Штам escherichia coli bl21(de3)gold/petmin-cypa - продуцент рекомбінантного циклофіліном а людини

 

Винахід відноситься до галузі молекулярної біотехнології і генної інженерії і стосується нового штаму-продуцента рекомбінантного циклофіліном А людини (рчЦфА).

Застосування протипухлинної хіміотерапії веде до пригнічення гемопоезу і створює ризик виникнення інфекційних ускладнень, що перешкоджає проведенню своєчасного лікування. У зв'язку з цим існує необхідність використання засобів, що підтримують кровотворну функцію кісткового мозку.

Циклофилин А (ЦфА) - білок з молекулярною масою 18 кД, який знаходиться у всіх тканинах ссавців, бере участь у процесах внутрішньоклітинного транспорту білків, регуляції клітинної проліферації та проведення сигналу від рецептора в Т-лімфоцитах [Fischer G, Bang Н, Mech С. Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. Biomed. Biochim. Acta. 1984; 43(10): 1101-1111; Colgan J, Asmal M, Yu B, Luban J. Cyclophilin A-deficient mice are resistant to immunosuppression by cyclosporine. Journal of immunology. 2005; 174(10): 6030-6038]. Секреторний ЦфА формує вогнище запалення, залучаючи туди зрілі макрофаги, нейтрофіли і активовані Т-лімфоцити [Sherry, Yarlett N, Strupp A, Cerami А. Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product of lipopolysaccharide-activated macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992; 89(8): 3511-3515].

ЦфА посилює міграцію як фактор регенерації [Khromykh LM, Kulikova NL, Anfalova TV, et al. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells. Cell Immunol. 2007; 249 (1): 46-53].

ЦфА є фактором диференціювання стовбурових клітин мієлоїдного ряду і сприяє дозріванню дендритних клітин, що дозволяє розглядати його в якості гемопоэтического фактора, здатного брати участь у відновленні імунної системи.

Для всебічного вивчення біологічних властивостей ЦфА, особливо в системах in vivo, потрібна значна кількість цього білка.

Відомий штам Escherichia coli (E. coli), що продукує рчЦфА у вигляді білка з полигистидиновой послідовністю [Ст. Sherry, G. Zybarth, М. Alfano, L. Dubrovsky, R. Mitchell, D. Rich, P. Ulrich, R. Bucala, A. Cerami, M. Bukrinsky. Role of cyclophilin A in the uptake of HTV-1 by macrophages and T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, 95, pp.1758-1763].

Недоліки: рчЦфА продукується у вигляді білка, відмінного від нативного, що містить у своєму складі полигистидиновую послідовність; невисокий вміст отриманого кінцевого продукту (білка); необхідність додаткових стадій очищення.

Відомий штам E. coli, продукує рчЦфА без додаткових поліпептидних послідовностей [Liu J, Albers MW, Chen CM, Schreiber SL, Walsh CT. Cloning, expression, andpurification of human cyclophilin in Escherichia coli and assessment of the catalytic role of cysteines by site-directed mutagenesis. ProcNatlAcadSciUSA, 1990 Mar; 87(6�емого винаходу є створення штаму E. coli - продуцента рчЦфА з високим вмістом білка, структурно максимально наближеного до нативному і не вимагає складної системи очищення.

Поставлена задача вирішується шляхом трансформації компетентних клітин E. coli BL21(DE3)Gold плазміди pETmin-CypA

Технічний результат винаходу: отримано штам E. coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - продуцент рекомбінантного циклофіліном А, структурно максимально наближений до нативному та не потребує складної системи очищення.

Для отримання плазміди pETmin-CypA проводили полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) з олигонуклеотидними праймерами (5'-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC і 5'-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC), використовуючи в якості матриці плазміду pCyPAwt/pGEX-2TK. Отриманий в результаті реакції фрагмент довжиною 515 п. н. і вектор рЕТ-22b(+) розщеплювали эндонуклеазами рестрикції BamHI та NdeI. Після цього ферменти инактивировали при t=65°C протягом 20 хв і проводили реакцію лігування. Штам E. coli ТОР10 трансформували лигазной сумішшю (вода, трансформований вектор, буфер для лігази, лигаза, поліетиленгліколь). Відбирали стійкі до ампіциліну клони, виділяли плазміди і проводили їх рестрикційний аналіз.

