Композиція, інгібуюча агрегацію тромбоцитів


 

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД

Даний винахід відноситься до поліпептиду, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, або фармацевтичної композиції, наприклад, інгібуючої агрегацію тромбоцитів композиції, що містить в якості активного компонента экспрессированний продукт (рекомбінантний поліпептид), экспрессируемий кодирующим зазначений поліпептид полинуклеотидом.

Крім того, даний винахід відноситься до поліпептиду, що володіє здатністю зв'язуватися з колагеном, або фармацевтичної композиції, що містить в якості активного компонента зазначений поліпептид.

Даний винахід відноситься до способу скринирования з'єднання (наприклад, агоніста), сприяючого інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів, у якості активного компонента фармацевтичної композиції. Крім того, даний винахід відноситься до нового поліпептиду, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів, і до кодирующему його полинуклеотиду.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Тромбоцити агрегує вследѾм коронарної судини, церебрального судини або периферичного судини є причиною інфаркту міокарда, інфаркту головного мозку або хронічної обструкції артерій, відповідно. Приклади тромботичних захворювань, які слідують за такий активацією (стимуляцією агрегації) тромбоцитів, включають склероз артерій, ішемічний інфаркт головного мозку, ішемічні захворювання серця, зокрема інфаркт міокарда і стенокардія, хронічну обструкцію тромбоз артерій і вен.

Інгібують агрегацію тромбоцитів лікарські засоби використовують в якості лікарських засобів для профілактики ішемічних порушень, що супроводжують вищевказані різні захворювання у вигляді ускладнень, і в якості лікарських засобів для профілактики патологічних станів після гіпертензії, легеневої гипертезии, інфаркту головного мозку, інфаркту легені і субарахноїдального крововиливу. Крім того, вищезазначені лікарські засоби використовують для профілактики утворення тромбів при черезшкірної транслюмінальної коронарної ангіопластиці (ЧТКА) і розміщенні стента, а також використовують в якості агентів для профілактики рестеноза після розміщення стента шляхом включення за допомогою нанесення чекаю тим, комар проколює шкіру з допомогою щелеп ротового апарату, які виконують функцію голки, досягають периферичної кровоносної судини під час ссання крові, і для виявлення периферичної кровоносної судини часто повторює поведінку у вигляді проколювання і вилучення щелеп, на яке робиться посилання на «зондування». Вважають, що одночасно комар секретує слину, що містить сприяє вазодилатації речовина, для полегшення виявлення кровоносної судини. Внаслідок вищезазначеного зондування периферичний кровоносну судину часто пошкоджується, стаючи застійним. Як правило, при ушкодженні кровоносної судини тканини колаген під ендотелієм судин стає незахищеним, із зруйнованих клітин вивільняється аденозиндифосфат (АДФ) і активуються фактори згортання з утворенням тромбіну. Тромбін сильно активує тромбоцити з индуцированием адгезії тромбоцитів, агрегації тромбоцитів і вивільненням гранул і, в кінцевому рахунку, призводить до утворення стійкого тромбу за допомогою згортання крові з утворенням фібрину (механізму гемостазу). Відомо, що слина комара містить речовину, яка пригнічує такий механізм гемостазу (див. н�ться інгібуючим агрегацію тромбоцитів речовиною, вперше ідентифікованим у слиніAedes aegypti. Приводячи до розкладання АДФ, що вивільняється з пошкоджених ендотеліальних клітин судин, еритроцитів і адгезированних тромбоцитів, до АМФ (аденозинмонофосфату), апіраза інгібує агрегацію тромбоцитів і проявляє антигемостатическое дію. Для пояснення поведінки різних є вампірами комах крім комара, мабуть, є істотним аналіз функції речовин їх слини.

Передбачається, що ряд речовин слини залучений в інгібування агрегації тромбоцитів, повідомлялося, наприклад, про інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів білка, отриманого зTriatoma infestans(патентні документи 1 і 2).

Серед одержуваних з слинної залози білківAnopheles stephensiідентифікували білок, що володіє інгібіторною активністю щодо згортання крові, але не був ідентифікований білок, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів (див. патентний документ 3).

Крім того, повідомлялося про 33 нових білках при клонуванні бібліотеки кДНК слинної залозиAnopheles stephensi, але в повідомленні не описується білок, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів (див. неппоследовательность, клонированную з слинної залозиAnopheles stephensi(див. непатентний документ 3). Білок кодується відкритої рамки зчитування (ORF) з 810 п. о. і є білком з М. м. 28,5 кДа, що складається за розрахунками з 269 амінокислотних залишків. Згодом виявлено, що цей білок схожий з антигеном з М. м. 30 кДа (номер доступу в GenBank - AY226454), розкритим а непатентном документі 2, однак у непатентних документах 2 і 3 не описуються ефекти і функції білка.

[Патентний документ 1] JP 2004-121091-A

[Патентний документ 2] JP 2004-121086-A

[Патентний документ 3] JP 2003-116573-A

[Непатентний документ 1] Riberio, J. M., J. Exp. Товарbiol., 108, 1-7 (1984))

[Непатентний документ 2] Valenzuela, J. G., et al., "Exploring the salivary gland transcriptome and of the proteome Anopheles stephensi mosquito", Insect Biochemistry

[Непатентний документ 3] Hiroyuki Watanabe et al., Medical Entomology and Zoology 55 Suppl., pp 41, 19 (2004).

РОЗКРИТТЯ ВИНАХОДУ

Цим винаходом забезпечується нова фармацевтична композиція, зокрема інгібітор агрегації тромбоцитів і/або інгібітор адгезії тромбоцитів.

Цим винаходом, крім того, забезпечується нова фармацевтична композиція, що містить в якості активного компонента білок, що володіє здатністю зв'язуватися з колагеном.

Цим винаходом також обеспечивность щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторна активність щодо адгезії тромбоцитів речовини.

В результаті додаткового ґрунтовного дослідження, на додаток до вивчення білка (ААРР), про якому раніше повідомлялося авторами цього винаходу, останні виявили новий білок, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, в слинній залозіAnopheles stephensiуспішно виділили і ідентифікували ДНК, що кодує цей білок, і нещодавно виявили, що білок має інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів.

Даний винахід характеризується ознаками, що містяться в наступних пунктах 1-14.

Пункт 1. Фармацевтична композиція, що містить в якості активного компонента принаймні одного з таких поліпептидів (а)-(d):

(а) поліпептид, що включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1;

(b) поліпептид, що включає аминокислотную послідовність, що включає одну або кілька делецій, вставок, замін або додатків амінокислот у амінокислотної послідовності вищевказаного поліпептиду (а), і володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або ингивательность SEQ ID NO:3; і

(d) поліпептид, що включає аминокислотную послідовність, що включає одну або кілька делецій, вставок, замін або додатків амінокислот у амінокислотної послідовності вищевказаного поліпептиду (c), і володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів.

Пункт 2. Фармацевтична композиція, що містить в якості активного компонента экспрессированний продукт, який експресується щонайменше одним з наступних полінуклеотидів (е)-(j):

(е) полинуклеотидом, що включає ДНК-послідовність SEQ ID NO:2 або її комплемент;

(f) полинуклеотидом, який гибридизуется в жорстких умовах з вищевказаним полинуклеотидом (е) і здатний експресувати поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів;

(g) полинуклеотидом, що включає ДНК-послідовність, гомологичную вищезазначеного полинуклеотиду (е) на 80% або більше, і здатним експресувати поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю у відношенні >i) полинуклеотидом, який гибридизуется в жорстких умовах з вищевказаним полинуклеотидом (h) і здатний експресувати поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів;

(j) полинуклеотидом, що включає ДНК-послідовність, гомологичную вищезазначеного полинуклеотиду (h) на 80% або більше, і здатним експресувати поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів.

Пункт 3. Фармацевтична композиція у відповідності з пунктом 1 або 2, в якій зазначеної інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів є інгібіторна активність щодо агрегації тромбоцитів, індуковану колагеном, і/або інгібіторна активність щодо адгезії тромбоцитів до колагену.

Пункт 4. Фармацевтична композиція у відповідності з пунктом 1 або 2, що володіє здатністю зв'язуватися з колагеном.

Пункт 5. Інгібітор агрегації тромбоцитів і/або інгібітор адгезії тромбоцитів, що містить поліпептид, окте 2.

Пункт 6. Спосіб скринирования агоніста інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів, в якому рівень інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів поліпептиду, описаного в пункті 1, вимірюють у присутності або відсутності досліджуваного речовини, і величину, виміряну в присутності досліджуваного речовини, порівнюють з величиною, виміряної у відсутності досліджуваного речовини, для відбору досліджуваного речовини, яка збільшує інгібіторний ефект, як агоніста.

Пункт 7. Спосіб скринирования агоніста інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів, в якому рівень інгібіторної активності экспрессированного продукту, який експресується описаним у пункті 2 полинуклеотидом, вимірюють у присутності або відсутності досліджуваного речовини, і величину, виміряну в присутності досліджуваного речовини, порівнюють з величиною, виміряної у відсутності досліджуваного речовини, для відбору досліджуваного речовини, яка збільшує інгібіторну � як агоніста.

Пункт 8. Спосіб скринирования речовини-кандидата, є агоністом інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів поліпептиду, описаного в пункті 1, або экспрессированного продукту, описаного в пункті 2, який включає наступні стадії(1)-(4):

(1) стадію приготування живильного середовища, що містить клітку, трансформовану экспрессирующим вектором, який экспрессирует описаний в пункті 1 поліпептид, або клітку, що включає описаний в пункті 2 экспрессированний продукт, і багату щодо тромбоцитів плазму;

(2) стадію додавання агрегирующего тромбоцити агента в культуральне середовище вищевказаної стадії (1) для індукування агрегації тромбоцитів у присутності або відсутності досліджуваного речовини;

(3) стадію вимірювання рівня агрегації тромбоцитів у присутності або відсутності досліджуваного речовини на вищевказаній стадії (2);

(4) стадію відбору досліджуваного речовини в якості речовини-кандидата, коли величина, виміряна в присутності досліджуваного речовини, більше величини, вимірюваної у відсутності досліджуваного речовини.

Пункт 9. Набір для скринінгу агоніста поліпи�линуклеотидом, відрізняється тим, що в якості компонентів він містить багату щодо тромбоцитів плазму, один із поліпептидів, описаних у пункті 1, і экспрессированний продукт, що описаний в пункті 2, і агент, що агрегує тромбоцити.

Пункт 10. Виділений поліпептид, що включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1.

Пункт 11. Виділений поліпептид, що включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:3.

Пункт 12. Виділений поліпептид, що включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:5.

Пункт 13. Полинуклеотид, що включає ДНК-послідовність SEQ ID NO:2 або її комплемент.

Пункт 14. Полинуклеотид, що включає ДНК-послідовність SEQ ID NO:4 або її комплемент.

Пункт 15. Полинуклеотид, що включає ДНК-послідовність SEQ ID NO:6 або її комплемент.

На вищевказаний щонайменше один поліпептид (білок) (а)-(d) іноді дається нижче посилання у вигляді "SY-001". На экспрессированний продукт вищевказаного щонайменше одного полинуклеотида (е)-(j) іноді дається нижче посилання у вигляді "экспрессированний продукт цього винаходу".

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

На фіг.1 демонструється інгібіторна активність SY-001, продукованого в прикладі 1, 3(1), щодо агрегації тромбоцитпримере 1, 3(2), щодо агрегації тромбоцитів, індуковану колагеном.

На фіг.3 демонструється інгібіторна активність щодо агрегації тромбоцитів SY-001, продукованого в прикладах 1 і 3, який інгібує адгезію тромбоцитів до колагену в прикладі 5.

На фіг.4 демонструється, що SY-001, продуцированний в прикладах 1 і 3, має здатність зв'язуватися з колагеном в прикладі 6.

КРАЩІ ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ

Представлені тут скорочення амінокислот, пептидів, послідовностей підстав і нуклеїнових кислот знаходяться у відповідності з біологічної номенклатурою IUPAC-IUB, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984), визначеної IUPAC-IUB, "Guideline for preparing specifications comprising base sequences and amino acid sequences" (Патентне відомство), і зазвичай використовуються в даній області техніки позначеннями.

