Мутантна рослинна формиатдегидрогеназа (варіанти)

 

Винахід відноситься до галузі генної та білкової інженерії і може бути використане в процесах синтезу оптично активних з'єднань або фізіологічно активних речовин, детекції форміату, а також для отримання стресостійкість рослин.

Отримані дві нові мутантні форми рослинної формиатдегидрогенази (ФДГ), що володіють підвищеною термостабільність порівняно з вихідним ферментом. У всіх із запропонованих мутантних білків природний залишок аланіну в положенні, відповідному положенню 267 в послідовності вихідної формиатдегидрогенази з сої Glycine max, замінений на залишок метіоніну. Крім того, в одному з мутантів природний залишок ізолейцину в положенні 272 замінений на залишок валіну. Дані заміни можуть бути використані в комбінації з іншими мутаціями, що забезпечують придбання формиатдегидрогеназами нових або поліпшених властивостей.

Дане винахід відноситься до нового білку, зокрема до мутантним формиатдегидрогеназам з рослин, які володіють підвищеною термостабільність порівняно з відповідним ферментом дикого типу, до ДНК, що кодує мутантні форми формиатдегидрогенази, до застосування даних ферментів в системах синтезу оптичтрессоустойчивих рослин.

НАД+-залежна формиатдегидрогеназа каталізує окислення форміату до вуглекислого газу при асоційованому відновлення NАД+до НАДН.

ФДГ володіє високою специфічністю до формиату, тому цей фермент успішно застосовують для визначення форміату в складних сумішах.

Реакція окислення форміат-іона є незворотною, продуктом є вуглекислий газ, який можна легко вивести зі сфери реакції. Також ФДГ володіє широким рН-оптимумом активності. Тому формиатдегидрогеназа може бути ефективно використана для регенерації NADH в процесах синтезу оптично активних з'єднань з використанням дегідрогеназ. В якості прикладу можна навести великомасштабний процес отримання терт-L-лейцину з триметилпирувата з використанням лейциндегидрогенази з системою регенерації NADH на основі формиатдегидрогенази з дріжджів Candida boidinii (Bommarius A. S., Schwarm M., Stingi K., Kottenhahn M., Huthmacher K. and Drauz K., Synthesis and Use of Enantiomerically Pure tert-Leucine, Tetrahedron Asymmetry, 1995, v.6, p.2851-2888). Також застосовують спосіб, в якому процес синтезу і регенерацію здійснюють безпосередньо в бактеріальній клітині. В одній з перших робіт ген ФДГ з бактерій Mycobacterium vaccae N10 був экспрессирова�лаланиндегидрогеназой. Такі клітини E. coli були використані для синтезу L-лейцину, L-валіну, L-норлейцина, L-метіоніну, L-фенілаланіну та L-тирозину з виходом більш 80% і оптичною чистотою до 100% (Galkin,A., Kulakova, L., Yoshimura, T., Soda, K., & Esaki, N. Synthesis of optically active amino acids from alpha-keto acids with Escherichia coli cells expressing heterologous genes. Appl. Environ. Microbiol., 1997, v.63, p.4651-4656). Нещодавно ген ФДГ з дріжджів Candida boidini був экспрессирован в E. coli спільно з кеторедуктазой і такий біокаталізатор був використаний в процесах синтезу ксилітолу з ксилози і 5-1-(2-хлорфеніл) етанолу з про-хлорацетофенона (Madje K., Schmolzer K., Nidetzky Ст., Kratzer R. cell Host and expression engineering for development of an E. coli ketoreductase catalyst: Enhancement of formate dehydrogenase activity for regeneration of NADH. Microb. Cell Fact. 2012 v.11, p.11-17). Одним з поширених прийомів для роботи з ферментами є їх іммобілізація на твердих носіях. Авторами (Demir A. S., Talpur F. N., Betui Sopaci S., Kohring G. W., Celik A. Selective oxidation reduction and reactions with cofactor regeneration mediated by galactitol-, lactate-, and formate dehydrogenases immobilized on magnetic nanoparticles. J Biotechnol., 2011, v.10, p.176-183.) була проведена іммобілізація формиатдегидрогенази з дріжджів Candida methylica, а також інших ферментів на наночастинки з проведенням синтезу 5-1,2-пропандіолу високою мірою оптичної чистоти.