Фізична карта отриманої плазміди представлена на фіг.1.

Структуру клонованого гена в отобранн�equencing Kit (v. 3.1). В результаті отримували експресійної плазміду pETmin-CypA (фіг.1). Плазміда pETmin-CypA містить унікальні сайти впізнавання рестрикционними эндонуклеазами, мають наступні координати: PstI - 4726, EcoRV - 1937, BgIII - 765.

Плазміда pETmin-CypA має розмір 5865 пар нуклеотидів (п. н.) і містить: фрагмент XhoI-NdeI вектора рЕТ-22b(+), що несе ген стійкості до ампіциліну ampR, промотор та термінатор РНК-полімерази фага Т7 і полилинкер, в якому з сайтів XhoI-NdeI клонований фрагмент, отриманий за допомогою ПЛР з використанням олігонуклеотидних праймерів 5'-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC і 5'-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC плазміда pCyPAwt/pGEX-2TK з клонованим фрагментом гена рчЦфА розміром 498 п. н. (М. Bukrinsky Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, США):

Спосіб одержання штаму E. coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA.

Компетентні клітини E. coli BL21(DE3)Gold трансформували плазміди pETmin-CypA і після вирощування рекомбінантних клонів на агаризированной середовищі LB, містить 150 мг/л ампіциліну при t=37°C, отримували штам-продуцент поліпептиду рчЦфА.

Вирощування заявляється штаму в ферментері.

Одиничну колонію заявляється штаму інокулював в 5 мл бульйону ТБ, містить 150 мг/л ампіциліну і вирощували протягом 18 год при перемішуванні зі скоѳотовленной середовища, культивували в умовах аерації протягом 18 год і вносили у ферментер.

Ферментацію культури проводили після додавання в ферментер інокулята у співвідношенні 1:10 до об'єму середовища при pH 7,0-7,4; t=37°C і аерації 150 об/хв. Культуру вирощували протягом 2 год, потім вносили індуктор ізопропіл-β-D-1-тиогалактопиранозид (ІПТГ) до кінцевої концентрації 0,5 мМ, культивували протягом 4 ч. Клітини збирали центрифугуванням 4000 об/хв протягом 10 хв і зберігали при t=-20°C. Зміст рчЦфА в біомасі рекомбінантного штаму-продуцента становила до 20% від сумарного вмісту білка штаму-продуцента або до досягнення 100 мг/літр бактеріальної культури.

Отриманий штам E. coli BL21(DE3)Gold/ pETmin-CypA характеризується наступними ознаками.

Морфологічні ознаки: клітини палочковидной форми, грамнегативні, неспороносние.

Культуральні ознаки: клітини добре ростуть на звичайних поживних середовищах. Час генерації становить до 30 хв в рідкій LB-середовищі. При зростанні на агарезированной середовищі LB колонії круглі, гладкі, напівпрозорі, блискучі, сірі, край рівний; діаметр колоній становить 2-3 мм; консистенція пастоподібна. Зростання в рідкому середовищі LB характеризується рівномірним помутнінням. Культуральне жи�діапазоні температур 20-42°C, при значенні рн 6,8-7,2.

Стійкість до антибіотиків штами: клітини стійкі до ампіциліну, що обумовлено наявністю в плазмиде pETmin-CypA гена ampR.

Умови зберігання штаму: середовище LB 15% вмістом гліцерину, t=-70°C криовиалах.

Штам E. coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA депонований у Всеросійської Колекції Промислових Мікроорганізмів ФГУП ГосНИИИ Генетика, реєстраційний номер ВКПМ В-11722.

