.

Потім залишається обсязі проводиться элюирование нуклеїнових кислот. Для цього пробірку нагрівають до 75°С за допомогою модуля нагрівання, що представляє собою єдине ціле з держателем пробірки, до тих пір, поки температура рідини, що дорівнює 65°С, не буде досягнута протягом приблизно 5 хв. Одночасно зі стадією нагрівання пробірку піддають дії магнітів, розташованих у нижньому положенні, з метою сприяти элюированию.

Після того як нуклеїнові кислоти були очищені і элюировани в элюирующем обсязі, їх можна амплифицировать з метою аналізу. Для цього деяку частину або весь элюирующий обсяг необхідно ввести в контакт з так званим кондиціонуючим буфером для ампліфікації (40 мМ Трис HCl, pH 8,5, 12 мМ MgCl270 мМ KCl2, 5 мМ дитиотреитол, 15% про/про диметилсульфоксид, 1 мМ dNTP, 2 мМ кожного NTP, 0,2 мкМ праймерів, 0,1 мкМ молекулярних маяків). Таке введення в контакт може бути здійснено у відповідності з двома різними прот�вому протоколу, элюирование і кондиціонер для ампліфікації проводиться в двох різних пробірках. У цьому випадку з пробірки для аналізу необхідно взяти попередньо задану частину элюирующего обсягу, що містить в собі очищені нуклеїнові кислоти. Потім цю частину переносять у другу пробірку, в якій буде проводитися кондиціонер для ампліфікації і яка вже містить у собі необхідну кількість буфера для кондиціонування з метою ампліфікації. Потім цю пробірку переміщують в пристосування, в якому буде проходити ампліфікація нуклеїнових кислот. Частина реакційного об'єму потім забирають допомогою нерухомого насоса 80. У цьому випадку, клапани 70 і 82 будуть налаштовані для того, щоб забезпечити рідинне сполучення між насосом 80 з'єднувальним отвором 703. Пробірку для аналізу поміщають у верхнє положення таким чином, щоб конус був занурений у элюирующий обсяг. Потім частина всмоктують насосом 80. Необхідно нагадати, що даний насос 80, а в більш загальному сенсі, рідинної контур, запозичений частиною взятого элюирующего обсягу, знаходиться в контакті лише з элюирующим буфером протягом усього часу протоколу для лізису і очищення. Внаслідок цього. �ісля того як ця фракція була взята, пробірку для аналізу можна замінити пробіркою для кондиціонування з метою ампліфікації. З цією метою пробірку для аналізу опускають у нижнє положення таким чином, щоб її можна було витягти з держателя, а пробірку для кондиціонування з метою ампліфікації можна було встановити на своє місце. Потім цю пробірку піднімають у верхнє положення так, щоб конус увійшов в пробірку, а частина элюирующего обсягу потім була перенесена з допомогою насоса 80.

В якості альтернативи, автоматична система може бути забезпечена специфічним модулем для управління і переміщення пробірки для кондиціонування з метою ампліфікації.

Цей перший протокол пропонує ту перевагу, що запобігає контакт між частинками діоксиду кремнію і буфером для кондиціонування з метою ампліфікації. Насправді відомо, що подібні частинки можуть інгібувати реакції ампліфікації нуклеїнових кислот.

Відповідно до другого протоколу, буфер для кондиціонування з метою ампліфікації і элюирующий обсяг вводять в контакт безпосередньо в пробірці для аналізу і в даному випадку буфер для кондиціонування з метою ампліфікації додають мати-ческая система повинна бути постійно обладнана другий дозуючою системою, а саме контейнером, містило у собі буфер для кондиціонування з метою ампліфікації, шприцом для аспірації та виштовхування зазначеного буфера, клапаном, еквівалентним клапану 82, і голкою або конусом, який може проходити крізь діафрагму, встановлену на пробірці для аналізу.