Полинуклеотид (молекула ДНК) тут включає не тільки двухцепочечную ДНК, але також одноцепочечную ДНК, в тому числі смислові ланцюги і антисмисловие ланцюга, які їх складають, і не обмежується своєю довжиною. Отже, кодує SY-001 полинуклеотид включає двухцепочечную ДНК, в тому числі геномну ДНК, і одноцепочечную ДНК (смислове ланцюг), у тому числі кДНК, і одноцепочечную ДНК (антисмисловую ланцюг), �ється інше.

Полинуклеотид (молекула ДНК) тут не визначається функціональним районом і може включати щонайменше один з таких районів: супрессирирующий експресію район, кодує район, лидерную послідовність, екзон і інтрон.

Полинуклеотид також включає РНК і ДНК. Поліпептид, що включає певну аминокислотную послідовність, і полинуклеотид, що включає певну ДНК-послідовність, включають їх фрагменти, гомологи, похідні і мутанти.

Мутанти полинуклеотида (мутантна ДНК) включають зустрічаються в природі алельні мутанти, які не зустрічаються в природі мутанти і мутанти, які мають делецию, заміну, додавання і вставку. Але ці мутанти кодують поліпептид, що володіє, по суті, тією ж самою функцією, що і функція поліпептиду, кодованого полинуклеотидом до мутації.

Мутація поліпептиду (модифікація амінокислотної послідовності) необов'язково відбувається за допомогою зустрічається в природі, наприклад, мутації або посттрансляційної модифікації і може бути мутацією, штучно виробленої при використанні зустрічається в природі білка (наприклад, SY-001). Вищевказані мутанти поліпептиду включають алельні варіанти, гомологи і �а 95% і більш переважно на 99%.

Гомологію поліпептиду або полинуклеотида можна проаналізувати при вимірі з використанням програми FASTA (Clustal, V., Methods Mol. Товарbiol., 25, 307-318 1994)). В якості прикладу найбільш пріоритетним і простого методу аналізу гомологи можна привести метод, при якому послідовність зберігають на носії (наприклад, на гнучкому диску, компакт-диску, накопичувачі на жорсткому диску, накопичувачі на диску для зовнішнього зв'язку, цифровому відео-диску тощо), здатному зчитуватися комп'ютером, і потім бази даних відомих послідовностей піддають пошуку у відповідності з добре відомою процедурою пошуку з використанням збереженої послідовності. Конкретні приклади баз даних відомих послідовностей включають наступне:

-База даних ДНК Японії (DDBJ) (http://www/ddbj,nig.ac.jp/);

-Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genebank./Index.htlm);

-База даних послідовностей нуклеїнових кислот Європейської лабораторії молекулярної біології (EMBL) (http:// ebi.ac/uk/ebi docs/embl db.html).

Більшість алгоритмів пошуку для аналізу гомології доступні кваліфікованим в даній області техніки фахівцям. Один приклад включає програму, на яку дається посилання у вигляді програми BLAST. У цій програмі існує 5 BLAST-процедур. Ср�дурепи призначені для перевірки послідовності білка (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1: 543-559 (1997)).

Крім того, для аналізу ідентифікованої послідовності в даній області техніки є додаткові програми, наприклад, програма вирівнювання послідовностей і програма для ідентифікації віддалених послідовностей.

Мутантна ДНК є мовчазною (немає зміни амінокислотного залишку, кодованого мутованою послідовністю нуклеїнової кислоти) або консервативною щодо кодованої її амінокислоти. Приклади консервативних амінокислотних замін показано нижче.

Початковий амінокислотний
залишок
Консервативний замещенний
амінокислотний залишок
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Ser
Lys
Gln або His
Glu
Ser
Asn
Asp
Pro
Asn або Gln
Leu або Val
Ile або Val
Arg, Asn або Glu
Leu або Ile
Met, Leu або Tyr
Thr
Ser
Tyr
Trp або Phe
Ile або Leu

Як правило, один чи більше кодонов, що кодують залишок Cys, впливають на утворення дисульфидной связва білка, включає наступні заміни:

(a) заміну гідрофобного залишку гідрофобним залишком, наприклад, заміна Leu, Ile, Phe, Val або Ala залишком Ser або Thr;

(b) заміну амінокислотного залишку, відмінного від Cys і Pro, залишком Cys або Pro;

(c) заміну залишку, що має несучу позитивний заряд бічний ланцюг, наприклад, Lys, Arg або His, що несе негативний заряд залишком, наприклад, Glu або Asp;

(d) заміну амінокислотного залишку, що має надзвичайно велику бічну ланцюг, наприклад Phe, амінокислотним залишком, що не мають бічний ланцюга, наприклад Gly.

(1) SY-001

SY-001 включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 або 3 або аминокислотную послідовність, що має одну або кілька делецій, вставок, замін або додатків амінокислот у амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1 або 3, і має інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, яка інгібує адгезію тромбоцитів до колагену та/або здатність зв'язуватися з колагеном.

SY-001 може бути поліпептидом, экспрессируемим в системі експресії білків з використаннямEscherichia coliабо в системі експресії білків з використанням бакуловируса (AcNPV), продемонстрированнѼ синтезом.

В якості одного конкретного прикладу амінокислотної послідовності SY-001 можна привести одну з SEQ ID NO:1 або 3. Амінокислотна послідовність SY-001 не обмежується однією з SEQ ID NO:1 або 3 і може бути послідовностями, що мають з ними певну гомологію, (гомологічними послідовностями). Гомологічні послідовності можуть включати поліпептиди, що включають аминокислотную послідовність, що має одну або кілька делецій, вставок, замін або додатків амінокислот у амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1 або 3, і володіють інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, яка інгібує адгезію тромбоцитів до колагену та/або здатність зв'язуватися з колагеном.

Інгібіторна активність щодо агрегації тромбоцитів, якою володіє SY-001, включає ефекти інгібування або блокування стану, при якому в кровоносній судині людини (зокрема, у коронарної артерії, аорті і церебральної артерії) збільшується вміст речовини, індукує агрегацію тромбоцитів, або в кровоносній судині полегшується агрегаційна здатність тромбоцитів, або відбули�>p>Інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів можна виявити по інгібуванню (супресії) агрегації тромбоцитів, індукованої агрегуюючим тромбоцити агентом, в багатій щодо тромбоцитів плазмі (PRP) при додаванні SY-001 в плазму в експерименті in vitro.

Більш детально, інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів SY-001 можна визначити за допомогою наступного способу. Тобто спочатку за допомогою центрифугування з цільної крові людини готують PRP. Згодом цю приготовану PRP попередньо інкубують з розчином, наприклад, розчином PBS, що містить SY-001, і для агрегації тромбоцитів до цього розчину далі додають агент, що агрегує тромбоцити. Приклади агрегирующего тромбоцити агента включають АДФ (аденозиндифосфат), колаген, CRP (споріднений колагену пептид), конвульксин, TRAP (пептид-активатор рецептора тромбіну), епінефрин, арахідонова кислота, U-46619 (аналог тромбоксану А2, аналог TXA2) та А23187 (кальцієвий ионофор). Швидкість агрегації тромбоцитів в отриманому в результаті розчині вимірюють з використанням турбидиметрического тромбоагрегометра з пропусканням світла (MCM HEMA TRACER 313M, що поставляється MC Medical), і швидкість інгібування з допомогою SY-001 агрегац�01. Таким чином, можна виявити інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів SY-001.

Можна також визначити інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів SY-001 за допомогою наступного методу.

Розчин PBS, що містить SY-001 у встановлених концентраціях, додають в лунки 96-лункового планшета, вкриті розчином колагену, і інкубують протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації в лунку додають суспензію тромбоцитів і інкубують протягом 45 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації інкубаційний розчин видаляють з лунки за допомогою піпетки, і лунку промивають PBS.

В лунку додають розчин PBS, що містить 1% SDS, і після похитування й перемішування лунку піддають повітряної сушки. Потім в лунку додають дистильовану воду, кількість білка в кожній лунку вимірюють з використанням набору для аналізу білка Dc (BIO-RAD Laboratories). Швидкість інгібування адгезії тромбоцитів з допомогою SY-001 розраховують з отриманої величини вимірювання на основі величини в контролі, не містить SY-001, і інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів SY-001 розраховують з кривою адгезії тромбоцитів. Таким чином, можна виявити інгібіторну активносѾпределить здатність SY-001 зв'язуватися з колагеном з допомогою наступного способу.

У кожну лунку 96-лункового планшета з або без покриття колагеном додають 300 мкл блокуючого розчину і інкубують протягом 1 години. Після видалення з кожної лунки інкубаційного розчину в кожну лунку додають 100 мкл розчину, що містить SY-001 у встановлених концентраціях, і інкубують протягом 1 години при кімнатній температурі. Після видалення з кожної лунки інкубаційного розчину в кожну лунку потім додають 200 мкл 2% сахарози і інкубують протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Після видалення з кожної лунки інкубаційного розчину лунки висушують, кожну лунку додають 100 мкл відтвореного розчину нікель-HRP (KPP: Kirkegaard&Perry Laborator, Ltd) і інкубують протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після промивання буфером для промивок у кожну лунку додають 100 мкл субстрату для пероксидази ABTS (KPL Ltd.), і 96-лунковий планшет обережно погойдують.

Після завершення реакції у кожну лунку додають 100 мкл 1% SDS, і потім лунку вимірюють з допомогою зчитувального пристрою Micro Plate Reader з варіацією абсорбції при 405-410 нм.

Здатність SY-001 при встановлених концентраціях зв'язуватися з колагеном розраховують з отриманої величини OD (оптичної щільності) на основі величи�я колагену. Таким чином, можна виявити здатність SY-001 зв'язуватися з колагеном.

Можна також визначити антитромбоцитарну активність, якою володіє SY-001, з допомогою наступного способу. Тобто PRP готують з допомогою центрифугування з цільної крові, одержуваної шляхом взяття за допомогою шприца з антикоагулянтом зразка крові здорового донора. Потім отриману PRP розводять відповідним буфером, наприклад, Tyrode-Hepes (134 мМ NaCl, 0,34 мМ Na2HPO4, 2,9 мМ KCl, 12 мМ NaHCO3, 20 мМ Hepes, 5 мМ глюкози, 1 мМ MgCl2, pH 7,3), і до цього серійного розведення додають SY-001 у встановлених концентраціях і попередньо інкубують. До цього розчину додають флуоресцентно меченное антитіло проти селектина Р, антитіло (постачається Becton Dickinson), яке дізнається РАС-1 (комплекс GPIIb/GPIIIa), фібриноген і аннексин V, та згодом для активації тромбоцитів додають агрегуючий тромбоцити агент, наприклад, АДФ, колагеном або TRAP. Отже, для оцінки активності (інгібіторної активності щодо активації) SY-001 щодо активації тромбоцитів вимірюють інтенсивність флуоресценції активованих тромбоцитів з допомогою проточної цитометрії. Ця інгібіторна активність щодо активації тромбоцитів являеѸи флуоресцентно мічених антитіл, дізнаються тромбоцит і лейкоцит, можна також оцінити ефект з'єднання на взаємодію тромбоциту та лейкоцита (тромбоцит-лейкоцит адгезію).

Щодо подробиць способу вимірювання інгібіторної активності SY-001 щодо агрегації тромбоцитів, в якому використовується турбідиметричний тромбоагрегометр з пропусканням світла, в цьому винаході наводиться посилання, наприклад, на Born, G. V. R., "Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal", Nature, 1962, 194, 927-8 і Sudo, T., et al., "Potent effects of novel anti-platelet aggregatory cilostamide analogues on recombinant cyclic nucleotіde phosphodiesterase isozyme activity", Biochem. Pharmacol., 2000, 59, 347-56. Стосовно вимірювання активації тромбоцитів у цьому винаході наводиться посилання, наприклад, на Ito, H., et al., "Cilostazol inhibits platelet-leukocyte interaction by suppression of platelet activation", Platelets, 2004, 15, 293-301.

