Термофильная маннаногидролаза і містять рідини розриву

 

Область техніки

Виділений фермент маннаногидролаза, який гідролізує галактоманнановие субстрати при температурах, складових понад 160°F, має конкретної придатність в якості ферменту-разжижителя в рідинах розриву, що містять гуарова камедь і модифіковані гуаровие камеді.

Рівень техніки

Гідравлічний розрив використовується для створення розривів у підземних формаціях, які виходять від свердловини область формації з метою збільшення швидкості, з якою можуть бути отримані рідини з формації. Як правило, високов'язка рідина розриву закачується в свердловину під тиском, достатнім для розриву підземної формації. З метою підтримання підвищеного тиску на формацію, додають твердий розклинювальний агент рідина розриву, яка подається в розрив під високим тиском, застосовуваним до рідини.

Більш ніж 65% стандартних рідин розриву роблять з гуарової камеді (галактоманнани) або з похідних гуарової камеді, таких як гидроксипрпилпроизводное гуарової камеді (HPG), карбоксиметилпроизводное гуарової камеді (CMG) і карбоксиметилгидроксипропилпроизводное гуарової камеді (CMHPG). Ці полімери можуть бути попернта.

Після того як високов'язка рідина розриву транспортує розклинювальний агент у формацію, використовуються разжижители для зниження в'язкості рідини, яка дає можливість расклинивающему агенту осідати в розриві, підсилюючи таким чином вплив формації по відношенню до свердловині. Разжижители працюють шляхом зменшення молекулярної маси полімерів, "руйнуючи", таким чином, полімер. Потім розрив стає високопроницаемим проходом назад у свердловину для отримуваних рідин і газу.

Як разжижителей найбільш широко використовуються хімічні окислювачі і ферменти. Окислювач генерує радикал, який потім руйнує полімер. Реакція обмежена тим фактом, що окислювачі необхідно додавати в стехіометричному співвідношенні, інакше вони будуть атакувати не тільки полімер, але і будь-яку молекулу, яка схильна до окислення. З іншого боку, ферменти є каталітичними і специфічними до субстрату і будуть каталізувати гідроліз специфічних зв'язків всередині полімеру. Фермент буде руйнувати безліч полімерних зв'язків протягом його строку дії. На жаль, ферменти діють в дуже вузькому температурному інтервалі та їх функції часто інактивуються при� температурах від кімнатної до помірних (75°F - 150°F). При підвищених температурах, (>150°F), ці ферменти швидко денатурують і втрачають активність. Фермент бета-маннаназа, що використовується в звичайних ферментних складах, має температурний максимум, що становить приблизно 150°F. Профілі активності виявили, що фермент зберігає мало активності або не зберігає її після цього моменту. Так як багато свердловинні операції розриву проводять при температурах, складових понад 150°F, то було б бажано мати фермент, який може руйнувати рідини розриву на основі гуарової камеді при таких підвищених температурах.

Сутність винаходу

Фермент маннаногидролаза ефективно гідролізує галактоманнини і володіє особливою ефективністю при гідролізі полімерів гуарової камеді в інтервалах підвищених температур. Високотемпературний фермент маннаногидролаза може бути пов'язаний з глутатіон-S-трансферазой (GST) або може бути не пов'язаний з GST.

Нуклеотидна послідовність, що кодує фермент маннаногидролазу, була отримана з гена β-маннанази з Caldocellum saccharolyticum з оптимізацією кодонов для експресії в E. coli. Ген, що кодує маннаногидролазу, (далі "htβ"), має нуклеотидну послідовність, представлену на ФІГ�ован у відповідні плазмідні вектори, такі як pUC57, pUC 19 і pGS-21a, або в інші комерційно доступні або спеціально сконструйовані клонуючі вектори. Маннаногидролаза може бути трансформована і экспрессирована в комерційно доступних штами Escherichia coli. Трансльована амінокислотна послідовність маннаногидролази представлена на ФІГ.1B.

Потім може бути отримана водна рідина розриву, що містить фермент, полімер на основі гуарової камеді та зшиваючий агент.

При використанні в гідравлічному розриві маннаногидролаза ефективна в руйнуванні полімерів на основі гуарової камеді при температурах, складових понад 160°F.

Короткий опис креслень

З метою більш повного розуміння креслень, на які робиться посилання в докладному описі цього винаходу, представлено короткий опис кожного креслення, де:

На ФІГ.1A представлена нуклеотидна послідовність, яка кодує маннаногидролазу, використовувану у винаході;

На ФІГ.1B представлена амінокислотна послідовність ферменту маннаногидролази;

На ФІГ.2 представлена схема створення плазмід pUC57-htβ, pGS-21a-gst-htβ і pGS-21-htβ, що несуть ген маннаногидролази;

На ФІГ.3 зіставляється зменшення в'язкості 25 частин ну, через 18 годин при 180°F порівняно з суспензією, не містить фермент маннаногидролазу;

На ФІГ.4 зіставляється зменшення в'язкості 25 частин на трильйон суспензії гуарової камеді, поперечно зшитого з допомогою бората, що містить фермент маннаногидролазу, через 18 годин при 160°F порівняно з суспензією, не містить фермент маннаногидролазу;

На ФІГ.5 зіставляється зменшення в'язкості суспензії гуарової камеді, поперечно зшитого з допомогою бората, що містить фермент маннаногидролазу, через 10 годин при 180°F порівняно з суспензією, не містить фермент маннаногидролазу;

На ФІГ.6 зіставляється зменшення в'язкості суспензії гуарової камеді, поперечно зшитого з допомогою бората, що містить фермент маннаногидролазу, через 3,5 години при 140°F порівняно з суспензією, не містить фермент маннаногидролазу;

На ФІГ.7 зіставляється зменшення в'язкості при різних температурах суспензії гуарової камеді, містить фермент маннаногидролазу;

На ФІГ.8 представлені мікрофотографії бар'єрів з розклинюючого агента, і зіставляється провідність суспензії, що містить фермент маннаногидролазу, порівняно з суспензією, не містить фермент маннаногидролазу.