Незалежно від використаного протоколу, може бути кращим виведення кластера частинок діоксиду кремнію за межі або тільки элюирующего обсягу, або суміші элюирующего обсягу і буфера для кондиціонування з метою ампліфікації, укладеного в пробірці для аналізу, перед взяттям фракції, яка в підсумку буде служити для ампліфікації. Це може бути зроблено за допомогою подвергания пробірки намагничиванию магнітом, розташованим у верхньому положенні.

Крім того, всі системи і пристрої згідно винаходу, описані вище, підходить для забезпечення можливості повного відстеження протягом протоколів для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот. Насправді, по-перше, всі витратні матеріали (картриджі, ротор, багатоходовий клапан, пробірки) ідентифікуються спеціалізованим засобом ідентифікації (1D або 2D штрих-кодами, радіомітками тощо). Більше т�пособно мати засіб бездротового повідомлення, забезпечує його сполучення з системою для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот. Зазначене засіб бездротового повідомлення являє собою, наприклад, системи WiFi (стандарт 802.11 b), Bluetooth (стандарт 802.15) або ZigBee (стандарт 802.15.4). Дані, які можна передавати через ці системи бездротового зв'язку, можуть ставитися, наприклад, до місць (приміщення/точка відбору), умовами відбору зразків (час, швидкість потоку, гигрометрия, температура, атмосферний тиск), ідентифікації оператора і, звичайно, до елементів, що ідентифікує витратні матеріали.

Пристрій і системи згідно винаходу також цілком підходять для аналізу клінічних проб, таких як проби цільної крові або біопсії тканин. В даному випадку, картридж використовують без модуля відбору повітря. У разі проби рідини, такої як цільна кров, останню поміщають в картридж, а потім картридж з'єднують з ротором у кришці для складання пристрою для лізису мікроорганізмів. Потім останній поміщають в автоматичну систему для лізису мікроорганізмів і виділення нуклеїнових кислот. У разі біопсії тканин, останню, по-перше, нарізають тонкими шарами за кілька міліметрів, а потім поміщають в картридж, кото�її потім поміщають в автоматичну систему для лізису клітин і виділення нуклеїнових кислот.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1: Вихідний протокол:

- Підготовка витратних матеріалів:

Підготовка картриджа:

Картридж наповнюють попередньо заданою кількістю скляних кульок і агарозного гелю:

- 0,3-0,45 г скляних кульок (діаметр: 420-600 мкм)

- Склад гелю: 1% агарози - 1% гліцеролу

Обсяг элюирующего буфера, використовуваного для здійснення лізису мікроорганізмів становить 300 мкл.

Підготовка пробірки для аналізу:

Пробірку для аналізу, вміщену в автоматичну систему і призначену для виділення лізати, наповнюють 30 мкл магнітних частинок діоксиду кремнію і 200 мкл лікувальної буфера (гуанідинів тіоціанат).

-Параметри лізису:

Час лізису: 4 хвилини

Швидкість обертання ротора: 200 об/хв (нижня швидкість); 2000 об/хв (верхня швидкість)

-Параметри лізису:

Аспірація лізату із картриджа у шприц многоходового клапана:

Обсяг аспірації шприца = 1000 мкл

Швидкість аспірації шприца = 70 ммс-1

Час обертання ротора в процесі аспірації = 9

Швидкість обертання ротора в процесі аспірації = 200 об/хв

Перенесення лізату з шприца многоходового клапана в пробірку для аналізу:

Обсяг аспірації з шпр�леїнових кислот:

Очищення включає 3 стадії:

- ізоляції нуклеїнових кислот

- промивання элюирующим буфером (3 рази)

- элюирования в элюирующем буфері (рН 8,5)

Після переміщення лізату в пробірку для аналізу (0,5 мл), остання укладає в собі 30 мкл кремнієвих кульок, 200 мкл лікувальної буфера і 120-150 мкл лізату.

З допомогою магнітів здійснюють два типи коливань кремнієвих частинок:

• Високі коливання, які виникають між магнітами у верхньому положенні

• Низькі коливання, які виникають між магнітами в нижньому положенні

Високі коливання використовують для здійснення уловлювання нуклеїнових кислот магнітними частинками, але також для стадій промивання (видалення супернатанту). Низькі коливання використовують для стадії элюирования і об'єднують з нагріванням пробірки.