Спосіб отримання рчЦфА здійснювали наступним чином. Культивування штаму E. coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA здійснювали при t=37°C в живильному середовищі на основі бульйону ТБ (Terrific Broth) при pH 7,2; культуральне рідина після охолодження центрифугували. Отриману біомасу руйнували ультразвуковим дезінтегратор. Розчинну фракцію піддавали іонообмінної хроматографії на колонці з Fractogel TSKDEAE-650(S); несвязавшуюся фракцію пропускали через іонообмінну колонку з CM Sepharose Fast Flow. Очищення кінцевого продукту від ендотоксинів проводили на колонці з Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel.

Руйнування біомаси проводили за допомогою ультразвукового дезінтегратора Branson Sonifier 250 в лизирующем буфері 20 мМ TrisCl, pH 8,0 протягом 5 хв. Температуру суспензії підтримували в межах від 2 до 8°C при частоті коливань наконечника, що становить 22 КГц, амплітуді 1имую фракцію клітин наносили на колонку містить Fractogel TSKDEAE-650(S) і врівноважену буфером 20 мМ TrisCl pH 8,0 зі швидкістю 3 мл/хв. В даних умовах рчЦфА не зв'язувався з сорбентом. Фракцію, що містить рчЦфА, доводили до значення рн 6,2, додаючи 10% оцтову кислоту. Поділ фракції проводили на колонці, заповненій катионообменним сорбентом CM Sepharose Fast Flow і врівноваженою 20 мМ натрій-фосфатний буфером, рн 6,2 (буфер З) при швидкості протоку 5 мл/хв. Після нанесення фракції колонку промивали буфером до виходу З оптичної щільності розчину протікає при 280 нм до значення, близького до нуля. Элюцию проводили лінійним градієнтом від буфера З до буфера 20 мМ Na2CO3, 250 мМ NaCl, pH>10, об'ємом 150 мл

Для видалення ліпополісахаридів використовували сорбент Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel (Thermo Scientific), який поміщали в хроматографічну колонку ХК16/20 і врівноважували пропусканням 50 мл фосфатно-сольового буфера. Далі через колонку пропускали розчин очищеного рчЦфА у фосфатно-сольовому буфері при швидкості потоку 2 мл/хв. Максимальна сумарна кількість білка, що наноситься за один раз, становила 200 мг, а об'єм розчину - 50 мл Контроль процесу здійснювали шляхом проточного вимірювання оптичної густини розчину при довжині хвилі 280 нм. Отриманий прпо вмісту домішкових бактеріальних білків E. coli і ендотоксинів.

Спосіб дозволяє отримати 70-100 мг білка на 1 л бактеріальної культури.

Хроматографічне розділення рчЦфА методом електрофорезу представлено на фіг.2.

Умовні позначення:

М - маркери.

А - розчинна фракція лізату штаму E. coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA.

В - фракція, отримана після флеш-хроматографії.

З - фракція, що не пов'язана з катіонообмінної колонкою.

1, 2, 3 - фракції, отримані градієнтної елюції катіонообмінної колонки.

Штам Escherichia coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - продуцент рекомбінантного циклофіліном А людину, отриманий шляхом трансформації клітин штаму BL21(DE3)Gold плазміди pETmin-CypA, що має розмір 5865 пар нуклеотидів і містить фрагмент XhoI-NdeI вектора рЕТ-22b(+), що несе ген стійкості до ампіциліну ampR, промотор та термінатор РНК-полімерази фага Т7 і полилинкер, в якому з сайтів XhoI-NdeI клонований фрагмент, отриманий за допомогою ПЛР з використанням олігонуклеотидних праймерів 5'-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC і 5'-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC плазміди pCyPAwt/pGEX-2TK з клонованим фрагментом гена рчЦфА розміром 498 п. н.:
1 atggtcaacc ccaccgtgtt cttcgacatt gccgtcgacg gcgagccctt
51 gggccgcgtc tcctttgagc tgtttgcaga caaggtccca aagacagcag
101 aaaattttcg tgctctgagc actggagaga aaggatttgg ttataagggt
151 tcctgctttc acagaattat tccagggttt atgtgtcagg gtggtgactt
201 cacacgccat aatggcactg gtggcaagtc catctatggg gagaaatttg1 aaggcatgaa tattgtggag gccatggagc gctttgggtc caggaatggc
451 aagaccagca agaagatcac cattgctgac tgtggacaac tcgaataa