Формиатдегидрогеназа знайдена в бактеріях, дріжджах, мікроскопічні гриби, а також раст�rments oxydants dans les grains de Phaseolus vulgaris. Arch.int.PhysioL, 1921, v.l8, pp.601-606). В рослинах ФДГ - це фермент стресу, синтез якого різко зростає при таких стресових впливах, як засуха, підвищена доза ультрафіолету, різкі скачки температури, нестача кисню і т. п. (Hourton-Cabassa С., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy de V., Remy R., and Francs-Small C. C. Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.627-635; Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N. K., Yoshimura E., and Mori S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.725-732; Thompson P., Bowsher C. G., and Tobin A. K. Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol, 1998, v.118, p.1089-1099; Andreadeli A., Flemetakis E., Axarii I., Dimou M., Udvardi M. K., Katinakis P., and Labrou N. E. Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: a possible correlation with hypoxia. Biochim.Biophys.Acta, 2009, v.1794, pp.976-984; David P., des Francs-Small C. C., Sevignac M., Thareau V., Macadre C., Langin Т., and Geffroy V. Three highly similar formate dehydrogenase genes located in the vicinity of the B4 resistance gene cluster are differentially expressed under biotic and abiotic stresses in Phaseolus vulgaris. Theor. Appl Genet., 2010, v.121, pp.87-103). Детальний огляд з фізіологічної ролі, отримання і властивостями ФДГ з рослин був опублікований в 2011 році (Алексєєва А. А., Савін C. C., Тишков в. І. NAD+-залежна формиатдегидрогеназа рослин. Acta Naturae, 2011, т. 3, №4(11), с. 40-56).

Багато з генів, що кодують дані ферменти, були клоновані і секвенировани, тому їх могидрогеназу, вбудовують в генно-інженерний вектор (плазміда, фаг тощо), який використовують для трансформації мікроорганізмів, наприклад, бактерій E. coli. Отриманий рекомбінантний штам використовують для експресії бажаного ферментного продукту.

Для рослинних формиатдегидрогеназ характерні низькі значення констант Міхаеліса порівняно з ферментами з інших джерел. Однією з найбільш перспективних для практичного застосування формиатдегидрогеназ з рослин є формиатдегидрогеназа з сої Glycine max (SoyFDH). Цей фермент був отриманий в активній і розчинній формі (Садихов Е. Р., Сєров А. Е., Ясний В. Е., Воінова Н.З., Алексєєва А. А., Петров А. С., Тишков в. І. NAD+-залежні формиатдегидрогенази з Arabidopsis thaliana та сої: експресія в клітинах E. coli та кінетичні властивості рекомбінантних ферментів. Вестн.Моск.Ун-та.Сер.2.Хімія, 2006, т. 47, N1, с. 31-34) і він має найнижчі значення констант Міхаеліса порівняно з усіма вивченими формиатегидрогеназами на даний момент (Алексєєва А. А., Савін С. С., Тишков в. І. NAD+-залежна формиатдегидрогеназа рослин. Acta Naturae, 2011, т. 3, №4(11), с. 40-56). Характерною особливістю рослинних формиатдегидрогеназ є наявність декількох ізоферментів, які кодируюСавин С. С., Тишков в. І. NAD+-залежна формиатдегидрогеназа рослин. Acta Naturae, 2011, т. 3, №4(11), с. 40-56). В нашому розпорядженні є ще один ген ізоферменту сої. Амінокислотна послідовність цього ізоферменту представлена в даній заявці у вигляді послідовності Seq_ID №1.