Параметри уловлювання нуклеїнових кислот:

Швидкість коливання = 5 ммс-1

Кількість коливань = 112

Амплітуда коливань = 27 ммс-1

Параметри промивання

Швидкість коливання = 5 ммс-1

Кількість коливань = 10

Амплітуда коливань = 27 ммс-1

Параметри видалення супернатанту:

Аспірація шприцом многоходового клапана = 600 мкл

Швидкості�ля аналізу:

Об'єм розподілу = 400 мкл

Швидкість насоса = 100 ммс-1

Параметри для элюирования:

Швидкість коливання = 5 ммс-1

Амплітуда коливань = 9 ммс-1

Намічена температура = 75°С

Час нагріву = 300

Обсяг элюирующего буфера = 45 мкл

Приклад 2: Механічний лізис тканин

Стадію здійснювали для оцінки ефективності механічного лізису в пристрої для лізису згідно винаходу, з метою руйнування стінок живих клітин мікроорганізмів для вивільнення тРНК. Дані випробування проводили на пробах солідних пухлин.

Детально розроблений і пройшов випробування протокол:

• Реактиви та обладнання:

- Пухлини раку молочної залози, попередньо знежирені і стабілізовані за допомогою обладнання RNAlater®, продаваного Qiagen,

- Чашки Петрі,

- Стерильні пробірки 2мл,

- Пластмасові пінцети і скальпелі одноразового застосування,

- Пристрої для лізису згідно винаходу (картридж і ротор), знезаражені Актрилом,

- Скляні кульки 400-600 мкм,

- Набір RNeasy Plus, продаваний Qiagen + автоматична система виділення Qiacube

• Підготовка:

- Очищення лабораторного столу і піпеток RNaze Zap і в чашку Петрі уникаючи взяття RNAlater®,

- Промивання двічі 300 мкл буфера RTL (Qiagen) для видалення залишку RNAlater.

• Подрібнення пухлин:

- Тонка нарізка пухлини (діаметр приблизно 4 мм) скальпелем,

- Виділення частин пухлини, використовуючи пластмасові пінцети, і переміщення в 2 мл пробірку, що містить у собі 300 мкл RLT (+3 мкЛ β-меркаптоэтанол),

- Подрібнення часток пухлини з допомогою:

Qiagen Tissue Ruptor: 2 швидкість протягом 2 хвилин або

пристрої для лізису мікроорганізмів згідно винаходу: 0,4-0,5 г скляних кульок (400-600 мкм), 2000 об/хв, 2×20 секунд.

- Виділення проби і регулювання обсягу буфером RTL для отримання обсягу, рівного 300 мкл перед очищенням.

Очищення тРНК з допомогою набору Qiagen RNeasy Plus:

1. Приміщення 300 мкл буфера RTL, виділеного після подрібнення залишення без залишку пухлини в 2 мл пробірку,

2. Підготовка 2 типів колон для очищення і фіксації РНК: колона Елімінатора гДНК і швидкого обертання РНК,

3. Підготовка буферів, шатлів виділення Qiagen і пробірок для элюирования,

4. Підготовка тестера Quicube після команд для автоматичного пристрою і запуск роботи,

5. Виділення 80 мкл елюату і заморожування очищеної тРНК при -80°С,

6. Дозування�ласно протоколу RNA 6000 Nano на биоанализаторе Agilent.

Як і в загальновизнаному електрофорезі, розподіл транскриптів рРНК спостерігалося з двома основними піками на 18 і 28 с.