Отже, існує ймовірність використання SY-001, має інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів, в якості терапевтичного агента проти розповсюдження або для профілактики пов'язаних з кров'ю захворювань та їх ускладнень, надаючи дію на кров та кровоносна судина є ссавцями тварин з інгібуванням або запобіганням образовЀную активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів, в якості терапевтичного агента або профілактичного агента для патологічних станів після захворювань та їх ускладнень, наприклад, інфаркту міокарда, емболії судин головного мозку, хронічної обструкції артерій, склерозу артерій, ішемічного інфаркту головного мозку, стенокардії, тромбозу вен, гіпертензії, легеневої гипертезии, інфаркту головного мозку, інфаркту легені, серцевої недостатності, нефриту, ниркової недостатності і субарахноїдального крововиливу, викликаних утворенням тромбу або ембола.

Також передбачається ефективне використання SY-001, має інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів, для профілактики утворення тромбу при ЧТКА і розміщенні стента і в якості агента, що запобігає рестеноз після розміщення стента шляхом включення за допомогою нанесення на стент або закладення в нього самого лікарського засобу, що містить SY-001.

Ступінь і положення модифікації, тобто "делеції, вставки, заміни або додавання" амінокислотних залишків, в SY-001, представленого у вигляді вищевказаного поліпептиду (b) і (d), особливо не обмежується за умови, що поліп�уществу ту ж саму активність, що і активність поліпептиду, що включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 або 3. Переважно, щоб зазначена модифікація зазвичай зачіпала приблизно від одного до декількох амінокислотних залишків.

У цьому винаході "делеції, вставки, заміни або додавання безлічі амінокислотних залишків" ставляться до того, що делетируются, вставляються, заміщаються або додаються 2 або більше і 20 або менше амінокислот. Переважно безліч амінокислот складають 2 або більше і 10 або менше амінокислот, краще 2 або більше і 7 або менше і ще більш бажано 2 або більше і 5 або менше. Ця модифікована амінокислотна послідовність гомологична амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1, або 3, наприклад, на приблизно 70% або більше, переважно на приблизно 80% або більше, більш переважно на приблизно 95% або більше і ще більш переважно на приблизно 98% або більше.

Конкретні приклади поліпептиду (SY-001), який є активним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу, продемонстровані в описуваних пізніше прикладах.

SY-001 володіє властивою йому інгібіторною активністю щодо агприсущей йому здатність зв'язуватися з колагеном.

Отже, фармацевтична композиція цього винаходу, що містить в якості активного компонента SY-001, застосовна в якості терапевтичного агента або профілактичного агента для патологічного стану після захворювань та їх ускладнень, наприклад, гострого коронарного синдрому, інфаркту міокарда, емболії судин головного мозку, хронічної обструкції артерій, склерозу артерій, ішемічного інфаркту головного мозку, стенокардії, тромбозу вен, гіпертензії, легеневої гипертезии, інфаркту головного мозку, інфаркту легені, серцевої недостатності, нефриту, ниркової недостатності і субарахноїдального крововиливу, викликаних утворенням тромбу або ембола. Фармацевтична композиція цього винаходу також застосовується для профілактики утворення тромбу при ЧТКА і розміщенні стента і в якості агента, що запобігає рестеноз після розміщення стенду з допомогою нанесення на стент або закладення в нього фармацевтичної композиції.

(2) Полинуклеотид (ДНК-молекула), що кодує SY-001

Один конкретний приклад полинуклеотида, що кодує SY-001, (на який дається посилання у вигляді "ДНК-молекула SY-001") може включати полинуклеотид (ДНК-молекулу), вполинуклеотид, гибридизующийся в жорстких умовах з полинуклеотидом, що включає комплемент ДНК-послідовності SEQ ID NO:2 або 4, і здатний експресувати поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів.

"Жорсткими умовами" тут можуть бути умови, при яких відбувається гібридизація у 2 ч SSC, що містить 0,1% SDS, при 50°С і не припиняється після відмивання у 1×SSC, що містить 0,1% SDS, при 60°С.

Крім того, інший приклад ДНК-молекули (полинуклеотида) SY-001 включає полинуклеотид, що включає ДНК-послідовність, гомологичную найбільш близькоспорідненої послідовності серед полінуклеотидів, що включають ДНК-послідовність SEQ ID NO:2 або 4 або її комплемент, на 80% або більше, переважно на 95% або більше і більше переважно на 98% або більше, і здатний експресувати поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів.

Істотною вимогою для ДНК-молекул (на які дається посилання у вигляді модифіковані ДНК-молекули), які здатні експресувати володіють необхідними ефектами по�оследовательностью, кодованої такий ДНК-молекулою, міг проявляти інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів (зокрема, інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів, індуковану колагеном, і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів до колагену). Іншими словами вимога полягає в тому, щоб трансформант, трансформований рекомбінантним экспрессирующим вектором, в який вбудований полинуклеотид (модифікована ДНК-молекула), міг експресувати білок, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, як його експресованого продукту.

Вищевказана модифікована ДНК-молекула включає ДНК-молекули, які містять ДНК-послідовності, що кодують амінокислотні послідовності SEQ ID NO:1 або 3, зокрема амінокислотні послідовності (модифіковані амінокислотні послідовності), що мають одну або кілька делецій, вставок, замін або додатків амінокислот, і ДНК-послідовності, що кодують її комплемент. Модифіковані ДНК можуть бути последовательностр>ДНК-молекула, гомологичная полинуклеотиду (ДНК SY-001 або її фрагментів), включеного до ДНК-молекулу SY-001 порівняння ДНК-послідовність SEQ ID NO:2 або 4, означає ряд споріднених ДНК-молекул, між якими і ДНК-послідовністю SEQ ID NO:2 або 4 існує гомологія послідовностей і які визнано відповідно до їх структурними властивостями, спільності їх картин експресії і схожість їх біологічних функцій в якості одного сімейства ДНК-молекул.

Такий гомологічною ДНК-молекулою можуть бути молекули, штучно отримані на основі зустрічаються в природі ДНК-молекул (наприклад, ДНК-фрагмента SY-001). Приклади такого методу штучного отримання містять генно-інженерні методи, такі як сайт-спрямований мутагенез [Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); там же 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984); "Zoku Seikagaku Jikken Kouza 1", "Idenshi Kenkyuho II" edited by the Japanese Біохімічний Society, p105 (1986)], методи хімічного синтезу, такі як фосфотриэфирний метод і фосфорамидитний метод [J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); там же 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); там же 24, 245 (1983)] і їх комбінації. Більш конкретно, ДНК-молекулу також можна синтезувати з допомогою фосфорамидитного методу або фосфотриэфирного методу, а також можна синтезувати з вико�потрібно отримати з допомогою синтезу комплементарної ланцюга і відпалу комплементарної ланцюга до хімічно синтезованої одноланцюгової ланцюга при відповідному умови або додавання комплементарної ланцюга до хімічно синтезованої одноланцюгової ланцюга з використанням ДНК-полімерази з відповідними праймерами.

ДНК-послідовність SEQ ID NO:2 або 4, яка є одним конкретним варіантом ДНК-молекули SY-001, являє собою один з прикладів комбінації кодонов, які кодують амінокислотні залишки поліпептиду, що включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 або 3. ДНК-молекула SY-001 не обмежується ДНК-молекулою, що має таку конкретну ДНК-послідовність, і може мати комбінацію оптимальних кодонов і ДНК-послідовність, обрану для кожного амінокислотного залишку. Кодон можна вибрати у відповідності зі стандартним способом. У цей час можна прийняти до уваги частоту використання кодонов у використовуваному господаря [Nucleic Acids Res., 9, 43(1981)].

(3) Одержання ДНК-молекули SY-001

ДНК-молекулу SY-001 можна легко продукувати і отримати з допомогою синтезу на основі розкритої тут інформації про послідовності нуклеїнової кислоти полинуклеотида, що кодує SY-001, або прямого синтезу ДНК-молекули, що відповідає послідовності нуклеїнової кислоти, кодує аминокислотную послідовність, на основі інформації про амінокислотної послідовності SY-001 (хімічного синтезу ДНК). Для отримання такого можна застосовувати загальні генно-інженерні методи [наприклад, див Moleculaра методу хімічного синтезу ДНК, за допомогою якого безпосередньо синтезують ДНК-молекулу SY-001, можна навести метод твердофазного синтезу з допомогою фосфорамидитного методу. Для цього методу синтезу можна використовувати автоматичний синтезатор.

Одержання ДНК-молекули SY-001 за допомогою генно-інженерного методу можна більш конкретно здійснити з допомогою приготування бібліотеки кДНК з відповідного джерела, в якому экспрессировалась ДНК-молекула SY-001, у відповідності зі стандартним методом відбору з бібліотеки необхідного клону, використовуючи відповідний зонд або специфічне щодо ДНК-молекули SY-001 антитіло [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)].

У цьому методі в якості прикладу джерела кДНК можна привести різні клітини і тканини, в яких експресується ДНК-молекула SY-001, і походять від них культивовані клітини. Зокрема, бажано отримати слюнную залозуAnopheles stephensi, який є комахою-терористом. Всі з нижче перерахованого: екстракцію і виділення загальної РНК з джерела, відділення та очищення мРНК і отримання і клонування кДНК - можна здійснити у відповідності зі стандартними методами.

ДНК-молекулу SY-001 можна отримати, використовуючи бібліотеку кДН�мо цього ДНК-молекулу SY-001 можна також отримати, використовуючи бібліотеку фагів, приготовану з допомогою екстракції вищевказаної мРНК слинної залози, додавання полі-А до РНК, потім збору РНК з полі-А, отримання кДНК з використанням зворотної транскриптази і згодом додавання сайтів рестрикційних ферментів з обох кінців кДНК, яку вбудовують в фаг.

Метод скринирования ДНК-молекули SY-001 з бібліотеки кДНК особливо не обмежується, і його можна здійснити у відповідності зі стандартними методами. В якості прикладу конкретного методу можна навести метод, у якому відповідний кДНК-клон відбирають з допомогою імунологічного скринінгу з використанням антитіла (наприклад, антитіла проти слиниAnopheles stephensi), специфічного щодо продукованого кДНК білка, метод гібридизації бляшок з використанням зонда, який вибірково зв'язується з цільової ДНК-послідовністю, метод гібридизації колоній і їх комбінації.

Зонд, який використовується в кожному з вищевказаних методів гібридизації, являє собою, як правило, ДНК-фрагмент, хімічно синтезований на основі інформації про ДНК-послідовності ДНК-молекули SY-001. Як вищевказаного зонда можна вигідно використовувати вже отримані ДНК-молемисловой праймер і антисмислової праймер, отримані на основі інформації про ДНК-послідовності ДНК-молекулу SY-001.

Використовувана в якості зонда ДНК (нуклеотиди) являє собою часткову ДНК (нуклеотиди), що відповідає послідовності ДНК SY-001 і включає щонайменше 15 послідовних ДНК, переважно щонайменше 20 послідовних ДНК і більш переважно щонайменше 30 послідовних ДНК. В якості зонда можна використовувати сам клон, позитивний відносно вищевказаної продукції ДНК-молекули цього винаходу.

Після отримання ДНК-молекули SY-001 можна відповідним чином використовувати метод ампліфікації ДНК/РНК з допомогою ПЛР-методу [Science, 230, 1350 (1985)]. Зокрема, коли з бібліотеки важко отримати повнорозмірну кДНК, можна відповідним чином використовувати RACE-метод [швидку ампліфікацію решт кДНК; Jikken Igaku, 12(6), 35(1994)], зокрема 5'-RACE-метод [M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)].

Використовується для ПЛР-методу праймер можна необов'язково сконструювати на основі інформації про послідовності ДНК-молекули SY-001, як продемонстровано в описуваних пізніше прикладах, і синтезувати у відповідності зі стандартним методом. В якості такого праймера можна використовувати частині а, в який вбудована кДНК SY-001, як продемонстровано в описуваному пізніше прикладі.

Амплифицированний за допомогою ПЛР-методу фрагмент ДНК/РНК можна виділити й очистити у відповідності зі стандартними методами, наприклад, методом гель-електрофорезу.

ДНК-молекулу SY-001 і її різні ДНК-фрагменти, отримані як зазначено вище, можна секвенувати у відповідності зі стандартним методом, наприклад, дидезокси-методом [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)] або методом Максама-Джільберто [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)] або просто з використанням комерційно доступного набору для секвенування.