 

Схожі патенти:

Штам гриба aspergillus oryzae - продуцент комплексу протеїназ і пептидаз, нуклеаз, хітинази, бета-глюканазу, маннанази та альфа-амілази

Винахід відноситься до біотехнології. Штам Aspergillus oryzae 12-84, що володіє високим рівнем синтезу комплексу протеїназ і пептидаз, нуклеаз, хітинази, β-глюканазу, маннанази і α-амілази, депонований у ГНУ ВНИИСХМ РОССІЛЬГОСПАКАДЕМІЇ під реєстраційним номером Aspergillus oryzae RCAM01134. Штам може бути використаний для отримання комплексних ферментних препаратів з подальшим їх використанням для гідролізу сировини при отриманні биокорректоров їжі та кормів, амінокислотних добавок та біологічно активних добавок з функціональними властивостями. Винахід дозволяє підвищити вихід протеолітичною, нуклеазной, хитиназной, β-глюканазной, маннаназной і α-амилазной активностей. 2 табл., 2 пр.

Штам зеленої мікроводорості acutodesmus obliquus, призначений для очищення стічних вод від забруднюючих речовин в комунальному господарстві та целюлозно-паперової промисловості

Винахід відноситься до біотехнології. Штам зеленої мікроводорості Acutodesmus obliquus Syko-A Ch-055-12, що володіє здатністю знижувати вміст забруднюючих речовин в стічній воді, депонований у Колекції Мікроводоростей ІФР РАН (IPPAS) під реєстраційним номером IPPAS S-2016. Штам зеленої мікроводорості Acutodesmus obliquus IPPAS S-2016 може бути використаний для очищення стічних очисних споруд комунального господарства та целюлозно-паперового підприємства від забруднюючих речовин (амонійного азоту, завислих речовин, заліза) при високих температурах. 1 іл., 2 пр. . .

Спосіб диференціації токсигенних генетично змінених штамів vibrio cholerae біовару ель-тор з різним епідемічним потенціалом методом мультиплексного полімеразної ланцюгової реакції та тест-система для його здійснення

Винаходи належать до галузі медичної мікробіології і стосуються способу диференціації токсигенних генетично змінених штамів V. cholerae біовару Ель-Тор і тест-системи. Охарактеризований спосіб включає проведення ПЛР з використанням специфічних праймерів до генам vc0497, vc0502 і vc0514 з острова пандемичности VSP-II. Охарактеризована тест-система містить компоненти для виділення ДНК, компоненти для проведення ПЛР, що включають, зокрема, суміш праймерів VSPIIreg-F - 5'-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3', VSPIIreg-R - 5'-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3' ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5'-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3', VSPIIpilin-R - 5'-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3' ген vc0502, VSPIIchem-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3', VSPIIchem-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3' ген vc0514, взятих у співвідношенні 1:1:1:1:1:1 відповідно. Винаходи дозволяють швидко і достовірно диференціювати токсигенні генетично змінені штами V. cholerae біовару Ель-Тор на геноварианти з низьким і високим епідемічним потенціалом. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 2 табл.

Штам бактерії bacillus subtilis - високоактивний продуцент пектолитических ферментів, мацерирующих рослинну тканину

Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості. Запропоновано штам бактерії Bacillus subtilis ВКПМ B-11964 - високоактивний продуцент пектолитических ферментів, мацерирующих рослинну тканину. Даний штам проявляє високі пектат-лиазную і пектин-лиазную активності по відношенню до пектинам з різних джерел. 2 табл., 5 пр.