Результати:

Для даного дослідження використовували дві біопсії, отримані і зберігалися ідентичним чином. Дані біопсії є круглими з діаметром, що становлять приблизно 4 мм, і товщиною, яка становить 1,5 мм. Їх масу оцінили приблизно 10 мг. Дані біопсії просто розділили на дві для того, щоб паралельно провести два типи механічного лізису (стандартний лізис Tissue Ruptor і PPM). Однак необхідно зауважити, що кількість використаної тканини не є ідентичним від одного тесту до іншого, так як мета полягає в тому, щоб забезпечити правильне проведення тесту, а не порівняння ефективності між стандартною методикою та протоколом згідно винаходу.

Аналіз чистоти заснований на співвідношенні між значеннями поглинання з різними довжинами хвиль: 260 нм для нуклеїнових кислот, 230 нм для солей і 280 нм для білків. Значення співвідношення, близьке до 2, відображає хорошу чистоту нуклеїнових кислот.

БіопсіяПрот Чистота
ЛізисОчищення260/280260/230
1Tissue Ruptor (Qiagen) 2 хв, 2 швидкістьНабір: RNeasy, Plus Автоматичний пристрій: Qiacube3,40,860,19
1Пристрій згідно винаходу 2×20 с при 2000 об/хв, 0,4 г кульок, 420-600 мкмНабір: RNeasy Plus, Автоматичне пристрій: Qiacube2,20,420,11
2Tissue Ruptor від Qiagen 2хв, 2 швидкістьНабір: RNeasy Plus, Автоматичне пристрій: Qiacube31,72,090,56
2Пристрій згідно винаходу 2×20 с при 2000 об/хв, 0,4 г кульок, 420-600 мкмНабір: RNeasy Plus, Автоматичне пристрій:>/td>

У разі біопсії 1 можна бачити, що кількість виділеної тРНК є дуже невеликим. Це можна пояснити тим фактом, що біопсія піддалася руйнуванню, що веде до втрати матеріалу.

У разі біопсії 2 можна бачити, що значна кількість тРНК було виділено з допомогою обох методик. Більш того, можна бачити, що чистота хороша.

Таким чином, з даних експериментів зрозуміло, що пристрій згідно винаходу пропонує гарну ефективність для відбору бактерій, що містяться в пробі повітря, лизирования їх і забезпечення виділення нуклеїнових кислот із зазначених бактерій з метою аналізу. Для цього використане пристрій буде полягати, по-перше, з картриджа, вставленого в модуль для відбору повітря, а по-друге, з картриджа, що містить у собі відібрані бактерії, у поєднанні із засобом для виділення нуклеїнових кислот.

1. Пристрій для лізису мікроорганізмів, де вказаний пристрій має:
- картридж орієнтовно циліндричної форми, що має зону затримування мікроорганізмів, причому зазначена зона затримування має засіб для лізису вказаних мікроорганізмів і матеріал, який здатний затримувати зазначені микрооргЀидж виконує роль статора;
- ротор, встановлений у картриджі, причому зазначений ротор має засіб обертання;
- кришку, призначену для утримування ротора у вигляді єдиного цілого з картриджем;
в якому внутрішній діаметр картриджа більше, ніж зовнішній діаметр ротора, так що, коли ротор вставляють в картридж, відстань від внутрішньої стінки картриджа до зовнішньої стінки ротора є достатньо великим, щоб надати можливість розташування лікувальної кошти в даному проміжному просторі, і досить маленьким для того, щоб лизирующее засіб знаходився у контакті з однієї чи іншої з зазначених стінок.

2. Пристрій п. 1, в якому засіб обертання складається з діаметрально протилежних жолобків, зроблених в стінці глухого проходу, утвореного в роторі, причому зазначені жолобки призначені для прийому кінця трансмісійного вала засоби обертання зазначеного ротора.

3. Система для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот зазначених мікроорганізмів, має:
- засіб позиціонування пристрою для лізису мікроорганізмів за п. 1 або 2;
- засіб обертання ротора, коли вказаний пристрій для лізису встановлюють на засіб позиционироваЕпирации/випускання рідини;
- багатоходової клапан, в рідинному повідомленні з пристроєм для лізису мікроорганізмів, контейнером для прийому очищених нуклеїнових кислот і засобом для аспірації/випускання рідини.