(4) Отримання методами генної інженерії экспрессированного продукту цього винаходу

Экспрессированний продукт (рекомбінантний SY-001) цього винаходу можна легко і стабільно отримувати у великій кількості у вигляді экспрессированного продукту ДНК-молекули або білка, що містить SY-001, використовуючи інформацію про послідовності ДНК-молекули SY-001, у відповідності з загальними методами генної інженерії [наприклад, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)]. Більш конкретно, экспрессированний продукт цього винаходу можна отримати з допомогою приготування рекомбінантної ДНК (эксрмации клітини-господаря цим вектором з отриманням трансформанта, культивування трансформанта і збору цільового білка з отриманої в результаті культури.

При отриманні экспрессированного продукту цього винаходу в якості клітини-хазяїна можна використовувати будь-який з прокариотических організмів і эукариотических організмів. Наприклад, прокариотическими організмами в якості господаря можуть бути будь-якої зEscherichia coli, Bacillus subtilisі таких, зазвичай використовуються. Слушно, якщо використовуєтьсяEscherichia coliзокрема штам К12Escherichia coli. Клітини-господарі эукариотических організмів включають клітини хребетних і дріжджів. Приклади відповідних клітин хребетних включають клітини COS мавпи [Cell, 23: 175 (1981)], клітини яєчника китайського хом'ячка і їх лінії з делецією гена редуктази дигідрофолієвої кислоти [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)], а приклади відповідних клітин дріжджів включають клітини, які належать до роду Saccharomyces. Звичайно, клітини-господарі не обмежуються ними.

Коли в якості господаря використовується прокариотическая клітка з застосуванням вектора, здатного правильно в клітині-хазяїні, можна відповідним чином використовувати экспрессирующую плазміду, отриману вбудовуванням промотора і SD-послідовності (послідовності Шайна-Дабретения так, щоб ген міг экспрессироваться у цьому векторі. Як вищевказаного вектора часто використовують плазміди, такі як pET-16b, pET-32, pBR322, pBR325, pUC12 і pUC13, що відбуваються зEscherichia coli. Не обмежуючись ними, можна використовувати різні відомі вектори. Приклади комерційно доступного вектора, використовуваного для экспрессирующей системи з використаннямEscherichia coli, включають pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMAL-P2 (New England Biolabs), pET-16, pET-32, pET-21, pET-21/lacq (Invitrogen) та pBAD/His (Invitrogen).

При використанні в якості господаря клітини хребетного экспрессирующий вектор включає вектори, зазвичай містять промотор, сайт сплайсингу РНК, сайт полиаденилирования і терминирующую транскрипцію послідовність, розташовані 5' від експресованого гена цього винаходу. Вони можуть, крім того, містити початок реплікації, якщо потрібно. Конкретно, приклади экспрессирующего вектора включають pSV2dhfr [Mol. Cell. Товарbiol., 1: 854 (1981)], має ранній промотор SV40. Крім вищевказаного можна використовувати різні відомі комерційно доступні вектори. Приклади комерційно доступних векторів, використовуваних для экспрессирующей системи з використанням клітини тварини, включають такі вектори, як pEGFP-N, pEGFP-C (Clontrech), pIND (Invitrogen) та pcDNA3.я клітин комах.

В якості прикладу вектора для клітин комах можна привести бакуловирусний вектор (Takara), в який вбудована кДНК SY-001. Конкретно экспрессированний продукт цього винаходу можна отримати шляхом введення бакуловирусного экспрессирующего вектора, в який вбудована кДНК SY-001, культивовані клітини BmN4 або личинки тутового шовкопряда (Bombyx mori) з використанням вірусу ядерного поліедрозу (BmNPV) шовковичного шовкопряда з експресією і виділення з культуральної середовища або рідкої маси шовковичного шовкопряда за допомогою хроматографії. Экспрессированний продукт цього винаходу можна також отримати шляхом вбудовування кДНК SY-001 вірус ядерного поліедрозу (AcNPV)Autographa californica, його експресії в клітинах Sf9Spodoptera frugiperdaабо клітинах Tn5Trichoplusia niі також очищення з супернатанту культури з допомогою хроматографії.

При використанні в якості господаря клітини дріжджів конкретні приклади экспрессирующего вектора включають pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)], має промотор гена кислої фосфатази. Приклади комерційно доступного экспрессирующего вектора для дріжджової клітини включають pPICZ (Invitrogen) та pPICZα (Invitrogen).

Промотор особливо не обмежується. При використанні в якості хозяомотор, lac-промотор, recA-промотор і PL/RL-промотор. Коли господар належить роду Bacillus, переважними є SP01-промотор, SP02-промотор, penP промотор і т. п. При використанні в якості господаря дріжджів можна відповідним чином використовувати pH05-промотор, PGK-промотор, GAP-промотор, ADH-промотор і т. п. При використанні в якості господаря клітини тваринного переважними є промоторами промотор, що відбувається з SV40, промотор ретровірусу, промотор металлотионеина, промотор теплового шоку, цитомегаловирусний промотор, SRα промотор і т. п. При використанні в якості господаря клітини комахи можна навести в якості прикладу промотор бакуловируса р10, промотор полиэдрина і т. п.

Як экспрессирующего ДНК-молекулу SY-001 вектора можна переважно використовувати экспрессирующий злитий білок вектор. Конкретні приклади вектора включають pGEX (Promega) для експресії у вигляді злитого з глутатіон-S-трансферазой (GST) білка.

В якості прикладу полінуклеотидного послідовності, відповідної кодує зрілий поліпептид послідовності, що допомагає експресії і секреції поліпептиду з клітини-господаря, можна навести секреторну послідовність і лидерную послідовність. Ці наприклад, гемагглютининовий маркер у разі клітини тварини, використовувані для очищення злитого зрілого поліпептиду з бактеріального господаря.

Метод введення необхідної рекомбінантної ДНК (экспрессирующего вектора) у клітину-господаря і метод трансформації з використанням цієї ДНК особливо не обмежуються, і можна використовувати різні загальні методи.

Одержуваний у результаті трансформант можна культивувати у відповідності зі стандартними методами, і при культивуванні цільовий білок (экспрессированний продукт), який кодується ДНК-молекулою SY-001, сконструйованої як потрібно, експресується і продукується (накопичується і секретується) внутрішньоклітинно або внеклеточно або на клітинній мембрані трансформанта.

В якості середовища, що використовується для культивування, можна довільно вибрати і використовувати в залежності від застосовуваної клітини-хазяїна різні зазвичай використовуються середовища.

Отриманий таким способом экспрессированний продукт (рекомбінантний білок) цього винаходу можна відокремити і очистити з допомогою різних прийомів відділення [дивись Biochemistry Data Book II, pages 1175-1259, 1stedition 1stprinting published by Tokyo Kagaku Dojin on June 23, 1980; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987� звичайну перегруппировочную обробку, обробку (висаливание) з допомогою осаждающего білок агента, центрифугування, осмотичний шок, руйнування ультразвуком, ультрафільтрацію, різні рідинні хроматографії, такі як хроматографія на молекулярних ситах (гель-фільтрація), адсорбційна хроматографія, іонообмінна хроматографія, аффинная хроматографія і рідинна хроматографія високого дозволу (HPLC), діаліз та їх комбінації. Особливо корисний метод включає аффинную хроматографію з використанням колонки, з якою пов'язано антитіло, специфічне стосовно SY-001.

При конструюванні полинуклеотида, що кодує SY-001, можна використовувати ДНК-послідовність ДНК-молекули SY-001 SEQ ID NO:2. У цій послідовно також можна довільно відібрати, змінити кодон для кожного амінокислотного залишку, як потрібно.

Для амінокислотної послідовності SY-001, коли частина амінокислотних залишків або амінокислотної послідовності модифікують з допомогою заміни, вставки, делеції або додавання, можна використовувати різні методи, такі як сайт-спрямований мутагенез, описаний вище.

(5) Экспрессированний продукт цього винаходу, який є активним компонентом фармац�ий продукт, використовуваний в способі скринінгу цього винаходу) цього винаходу, який є активним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу, можна отримати за допомогою генно-інженерних методів, представлених у попередньому розділі (4).

Інгібіторна активність экспрессированного продукту цього винаходу щодо агрегації тромбоцитів є тією ж самою інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів, визначеної для SY-001 і описаної вище в попередньому розділі (1). Цю інгібіторну активність можна визначити у відповідності з публічно відомим методом перевірки агрегації тромбоцитів, наприклад, за допомогою методу визначення агрегації в багатій щодо тромбоцитів плазмі (PRP) з використанням турбидиметрического тромбоагрегометра з пропусканням світла.

Більш конкретно, інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів экспрессированного продукту цього винаходу можна визначити і оцінити шляхом вимірювання рівня агрегації тромбоцитів при додаванні агрегирующего тромбоцити агента в PRP, приготовану з крові людини, у присутності або відсутності SY-001, використовуючи турбідиметричний тромб�вербою агрегації тромбоцитів.

Інгібіторна активність экспрессированного продукту цього винаходу стосовно адгезії тромбоцитів є тією ж самою інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів (тобто інгібує адгезію тромбоцитів до колагену), визначеної для SY-001 і описаної вище в попередньому розділі (1). Цю інгібіторну активність можна визначити у відповідності з публічно відомим методом перевірки адгезії тромбоцитів до колагену, наприклад, за допомогою методу визначення адгезії тромбоцитів до колагену з використанням набору для аналізу білка Dc (BIO-RAD Laboratories).

Більш конкретно, інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів экспрессированного продукту цього винаходу стосовно адгезії тромбоцитів до колагену можна визначити і оцінити шляхом вимірювання рівня адгезії тромбоцитів до колагену при додаванні суспензії тромбоцитів, приготовленої з крові людини, у присутності або відсутності SY-001, використовуючи набір для аналізу білка Dc, і розрахунку інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів SY-001 з кривий адгезії тромбоцитів.

Здатність экспрессированного продукту цього винаходу зв'язуватися з колагеном є тією ж самою �ше в попередньому розділі (1). Цю здатність зв'язуватися з колагеном можна визначити у відповідності з публічно відомим методом перевірки зв'язування з колагеном, наприклад, за допомогою методу визначення здатності зв'язуватися з колагеном, використовуючи скануючий пристрій Micro Plate Reader з варіацією абсорбції при 405-410 нм.

Більш конкретно, здатність экспрессированного продукту цього винаходу зв'язуватися з колагеном можна визначити і оцінити шляхом вимірювання рівня зв'язування SY-001 з колагеном при додаванні SY-001 у встановлених концентраціях у присутності або відсутності колагену, використовуючи скануючий пристрій Micro Plate Reader з варіацією абсорбції при 405-410 нм, та розрахунку здібності SY-001 зв'язуватися з колагеном з кривою зв'язування з колагеном.

Композиція цього винаходу застосовується в якості терапевтичного агента або профілактичного агента для патологічних станів після захворювань та їх ускладнень, наприклад, гострого коронарного синдрому, інфаркту міокарда, емболії судин головного мозку, хронічної обструкції артерій, склерозу артерій, ішемічного інфаркту головного мозку, стенокардії, тромбозу вен, гіпертензії, легеневої гипертезии, інфаркту головного мозку, инфария, викликаних утворенням тромбу або ембола, згідно інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів экспрессированного продукту цього винаходу, включеного в якості активного компоненту. Композиція цього винаходу також застосовується для профілактики утворення тромбу при ЧТКА і розміщенні стента і в якості агента, що запобігає рестеноз після розміщення стенда шляхом включення за допомогою нанесення на стент або закладення в нього самого цій композиції.

(6) Хімічний синтез SY-001, який є активним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу

Поліпептид (SY-001), що є активним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу можна також отримати за допомогою загального методу хімічного синтезу у відповідності з інформацією про амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1 або 3. Метод включає методи синтезу пептидів з допомогою звичайного рідкофазного методу або твердофазного методу. Методи синтезу пептидів включають так званий покроковий метод елонгації, при якому кожну амінокислоту послідовно синтезують і пов'язують одну за одною для елонгації ланцюга, і метод конденсац фрагменти з'єднують. SY-001 можна синтезувати одним з цих двох методів.

Метод конденсації, застосовуваний для синтезу пептидів, можна також виконати у відповідності зі стандартними методами. Приклади стандартних методів включають азидний метод, метод з використанням змішаних ангидратов карбонових кислот, DCC-метод, метод з використанням активних складних ефірів, метод окислення і відновлення, DPPA (дифенилфосфорилазид)-метод, метод з використанням DDC + добавка (1-гидроксибензотриазол), метод з використанням N-гидроксисукцинамида, N-гідрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида і метод Вудварда.