Основними недоліками відомих природних і рекомбінантних формиатдегидрогеназ з рослин дикого типу є невисока температурна стабільність цих ферментів. Таким чином, для успішного застосування формиатдегидрогенази з сої на практиці необхідно підвищити стабільність цього ферменту. Одним з підходів для вирішення поставленої задачі є мутагенез амінокислотних залишків цільового білка.

Для бактеріальних і дріжджових ферментів у літературі описано багато прикладів успішного поліпшення властивостей методами білкової інженерії. Для підвищення термостабільності формиатдегидрогенази з бактерій Pseudomonas sp.101 (PseFDH) були використані підходи, засновані на гідрофобізації α-спіралей (заміни залишків Ser в α-спіралях на Ala) (Rojkova A. M., Galkin A. G., Kulakova L. B., Serov A. E., Savitsky P. A., Fedorchuk V. V., and Tishkov V. I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, pp.183-188), збільшення гідрофобності білкової глобули (замін�nce interactions of between amino acid residues 43 and 61 on thermal stability of bacterial formate dehydrogenases. Biochemistry (Mosc.), 2002, v.67, pp.1145-1151) та зняття конформаційних напружень в поліпептидного ланцюга (заміни об'ємних Asn і Tyr на Gly) (Serov A. E. and Tishkov V. I. Role of Pro residues in stability of prokaryotic and euacaryotic formate dehydrogenases. Вестн.Моск.Ун-та. сер.2. Хімія, 2002, v.43, pp.345-349; Serov A. E., Odintzeva E. R., Uporov I. V., and Tishkov V. I. Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), 2005, v.70, pp.804-808). Пошук положень для мутагенезу був заснований на даних рентгеноструктурного аналізу та порівняння амінокислотних послідовностей ФДГ з різних джерел. В результаті одиничної заміни ефект стабілізації був невеликим - від 10 до 50%, але практично у всіх випадках - адитивним (Rojkova A. M., Galkin A. G., Kulakova L. B., Serov A. E., Savitsky P. A., Fedorchuk V. V., and Tishkov V. I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, p.183-188; Serov A. E., Odintzeva E. R., Uporov I. V., and Tishkov V. I. Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), 2005, v.70, pp.804-808).

Мутації, що підвищують операційну і температурну стабільність, були об'єднані в мутант PseFDH GAV. В результаті такого об'єднання спорідненість до NAD+збільшилася в 2 рази, а температурна стабільність - у 2,5 рази, а операційна - більш, ніж в 1000 разів у порівнянні з PseFDH дикого типу. Отримання мутантних PseFDH з поліпшеною термостабільність позволилкта при 60°С протягом 20-30 хв призводить до підвищення чистоти препарату PseFDH GAV з 50 до 80-85% без втрати ферментативної активності (Tishkov V. I. and Popov V. O. Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomol. Eng, 2006, v.23, pp.89-110).

Також у літературі є дані щодо збільшення стабільності ФДГ з дріжджів С. boidini. У роботі (Slusarczyk Н., Felber S., Kula M. R., and Pohl M. Novel of mutants formate dehydrogenase from Candida boidinii. US Patent Application Publication, 2003, US 2003/0157664) одержано хімічно більш стабільний мутант CboFDH SM із заміною Cys23Ser, який був набагато стійкіше ферменту дикого типу в розчинах 150 мМ Н2Про2і 50 мкМ CuSO4, однак його термостабільність зменшилася у 6,7 разів (зменшення Tmна 5°С). Для компенсації втрати стабільності використовували метод спрямованої еволюції. Були знайдені 4 мутації, що дає найбільший ефект стабілізації (Glu151Asp, Arg178Ser, Lys306Arg, Thr315Asn), які підвищили термостабільність мутанта CboFDH_SM в 36 разів (збільшення Tmна 10°С), а порівняно з ферментом дикого типу - в 5,7 разів.