За, �що використовується в способі розриву щодо винаходу, якщо він не пов'язаний з глутатіон-S-трансферазой (GST), то зазначається у цьому документі як "маннаногидролаза", і "GST-маннаногидролаза", коли він являє собою продукт злиття β-маннанази та GST.

Фермент маннаногидролаза, описаний у цьому документі, відбувається з термофільних анаеробних бактерій Caldocellum saccharolyticum. Виділення гена, що кодує фермент β-маннаназу, описано в публікації E. Luthi et al., "Cloning, Sequence Analysis, and Expression in Escherichia coli of a Gene Coding for a β-Mannanase From the Extremely Thermophilic Bacterium 'Caldocellum saccharolyticum',Applied and Environmental Microbiology, Mar. 1991, pp. 694-700, яка включена в справжній документ в якості посилання.

Потім проводили оптимізацію кодонов гена ферменту маннаногидролази для підвищення ефективності його експресії в E. coli. Нуклеотидна послідовність гена htβ представлена на ФІГ.1 A. Нуклеотидна послідовність має 74% гомології з послідовністю гена маннанази, зображеної на ФІГ.2 у Luthi et al. Нуклеотидна послідовність включає кодує послідовність маннаногидролази і лидерную послідовність на N-кінці.

На ФІГ.2 (a) проілюстровано, що ген htβ може бути проклонирован в клонирующий вектор pUC57 для створення плазмй містить кодує ділянку білка GST. (B) проілюстровано, що отриманий в результаті ген кодує продукт злиття GST і маннаногидролази. На (c) проілюстровано, що отриманий в результаті ген кодує фермент без злиття з фрагментом GST. В результаті експресія з використанням плазмід pGS-21a-gst-htβ і pGS-21a-htβ (b) і (c), відповідно, отримують маннаногидролазу, злиту з N-кінцевий областю білка GST, і маннаногидролазу, не пов'язану з білком GST, відповідно.

На кожній з ФІГ.2 (a), (b) і (c), Amprрегулює експресію β-лактамази, rep(pMBl), і fl ori відповідають послідовності початку реплікації pUC57 і pGS-21a, відповідно, відповідальним за реплікацію плазмід, lacl кодує лактозний репрессор, T7 відповідає T7 РНК-полимеразному промотору, і MCS відповідає полилинкеру з безліччю сайтів клонування. 5'-кінець оптимізованої послідовності містить сайт ендонуклеази рестрикції BamHI, 3'-кінець містить сайт ендонуклеази рестрикції HindIII для клонування в экспрессирующий вектор pGS-21a для створення злитого білка GST-маннаногидролаза. Альтернативно, 5'-сайт BamHI замінювали на сайт ендонуклеази рестрикції Ndel для створення білка маннаногидролази, не пов'язаної з GST.

Плазміди pGS-21a-htβ, pGS-21a-gst-htβ і pUC57-htβ можуть бути трансформир�ни, і отриманий в результаті розчин використовують в якості клітинного лізату. Бесклеточний екстракт може бути отриманий шляхом видалення клітинного дебриса з лізату, і потім фермент може бути виділений з екстракту. Термін "виділений" означає, що фермент був видалений із інтактних клітин або з клітинного дебриса, і при умовах, відмінних від природного середовища, він є вільним від інших чужорідних або небажаних нуклеїнових кислот, протеаз і ліпідів, та представлений у формі, придатної для застосування в якості разжижителя для рідин розриву.

Ген, що кодує фермент маннаногидролазу, може додатково містити нуклеотидну послідовність, яка по суті гомологична нуклеотидної послідовності, представленої на ФІГ.1A. Термін "по суті гомологичний" використовується в цьому документі для позначення нуклеотидів, що володіють щонайменше 75% ідентичності послідовності, більш переважно, щонайменше, 80%, більш переважно, щонайменше 85%, і ще більш переважно, щонайменше, 90% ідентичності послідовності з послідовністю, представленої на ФІГ.1.

Трансльована амінокислотна послідовність манна�маннаногиролази, використовується для способи гідравлічного розриву, описаний у цьому документі, щонайменше, на 60% гомологична трансльованій амінокислотної послідовності, представленої на ФІГ.1B.

У кращій формі, виділений білок по суті вільним від інших білків. Переважно отримання білків зі ступенем чистоти більш ніж 40%, більш переважно, зі ступенем чистоти більш ніж 60%. Ще більш переважно, отримання білка у високочистому вигляді, тобто, зі ступенем чистоти більш ніж 80%, більш переважно, зі ступенем чистоти більш ніж 95%, і ще більш переважно, зі ступенем чистоти більш ніж 99%, яку визначали за допомогою SDS-PAGE.