При вищезгаданої реакції синтезу пептиду амінокислоту, не входить у реакцію або карбоксильную групу в пептиді, можна захистити у вигляді складного ефіру нижчих алкільних спиртів, таких як складний метиловий ефір, складний етиловий ефір і складний ефір трет-бутилового спирту, і у вигляді аралкилового складного ефіру, такого як бензиловий складний ефір, пара-метоксибензиловий складний ефір і пара-нитробензиловий складний ефір, зазвичай з допомогою естерифікації.

Гідроксильну групу амінокислоти, такий як залишок тирозину, що має функціональну групу в бічний ланцюга, можна захистити за допомогою ацетильной групи, ромі того, наприклад, гуанидиногруппу в залишку аргініну можна захистити за допомогою відповідної захисної групи, такий як нитрогруппа, тозильная група, пара-метоксибензолсульфонильная група, метилен-2-сульфонильная група, бензилоксикарбонильной групи, изоборнилоксикарбонильной групи або адамантилоксикарбонильной групи.

Реакцію зняття захисту з цих захисних груп мають захисну групу амінокислоти, пептиді і полипептиде, який є активним компонентом отримуваної, в кінцевому рахунку, фармацевтичної композиції цього винаходу, можна виконати у відповідності з зазвичай використовуваними методами, такими як контактний метод відновлення і метод з використанням рідкого аміаку/натрію, фтороводень бромоводорода, хлороводню, тріфторуксусной кислоти, оцтової кислоти, мурашиної кислоти, метансульфокислоти і т. п.

Отриманий таким способом SY-001, який є активним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу, можна довільно очистити згідно з різними методами, такими як методи з використанням іонообмінної смоли, розподільної хроматографії та гель-хроматографії та метод розподілу способом противотоЏ

Важливо, щоб фармацевтична композиція цього винаходу містила в якості активного компонента SY-001 або экспрессированний продукт цього винаходу. Фармацевтична композиція застосовується в якості фармацевтичної композиції, зокрема в якості інгібітора агрегації тромбоцитів для інгібування або блокування стану, при якому в кровоносній судині людини (зокрема, у коронарної артерії, аорті і церебральної артерії) збільшується речовина, індукуючу агрегацію тромбоцитів, або в кровоносній судині полегшується агрегаційна здатність тромбоцитів, або стану, при якому при ушкодженні кровоносної судини тромбоцити надмірно агрегує в місці пошкодження.

Фармацевтична композиція також застосовується, зокрема, в якості інгібітора адгезії тромбоцитів для інгібування або блокування адгезії тромбоцитів до речовини у вигляді агрегирующего агента, такого як колаген, стану, при якому в кровоносній судині людини (зокрема, у коронарної артерії, аорті і церебральної артерії) збільшується речовина, індукуючу адгезію тромбоцитів, або в кровоносній судині полегшується здатність тромбоцитів до адгезії, або �ня.

Фармацевтична композиція цього винаходу застосовується в якості терапевтичного агента або профілактичного агента для патологічного стану після захворювань та їх ускладнень, наприклад, гострого коронарного синдрому, інфаркту міокарда, емболії судин головного мозку, хронічної обструкції артерій, склерозу артерій, ішемічного інфаркту головного мозку, стенокардії, тромбозу вен, гіпертензії, легеневої гипертезии, інфаркту головного мозку, інфаркту легені, серцевої недостатності, нефриту, ниркової недостатності і субарахноїдального крововиливу, викликаних утворенням тромбу або ембола, за допомогою використання її інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів.

Фармацевтична композиція застосовується для профілактики утворення тромбу при ЧТКА і розміщенні стента і для запобігання рестеноза після розміщення стента шляхом включення за допомогою нанесення на стент або закладення в нього самого композиції, розраховуючи на інгібіторну активність SY-001 щодо агрегації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів.

SY-001 або экспрессированний продукт цього винаходу, що є активним компонент�ації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів і може використовуватися для маніпуляції із захворюванням, пов'язаних з агрегацією тромбоцитів і/або адгезію тромбоцитів, у клітці - чи тканини-мішені за допомогою використання його ефекту або активності. Приклади клітини-мішені, на яку впливає така агрегація тромбоцитів і/або адгезія тромбоцитів, можуть включати клітини крові і тромбоцити. Приклади тканин, що включають ці клітини, можуть включати коронарний артеріальна судина, церебральний артеріальна судина, артеріальна судина шиї, артеріальна судина, венозний посудину, периферичний артеріальний посудину, периферичний венозний посудину, нирковий артеріальна судина нирок і печінковий артеріальна судина.

Згідно з інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів або ефектом інгібування агрегації тромбоцитів і/або ефектом інгібування адгезії тромбоцитів в клітині-мішені, якій(им) має фармацевтична композиція цього винаходу, можна лікувати або запобігати патологічні стани після захворювань та їх ускладнень, наприклад, інфаркту міокарда, емболії судин головного мозку, хронічної обструкції артерій, склерозу артерій, ішемічного інфаркту головного мозку, стено� недостатності, нефриту, ниркової недостатності і субарахноїдального крововиливу, викликаних утворенням тромбу або ембола.

Згідно з інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів SY-001 щодо агрегації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів можна запобігати утворенню тромбу при ЧТКА і розміщенні стента і запобігати рестеноз після розміщення стента шляхом включення за допомогою нанесення на стент або закладення в нього фармацевтичної композиції цього винаходу.

Фармацевтичну композицію цього винаходу для запобігання рестеноза після розміщення стента можна використовувати у вигляді циклодекстрину клатрата. Фармацевтичну композицію цього винаходу можна також використовувати при нанесенні нанесенні товстим шаром або розпиленні) на біорозкладана пластмасу, яка є матеріалом стента, або закладенні в стент.

SY-001 або экспрессированний продукт, який є активним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу, також включає його фармацевтично прийнятні солі. Приклади такої солі включають нетоксичні солі лужних металів, такйние солі. Ці солі можна приготувати у відповідності зі стандартними методами. Вищевказані солі, крім того, включають нетоксичні кислотно-адитивні солі, одержані в результаті реакції SY-001 або экспрессированного продукту цього винаходу з відповідної органічної або неорганічної кислотою. Приклади типових представників нетоксичних кислотно-адитивних солей включають гідрохлорид, гідробромід, сульфат, бісульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурати, борат, бензоат, лактат, малат, пара-толуолсульфонат (тозилат), цитрат, фумарат, сукцинат, тартрат, сульфонал, гліколят, аскорбат, бензолсульфонат і напсилат.

Фармацевтичну композицію цього винаходу готують у формі фармацевтичного препарату, отримуючи SY-001, экспрессированний продукт цього винаходу або його сіль в якості активного компонента, і вона містить фармацевтично ефективне кількість активного компонента разом з відповідним фармацевтичним носієм або розріджувачем.

В якості прикладу фармацевтичного носія, використовуваного для приготування фармацевтичної композиції, можна навести наповнювачі і розріджувачі, такі як наповнювачі, загусники, сполучні речовин�бирают і використовують залежно від форми стандартної дози одержуваної в результаті композиції. Особливо бажану фармацевтичну композицію готують необов'язково з використанням різних інгредієнтів, наприклад, стабілізатора, бактерицидного агента, буфера, изотонизирующего агента, хелатообразующего агента, що регулює рН агента, поверхнево-активної речовини тощо, які використовуються для звичайних білкових композицій.

Приклади стабілізатора у вищевказаній композиції включають сироватковий альбумін людини, звичайні L-амінокислоти, цукри і похідні целюлози. Їх можна використовувати окремо або в комбінації з поверхнево-активною речовиною. Зокрема, за допомогою цієї комбінації в деяких випадках додатково збільшується стабільність активного компонента.

L-амінокислота особливо не обмежується, і можна використовувати будь-яку амінокислоту з гліцину, цистеїну, глутамінової кислоти і т. п.

Сахариди особливо не обмежуються. Наприклад, можна використовувати моносахариди, такі як глюкоза, маноза, галактоза і фруктоза, сахароспирт, такий як маніт, інозит та ксиліт, дисахариди, такі як сахароза, мальтоза і лактоза, полісахариди, такі як декстран, гидроксипропилкрахмал, хондроїтинсульфатів і гіалуронова кислота, і їх похідні.

Поактивних речовин і неіонних поверхнево-активних речовин. Їх конкретні приклади включають поверхнево-активні речовини на основі полиоксиэтиленгликоля, сорбитана алкильного ефіру, полиоксиэтилена алкильного ефіру, сорбитана моноацильного ефіру і глицерида жирних кислот.

Похідне целюлози особливо не обмежується. Можна використовувати метилцелюлозу, этилцеллюлозу, гідроксиетилцелюлоза, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу і натрій карбоксиметилцелюлозу і т. п.

Додається кількість вищевказаних сахаридів становить приблизно 0,0001 мг або більше і переважно приблизно 0,01-10 мг щодо 1 мкг активного компонента. Додається кількість поверхнево-активної речовини становить приблизно 0,00001 мг або більше і переважно приблизно 0,0001-0,01 мг щодо 1 мкг активного компонента. Додається кількість сироваткового альбуміну людини становить приблизно 0,0001 мг або більше і переважно приблизно 0,001-0,1 мг щодо 1 мкг активного компонента. Слушно, якщо додається кількість L-амінокислоти становить приблизно 0,001-10 мг щодо 1 мкг активного компонента. Додається кількість похідного целюлози становить приблизительличество активного компонента, міститься в фармацевтичної композиції цього винаходу, довільно вибирають з широкого діапазону. Слушно, щоб у композиції кількість активного компонента звичайно становило приблизно 0,00001-70% у ваговому відношенні і переважно приблизно 0,0001-5% у ваговому відношенні.

У фармацевтичну композицію можна додати різні добавки, такі як буфери, изотонизирующие агенти і хелатообразующіе агенти. Приклади буфера містять борну кислоту, фосфорну кислоту, оцтову кислоту, лимонну кислоту, ε-амінокапронову кислоту, глутамінову кислоту та/або їх солі (наприклад, солі лужних металів, такі як солі натрію, калію, кальцію і магнію, солі лужноземельних металів). Приклади изотонизирующего агента містять натрію хлорид, калію хлорид, сахариди і гліцерин. Приклади хелатообразующего агента включають натрію едетат і лимонну кислоту.

Фармацевтичну композицію можна приготувати у вигляді розчину і, крім того, в ліофілізованої дозованій формі, одержуваної при ліофілізації фармацевтичної композиції, яку готують для використання у відповідній концентрації з допомогою розчинення у буфері, що містить сіль.

Форму стандартно� її типових представників включають тверді дозовані форми, такі як таблетки, драже, порошкоподібні лікарські засоби, порошки, гранули і капсули, і рідкі дозовані форми, такі як розчини, суспензії, емульсії, сиропи та еліксири. Вони далі в залежності від способів введення класифікуються на пероральні агенти, парентеральні агенти, назальні агенти, вагінальні агенти, супозиторії, під'язикові агенти і мазі, і їх можна об'єднати, сформувати і приготувати у відповідності з загальними методами. Якщо потрібно, фармацевтичної композиції цього винаходу можуть також міститися фарбувальні агенти, консерванти, ароматизуючі агенти, корригенти і підсолоджувачі та інші фармацевтичні препарати.

Спосіб введення фармацевтичної композиції особливо не обмежується і визначається залежно від різних форм композиції, віку, статі, інших станів і тяжкості захворювання хворого. Наприклад, таблетки, драже, рідина, суспензію, емульсію, гранулу і капсулу вводять орально. Инъецируемий агент вводять окремо або в суміші зі звичайним замінником рідини, таких як глюкоза і амінокислоти, внутрішньовенно, якщо потрібно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, підшкірно або внутрішньочеревно окремо. Супозиторію вводять интратовую порожнину, а мазь, діючу черезшкірною, застосовують місцево.

Доза фармацевтичної композиції особливо не обмежується, і її довільно вибирають з широкого діапазону в залежності від необхідного терапевтичного ефекту, способу введення, часу лікування, віку, статі та інших станів хворого. Як правило, переважно, коли доза визначається так, що кількість активного компонента зазвичай становить приблизно від 0,01 мкг до 10 мг, переважно приблизно від 0,1 мкг до 1 мг на кг ваги тіла в день. Композицію можна вводити за допомогою роздільних введень від одного до декількох разів на день або з перервами.