У разі рекомбінантної формиатдегидрогенази з сої (SoyFDH) описані мутанти з точковими замінами залишку Phe290 на залишки Asp, Asn і Ser (Alekseeva A. A. et al. Protein Eng. Des. Sel., 2012, v.25, N11, p.781-788), у яких константа швидкості інактивації при 56°С була знижена від 2,5 (заміна Ala267Met) до 42 раз (заміна Phe290Asp) порівняно з такою для ферменту дикого типу. У той же час вихідна рекомбінантна ФДГ сої має таку ж хімічну стабильностеина Cys145Ser і Cys255Ala (Савін С. С., Тишков в. І. Інактивація пероксидом водню як метод оцінки стресовій стабільності формиатдегидрогенази in vivo. Acta Naturae, 2010, т. 2, №1(4), с. 80-84. Однак отримані мутантні SoyFDH поступаються по стабільності ФДГ з бактерій і дріжджів.

Технічна задача, розв'язувана за допомогою пропонованого технічного рішення, полягає в отриманні мутантної форми формиатдегидрогенази з сої Glycine max з підвищеною температурною стабільністю порівняно зі стабільністю ферменту дикого типу.

Технічний результат, що отримується при реалізації пропонованого технічного рішення, полягає у підвищенні температурної стабільності отриманої мутантної форми формиатдегидрогенази з сої Glycine max по відношенню до термостабільності ферменту дикого типу.

Для досягнення зазначеного технічного результату запропоновано використовувати рекомбинантную рослинну формиатдегидрогеназу, в якій в якості основи використана амінокислотна послідовність формиатдегидрогенази з сої Glycine max, зазначена в Seq_ID №1. Відмінною особливістю даної послідовності є наявність в ній 1 положенні на N-кінці залишку Ala, в той час як в активному ферменті дикого типу в цьому положенні знаходиться залишок Ser. Дана�рессии в клітинах E. coli.

Надалі отримання та переваги отриманої мутантних рослинних формиатдегидрогеназ будуть розглянуті з використанням прикладів отримання і реалізації цього ферменту.

Приклад 1

Отримання мутантної рослинної формиатдегидрогенази, в якій залишок Ala267 замінений на залишок Met.

Спрямований мутагенез проводили з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). В якості матриці для проведення спрямованого мутагенезу використовували плазміду pSoyFDH. Плазміда pSoyFDH отримана з комерційно доступною плазміди рЕТ21а (Novagen, США), в яку за сайтів рестрикції NdeI і EcoRI вбудована кДНК вихідної формиатдегидрогенази сої Glycine max.

Для введення мутації Ala267Met в ген рослинної формиатдегидрогенази з використанням ПЛР застосовували універсальні праймери Т7 for і Т7 rev:

T7For 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'

T7rev 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3',

а також прямий та зворотній праймери, які несуть необхідну заміну в триплете, кодує в гені soyfdh залишок Met в положенні 267:

SoyA267Mfor 5'-GAGGGGCAATTATGGACACCCAAGCAATTGCA-3'

SoyA267Mrev 5'-TTGGGTGTCCATAATTGCCCCTCGAGCATTGTT-3'.

Напівжирним шрифтом з підкресленням виділені нуклеотидні заміни, що забезпечують мутацію Ala267Met.

Реакцію ПЛР проводили в тонкостінної пластикової пробірці об ' �авляли 30 мкл мінерального масла. Пробірку прогрівали 5 хв при 95°С і потім проводили реакцію ПЛР за наступною програмою: 1-я стадія - 95°С, 60 с; 2-стадія - 56°С, 60 с і 3-я стадія - 72°С, 2 хв., всього 25-35 циклів. Після цього реакційну суміш витримували ще 10 хв при 72°С. Температуру на другій стадії обирали на 3-5° нижче Tmтемператури плавлення дуплексів, утворених праймерами.