Маннаногидролаза ефективно гідролізує полімер на основі гуарової камеді в інтервалах підвищених температур, таких як понад 72°F, як правило, в інтервалах pH приблизно від 5 до 11. Фактично, маннаногидролаза гідролізує полімер на основі гуарової камеді при температурах, складових понад 160°F, а також понад 180°F. Крім того, маннаногидролаза може використовуватися в комбінації з іншими ферментами і/або з окислюючими разжижителями для руйнування гелів гуарової камеді при більш широких температурних інтервалах і интератируемого полімеру у водній рідини. Водна рідина може являти собою, наприклад, воду, сольовий розчин або водно-спиртові суміші. Для цієї процедури може використовуватися будь-який апарат для змішування. В разі періодичного змішування, гидратируемий полімер і водна рідина змішуються протягом періоду часу, якого достатньо для утворення гидратируемого розчину. Гидратируемий полімер додають до водного рідини в концентраціях в інтервалі приблизно від 0,1% до 5% по масі водної рідини. Найбільш бажаний інтервал по справжньому винаходу становить приблизно від 0,2% до 0,8% по масі.

Гидратиуемий полімер, що використовується в цьому винаході, являє собою не модифіковану гуарова камідь, а також модифіковану гуарова камедь. Не модифікована гуарова камедь є кращою. Приклади модифікованої гуарової камеді включають гидроксипропилгуаровую камедь, карбоксиметилгидроксипропилгуаровую камедь і карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу.

Додатково до ферменту-разжижителю і гидратируемому полімеру рідина розриву включає зшиваючий агент. Зшиваючий агент може представляти собою полімер з іонами металів, що включають сполуки, що містять ал�е борати і бор. У разі боратних сшивателей, сшивающим агентом може бути будь-яка речовина, що є джерелом боратних іонів. Відповідні боратного сшиватели включають органоборати, моноборати, полиборати, мінеральні борати, борну кислоту, борат натрію, включаючи ангідрид або будь-гідрат, боратного мінерали, такі як колеманит або улексит, а також будь-боратного комплекси з органічними сполуками для затримки вивільнення боратного іона. Боратного зшиваючі агенти є бажаними.

Зшиваючий агент переважно присутній в кількості в інтервалі приблизно від 0,001% до понад 0,5% по масі водної рідини. Переважно, концентрація зшиваючого агента знаходиться в інтервалі від 0,005% до 0,25% по масі водної рідини.

Як правило, фермент вводять у вигляді водного розчину ферменту. Масове процентний вміст розчину ферменту в рідини для обробки свердловини залежить від кількості одиниць активності ферменту у водному розчині ферменту. Наприклад, кількість водного розчину ферменту, що має активність 30000 одиниць активності ферменту в рідини для обробки свердловини, як правило, становить приблизно 0,05-приблизно до 1,3 мас.%, переважно, приоличество одиниць активності ферменту, можна визначити з використанням певного масового процентного вмісту для розчину ферменту, що містить 30000 одиниць активності ферменту.

Оптимальний pH водної рідини, що містить сшиваемий полімер, є лужним і, як правило, складає приблизно від 9,5 до 11.

Рідини розриву за винаходу також можуть містити включене до їх складу речовина, що регулює pH, в якості матеріалу, додаткового до ферменту-разжижителю. Речовиною, що регулює pH, може бути будь-яка речовина, яке початково інертно, але при цьому злегка гідролізує у гелеподібній рідини розриву з отриманням кислоти Брэнстеда, таким чином, поступово знижуючи pH гелеподібної рідини і активуючи фермент-разріджувач. Кращі речовини, що регулюють pH, включають органічні ангідриди, ацилгалогениди, сульфонилгалогениди, бензилгалогениди і низькомолекулярні ефіри, які повільно гідролізують з отриманням кислот Брэнстеда. Під "низькомолекулярним" ефіром розуміють, що ефір повинен бути розчинний у рідини розриву з метою здійснення його призначеної мети гідролізу протягом періоду часу з отриманням кислоти. Як правило, чим вище молекулярна маса, тим менше раью застосування. Переважно, речовина, що регулює pH, являє собою низькомолекулярний ефір, обраний із групи, що складається з етилацетату, 2-этоксиэтилацетата, этилацетоацетата, триэтилцитрата, метилбензоата і диметилфталат. Типові молекулярні маси для 2-этоксиэтилацетата, этилацетоацетата і триэтилцитрата, використовуваних у прикладах, які представлені нижче, складає 132, 130 та 276, відповідно. Переважно, кількість речовини, що регулює рН, знаходиться в інтервалі приблизно від 0,01% приблизно до 0,85% по масі водної рідини.

Рідина обробки свердловини може бути отримана на місці з використанням піногенератора з великими зсувними зусиллями або може бути транспортована в бажане місце розташування.

Рідина розриву може додатково містити розклинювальний агент, який зазвичай додають до рідини перед додаванням зшиваючого агента. Відповідні расклинивающие агенти включають стандартні агенти, відомі в даній області, що включають зернистий кварцовий пісок, скляні гранули, алюмінієві гранули, кераміку, пластмасові гранули, що включають поліаміди, і надлегкі (ULW) частинки, такі як перемелена або подрібнена лушпиння волоського горіхів типу ошелуха насіння (включаючи кісточки фруктів), таких як слива, олива, персик, вишня, абрикос і т. д.; перемелена або подрібнена лушпиння насіння інших рослин, таких як маїс (наприклад, серцевина кукурудзяного качана або кукурудзяні зерна), і т. д.; оброблений деревний матеріал, такий як матеріал, отриманий з деревини, такої як деревина дуба, гікорі, волоського горіха, тополі, червоного дерева і т. д., включаючи таку деревину, яка була оброблена за допомогою шліфування, обтісування або іншої форми подрібнення, обробки і т. д.