(8) Скринінг речовин (агоніста), які сприяють інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів

Цим винаходом також забезпечується спосіб скринирования сполук-кандидатів, які сприяють інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів.

Спосіб характеризується вимірюванням рівня інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів поліпептиду, що включає аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 або 3, �, замін або додатків амінокислот у амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1 або 3, і володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, у присутності або відсутності досліджуваного речовини і відбором досліджуваного речовини, що впливає на інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів як агоніста, шляхом порівняння величини, вимірюваної в присутності досліджуваного речовини, з величиною, виміряної у відсутності досліджуваного речовини.

Рівень пригнічувальної щодо агрегації тромбоцитів ефекту можна визначити за швидкості інгібування агрегації тромбоцитів, розрахованої з величин вимірів, отриманих з використанням турбидиметрического тромбоагрегометра з пропусканням світла. Більш конкретно, зразок крові людини беруть за допомогою шприца з антикоагулянтом, і з взятої цільної крові з допомогою центрифугування готують багату щодо тромбоцитів плазму (PRP). До PRP, яку потім попередньо інкубують при 37°С, додають розчин очищеного SY-001, попередньо розчиненого в PBS. Згодом дбоцити агента, і продовжують інкубацію протягом встановленого періоду часу. Потім, використовуючи турбідиметричний тромбоагрегометр з пропусканням світла (MCM HEMA TRACER 313M, що поставляється MC Medical), вимірюють пропускання розчину з побудовою кривої агрегації тромбоцитів. Швидкість інгібування агрегації тромбоцитів можна розрахувати з цієї кривої в кожному випадку SY-001 або SY-001 + досліджувана речовина. Як вищевказаного агрегирующего агента крім колагену можна використовувати АДФ (аденозиндифосфат), CRP (споріднений колагену пептид), конвульксин, TRAP (пептид-активатор рецептора тромбіну), епінефрин, арахідонову кислоту, U-46619 (аналог тромбоксану А2, аналог TXA2), А23187 (кальцієвий ионофор) і т. п.

Рівень інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів можна також визначити по швидкості інгібування адгезії тромбоцитів, розрахованої з величин вимірів, отриманих з використанням набору для аналізу білка Dc (метод Лоурі [Lowry, O. et al., J. Товарbiol. Chem., 193, 265 (1951)] (BIO-RAD Laboratories). Більш конкретно, зразок крові людини беруть за допомогою шприца з антикоагулянтом, і суспензію тромбоцитів людини готують з PRP, отриманої за допомогою центрифугування цільної крові. Розчин очищеного SY-001, попередньо раствормнатной температурі. Після інкубації в лунку додають суспензію тромбоцитів і інкубують протягом 45 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації інкубаційний розчин видаляють з лунки за допомогою піпетки, і лунку промивають PBS.

В лунку додають розчин PBS, що містить 1% SDS, і після похитування й перемішування лунку піддають повітряної сушки. Потім в лунку додають дистильовану воду, кількість білка в кожній лунку вимірюють з використанням набору для аналізу білка Dc (BIO-RAD Laboratories), і швидкість інгібування адгезії тромбоцитів з допомогою SY-001 розраховують з отриманої величини вимірювання на основі величини в контролі, не містить SY-001, і інгібіторну активність щодо адгезію тромбоцитів SY-001 розраховують з кривою адгезії тромбоцитів. Швидкість інгібування адгезії тромбоцитів можна розрахувати з цієї кривої в кожному випадку SY-001 або SY-001 + досліджувана речовина. Як вищевказаного індуктора адгезії тромбоцитів можна використовувати колаген.

Цим винаходом також забезпечується спосіб скринирования речовини-кандидата, що збільшує інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів SY-001, який включає наступні стадії(1)-(4):

(1) стадію готування кул тромбоцитів плазму (PRP);

(2) стадію індукування агрегації тромбоцитів додаванням агрегирующего тромбоцити речовини в культуральне середовище вищевказаної стадії (1) в присутності або відсутності досліджуваного речовини;

(3) стадію вимірювання рівнів інгібування агрегації тромбоцитів у присутності досліджуваного речовини і відсутності досліджуваного речовини на вищевказаній стадії (2);

(4) стадію відбору досліджуваного речовини в якості речовини-кандидата, коли величина, виміряна в присутності досліджуваного речовини, більше величини, вимірюваної у відсутності досліджуваного речовини.

Цим винаходом також забезпечується спосіб скринирования речовини-кандидата, що збільшує інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів экспрессированного продукту цього винаходу, який включає наступні стадії(1)-(4):

(1) стадію приготування живильного середовища, що містить клітину, що містить экспрессированний продукту цього винаходу, і багату щодо тромбоцитів плазму (PRP);

(2) стадію індукування агрегації тромбоцитів додаванням агрегирующего тромбоцити речовини в культуральне середовище вищевказаної стадії (1) в присутності або відсутності исследуемо� речовини і відсутності досліджуваного речовини на вищевказаній стадії (2); і

(4) стадію відбору досліджуваного речовини в якості речовини-кандидата, коли величина, виміряна в присутності досліджуваного речовини, більше величини, вимірюваної у відсутності досліджуваного речовини.

Цим винаходом також забезпечується спосіб скринирования речовини-кандидата, за допомогою якого визначається інгібіторна активність щодо адгезії тромбоцитів SY-001, який включає наступні стадії(1)-(4):

(1) стадію приготування живильного середовища (або лунки), що містить клітку, трансформовану экспрессирующим SY-001 вектором, і лунковий планшет, покритий адгезує тромбоцити речовиною (тобто колагеном);

(2) стадію індукування адгезії тромбоцитів додаванням суспензії тромбоцитів у культуральне середовище вищевказаної стадії (1) в присутності або відсутності досліджуваного речовини;

(3) стадію вимірювання рівнів інгібування адгезії тромбоцитів у присутності досліджуваного речовини і відсутності досліджуваного речовини на вищевказаній стадії (2);

(4) стадію відбору досліджуваного речовини в якості речовини-кандидата, коли величина, виміряна в присутності досліджуваного речовини, більше величини, вимірюваної у відсутності досліджуваного речовин�ю якого визначається інгібіторна активність щодо адгезії тромбоцитів экспрессированного продукту цього винаходу, який включає наступні стадії(1)-(4):

(1) стадію приготування живильного середовища (або лунки), що містить клітину, що містить экспрессированний продукт цього винаходу, і лунковий планшет, покритий адгезує тромбоцити речовиною (тобто колагеном);

(2) стадію індукування адгезії тромбоцитів додаванням суспензії тромбоцитів у культуральне середовище вищевказаної стадії (1) в присутності або відсутності досліджуваного речовини;

(3) стадію вимірювання рівнів інгібування адгезії тромбоцитів у присутності досліджуваного речовини і відсутності досліджуваного речовини на вищевказаній стадії (2);

(4) стадію відбору досліджуваного речовини в якості речовини-кандидата, коли величина, виміряна в присутності досліджуваного речовини, більше величини, вимірюваної у відсутності досліджуваного речовини.

Метод скринирования цього винаходу можна проводити, практично застосовуючи технологію високомасштабного скринирования. У відповідності з практичним застосуванням цієї технології, наприклад, при скринировании на каталізатор інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів препарат (у тому чі�еточной фракцією, фракцією крові, наприклад, багатою щодо тромбоцитів плазмою, або суспензією тромбоцитів - у присутності або відсутності досліджуваного речовини, що піддається скринированию. Чи є досліджувана речовина агоністом SY-001 або антагоністом SY-001, визначають по зменшенню кількості пов'язаного міченого ліганда. Рівень активності SY-001 можна визначити з допомогою репортерной системи колориметричного маркера (не обмежуючись цим), вбудовування репортерного, відповідає на зміну активності полинуклеотида або поліпептидів, або аналізу зв'язування, публічно відомого в даній галузі техніки.

Для скринінгу сполуки-кандидати в якості каталізатора інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів можна використовувати конкурентний аналіз, в якому SY-001 або інший мутант [наприклад, SY-001(151-269), SY-001(21-269)] і інший інгібітор агрегації тромбоцитів (наприклад, ацетилсаліцилову кислоту, цилостазол) об'єднують із з'єднанням, яке пов'язується з ними.

Для скринінгу сполуки-кандидати в якості каталізатора інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів можна використовувати конкурентний аналіз, в якому SY-001 або інший мутант [наприклад, SY-001(151-269), SY-0�ється з ними.

Досліджувана речовина (сполука-кандидат), проскринированное з допомогою методу скринінгу цього винаходу, є агоністом з високою ймовірністю SY-001 у вигляді каталізатора інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів.

Агоніст може бути речовиною, який збільшує інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів при його присутності в системі скринирования цього винаходу.

Конкретні приклади цих досліджуваних речовин включають олігопептиди, білки, антитіла, молекули РНК, мірнк (маленькі інтерференційні РНК), непептидние з'єднання (синтетичні сполуки) ферментовані продукти, клітинні екстракти (екстракти рослин, екстракти тварин) і плазма. Ці речовини можуть бути речовинами, нещодавно розробленими, або відомими речовинами.

Приклади речовини, що інгібує агрегацію тромбоцитів, та/або речовини, що інгібує адгезію тромбоцитів, включають неорганічні або органічні низькомолекулярні сполуки, що зустрічаються в природі або синтетичні пептиди і поліпептиди або пептиди і поливания з ним. Смислова ДНК-молекула для кодує SY-001 ДНК-молекули, що вводиться in vivo безпосередньо або вводиться в вбудованою в рекомбінантний вектор формі, також включена в вищевказане речовина, інгібуючу агрегацію тромбоцитів, та/або речовину, інгібуючу адгезію тромбоцитів.

Речовина-кандидат, що збільшує інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів, проскринированное у відповідності з методом скринінгу цього винаходу, оцінюють наступним чином. Тобто речовина-кандидат, що збільшує інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторну активність щодо адгезії тромбоцитів або сприяє такої активності на приблизно 20% або більше, переважно на приблизно 30% або більше і переважно на приблизно 50% або більше у порівнянні з контролем (з відсутністю досліджуваного речовини), можна оцінити як з'єднання, яке сприяє інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів.

Вважають, що з'єднання, яке сприяє інгібіторної активності в отношеве терапевтичного агента або профілактичного агента для патологічного стану після захворювань та їх ускладнень, наприклад, інфаркту міокарда, емболії судин головного мозку, хронічної обструкції артерій, склерозу артерій, ішемічного інфаркту головного мозку, стенокардії, тромбозу вен, гіпертензії, легеневої гипертезии, інфаркту головного мозку, інфаркту легені, серцевої недостатності, нефриту, ниркової недостатності і субарахноїдального крововиливу, викликаних утворенням тромбу або ембола.

Серед речовин, які сприяють інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторної активності відносно адгезії тромбоцитів, отриманих методом скринінгу цього винаходу, як вважається, існує речовина, само володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів, індукованої агрегуюючим тромбоцити речовиною in vivo, та/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, індукованої адгезує тромбоцити речовиною in vivo, і така речовина, як вважають, застосовується в якості інгібітора агрегації тромбоцитів і/або інгібітора адгезії тромбоцитів в різних областях, в тому числі фармацевтичної галузі.

(9) Набір для скринінгу

Цим винаходом також забезпечується набір для скринінгу агоніста S�у, SY-001 (у тому числі экспрессированний продукт цього винаходу) та агрегує тромбоцити агент.

Набір для скринінгу цього винаходу в якості істотних інгредієнтів містить (1) SY-001 (наприклад, поліпептид, що має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 або 3) або экспрессированний продукт цього винаходу (наприклад, экспрессированний продукт кодує SY-001 ДНК-молекули ДНК-послідовності SEQ ID NO:2 або 4), (2) клітинну культуральне середовище, що включає багату щодо тромбоцитів плазму, і (3), що агрегує тромбоцити агент. В якості інших необов'язкових набір інгредієнтів, подібний наборів для скринінгу цього типу, може містити різні реагенти, такі як клітинні культуральні середовища, розріджувачі реакції, що забарвлюють агенти, буфери, фіксуючі розчини і розчини для промивок.