Реакційна суміш для проведення ПЛР мала наступний склад (таблиця I):

Таблиця 1
Умови проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)
КількістьКомпонент
2,5 мкл10-кратний буфер для PFU Turbo ДНК-полімерази (Fermentas, Литва)
2 мклсуміш dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрація 2,5 мМ
1 мклДНК-матриця, концентрація ~10 нг/мкл
2 мклпраймер 1, концентрація 10 нмоль/мл (Синтол, Росія)
2 мклcolspan="0">PFU Turbo ДНК-полімераза (2,5 Од/мкл) (Fermentas, Литва)
до 25 мклдеионизованная вода, очищена з використанням системи MilliQ (Millipore, США)

На першому етапі проводили дві полімеразні ланцюгові реакції з використанням наступних пар праймерів: 1) T7For + SoyA267Mrev і 2) SoyA267Mfor + T7Rev. В якості матриці використовували плазміду pSoyFDH. Отримані продукти ПНР, фрагмент 1 і фрагмент 2 очищали з використанням препаративного електрофорезу в агарозному гелі з використанням призначених для цього наборів, наприклад, GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва). Потім проводили третю, об'єднуючу ПЛР з праймерами T7For і T7Rev, де в якості ДНК-матриці використовували отримані раніше фрагменти 1 і 2.

Продукт третьої ПЛР очищали аналогічно частинами 1 і 2 і обробляли эндонуклеазами рестрикції Kpnl і EcoRI протягом двох годин при 37°С, потім інкубували рестрикционную суміш для інактивації рестриктаз протягом 20 хвилин при 65°С (використовували рестриктази і буферні розчини фірми Fermentas (Литва)). Потім отримані фрагменти ДНК очищали від коротких фрагментів препаративним електрофорезом в агарозному гелі з наступною екстракцією потрібної смуги з агарози з використанням �з якої розщепленням за тим же сайтів рестрикції KpnI і EcoRI був видалений фрагмент гена soyfdh з G. max дикого типу.

Отриманої після лігування реакційною сумішшю трансформували клітини Е. coli TG1 (генотип supE hsdΔ5 thi Δ(lac-proAB) F'[traD36 proAB+lacqlacZΔM15]) і вирощували протягом ночі при 37°С на твердому агаризованому середовищі LB, містить ампіцилін у концентрації 100 мкг/мл (плазміда pSoyFDH містить ген стійкості до ампіциліну).

Виросли колонії інокулював в 6-8 мл середовища 2YT, що містить 150 мкг/мл ампіциліну, і ростили при 37°С протягом 8-10 годин при аерірованія. Плазмидную ДНК виділяли з отриманої культури клітин з використанням призначеного для цього набору, наприклад, GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Для контролю введення необхідних мутацій проводили секвенування плазмідної ДНК у Центрі колективного користування «Геном» (Інститут молекулярної біології ім. В. А. Енгельгардта РАН). В результаті із 5 виділених плазмід всі 5 містили тільки необхідну заміну Ala267Met. Таким чином, була отримана плазміда pSoyFDH_A267M, яка забезпечувала отримання нової формиатдегидрогенази SoyFDH Ala267Met з заміною Ala267Met.

Для отримання мутантного ферменту клітини E. coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е. coli В F-ompT hsdS(rB-mB-) dcm+Tetrgal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Camr]) трансформували п�ікол (25 мкг/мл) і проводили їх культивування (див. нижче).

Приклад 2

Вивчення температурної стабільності мутантної формиатдегидрогенази SoyFDH з заміною Ala267Met і ферменту дикого типу.

Для точної оцінки ефекту зміни температурної стабільності за рахунок введених замін мутантний фермент SoyFDH Ala267Met і формиатдегидрогеназу дикого типу виділяли в високоочищеним стані і визначали залежність залишкової активності від часу інкубації при 52, 54 і 56°С.

Методика отримання високоочищених препаратів була однакова як для мутантної SoyFDH Ala267Met, так і для ферменту дикого типу.