Крім того, розклинювальний агент може включати пористу кераміку або органічні полімерні частинки. Пористий зернистий матеріал може бути оброблений з використанням непористі проникаючого матеріалу, покриваючого шару або лакирующего шару. Наприклад, пористий зернистий матеріал може бути оброблений зернистий матеріал, визначений в Патентній публікації U. S. № 20050028979, де (a) ASG обробленого пористого матеріалу становить менш ніж ASG пористого зернистого матеріалу; (b) проникність обробленого матеріалу становить менш ніж проникність пористого зернистого матеріалу; або (c) пористість обробленого матеріалу становить менш ніж пористість пористого зернистого матеріал�рідині розриву, але якщо необхідно, можуть використовуватися більш високі або низькі концентрації.

Рідина розриву також може містити інші відповідні добавки, широко поширені в індустрії експлуатації свердловини, такі як поверхнево-активні речовини, інгібітори корозії, агенти уповільнюють зшивання і так далі.

У звичайній операції розриву, рідина розриву з винаходу прокачують під достатньо високим тиском для того, щоб викликати утворення або розширення розривів і для приміщення розклинюючого агента в розрив.

Такі приклади є ілюстраціями деяких з варіантів здійснення цього винаходу. Всі відсоткові змісту, представлені в Прикладах, наведені у вигляді масових одиниць за винятком тих, що можуть бути зазначено інакше.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Ген htβ клонували в клонирующий вектор pUC57 з створенням плазміди pUC57-htβ і в экспрессирующий вектор pGS-21a c створенням плазміди pGS-21a-htβ. Плазміди pGS-21a-htβ і pUC57-htβ трансформували в компетентні клітини E. Coli, штами BL21 (DE3) або DH5a, і культивували в 5 мл живильного середовища LB-Miller при 98,6°F при 200 об./хв. протягом 16 годин. Культуральний бульйон з доданим до нього ампіциліном у концентрацС57-htβ. Ці культури ростили при 98,6°F і при 200 об./хв. Через 4 години до культури додавали ізопропіл-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до кінцевої концентрації 0,1 мМ. Через 3 години інкубації в присутності IPTG, клітини охолоджували до 39°F і збирали з допомогою центрифугування при 3000 об./хв протягом 20 хвилин. Культуральне середовище потім видаляли і клітини зберігали при -4°F до моменту застосування. Клітини потім розморожували і ресуспендували в 5 мл охолодженого 50 мМ натрій-фосфатного буфера. Лізоцим додавали до кінцевої концентрації 1 мг/мл, і культуру інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Нуклеїнові кислоти руйнували за допомогою коротких стимулів ультразвуку, і кінцевий бесклеточний екстракт (CFX) отримували шляхом центрифугування.

Приклад 2. Близько 1 г/т стандартного ферменту бета-маннанази, комерційно доступного як GBW-12CD від BJ Services Company, розводили в об'ємному співвідношенні 1:33 у воді, та додавали близько 2 мл CFX Прикладу 1, що містить pGS-21a-htβ і pUC57-htβ, до 100 мл водної рідини, що містить 25 частин на трильйон GW3, 2 м/т BF-7L і 1 г/т XLW-32, і інкубували протягом 18 годин при 180°F. (GW-3 являє собою агент суспензії гуарової камеді, XLW-32 являє собою боратний зшиваючий агент, і BF-7L являє собою буфной температури, і їх в'язкість вимірювали з використанням віскозиметра Fann 35. Результати представлені на ФІГ.3, де ілюструється, що маннаногидролаза забезпечує майже повне зниження в'язкості гуарової камеді через 18 годин при 180°F, в той час як стандартний ферментний продукт не проявляє себе в якості ефективного засобу для зниження в'язкості поперечно зшитого рідини при даних температурі і рн. Стрілка на ФІГ.3 відповідає неразрушенному зразком. Початкове значення pH всіх зразків склало 10,5.

Приклад 3. Близько 1 г/т стандартного ферменту Прикладу 3 і 2 мл CFX із зразків, що містять pGS-21a-htβ і pUC57-htβ з Прикладу 1, додавали до 100 мл водної рідини, що містить 25 частин на трильйон GW3, 2 м/т BF-7L і 1 г/т XLW-32, та інкубували протягом 18 годин при 160°F. Зразки використовували при pH 6,5 10,5. Було продемонстровано, що стандартний фермент, GBW-12, руйнує зразок GW-3 при pH 6,5, але не при 10,5. Зразки, що містять маннаногидролазу, забезпечували часткове або повне руйнування поперечно зшитого GW-3 через 18 годин при 160°F. в'язкості вимірювали на приладі Fann 35, і їх значення представлені на ФІГ.4, де демонструється зниження в'язкості за допомогою маннаногидролази в 25 частин на трильйон зразка GW-3, поперечно зшитого з допомогою б�ащей 25 частин на трильйон GW3, 1,5 г/т BF-7L і 1,5 г/т зшиваючого агента у вигляді боратного мінералу, суспендированного в нафтовому олії, комерційно доступного в BJ Services Company у вигляді XLW-30. pH розчину склало 10,8. Потім отримували зразок. Один зразок, позначений як (-), не містив ферменту в рідині. Інший зразок, позначений як (+), містив 0,75 г/т розведеного 1/25 розчину маннаногидролази, CFX, отриманої з экспрессирующего вектора pGS21a-htβ. ФІГ.5 демонструє зниження в'язкості двох зразків через 10 годин при 180°F. ФІГ.6 демонструє зниження в'язкості двох зразків через 10 годин при 140°F.