Конкретні приклади набору цього винаходу включають набори, що містять такі складові частини 1-3: складова частина 1: клітини (експресують SY-001 клітини, культивовані клітини, що включають клітиниEscherichia coliабо клітини комах, трансформовані полинуклеотидом (ДНК-молекулою), кодирующим SY-001), культивовані у 60 мм-чашці при 37°C в 5%2,при 0,5 ADP), індукуючу агрегацію тромбоцитів; і складову частину 3: багату щодо тромбоцитів плазму.

У способі скринирования з використанням набору для скринінгу цього винаходу швидкість інгібування агрегації тромбоцитів визначають в багатій щодо тромбоцитів плазмі на видиму область одиничної комірки, в яку додано перевіряється речовина (досліджувана речовина, лікарська речовина-кандидат). Потім визначають швидкість інгібування агрегації тромбоцитів у комірці, в яку перевіряється речовина не додавалося. Згодом перевіряють значну різницю між першою швидкістю і другий швидкістю. Ці вимірювання і оцінку можна виконати у відповідності зі стандартними методами.

Цим винаходом також забезпечується набір для скринінгу агоніста SY-001, характеризується тим, що в якості складових частин він містить адгезирующий тромбоцити агент (тобто колаген), SY-001 (у тому числі экспрессированний продукт цього винаходу) і суспензію тромбоцитів.

Набір для скринінгу цього винаходу в якості істотних інгредієнтів містить (1) SY-001 (наприклад, поліпептид, що має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:1 або 3) або экспрессиНК-послідовності SEQ ID NO:2 або 4), (2) адгезирующий тромбоцити агент (тобто колаген) і (3) суспензію тромбоцитів. В якості інших необов'язкових набір інгредієнтів, подібний наборів для скринінгу цього типу, може містити різні реагенти, такі як клітинні культуральні середовища, розріджувачі реакції, що забарвлюють агенти, буфери, фіксуючі розчини і розчини для промивок.

Конкретні приклади набору цього винаходу включають набори, що містять такі складові частини 1-3: складова частина 1: клітини (експресують SY-001 клітини, культивовані клітини, що включають клітиниEscherichia coliабо клітини комах, трансформовані полинуклеотидом (ДНК-молекулою), кодирующим SY-001), культивовані у 60 мм-чашці при 37°C в 5%2,при 0,5-1×105клітин/лунку, використовуючи PBS-буфері; складову частину 2: адгезирующее тромбоцити речовина (наприклад, колаген, ADP) для індукції адгезії тромбоцитів; і складову частину 3: суспензію тромбоцитів.

У способі скринирования з використанням набору для скринінгу цього винаходу швидкість інгібування адгезії тромбоцитів визначають у вигляді рівня адгезії тромбоцитів до колагену на видиму область одиничної лунки, в яку додано перевіряється речовина (досліджуване віщо, в яку перевіряється речовина не додавалося. Згодом перевіряють значну різницю між першою швидкістю і другий швидкістю. Ці вимірювання і оцінку можна виконати у відповідності зі стандартними методами.

ПРИКЛАДИ

Далі даний винахід описується більш детально з посиланням на наступні приклади. Ці приклади наведені тільки з метою пояснення прикладом і не обмежують даний винахід

Приклад 1

1. Приготування бібліотеки кДНК з слинної залозиAnopheles stephensi

СамкуAnopheles stephensi(штам SDA500) на 3-7 день після вилуплення змушували смоктати кров у миші (штам BALD/c, придбаний у CLEA Japan Inc.). Через 6 годин після смоктання крові у комара видаляли крила, ніжки, головну частину і черевну частину, і тільки грудну частину, в тому числі слюнную залозу, зберігали в рідкому азоті. У той час, коли збирали грудні частини від 300 комарів, екстрагували РНК з використанням набору RNeasy Midi Kit (QIAGEN). Бібліотеки отримували шляхом збору поліа-доданої РНК, отримання кДНК з використанням зворотної транскриптази, додавання сайтів для рестрикційних ферментів (сайтів для EcoRI та HindIII) на обох кінцях і вбудовування в фаги з використанням наборів для клонування λ SCREEN-1 Саждим фагом вищевказаної бібліотеки і скринировали з використанням антитіла проти слинної залозиAnopheles stephensiв якості зонда. Антитіло проти слинної залозиAnopheles stephensiотримували імунізацією кролика гомогенатом слинної залозиAnopheles stephensiразом з адъювантом Фрейнда.

Escherichia coliER-1647 інфікували позитивним клоном, отриманому при скринінгу, і фаги ампліфікували. Потім фаги витягували, і вбудовану частина клонували в плазміду pSCREEN-1b(+) (Novagen) з використанням вирізання з плазмід CreMediated Plasmid Excision (Novagen). Послідовність підстав вбудованої частини прослідковували з використанням ДНК-частин (праймера для перегляду SP6: SEQ ID NO:10, кодовий номер продукту - TKR3867, Takara Bio, і праймера для термінатора Т7: SEQ ID NO:11, кодовий номер продукту - NV432, Novagen), доданих з обох кінців pSCREEN, використовуючи аналізатор 310 Genetic Analyzer, що поставляється ABI.

В результаті аналізу послідовності підстав виявлено, що фрагмент клонованого гена містить стоп-кодон, але в ньому відсутня ініціюючий кодон. Для отримання відсутнього 5'-району кДНК SY-001 виконали 5'-RACE-метод [Frohman, M. A., et al., PNASC, 8, 8998-9002 (1988)], використовуючи ДНК фага λSCREEN, екстрагувати з бібліотеки кДНК слинної залози, в якості матриці і праймери, праймер для перегляду SP6 (SEQ ID NO:10) і праймер pAnS-1 (SEQ ID NO:12) для клонування ДНК-фрагмента р�нге, і, крім того, містив ініціюючий кодон. Два ДНК-фрагмента лігувати для визначення повної послідовності основ ДНК-молекули, кодує SY-001.

Відкрита рамка зчитування, виявлена в кДНК, кодувала передбачуваний білок з М. м. 28,5 кДа з 269 амінокислотних залишків і містила 807 п. о. Цей білок, як передбачалося, є білком, секретируемим у вигляді слини, оскільки, як передбачалося з виведеної амінокислотної послідовності, цей білок є кислим білком з pI=3,8, 21 амінокислот на N-кінці є гідрофобними і демонструють подібну сигнального пептиду послідовність, а З-кінець не має прикріплюватися до мембрани району.

Ця виведена амінокислотна послідовність продемонстрована в SEQ ID NO:5. Послідовність основ ДНК-молекули, кодує аминокислотную послідовність, продемонстрована в SEQ ID NO:6.

3. Експресія SY-001 за допомогою рекомбінантної ДНК і його очищення

(1) Одержання SY-001 (22-269)

ДНК-фрагмент, що кодує амінокислотні залишки в положеннях 22-269 SY-001 (SEQ ID NO:5), ампліфікували за допомогою ПЛР. В якості матриці використовували кДНК слинної залози, представлену вище 1. Використаний праймер pAnSG-F7 (SEQ ID NO:13) мав сайжениях від 5'-кінця. Потім ДНК-фрагмент клонували в pENTR/D-TORO (Invitrogen) для конструювання плазміди pENTR-SY-001-екзон 1-4.

Згодом ДНК-фрагмент SY-001 (приблизно 760 п. о.), отриманий в результаті розщеплення плазміди pENTR-SY-001-екзон 1-4 з допомогою NcoI і NotI, вбудовували в сайт NcoI/NotI pET32-b(+) (Novagen) для конструювання плазміди pET32-SY-001-екзон 1-4.

Escherichia coliBL21 (DE3) трансформували цієї плазміди pET32-SY-001-екзон 1-4, та отриманий в результаті трансформант культивували з погойдуванням в 6 мл LB-середовища (LBA), містить 50 мкг/мл ампіциліну, протягом 15 годин при 37°С. Потім культуральне середовище додавали в 600 мл LBA, яку потім культивуванні з погойдуванням протягом 4 годин при 37°С. Згодом до культурального середовища додавали 6 мл 100 мМ IPTG, і середу додатково культивували з погойдуванням протягом 4 годин при 37°С. Отриману в результаті культуральне середовище центрифугували при 6000×g протягом 15 хвилин, і супернатант відкидали. Отриманий в результаті осад лизирували додаванням до нього 40 мл 6 М гуанідину гідрохлориду. Отриманий в результаті бактеріальний розчин центрифугували при 30000×g протягом 25 хвилин, і збирали супернатант. До нього додавали 1,8 мл нікель-NTA (QIAGEN), потім суміш перемішували протягом 15 годин при 4°С. �кель-NTA додавали розчин TBS (150 мм NaCl, 50 мМ Tris-HCl [pH 7,5]), що містить 6 М сечовину і 10 мМ імідазол. Отриману в результаті суміш центрифугували при 3000×g протягом 3 хвилин, і супернатант відкидали. Отриману в результаті нікель-NTA упаковували в колонку.

Білок SY-001-екзон 1-4 элюировали з колонки наступним чином. Тобто через колонку послідовно пропускали 2 мл TBS-розчинів, що містять 6 М сечовину і 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ або 200 мМ імідазолу, відповідно, і збирали відповідні фракції. Частина кожної фракції піддавали електрофорезу в 12% SDS-ПААГ і потім фарбували за допомогою барвника кумасси для визначення фракції, яка містить білок SY-001-екзон 1-4. Цю фракцію диализовали проти PBS протягом 48 годин. Кількість білка визначали з використанням набору BSA Protein Assay Kit (PIERCE), і вихід становив 5 мг.

Амінокислотна послідовність рекомбінантного білка, отриманого таким способом, показана в SEQ ID NO:7. Амінокислотна послідовність у положеннях 1-162 і амінокислотна послідовність у положеннях 410-420 є амінокислотними послідовностями, що відбуваються з білка тиоредоксина і плазміди pET32-b(+), містить послідовність His-маркера, відповідно. Амінокислотна послідовність SY-001 (22-269) цього изобр�мзс pET32-SY-001-екзон 1-4, приготовленої як описано вище в (1), проводили, використовуючи праймери pAnSG-F8 (SEQ ID NO:15) і pAnSG-R1 (SEQ ID NO:14). Отриманий в результаті ДНК-фрагмент (382 п. о.) клонували в pENTR/D-TORO (Invitrogen) для конструювання плазміди pENTR-SY-001-екзон 3-4. Плазміду pENTR-SY-001-екзон 3-4 розщеплювали з допомогою NcoI/NotI з отриманням ДНК-фрагмента розміром 372 п. о. Цей фрагмент вбудовували в сайти NcoI/NotI pET32-b(+) (Novagen) для конструювання плазміди pET32-SY-001-екзон 3-4.

Escherichia coliBL21 (DE3) трансформували цієї плазміди pET32-SY-001-екзон 3-4, і отриманий в результаті трансформант культивували з погойдуванням в 6 мл LB-середовища (LBA), містить 50 мкг/мл ампіциліну, протягом 15 годин при 37°С. Потім культуральне середовище додавали в 600 мл LBA, яку потім культивуванні з погойдуванням протягом 4 годин при 37°С. Згодом до культурального середовища додавали 6 мл 100 мМ IPTG, і середу додатково культивували з погойдуванням протягом 4 годин при 37°С. Отриману в результаті культуральне середовище центрифугували при 6000×g протягом 15 хвилин, і супернатант відкидали. Отриманий в результаті осад лизирували додаванням до нього 40 мл 6 М гуанідину гідрохлориду. Отриманий в результаті бактеріальний розчин центрифугували при 30000×g протягом 25 хвилин, і збирали суперн�ировали при 3000×g протягом 3 хвилин, супернатант відкидали і збирали нікель-NTA. До зібраної нікель-NTA додавали розчин TBS (150 мм NaCl, 50 мМ Tris-HCl [pH 7,5]), що містить 6 М сечовину і 10 мМ імідазол. Отриману в результаті суміш центрифугували при 3000×g протягом 3 хвилин, і супернатант відкидали. Отриману в результаті нікель-NTA упаковували в колонку.

Білок SY-001-екзон 3-4 элюировали з колонки наступним чином. Тобто через колонку послідовно пропускали 2 мл TBS-розчинів, що містять 6 М сечовину і 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ або 200 мМ імідазолу, відповідно, і збирали відповідні фракції. Частина кожної фракції піддавали електрофорезу в 12% SDS-ПААГ і потім фарбували за допомогою барвника кумасси для визначення фракції, яка містить білок SY-001-екзон 3-4. Цю фракцію диализовали проти PBS протягом 48 годин. Кількість білка визначали з використанням набору BSA Protein Assay Kit (PIERCE), і вихід становив 1,8 мг.