Штам bacillus sp. для біологічної боротьби з saprolegnia sp. і його застосування

Група винаходів відноситься до галузі біотехнології і мікробіології. Запропоновано штам Bacillus sp. КССМ11143Р, володіє протигрибковою активністю щодо Saprolegnia sp., культуральна рідина, одержаний при культивуванні штаму, пробіотична композиція, кормова добавка, протигрибковий засіб і засіб для поліпшення якості води, що містять штам Bacillus sp. КССМ11143Р або його культуральну рідину. Також запропоновано спосіб культивування риби або ракоподібних, спосіб запобігання сапролегниоза у тварин і спосіб поліпшення якості води з використанням штаму Bacillus sp. КССМ11143Р або його культуральної рідини. Штам Bacillus sp. КССМ11143Р має високий рівень продуктивності сидерофоров з проявом високої здатності захоплення заліза, і таким чином інгібує ріст інших патогенних бактерій і Saprolegnia sp., сприяє збільшенню швидкості споживання їжі рибою і швидкості збільшення ваги, а також зниження рівня екскреції, що призводить до поліпшення якості води. 9 н. і 1 з.п. ф-ли, 4 іл., 11 табл., 15 пр.

Штам microbacterium species для очищення прісноводних водойм та їх донних відкладень від нафти і нафтопродуктів

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано штам Microbacterium species BKM Ac-2614D для очищення забруднених і хронічно забруднених прісноводних об'єктів в температурному діапазоні від +2ºC до +25ºC. Винахід дозволяє здійснювати очищення води і донних відкладень від нафтових вуглеводнів при низькій концентрації кисню у воді і в умовах високих широт. 3 табл., 2 пр.

Штам мікроводорості desmodesmus sp. для конверсії вуглекислоти з промислових скидних газів в сировину для виробництва біопалива та кормових добавок

Винахід відноситься до фотобиотехнологии. Штам мікроводорості Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 володіє високими показниками фіксації CO2 і толерантністю до високих концентрацій CO2 в середовищі культивування, а також високою здатністю до накопичення ліпідів, збагачених поліненасиченими жирними кислотами. Депонований штам в Колекції культур мікроводоростей Інституту фізіології рослин ім К. А. Тімірязєва РАН (IPPAS) під реєстраційним номером Desmodesmus sp. IPPAS S-2014 і може бути використаний для конверсії вуглекислоти з промислових скидних газів в сировину для виробництва біопалива та кормових добавок. Винахід дозволяє підвищити швидкість фіксації CO2 в газоповітряної суміші. 4 іл., 1 табл.

Штам мікроводорості chlorella vulgaris, призначений для очищення стічних вод сільськогосподарських і спиртових виробництв

Винахід відноситься до фотобиотехнологии. Штам мікроводорості Chlorella vulgaris 711-54 володіє високими показниками ступеня очищення стічних вод сільськогосподарських і спиртових виробництв, значною продуктивністю і високим вмістом цінних сполук в біомасі. Депонований штам в Російській Колекції Мікроводоростей при заснування Російської Академії Наук Інституті Фізіології Рослин ім. К. А. Тімірязєва (IPPAS) з присвоєним ідентифікатором Chlorella vulgaris IPPAS C-2015 і може бути використаний для очищення стічних вод сільськогосподарських і спиртових виробництв. Винахід дозволяє підвищити якість очищення вказаних стічних вод. 1 табл., 4 іл.

Олігонуклеотидні праймери і спосіб виявлення днк mycobacterium avium методом полімеразної ланцюгової реакції

Винаходи належать до галузі біотехнології і стосуються олігонуклеотидних праймерів і способи виявлення ДНК Mycobacterium avium з їх використанням. Охарактеризовані олігонуклеотидні праймери комплементарни специфічної області mig-гена Mycobacterium avium і мають наступний нуклеотидний склад: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' та 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Спосіб виявлення ДНК Mycobacterium avium вимикає виділення ДНК, проведення ампліфікації ДНК з використанням олігонуклеотидних праймерів, перенесення продукту ампліфікації на гель з подальшим детектуванням результатів аналізу на трансиллюминаторе. У разі позитивної реакції синтезується фрагмент, відповідний розміру 157 п. н. Представлені винаходи можуть використовуватися у ветеринарних діагностичних і науково-практичних лабораторіях для виявлення генетичного матеріалу Mycobacterium avium у пробах. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 4 пр.