Приклад 5. Отримували 100 мл водної рідини, що містить 25 частин на трильйон GW3, 1,3 г/т BF-7L і 1 г/т зшиваючого агента XLW-32, для тестів при 72°F та 140°F. Отримували другі 100 мл водної рідини, що містить 25 частин на трильйон GW3, 2 м/т BF-7L і 1,5 г/т зшиваючого агента XLW-32, для тестів при 200°F. У всіх зразках концентрація ферменту маннаногидролази склала 0,5 г/т. Реологічні властивості кожного зразка вимірювали на віскозиметрі Chandler HTHP 5550 при 100 с-1. ФІГ.7 демонструє реологічні профілі тестів при різних температурах і демонструє, що маннаногидролаза ефективна в зниженні в'язкості поперечно зшитого полімеру галактоманнана в темпера�ннаногидролазу, ефективно гідролізують полімер на основі гуарової камеді в інтервалах підвищених температур і при таких pH, коли стандартний фермент не настільки ефективний.

Приклад 6. Даний приклад ілюструє відновлену провідність бар'єру з розклинюючого агента, обробленого з використанням водної рідини, яка містить фермент-разріджувач маннаногидролазу. Отримували два зразки по 100 мл водної рідини, що містять 25 частин на трильйон GW-3, 1,5 г/т BF-7L і 1,3 г/т XLW-30. Один зразок додатково містив 1,25 г/т (розведення 1/5) маннаногидролази (згаданої в Прикладі 6); інший зразок не містив жодного ферменту. 60-мл шприц оснащували дротяною мембраною 30 меш, обрізаної по внутрішньому діаметру шприца. До мембрани додавався шматок фільтрувального паперу (розмір пір 2,5 мкм), яку також обрізали по внутрішньому діаметру шприца. Потім на фільтрувальний папір наносили 10 грамів 20/40 CarboProp, розклинюючого агента Carbo Ceramics. Потім додавали 100 мл поперечно зшитого рідини до шару розклинюючого агента і продавлювали через бар'єр з розклинюючого агента до тих пір, поки плунжер не зупиниться нагорі бар'єру з розклинюючого агента. На кінець шприца одягали ковпачок, і шприц погру� температури. Потім шприц перевертали і плунжер м'яко видаляли для мінімізації пошкоджень бар'єру з розклинюючого агента. Бар'єр з розклинюючого агента поміщали на синє блюдце ваг і негайно візуалізували під складним світловим мікроскопом з 10-м збільшенням. На ФІГ.8 представлені мікрофотографії бар'єрів з розклинюючого агента, що ілюструють провідність суспензії, не містить маннаногидролазу (мікрофотографія А), у порівнянні з суспензією, що містить фермент маннаногидролазу (мікрофотографія В).

Як представлено на мікрофотографії A, бар'єр з розклинюючого агента має високоточною структурою, що позначає те, що рідина розриву залишається поперечно зшитого. (Залишилася рідина зі шприца також була поперечно зшита). Мікрофотографія B ілюструє бар'єри розклинюючого агента без чіткої структури, де бар'єр "розпадається" негайно після видалення з шприца. Залишилася рідина зі шприца була подібна воді, маючи дуже низьку в'язкість. Бар'єри розклинюючого агента з рідин, що містять мананногидролазу, демонстрували стану від гелю з невеликою кількістю поперечних зшивок до гелю без поперечних зшивок. Це передбачає чудову очі�місячний приклад ілюструє отримання ферменту маннаногидролази в процесі ферментації з завантаженням 10 літрів. Ген htβ клонували в экспрессирующий вектор pGS21-a з використанням эндонуклеаз рестрикції NdeI та HindIII з створенням маннаногидролази, не пов'язаної з GST. Отриманий в результаті экспрессирующий вектор трансформували в клітини BL21 (DE3) E. coli і висівали на чашки з LB-агаром, що містить 100 мкг/мл ампіциліну. Чашки інкубували при 98,6°F протягом ночі. Одну колонію виколювали з чашки і використовували в якості посівного матеріалу в 100 мл бульйону LB-Miller, що містить 100 мкг/мл ампіциліну. Культуру інкубували протягом ночі при 98,6°F при 200 об./мін.

100 мл нічний культури використовували в якості посівного матеріалу в 10 л середовища Terrific Broth у ферментері Bioflow 3000 з New Brunswick Scientific. Ампіцилін додавали до кінцевої концентрації 100 мкг/мл Ферментаційних культуру вирощували протягом 24 годин при 98,6°F з максимальним перемішуванням і підживленням стисненим повітрям для підтримання максимально можливої аерації. Гліцерин додавали зі швидкістю 4 мл/год протягом повних 24 годин. Розчин противовспенивателя додавали по необхідності. По досягненні OD600значення 0,5 додавали до суміші стерильний розчин лактози, так, щоб кінцева концентрація лактози в системі склала 15 мМ. Через 24 години клітинну культуру зберігали �лялі або за допомогою центрифугування, або фільтрації через полиэфирсульфоновую мембрану з розміром пор 0,2 мкм. Отриманий в результаті розчин потім можна було використовувати в якості розчину ферменту маннаногидролази або за необхідності піддавати його додаткового концентрування. В даному прикладі, фільтрат концентрували з допомогою проточної фільтрації вздовж потоку (TFF) з використанням полиэфирсульфонового фільтра 30000 MWCO. Ультраконцентрат потім використовували в якості розчину ферменту маннаногидролази.

Інші варіанти здійснення в рамках даної формули винаходу будуть очевидні фахівця в даній галузі з опису винаходу, представленого в даному документі. Мається на увазі, що опис винаходу разом з прикладами розглядаються лише в якості прикладу, в той час як межі та сутність винаходу визначені за допомогою формули винаходу, представленої нижче.