Експресію SoyFDH дикого типу та її мутантів проводили в клітинах E. coli BL21 (DE3) CodonPlus/pLysS. Для приготування посівного матеріалу з чашки відбирали одиничну колонію і культивували протягом 7-9 ч при 30°С і 180 об/хв до досягнення величини поглинання на довжині хвилі 600 нм.600≈0,6-0,8 в 5 мл середовища 2YT (дріжджовий екстракт 10 г/л, бактотриптон 16 г/л, хлорид натрію, 5 г/л, рН 7,0) у присутності 150 мкг/мл ампіциліну та 25 мкг/мл хлорамфеніколу. Потім вміст пробірок переносили в конічні качалочние колби з відбійниками об'ємом 1 л, містять 200 мл середовища 2YT і 150 мкг/мл ампіциліну і клітини культивували при 30°С і 80-90 об/хв до досягнення величини поглинання на 600 нм, A600<�чной концентрації індуктора 20 г/л. Після індукції температуру культивування знижували до 20°С і клітини культивували протягом 17 год при 120 об/хв. Отриману біомасу осаджували на центрифузі Beckman J-21 (США) при 7500 об/хв протягом 20 хв при 4°С і після видалення культуральної рідини клітини ресуспендували в 0,1 М натрій-фосфатному буфері, рН 8,0 в співвідношенні 1:4 (мас.). Отриману суспензію заморожували і зберігали при -20°С.

Для виділення мутантів SoyFDH Ala267Met і ферменту дикого типу 20% суспензію клітин в 0,1 М натрій-фосфатному буфері, рН 8,0 піддавали двох циклів заморожування-розморожування, і потім клітини руйнували з використанням ультразвукового дезінтегратора «Branson Sonifier 25 Про» (Німеччина) при постійному охолодженні. Осад видаляли центрифугуванням на центрифузі «Eppendorf 5804 R» (11000 об/хв, 30 хв).

Для очищення використовували модифіковану методику, розроблену для отримання рекомбінантної ФДГ з бактерій Pseudomonas sp.101 (Rojkova A. M., Galkin A. G., Kulakova L. B., Serov A. E., Savitsky P. A., Fedorchuk V. V., and Tishkov V. I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, pp.183-188). Процедура очищення ферменту включала висаджування баластних білків сульфатом амонію (45% від насичення), осадження цільового білка при концентрації сульфату амонію 85% від насичення і його Отриманий супернатант використовували для гідрофобної хроматографії на Phenyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) в низхідному градієнті 45-0% концентрації сульфату амонію у буфері А і знесолення на колонці з Сефадекс G-25 в тому ж буфері. Контроль чистоти отриманих препаратів здійснювали з використанням аналітичного електрофорезу в 12% поліакриламідному гелі в присутності 0,1% додецильсульфата натрію на приладі для електрофорезу MiniProtean II фірми «BioRad».

Активність ФДГ визначали спектрофотометрично по накопиченню NADH на довжині хвилі 340 нм (ε340=6220 М-1см-1) на спектрофотометрі «Schimadzu UV 1800 PC» при 30°С в 0,1 М натрій-фосфатному буфері, рН 7,0. Концентрація форміату натрію і NAD+у кюветі становила 0,6 М і 0,2 мг/мл відповідно.

Термостабільність ферменту вимірювали в 0,1 М натрій-фосфатному буфері, рН 7,0. Для кожного експерименту готували серію з пластикових пробірок об'ємом 0,5 мл по 100 мкл розчину ферменту (0,2 мг/мл) у кожній. Пробірки поміщали в попередньо прогрітий до необхідної температури водний термостат (52-56°С, точність термостатування ±0,1°С). В певні моменти часу відбирали по одній пробірці і переносили на лід на 5 хв, після чого пробірку центрифугували протягом 3 хв при 12000 об/хв на центрифузі «Eppendorf 5415D». Залишкову активність ФДГ вимірювали, як описано вище. Константу швидкості термоінактивації km визначали як тангенс кута нахилу прямої з графіка залежності натуральног� лінійної регресії, використовуючи програму «Origin Pro 8.5».

В якості параметра, що характеризує термостабільність, використовували константу швидкості процесу термоінактивації. Результати представлені в таблиці 2. Як випливає з таблиці 2, введення мутації Ala267Met підвищує стабільність формиатдегидрогенази з сої в 4,9, 3,0 і 2,5 разів при температурах 52, 54 і 56°С відповідно.