Генетично модифікований бактеріальний штам wsj-ia, продукує изовалерилспирамицин i з високим змістом і високим виходом

Даний винахід відноситься до біотехнології і являє собою генетично модифікований штам бактерії Streptomyces thermotolarences WSJ-IA, продукує изовалерилспирамицин I. Даний винахід також розкриває спосіб отримання зазначеного штаму. Спосіб включає етапи конструювання рекомбінантної плазміди, що містить подвійний ген ist-acyB2, і трансформації зазначеної плазміди в штам WSJ-2, продукує изовалерилспирамицин I. Винахід також розкриває спосіб отримання изовалерилспирамицина I культивуванням штаму Streptomyces thermotolarences WSJ-IA в живильному середовищі. Даний винахід дозволяє підвищити вихід одержуваного изовалерилспирамицина I. 3 н. п. ф-ли, 3 іл., 5 табл., 4 пр.

Мікроорганізм, экспрессирующий ксилозоизомеразу

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Представлений трансформований мікроорганізм - дріжджі Saccharomyces для отримання етанолу, де згаданий мікроорганізм трансформований нуклеотидної послідовністю, кодує ксилозоизомеразу, і зазначений мікроорганізм трансформований нуклеотидної послідовністю, кодує ксилулокиназу, або зазначений мікроорганізм трансформований промотором, здатним підвищувати експресію ендогенної ксилулокинази. Зазначений мікроорганізм здатний до більш високої активності ксилозоизомерази; більш високої швидкості росту у середовищі для росту або на середовищі для росту, що містить ксилозу; більш швидкому метаболізму ксилози; і/або більш швидкій продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозе в якості джерела вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. Описані инокулят і культуральна середовище, що містять зазначені трансформовані дріжджі і ксилозу або джерело ксилози. Запропоновано спосіб одержання зазначеного трансформованого мікроорганізму, що включає стадію трансформації мікроорганізму нуклеотидної послідовністю, кодує ксилозоизомеразу, і або нуклеотидної послідовна� Розкрито спосіб ферментації, включає культивування зазначеного мікроорганізму в культуральному середовищі, що містить ксилозу або джерело ксилози. Представлений спосіб отримання біопалива, що містить етанол, де зазначений спосіб включає стадію культивування мікроорганізму по справжньому винаходу в культуральному середовищі, що містить ксилозу або джерело ксилози. Описано застосування дріжджів по справжньому винаходу для отримання етанолу. Винахід дозволяє отримувати етанол з допомогою зазначеного трансформанта в більшій кількості, порівняно з еквівалентним мікроорганізмом до трансформації, на середовищі, що містить ксилозу. 7 н. і 4 з.п. ф-ли, 7 іл., 1 табл., 7 пр.

Білки, що індукують множинну стійкість рослин до фитопатогенам і шкідників

Винахід відноситься до галузі біохімії та біотехнології і може бути використане в рослинництві

Спосіб отримання іммобілізованої рибозофосфатизомерази

Винахід відноситься до технології одержання іммобілізованих ферментних препаратів

Поліпептид, що володіє активністю d-лактатдегідрогенази, полинуклеотид, що кодує цей поліпептид, і спосіб отримання d-молочної кислоти

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Представлений поліпептид D-лактатдегідрогенази, який містить поліпептид з амінокислотною послідовністю, яка характеризується ідентичністю по послідовності на рівні не менше 80% з амінокислотною послідовністю, показаної в SEQ ID NO:1 або 2, розкриті в описі, де зазначений поліпептид володіє D-лактатдегидрогеназной активністю. Також представлені полінуклеотиди, що кодують зазначені поліпептиди D-лактатдегідрогенази; конструкція ДНК для експресії полинуклеотида, що кодує D-лактатдегидрогеназу, в якій пов'язані зазначений полинуклеотид і промотор, здатний здійснювати експресію полинуклеотида. Описаний трансформант, зокрема трансформовані дріжджі, для отримання D-молочної кислоти, в який введено полинуклеотид або конструкція ДНК по справжньому винаходу. Запропоновано спосіб отримання D-молочної кислоти, який включає стадію культивування зазначеного трансформанта. Винахід дозволяє отримувати D-молочну кислоту на підвищеному рівні за допомогою трансформанта по справжньому винаходу порівняно з рівнем D-молочної кислоти, отриманим з використанням нетрансформированной роди�

Мікроорганізм, экспрессирующий ксилозоизомеразу

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Представлений трансформований мікроорганізм - дріжджі Saccharomyces для отримання етанолу, де згаданий мікроорганізм трансформований нуклеотидної послідовністю, кодує ксилозоизомеразу, і зазначений мікроорганізм трансформований нуклеотидної послідовністю, кодує ксилулокиназу, або зазначений мікроорганізм трансформований промотором, здатним підвищувати експресію ендогенної ксилулокинази. Зазначений мікроорганізм здатний до більш високої активності ксилозоизомерази; більш високої швидкості росту у середовищі для росту або на середовищі для росту, що містить ксилозу; більш швидкому метаболізму ксилози; і/або більш швидкій продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозе в якості джерела вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. Описані инокулят і культуральна середовище, що містять зазначені трансформовані дріжджі і ксилозу або джерело ксилози. Запропоновано спосіб одержання зазначеного трансформованого мікроорганізму, що включає стадію трансформації мікроорганізму нуклеотидної послідовністю, кодує ксилозоизомеразу, і або нуклеотидної послідовна� Розкрито спосіб ферментації, включає культивування зазначеного мікроорганізму в культуральному середовищі, що містить ксилозу або джерело ксилози. Представлений спосіб отримання біопалива, що містить етанол, де зазначений спосіб включає стадію культивування мікроорганізму по справжньому винаходу в культуральному середовищі, що містить ксилозу або джерело ксилози. Описано застосування дріжджів по справжньому винаходу для отримання етанолу. Винахід дозволяє отримувати етанол з допомогою зазначеного трансформанта в більшій кількості, порівняно з еквівалентним мікроорганізмом до трансформації, на середовищі, що містить ксилозу. 7 н. і 4 з.п. ф-ли, 7 іл., 1 табл., 7 пр.

Нова ацетил-coa-карбоксилаза

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Представлена нуклеїнова кислота, що кодує білок, що володіє ацетил-СоА - карбоксилазной активністю, що компенсує недолік ацетил-СоА-карбоксилазной активності в дріжджах, де нуклеотидна послідовність обрана з групи, що складається з нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність: (a) кодує білок, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2; (b) яка гибридизуется в жорстких умовах з нуклеїнової кислотою, комплементарної SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; та (d) яка гибридизуется в жорстких умовах з нуклеїнової кислотою, складається з комплементарної нуклеотидної послідовності, що кодує білок SEQ ID NO:2; де SEQ ID NO:1 і 2 розкрито в описі. Також описані: ацетил-СоА-карбоксилаза (SEQ ID NO:2), підвищує вміст арахідонової кислоти, характерне для господаря; рекомбінантний вектор, що містить зазначену нуклеїнову кислоту; і клітина, яка трансформована зазначеним вектором, призначені для отримання композиції жирних кислот, що містить підвищений рівень арахідонової кислоти. Запропоновано спосіб одержання композиції жирних кислот, що включає культивування зазначеної клітини і збір кирних кислот у клітині-хазяїні з підвищеним вмістом арахідонової кислоти. 9 н. і 2 з.п. ф-ли, 8 іл., 5 табл., 8 пр.