1. Спосіб розриву підземної формації, яка має температуру в свердловині, що становить понад 160°F, що включає введення в формацію водної гелеутворюючої рідини розриву з рН від 9,5 до 11, що включає:
(a) гидратируемий полімер, обраний із групи, що складається з гуарової камеді та з модифікованих гуарових камедей;
(b) ст-разріджувач, включає фермент маннаногидролазу, який має аминокислотную послідовність, яка, щонайменше, на 90% гомологична амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2.

2. Спосіб за п. 1, де гидратируемий полімер являє собою немодифіковану гуарова камедь.

3. Спосіб за п. 1, де зшиваючий агент містить бор або здатний забезпечувати рідина іонами бору.

4. Спосіб за п. 1, де температура в свердловині підземної формації становить до 180°F.

5. Спосіб за п. 1, де гуарова камедь обрана з групи, що складається з гидроксипропилпроизводного гуарової камеді, карбоксиметилгидроксипропилпроизводного гуарової камеді та карбоксиметилгидроксизтилцеллюлози.

6. Спосіб за п. 1, де зшиваючий агент являє собою полімерний зшиваючий агент, що містить метал, обраний із групи, що складається з алюмінію, сурми, цирконію і титану.

7. Спосіб за п. 1, де гидратируемий полімер представлений у вигляді розчину, вибраного з групи, що складається з водного розчину, сольового розчину та водно-спиртової суміші.

8. Спосіб за п. 1, де водна гелеутворююча рідина розриву додатково включає речовина, що регулює рН.

9. Спосіб за п. 1, де водну гелеобразующую рідина рржит розклинювальний агент.

11. Спосіб за п. 1, де водна гелеутворююча рідина розриву додатково містить, щонайменше, одну добавку, обрану з групи, що складається з поверхнево-активних речовин, інгібіторів корозії та агентів, що уповільнюють поперечне зшивання.

12. Спосіб гідравлічного розриву підземної формації, яка має температуру в свердловині, що становить понад 160°F, що включає введення в формацію водної гелеутворюючої рідини розриву під тиском, достатнім для створення або розширення розривів у формації, з рН від 9,5 до 11, зазначена рідина включає:
(a) гидратируемий полімер, обраний із групи, що складається з немодифікованих гуарових камедей і з модифікованих гуарових камедей;
(b) зшиваючий агент для поперечної зшивки гидратируемого полімеру з утворенням полімерного гелю;
(c) фермент-разріджувач, що включає фермент маннаногидролазу, який має аминокислотную послідовність, яка, щонайменше, на 90% гомологична амінокислотної послідовності SEQ ID No:2.

13. Спосіб за п. 12, де температура в свердловині підземної формації становить понад 180°F.

14. Спосіб за п. 12, де гидратируемий полімер являє собою немодифіковану гуарова камедь.

15. З п. 12, де гуарова камедь обрана з групи, що складається з гидроксипропилпроизводного гуарової камеді, карбоксиметилгидроксипропилпроизводного гуарової камеді та карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлози.

17. Спосіб за п. 12, де водну гелеобразующую рідина розриву отримують на місці.

18. Спосіб розриву підземної формації, яка має температуру в свердловині, що становить понад 160°F, що включає введення в формацію водної гелеутворюючої рідини розриву з рН від 9,5 до 11, що включає:
(a) водну рідина, обрану з групи, що складається з води, сольового розчину та водно-спиртових сумішей;
(b) гидратируемий полімер, обраний із групи, що складається з немодифікованою гуарової камеді, гидроксипропилпроизводного гуарової камеді, карбоксиметилгидроксипропилпроизводного гуарової камеді та карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлози;
(c) зшиваючий агент для поперечної зшивки гидратируемого полімеру з утворенням полімерного гелю, де зшиваючий агент містить бор або здатний забезпечувати рідина іонами бору;
(d) фермент-разріджувач, що включає фермент маннаногидролазу, який має аминокислотную послідовність, яка, щонайменше, на 90% гомологична амінокислотної по�

 

Схожі патенти:
Запропоновані варіанти способу переробки біомаси рослинного походження у перероблену біомасу, яка є придатною для використання в якості палива. Біомаса включає лігноцелюлозних матеріали і мікроорганізми, що зустрічаються в природному біомасі і здатні переробляти цукри в молочну кислоту або солі молочної кислоти. Спосіб включає приготування суспензії диспергуванням зазначеної біомаси в рідини на водній основі, витримування суспензії в умовах, відповідних для аеробного розкладання мікроорганізмами, щоб одержати суспензію, що включає перероблену біомасу у вигляді диспергованої твердої фази і виділення із суспензії переробленої біомаси та екстракту біомаси. Також може бути здійснено поділ екстракту біомаси на водний виходить потік і водний концентрат. Запропоновано також спосіб спалювання переробленої біомаси. Група винаходів дозволяє отримати біомасу з меншою кількістю небажаних компонентів. 3 н. і 9 з.п. ф-ли, 1 табл., 4 пр.