Приклад 3

Отримання мутантної рослинної формиатдегидрогенази, в якій залишок А1а267 замінений на залишок Met, а залишок 11е272 замінений на залишок Val.

Даний приклад ідентичний приклад 1 за винятком того, що в якості матриці для проведення спрямованого мутагенезу використовували плазміду pSoyFDH_A267M (отримання див. у прикладі 1), а в якості прямого і зворотного праймерів, що забезпечують введення заміни Ile272Val, використовували наступні дезоксирибоолигонуклеотиди:

Soy_I272Vfor 5'-ACCCAAGCAGTTGCAGATGCTTGCTCCAGT-3'

Soy_I272Vrev 5'-AAGCATCTGCAACTGCTTGGGTGTCCATAATTGC-3'

Напівжирним шрифтом з підкресленням виділені нуклеотидні заміни, що забезпечують мутацію Ile272Val.

Плазміда pSoyFDH з нуклеотидними замінами, що забезпечують в гені ферменту мутації Ala267Met і Ile272Val, отримала назву pSoyFDH_(A267M,I272V).

Для отримання мутантного ферменту клітини E. coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генвали плазміди pSoyFDH_(A267M,I272V), висівали на чашки Петрі з агаризованому середовищем, що містить ампіцилін (150 мкг/мл) та хлорамфенікол (25 мкг/мл) і проводили їх культивування (див. вище).

Приклад 4

Вивчення температурної стабільності мутантної формиатдегидрогенази SoyFDH з замінами Ala267Met і Ile272Val і ферменту дикого типу.

Для точної оцінки ефекту зміни температурної стабільності за рахунок введених замін мутантний фермент SoyFDH (Ala267Met, Ile272Val) і формиатдегидрогеназу дикого типу виділяли в високоочищеним стані і визначали залежність залишкової активності від часу інкубації при 52, 54 і 56°С.

Культивування клітин, що містять плазміду pSoyFDH_(A267M, I272V), проводили згідно з методикою, описаною в прикладі 2.

Виділення, очищення, а також вимірювання активності і термостабільності мутантної форми формиатдегидрогенази з сої SoyFDH (Ala267Met, Ile272Val) проводили згідно з методиками, описаними в прикладі 2.

В якості параметра, що характеризує термостабільність, використовували константу швидкості процесу термоінактивації. Результати представлені в таблиці 2. Як випливає з таблиці 2, введення мутацій (Ala267Met, Ile272Val) підвищує стабільність формиатдегидрогенази із сої 15, 8 і 5,6 разів при температурах 52, 54 і 56°С відповідно.

Константи швидкості термоінактивації формиатдегидрогенази з сої дикого типу SoyFDH, а також мутантних форм SoyFDH Ala267Met і SoyFDH (Ala267Met, Ile272Val)Форма ферментутемпература525456kin, хв-1kin(wt)/kin(mut)kin, хв-1kin(wt)/kin(mut)km, хв-1kin(wt)/kin(mut)SoyFDH дикого типу(3,0±0,1)*10-21(5,3±0,2)*10-21(12,8±0,2)*10-2SoyFDH Ala267Met(0,63±0,02)*10-24,9(1,78±0,04)*10-23,0(5,16±0,07)*10-22,5(0,65±0,01)*10-28(2,26±0,08)*10-25,6

1. Мутантна рослинна формиатдегидрогеназа з підвищеною температурною стабільністю, що характеризується амінокислотною послідовністю, відповідної амінокислотної послідовності формиатдегидрогенази з Glycine max (SEQ_ID №1), в якій залишок аланіну в положенні 267 замінений залишком метіоніну (SEQ_ID №2).

2. Мутантна рослинна формиатдегидрогеназа з підвищеною температурною стабільністю, що характеризується амінокислотною послідовністю, відповідної амінокислотної послідовності формиатдегидрогенази з Glycine max (SEQ_ID №1), в якій залишок аланіну в положенні 267 замінений залишком метіоніну, а залишок ізолейцину в положенні 272 замінений залишком валіну (SEQ_ID №3).