4. Система для лізису за п. 3, що має в додаток засіб намагнічування.

5. Система для лізису за п. 3 або 4, що має в додаток нагріває засіб.

6. Система для лізису за пп.3 -5, в якій багатоходової клапан включає засіб для аспірації/випускання.

7. Спосіб лізису мікроорганізмів, де зазначений спосіб має стадії, що складаються з:
а) забезпечення картриджа, в якому мікроорганізми сконцентровані в зоні затримування зазначеного картриджа,
b) встановлення ротора у картриджі для того, щоб отримати пристрій для лізису мікроорганізмів за п. 1 або 2,
з) введення элюирующей рідини в картридж для суспендування лікувальної кошти, розташованого в зоні затримування мікроорганізмів картриджа, і
d) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа, причому зазначений ротор викликає обертання лікувальної кошти мікроорганізмів.

8. Спосіб виділення нуклеїнових кислот з мікроорганізмів, де зазначений спосіб має стадії, що складаються ртриджа,
b) встановлення ротора у картриджі для того, щоб отримати пристрій для лізису мікроорганізмів за п. 1 або 2,
з) введення элюирующей рідини в картридж для суспендування лікувальної кошти, розташованого в зоні затримування мікроорганізмів картриджа, і
d) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа, причому зазначений ротор викликає обертання лікувальної мікроорганізми кошти та
е) аспірації элюирующей рідини, що містить нуклеїнові кислоти зазначених мікроорганізмів, вивільнені в процесі лізису та
f) перенесення элюирующей рідини в контейнер для прийому та очищення нуклеїнових кислот.

9. Спосіб за п. 8, включає додаткову стадію для відмивання і очищення нуклеїнових кислот.

10. Спосіб лізису мікроорганізмів, що містяться в пробі рідини, де зазначений спосіб має стадії, що складаються з:
а) введення проби рідини, що містить зазначені мікроорганізми, в картридж, поблизу від зони затримування, таким чином, щоб вказана проба рідини призводила до суспендированию лікувальної кошти, розташованого в зазначеній зоні затримування мікроорганізмів картриджа,
b) встановлення ротора у картриджі для того, чтобедством обертання ротора всередині картриджа, причому зазначений ротор викликає обертання лікувальної засобу, на якому затримуються мікроорганізми.

11. Спосіб виділення нуклеїнових кислот з мікроорганізмів, що містяться в пробі рідини, де зазначений спосіб має стадії, що складаються з:
а) введення проби рідини, що містить зазначені мікроорганізми, в картридж, поблизу від зони затримування, таким чином, щоб вказана проба рідини призводила до суспендированию лікувальної кошти, розташованого в зазначеній зоні затримування мікроорганізмів картриджа,
b) встановлення ротора у картриджі для того, щоб отримати пристрій для лізису мікроорганізмів за п. 1 або 2,
з) механічного лізису мікроорганізмів за допомогою обертання ротора всередині картриджа, причому зазначений ротор викликає обертання лікувальної кошти,
d) аспірації проби рідини, що містить нуклеїнові кислоти зазначених мікроорганізмів, вивільнені в процесі лізису та
е) перенесення проби рідини в контейнер для прийому та очищення нуклеїнових кислот.

12. Спосіб виділення нуклеїнових кислот з проби клітинної тканини, де зазначений спосіб має стадії, що складаються з:
а) введення проби клітинної тканини в картридж у присутності элюирующей жи.1 або 2,
з) механічного лізису клітин клітинної тканини за допомогою обертання ротора всередині картриджа, причому зазначений ротор викликає обертання лікувальної кошти, що міститься у картриджі,
d) аспірації элюирующей рідини, що містить нуклеїнові кислоти, зазначених клітин, вивільнені в процесі лізису та
е) перенесення элюирующей рідини в контейнер для прийому та очищення нуклеїнових кислот.

13. Спосіб за п. 11 або 12, що включає додаткову стадію відмивання і очищення нуклеїнових кислот.