Спосіб визначення генотипу людини за поліморфізму в гені матриксною металопротеїнази ммр9-1562 з>т (rs3918242)

Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використане для визначення генотипу людини за поліморфізму в гені матриксною металопротеїнази ММР9-1562 C>Т (rs3918242). Спосіб заснований на зняття кривих плавлення з флуоресцентно-міченими алель-специфічними олигонуклеотидними пробами. У способі використовують загальну для всіх алелів пару праймерів, що відрізняються для кожного алелю флуоресцентно-мічені алель-специфічні олігонуклеотидні проби і універсальний олигонуклеотид, мічений гасителем флуоресценції наступного нуклеотидного складу: MMP9-1562s CGAAACCAGCCTGGTCAACG; ММР9-1562а TCTGCCTCCCGGGTTCAAGC; ММР9-1562р1 GGCGCACGCCTATAA-FAM; ММР9-1562р2 GGCGCATGCCTATAA-HEX; ММР9-1562pq BHQ1-ACCAGCTACTCGGGAGGC-3'-(P), де FAM - означає флуоресцентний барвник FAM, HEX - означає флуоресцентний барвник HEX, BHQ1 - означає приєднаний до 5'-кінцевого нуклеотиду темнової гаситель флуоресценції. Віднесення зразка до гомозиготе або гетерозиготе за даним аллелю оцінюється за формою кривих плавлення ДНК - по максимуму першої похідної графіків флуоресценції. Винахід дозволяє підвищити надійність і доступність генотипування. 1 іл.

Мутантна рекомбінантна l-аспарагиназа wolinella succinogenes (варіанти)

Даний винахід відноситься до біотехнології і являє собою мутантні варіанти рекомбінантної L-аспарагінази, що характеризуються амінокислотною послідовністю, відповідної амінокислотної послідовності L-аспарагінази бактерій Wolinella succinogenes, в якій амінокислотний залишок лізину в положенні 24 замінений на залишок серину або амінокислотний залишок валіну в положенні 23 замінений на залишок глутаміну, а амінокислотний залишок лізину в положенні 24 замінений на залишок треоніна. Винахід дозволяє отримати варіанти L-аспарагінази з поліпшеною стійкістю до протеолизу під дією трипсину порівняно з немодифікованим рекомбінантним білком і різним рівнем глутаминазной активності при повному збереженні аспарагиназной активності, що робить їх привабливими об'єктами для розробки на їх основі нових протипухлинних терапевтичних препаратів. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 1 табл., 11 пр.

Поліпшені вакцини проти bordetella pertussis на основі мутантних глікозилтрансфераз lps

Винахід відноситься до галузі біотехнології та імунології. Представлена клітина-господар Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica або Bordetella parapertussis, яка використовується в якості ад'юванта або для профілактики або лікування коклюшу, що має понижену активність ендогенної гликозилтрансферази з щонайменше 98% ідентичністю з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2 порівняно з активністю гликозилтрансферази батьківського штаму, де знижена активність досягається застосуванням інактивує вектора, який викликає інактивацію експресії послідовності ендогенної нуклеїнової кислоти, кодує гликозилтрансферазу, або призводить до зниженим рівнем експресії послідовності ендогенної нуклеїнової кислоти, кодує гликозилтрансферазу, злиттям послідовності нуклеїнової кислоти, кодує гликозилтрансферазу, зі слабким або индуцибельним промотором. Розкрито препарат, що складається з LPS з вказаної клітини-господаря зі збільшеною заміною гексозамином 1', 4' фосфатних груп частини LPS, що відноситься до липиду А, порівняно з препаратом LPS з батьківського штаму, і за допомогою чого LPS характеризується отриманням за меншою заходів�ша. Запропоновано застосування зазначених клітини-хазяїна або препарату LPS для одержання лікарського засобу для профілактики та/або лікування коклюшу, або одержання лікарського засобу для імунізації ссавця, де клітина-господар або LPS використовуються в якості ад'юванта. Описана фармацевтична композиція, що використовується в якості ад'юванта або для профілактики або лікування інфекції Bordetella, що містить зазначену клітку-господаря або вказаний препарат LPS в ефективному кількості та фармацевтично прийнятний носій. Винахід дозволяє отримати фармацевтичний препарат клітин Bordetella або LPS, що володіє підвищеною иммуногенностью у порівнянні з препаратом з батьківського штаму Bordetella. 9 н. і 3 з.п. ф-ли, 7 іл., 3 табл., 1 пр.
Up!