 

Схожі патенти:

Мутантна формиатдегидрогеназа (варіанти)

Винахід відноситься до галузі генної інженерії і може бути використане в процесах синтезу оптично активних з'єднань або фізіологічно активних речовин, детекції форміату, а також для отримання стресостійкість рослин. Винахід являє собою чотири нові мутантні форми рослинної формиатдегидрогенази (ФДГ). У першому з запропонованих мутантних білків природний залишок фенілаланіну в положенні, відповідному положенню 290 в послідовності формиатдегидрогенази з сої Glycine max, замінений на залишок аланіну. У другій мутантній формі ферменту цей же природний залишок фенілаланіну 290 замінений на залишок тирозину, у третій - на залишок треоніна і в четвертій - на залишок глутаміну. Винахід дозволяє отримати формиатдегидрогенази, що володіють поліпшеними властивостями в порівнянні як з ферментом дикого типу, так і з раніше описаними його мутантними формами 4 н. п. ф-ли, 2 табл., 5 пр.

Клітка мицелиального гриба penicillium canescens - продуцент ксиланази і лаккази, спосіб отримання комбінованого ферментного препарату ксиланази і лаккази

Група винаходів відноситься до біотехнології. Запропоновано клітина мицелиального гриба Penicillium canescens зі знятою катаболитной репресією і арабинозной індукцією, яка продукує ксиланазу і лакказу. Трансформована клітина плазміди, що містить промотор гена bgaS, лидерний пептид bgaS, фрагмент ДНК, що кодує ксиланазу, термінатор bgaS, ген β-лактамази і реплікон pMB1, і плазміди, що містить промотор гена bgaS, лидерний пептид bgaS, фрагмент ДНК, що кодує лакказу, термінатор bgaS, ген β-лактамази і реплікон pMB1. Запропоновано також спосіб ферментного препарату ксиланази і лаккази з використанням зазначеної клітини Penicillium canescens. Група винаходів забезпечує підвищення виходу цільових ферментів. 2 н. і 8 з.п. ф-ли, 9 іл., 3 табл., 4 пр.

Мутантна оксидаза d-амінокислот (варіанти)

Винахід відноситься до галузі генної інженерії і може бути використане для детекції D-амінокислот у складних зразках і в процесах ферментативного синтезу оптично активних речовин, альфа-кетокислот, цефалоспоринових антибіотиків та інших органічних сполук з використанням оксидаз. Отримані нові мутантні форми оксидази D-амінокислот з дріжджів Trigonopsis variabilis. В якості вихідного ферменту використана мутантна оксидаза D-амінокислот з дріжджів Trigonopsis variabilis з заміною Cys108Phe. Запропоновані нові мутантні форми відрізняються тим, що амінокислотний залишок фенілаланіну в положенні, відповідному положенню 54 в послідовності вищевказаної оксидази D-амінокислот, заміщений одним з таких залишків тирозину або серину. Винахід дозволяє отримати мутантні оксидази D-амінокислот, що характеризуються поліпшеними порівняно з вихідним мутантом і відповідним ферментом дикого типу каталітичними властивостями. 2 н.п. ф-ли, 1 іл., 2 табл., 4 пр.

Поліпептид, що має nadh-залежний hmf-редуктазную активність

Винахід відноситься до галузі біохімії

Композиції та способи зниження рівня h2s у ферментованих напоїв

Винахід відноситься до галузі біотехнології

Мутантна форма пероксидази хрону

Винахід відноситься до галузі біохімії

Спосіб ідентифікації поліморфізму rs1128446 гена тиоредоксинредуктази-1 у людини

Винахід відноситься до галузі молекулярної біології і може бути використаний в медицині при визначенні спадкової схильності до розвитку захворювань, асоційованих з носійство поліморфних варіантів гена тиоредоксинредуктази-1
Up!