14. Застосування пристрою для лізису мікроорганізмів за п. 1 або 2 для лізису клітин проби клітинної тканини.

15. Застосування системи для лізису мікроорганізмів і очищення нуклеїнових кислот із зазначених мікроорганізмів по одному з пп.3-6 для лізису клітин з проби клітинної тканини.



 

Схожі патенти:

Виборчий лізис клітин

Група винаходів відноситься до області лізису клітин. Запропоновано спосіб виборчого лізису клітин тварин, а також прилад для виявлення мікроорганізмів. Спосіб виборчого лізису тварин клітин в пробі води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, включає етапи забезпечення проби води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, додавання в згадану пробу неіоногенної детергенту і буферного розчину для одержання розчину зі значенням pH близько 9,5 або вище, інкубації цього розчину протягом періоду, достатнього для лізису клітин тварин. Прилад для виявлення мікроорганізмів у пробі складається з лизисной камери для прийняття проби води з тваринами клітинами, посудини з лужним буферним розчином із значенням pH 9,5 або вище і неіоногенним детергентом, або посудини з лужним буферним розчином із значенням pH близько 9,5 або більше і посудини з неіоногенним детергентом, фільтра, сполученого з лизисной камерою для фільтрування проби після лізису клітин тварин, камери індикації для аналізу присутності ДНК мікроорганізмів. Запропоновані винаходу забезпечують обробку зразка без його значного брабативать більш значні обсяги зразка і визначати низькі концентрації хвороботворних мікроорганізмів у зразку. 2 н. і 11 з.п. ф-ли, 12 іл., 8 пр.

Спосіб отримання

Винахід відноситься до біотехнології і являє собою спосіб отримання препарату "тіней" бактеріальних клітин, фармацевтичну композицію, яка є вакциною або адъювантом, спосіб інактивації живих бактеріальних клітин у препараті "тіней" бактеріальних клітин і застосування бета-пропиолактона. Спосіб включає отримання препарату "тіней" бактеріальних клітин і обробку препарату "тіней" бактеріальних клітин бета-пропіолактоном в кінцевій концентрації від 0,01% до 1% (про./про.), при якій кількість живих бактеріальних клітин у зазначеному препараті "тіней" знижується щонайменше на 103-104. Фармацевтична композиція включає ефективне кількість препарату "тіней" бактеріальних клітин, обробленого бета-пропіолактоном в кінцевій концентрації від 0,01% до 1% (про./про.), і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач та/або ад'ювант. Запропоноване винахід дозволяє отримувати препарат "тіней" бактеріальних клітин, практично не містить живих бактеріальних клітин. 4 н. і 14 з.п. ф-ли, 13 іл., 7 пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології

Спосіб отримання лизостафина

Винахід відноситься до біотехнології
Винахід відноситься до біотехнології і може бути використане в харчовій, парфумерній, мікробіологічної промисловості, медицині і сільському господарстві

Спосіб отримання лізатів дріжджових культур

Винахід відноситься до харчової промисловості і може знайти застосування в виноробної, пивоварної, лікеро-горілчаної, мікробіологічної промисловості в якості харчової добавки при приготуванні напоїв бродіння, дитячого і дієтичного харчування та кормів
Винахід відноситься до харчової промисловості, може знайти застосування в виноробної, пивоварної, лікеро-горілчаної, мікробіологічної промисловості в якості харчової добавки при приготуванні напоїв бродіння, дитячого і дієтичного харчування та кормів
Винахід відноситься до мікробіологічної, медичної, харчової і комбікормової промисловості, зокрема до способів автолізу дріжджових культур
Винахід відноситься до галузі мікробіології та харчової промисловості і може бути використано для отримання компонентів мікробіологічних поживних середовищ
Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використано в лабораторній і дослідницькій практиці для отримання препарату бактеріальної ДНК

Пристрій для подрібнення біологічних проб

Винахід відноситься до обладнання для подрібнення біологічних проб, зокрема для приготування гомогенізованих проб для тестування на патогени коров'ячої губчастої енцефалопатії
Up!