Спосіб одержання бактеріального концентрату та застосування його в якості біологічно активної добавки до їжі або закваски прямого внесення для курунги

Група винаходів включає способи одержання бактеріального концентрату та їх застосування в якості біологічно активної добавки до їжі або закваски прямого внесення. Винаходи належать до біотехнології і можуть бути використані для приготування бактеріальних концентратів. Спосіб передбачає вирощування симбіотичної закваски з грибкової кефірної закваски і термофільних лактобактерій Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus та Lactobacillus helveticus (1:0,5:0,5:1) на живильному середовищі, на основі сирної сироватки, житнього борошна і ростових компонентів при 30±2°с протягом 8-10 годин. Після отримання закваски виробляють відділення біомаси з отриманням рідкого бактеріального концентрату. В іншому варіанті для приготування закваски прямого внесення отриманий рідкий бактеріальний концентрат змішують із захисною середовищем і заморожують при температурі не вище (-20°С). Пропонується застосування отриманих концентратів в якості біологічно активної добавки до їжі або закваски прямого внесення для курунги. Винаходи дозволяють підвищити вихід біомаси і зберегти стабільність мікрофлори бактеріального концентрату при тривалому зберіганні з отриманням біологічно активної добавки до їжі або за

Удосконалений спосіб очищення правастатина

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до хіміко-фармацевтичної промисловості. Проводять очищення правастатина від стереоизомера 6-эпиправастатина. Центрифугують культуральну рідину з вмістом 6-эпиправастатина 7% від маси правастатина для відділення міцелію. Отримують нативний розчин має рН 6,6. Здійснюють очищення нативного розчину шляхом фільтрації через шар основної окису алюмінію з рН 10, що має активність, що відповідає 8% вологості. Окис алюмінію беруть у кількості 25:1 по відношенню до кількості правастатина, що знаходиться в нативному розчині. Екстрагують правастатин органічним розчинником. Проводять доочистку правастатина через отримання проміжної амонійної солі з використанням 25% водного розчину аміаку і подальшим переказом її в натрієву сіль. Винахід дозволяє провести очищення правастатина до змісту 6-эпиправастатина не більше 0,01%, що відповідає фармацевтичним вимогам по качеству.1 з.п. ф-ли, 2 ін.

Спосіб отримання хімічного продукту і апарат для безперервної ферментації

Група винаходів відноситься до біотехнології. Запропонована група винаходів: спосіб отримання хімічного продукту і апарат для отримання хімічного продукту вказаним способом. Культивують мікроорганізми або культуральні клітини у ферментаційному резервуарі. Переносять культуральну рідину з ферментационного резервуара в резервуар мембранної сепарації для фільтрування культуральної рідини через сепараційних мембрану. Збирають продукт ферментації з отриманої після фільтрації рідини в якості хімічного продукту. Забезпечують зворотний сток нефільтрованої культуральної рідини в ферментаційний резервуар для об'єднання з культуральної рідиною, що не пройшла через резервуар мембранної сепарації. Одна частина культуральної рідини спрямовується в обвід резервуара мембранної сепарації назад в ферментаційний резервуар. При цьому обсяг потоку культуральної рідини регулюють таким чином, що манометрическое тиск культуральної рідини з боку виходу потоку в резервуар мембранної сепарації становить 1 МПа або менше. Апарат включає в себе ферментаційний резервуар, резервуар мембранної сепарації, трубопровід циркуляції, що з'єднує фе�становлений в трубопровід циркуляції, обвідний трубопровід для резервуара мембранної сепарації, засіб реєстрації тиску потоку з боку входу потоку в резервуар мембранної сепарації, засіб регуляції об'єму потоку, встановлене в обвідний трубопровід. Винаходи забезпечують підвищення виходу кінцевого продукту. 2 н. і 11 з.п. ф-ли, 23 іл., 6 табл., 11 пр.

Спосіб профілактики і лікування ускладнень цукрового діабету, пов'язаних з розвитком дегенеративних процесів у нервовій тканині, фармацевтична композиція для нейропротективной терапії таких ускладнень та спосіб її отримання

Винахід відноситься до медицини і стосується способів та лікарських засобів, що застосовуються для профілактики і лікування ускладнень цукрового діабету, пов'язаних з розвитком дегенеративних процесів у нервовій тканині

Спосіб отримання хітозан-нуклеїнового гідролізату

Винахід відноситься до галузі біохімії

Спосіб отримання пенотворчого кошти

Винахід відноситься до галузі біохімії

Спосіб отримання палива та пристрій для його здійснення

Винахід відноситься до отримання нафтового палива

Прискорений спосіб перетворення енергії діоксиду вуглецю

Винахід відноситься до галузі застосування відновлюваних джерел енергії та області до отримання електричної і теплової енергії
Винахід відноситься до біохімії та біотехнології, зокрема до способів отримання хондроїтину сульфату з тканин морських гідробіонтів, таких як хрящова тканина риб
Винахід відноситься до біотехнології і мікробіології. Запропоновано штам мікроміцета Aspergillus foetidus 379-К-5-1 - продуцент комплексу пектіназ, β-глюканазу, ксиланази, целюлази, хітинази, маннанази і протеази для деструкції полісахаридів рослинного та мікробного сировини. Штам депонований у Відомчій колекції корисних мікроорганізмів сільськогосподарського призначення Россільгоспакадемії (RCAM) ГНУ ВНИИСХМ під реєстраційним номером RCAM 01136. Перевагою нового штаму є одержання більш активного комплексу ферментів, що каталізують гідроліз полісахаридів, а також эндополигалактуронази і пектинэстерази. Штам Aspergillus foetidus RCAM 01136 отримано з використанням ефективних методів селекції та мутагенезу із застосуванням УФ-опромінення і нитрозогуанидина з відомого штаму. Винахід дозволяє розширити асортимент одержуваних ферментів, що використовуються для деструкції полісахаридів. 2 табл.

Композиція ферментної суміші для гідролізу суміші целюлозних і гемицеллюлозних матеріалів (варіанти) і способи її використання (варіанти)

Описані композиції ферментної суміші для гідролізу суміші целюлозних і гемицеллюлозних матеріалів і способи гідролізу таких сумішей. Представлені ферментні суміші включають три композиції, перша з яких містить суміш цілісної целюлази T. reesei, доповнену β-глюкозидазой Т. reesei BGLU1, друга композиція складається з щонайменше однієї ксиланази, обраної з ксиланази GH10 або GH11, і третя композиція складається з щонайменше однієї додаткової гемицеллюлази, яка являє собою поєднання β-ксилозидази і двох або більше арабинофуранозидаз. Представлені способи передбачають контактування суміші целюлозних і гемицеллюлозних матеріалів з зазначеними композиціями. Охарактеризовані винаходи дозволяють підвищити конверсію глюкану та ксилана і можуть бути використані при перетворення біомаси в цукор. 4 н. і 8 з.п. ф-ли, 10 табл.

Виготовлення активних високофосфорилированних лізосомальних ферментів сульфатаз людини та їх застосування

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Представлений очищений препарат рекомбінантного ферменту N-ацетилгалактозамін-6-сульфатаза (GALNS) людини, де зазначений фермент включає аминокислотную послідовність, щонайменше, на 95% ідентичну амінокислот 27-522 SEQ ID NO:4, придатний для лікування суб'єкта, що страждає лізосомальної хворобою накопичення, яка асоційована з GALNS, де: (a) вказаний препарат ферменту GALNS має чистоту, щонайменше, приблизно 95% при визначенні фарбуванням кумасси синім при SDS-PAGE в невосстанавливающих умовах; та (b) залишок цистеїну в положенні 79, щонайменше приблизно в 50% молекул ферменту GALNS у зазначеному препараті ферменту GALNS перетворений в Cα-формилглицин (FGly); де зазначений фермент GALNS є гликозилированним N-пов'язаним глікозилюванням по залишках аспарагіну в положеннях 204 і 423, де, по меншою мірою, приблизно 50% олигоманнозних ланцюгів, підключених до залишку аспарагіну в положенні 204, є біс-фосфорилированними. Запропоновано спосіб лікування суб'єкта, який страждає на мукополісахаридоз типу IVa (MPS IVa), синдромом Моркіо A або множинної сульфатазной недостатністю (MSD), що включає введення суб'єкту терапевтическяет отримати фармацевтичний препарат рекомбінантної високофосфорилированной GALNS людини, має високий рівень молекул з перетвореним у Cα-формилглицин залишком цистеїну в положенні 79, в силу чого він високо поглинається через рецептор маноза-6-фосфату (MPR) і має високу активність. 2 н. і 27 з.п. ф-ли, 13 іл., 15 табл., 11 пр.

Альфа-d-галактозидази, що володіють зміненої региоспецифичностью, і спосіб їх отримання

Винахід відноситься до галузі біохімії. Описана альфа-D-галактозидаза, що володіє зміненої региоспецифичностью по відношенню до α1,4-зв'язку і містить мутацію або Pro402Asp, або Phe328Ala у відповідному положенні амінокислотної послідовності вихідного ферменту дикого типу, виділеного із штаму Thermotoga maritima MSB8. Запропоновано спосіб одержання зазначеної альфа-D-галактозидази, що полягає в тому, що здійснюють вибір позицій для сайт-спрямованого мутагенезу амінокислотної послідовності ферменту дикого типу наступним чином: а) проводять просторове накладення активних центрів ферментів, що володіють високою гомологією їх амінокислотних послідовностей і схожістю тривимірних структур, і кристалічна структура яких містить залишок D-галактози, на підставі проведеного накладення структур встановлюють можливе розташування D-галактози в активному центрі α-галактозидази з Thermotoga maritima MSB8, б) уточнюють методами молекулярної динаміки можливе розташування D-галактози в активному центрі α-галактозидази, визначають загальні амінокислотні залишки ферментативного центру, що утворюють водневі зв'язки з D-галактозою, і виявляють можливі положення D-галактози відно�ого типу, при цьому відбирають позиції амінокислотних залишків для сайт-спрямованого мутагенезу, після вибору позицій один з відібраних на етапі в) амінокислотних залишків заміняють іншим амінокислотним залишком, а саме або Pro402Asp, або Phe328Ala. Винахід дозволяє отримати региоспецифичние по відношенню до α1,4-зв'язку альфа-D-галактозидази. 2 н.п. ф-ли, 3 іл., 2 табл., 1 пр.

Модифікована ксиланаза

Винахід відноситься до біохімії і являє собою різні варіанти модифікованої ксиланази Сімейства 11

Способи посилення деградації або перетворення целюлозного матеріалу

Винахід відноситься до області біохімії і являє собою способи руйнування целюлози та композиції, що містять фермент, що руйнує целюлозу, і підсилює його білок
Винахід відноситься до біотехнології, а саме мікробіологічної промисловості

Ідентифікація варіанти днк, пов'язаного з гиполактазией дорослого типу

Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується варіанту ДНК, пов'язаного з гиполактазией дорослого типу

Генетична конструкція для забезпечення експресії цільових гомологічних і гетерологічних генів у клітинах мицелиального гриба penicillium verruculosum, використовуваного в якості господаря, спосіб одержання штаму гриба penicillium verruculosum і спосіб одержання ферментного препарату

Винахід відноситься до біотехнології і являє собою спосіб отримання ферменту, переважно целюлази або ксиланази, що розщеплюють целюлозу або ксилана відповідно, шляхом культивування штаму гриба Penicillium verruculosum
Up!