Амінокислотна послідовність рекомбінантного білка, отриманого таким способом, показана в SEQ ID NO:8, і ця послідовність містить 293 амінокислотних залишку. У цій амінокислотної послідовності амінокислотна послідовність у положеннях 1-160 і амінокислотна послідовність у положеннях 283-293 є аминокислотнить His-маркера, відповідно. Амінокислотна послідовність SY-001 (148-269) знаходиться в положеннях 161-282.

Приклад 2

Отримання рекомбінантного SY-001 (21-269) з використанням бакуловирусной экспрессирующей системи

(1) Одержання SY-001 (21-269) бакуловируса

ДНК-фрагмент, що кодує поліпептид в положеннях 21-269 SY-001 (SEQ ID NO:1), ампліфікували за допомогою ПЛР, використовуючи в якості матриці кДНК слинної залози, представлену вище в прикладі 1, 1. Використаний праймер pAnSG-F10 (SEQ ID NO:16) мав сайт для BamHI (GGATCC) у 5-10 положеннях від 5'-кінця і FLAG-послідовність у 12-41 положеннях. Використаний праймер pAnSG-R1 (SEQ ID NO:14) мав сайт для NotI (GCGGCCGC) у 2-9 положеннях від 5'-кінця. ДНК-фрагмент клонували в pENTR/D-TORO (Invitrogen) для конструювання плазміди pENTR-SY-001-екзон 1-4.

Згодом ДНК-фрагмент SY-001 (780 п. о.), отриманий в результаті розщеплення плазміди pENTR-SY-001-екзон 1-4 з допомогою BamHI/NotI, вбудовували в сайти BamHI/NotI pBACgus-1 (Novagen) для конструювання векторної плазміди для перенесення бакуловируса pBACgus-SY-001-екзон 1-4.

Рекомбінантний бакуловирус отримували з використанням набору для отримання рекомбінантного бакуловируса (BacVector-2000 Transfection Kit, Novagen) за допомогою котрасфекции клітин Sf9 з допомогою вищевказаної векторної плазміди для перенесення бкзон 1-4.

Тобто клітини Sf9 культивували при 1×107клітин на 150 мм-чашку Петрі і інфікували AcNPV-SY-001-екзон 1-4 з множинністю інфекції, що становить приблизно 5. Через 3-4 дні збирали приблизно 250 мл культурального супернатанту з 10-150 мм-чашок Петрі, і до нього додавали 1,5 мл нікель-NTA (QIAGEN), потім суміш перемішували протягом 15 годин при 4°С. Суміш центрифугували при 3000×g протягом 3 хвилин, супернатант відкидали. Збирали нікель-NTA, і до неї додавали 50 мл розчину TBS (150 мм NaCl, 50 мМ Tris-HCl [pH 7,5]), що містить 10 мМ імідазол. Отриману в результаті суміш центрифугували при 3000×g протягом 3 хвилин, і супернатант відкидали. Отриману в результаті нікель-NTA упаковували в колонку.

Білок SY-001-екзон 1-4 элюировали з колонки наступним чином. Тобто через колонку послідовно пропускали 2 мл TBS-розчинів, що містять 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ або 200 мМ імідазолу, відповідно, і збирали відповідні фракції. Частина кожної фракції піддавали електрофорезу в 12% SDS-ПААГ і потім фарбували за допомогою барвника кумасси для визначення фракції, яка містить білок SY-001-екзон 1-4. Цю фракцію диализовали проти PBS протягом 48 годин. Кількість білка визначали з використанням набору BSA Protein Assay Kit (PIERCE), і вихо�пособом, показана в SEQ ID NO:9. У цій послідовності послідовність у положеннях 1-10 являє собою FLAG-послідовність, амінокислотна послідовність у положеннях 11-259 є послідовністю SY-001 (21-269), і послідовність у положеннях 260-270 є послідовністю, що походить з pBACgus-1, що містить послідовність His-маркера.

Приклад 3

Інгібіторний ефект SY-001 щодо агрегації тромбоцитів оцінювали шляхом вимірювання агрегації тромбоцитів у багатій щодо тромбоцитів плазмі (PRP), використовуючи турбідиметричний тромбоагрегометр з пропусканням світла.

В загальних рисах спосіб являє собою наступне. Тобто спочатку брали зразок крові у здорової донора за допомогою шприца з антикоагулянтом, і багату щодо тромбоцитів плазму (PRP) готували з допомогою центрифугування цільної крові взятої. Приготовану PRP змішували і попередньо інкубували з розчином SY-001 [розчином PBS, в якому розчинений SY-001, має аминокислотную SEQ ID NO:7, приготований в прикладі 1, 3-(1)] або PBS в якості контролю, і згодом тромбоцити агрегировали при додаванні агрегирующего тромбоцити агента. Як агрегирующего тромбоцити агента використовували АДФAlexis), TRAP (поставляється Sawaday Technology Co.), епінефрин (поставляється Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.), арахідонову кислоту (поставляється Sigma), U-46619 (поставляється Cayman) або А23187 (поставляється Sigma), відповідно.

Потім, використовуючи турбідиметричний тромбоагрегометр з пропусканням світла (MCM HEMA TRACER 313M, що поставляється MC Medical), вимірювали швидкість агрегації тромбоцитів протягом 5 хвилин, і максимальну швидкість агрегації отримували при вимірюванні протягом 5 хвилин. Швидкість інгібування з допомогою SY-001 агрегації тромбоцитів (%) розраховували у відповідності з наступною формулою.

Швидкість інгібування агрегації тромбоцитів (%)=(1-As/Ac)×100

As: максимальна швидкість агрегації тромбоцитів у PRP з SY-001

Ac: максимальна швидкість агрегації тромбоцитів в одній PRP в якості контролю

Подробиці вищевказаної процедури представлені в наступних пунктах (а)-(с).

(а) Спочатку 60 мл крові брали у здорового донора за допомогою шприца з 6 мл 3,8% натрію цитрату в якості антикоагулянта. Згодом кров центрифугували при 1100 об/хв протягом 10 хвилин, шар багатою щодо тромбоцитів плазми (PRP) у вигляді верхнього шару переносили в іншу тестовану пробірку. Залишається частина нижнього шару центрифугували при 3000 об�мбоцитов плазму, РРР) переносили в іншу тестовану пробірку. Суміш, в якій число тромбоцитів доведено до 3×108/мл, отримували змішуванням PRP і РРР, отриманих як зазначено вище, і використовували для подальшого вимірювання. На цю суміш робиться посилання у вигляді "PRP-зразок для вимірювання" в подальшому вимірюванні.

Для швидкості агрегації тромбоцитів тромбоагрегометра встановили, що пропускання світла в РРР становить 100% швидкості агрегації тромбоцитів, а пропускання світла в PRP становить 0% швидкості агрегації тромбоцитів.

(b) Визначення концентрації колагену і вимірювання інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів

Спочатку в тромбоагрегометр встановлювали кювету для агрегації, в яку було додано 200 мкл PRP-зразка для вимірювання, не містить SY-001, та інкубували протягом 2 хвилин при 37°С. Згодом до неї додавали 22,2 мкл розчину колагену (поставляється NYCOMED GmBH, Moriya Sangyo), і швидкість агрегації тромбоцитів постійно вимірювали протягом 5 хвилин при 37°С. За максимальну швидкість агрегації тромбоцитів брали найвищу швидкість агрегації тромбоцитів у межах 5 хвилин. Використовували концентрації розчину колагену, складові 5-20 мкг/мл, (кінцеві концентрації�алі 70% максимальної швидкості агрегації тромбоцитів.

(с) Потім в кожну кювету, в яку додано 200 мкл PRP-зразка для вимірювання, додавали (i) SY-001 (22-269) [має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:7, приготований в прикладі 1, 3-(1)], приготований в концентрації 30 нМ, 100 нМ і 300 нМ, відповідно, (ii) SY-001 (148-269) [має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:8, приготований в прикладі 1, 3-(2)], приготований в концентрації 100 нМ, 300 нМ і 1000 нМ, відповідно, або (iii) PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,5 мМ KH2HPO4в якості контролю. Кожну суміш встановлювали в тромбоагрегометр і інкубували протягом 2 хвилин при 37°С. Згодом до неї додавали 22,2 мкл розчину колагену у встановленій концентрації, визначеної вище, і швидкість агрегації тромбоцитів вимірювали протягом 5 хвилин від моменту додавання розчину колагену.

На фіг.1 демонструється результат інгібіторної активності SY-001 (22-269) щодо агрегації тромбоцитів, індуковану колагеном. На фіг.2 демонструється результат інгібіторної активності SY-001 (148-269) щодо агрегації тромбоцитів, індуковану колагеном.

На кожній з цих фігур горизонтальна вісь являє собою тимчасової курс (-0,5-5 хвилин), починаючи з 30 секунд до додавання кнстрирует результат у разі додавання SY-001 (22-269) в концентрації 300 нМ, крива (2) демонструє результат у разі додавання SY-001 (22-269) у концентрації 100 нМ, крива (3) демонструє результат у разі додавання SY-001 (22-269) в концентрації 30 нМ, і крива (4) демонструє результат контролю.

На фіг.2 крива (1) демонструє результат у разі додавання SY-001 (148-269) у концентрації 1000 нМ, крива (2) демонструє результат у разі додавання SY-001 (148-269) в концентрації 300 нМ, крива (3) демонструє результат у разі додавання SY-001 (148-269) у концентрації 100 нМ, і крива (4) демонструє результат контролю.

З результатів, представлених на цих фігурах, очевидно, що SY-001 цього винаходу, як показано, зменшує агрегацію тромбоцитів, індуковану колагеном, по мірі збільшення кількості доданого, тобто SY-001 має інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів.

Ті ж самі експерименти, що й вищезгадані, виконали з використанням рекомбінантного білка SY-001 (21-269), продукованого в бакуловирусной экспрессирующей системі в прикладі 2. В результаті були отримані по суті ті ж самі результати, що і результати, представлені на фіг.1. Отже, очевидно, що SY-001 цього винаходу має інгібіторною активністю в огации тромбоцитів отримували при зміні концентрацій SY-001 (21-269) від 3 нМ до 1000 нМ. Потім, використовуючи програмне забезпечення SAS (SAS Institute, Japan, версія 8.1) виконували аналіз - лог-логіт-перетворення інгібіторної активності щодо агрегації тромбоцитів (IC50) SY-001 (21-269). В результаті розраховано, що IC50SY-001 (21-269) становить 25 нМ.

На підставі вищевказаних результатів припустили, що эпитопная частина, присутня на С-кінцевій ділянці між положеннями 148-269 амінокислотної послідовності SY-001 SEQ ID NO:5, може вносити внесок у інгібіторну активність щодо агрегації тромбоцитів SY-001 цього винаходу.

Приклад 4

Синтез мутанта SY-001

SY-001 синтезують нижче за допомогою методу твердофазного синтезу з використанням Fmoc (9-флуоренилметилоксикарбонил)-методу.

Синтетичний поліпептид, що має необхідне число амінокислотних залишків з N-кінця до С-кінця амінокислотної послідовності SEQ ID NO:5, можна отримати здійсненням реакції в моделі безперервного потоку з використанням у якості активних реагентів TBTU [2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборат] і HOBt [1-гидроксибензотриазол гідрат].

Якщо необхідно, отриманий в результаті синтетичний поліпептид можна розчинити в диметилсульфоксиді і далі разб� в инъецируемой формі можна приготувати додаванням і змішуванням 100 мкг/мл SY-001 (має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:8), 0,01 мг/мл твіну-80 (полиоксиэтилен(20) сорбитан моноолеат; полісорбат 80), 15 мг/мл декстрану 40, 0,1 мг/мл цистеїну і 1 мг/мл HSA (сиворотного альбуміну людини) в 0,01 М буфері лимонна кислота - натрію цитрат (рН 6,0), фільтруванням суміші (використовуючи мембранний фільтр 0,22 мкм), потім розподілу стерильно фільтрату по 1 мл в ампулу і його лиофилизацией. Композицію можна використовувати шляхом розчинення в 1 мл використовуваного сольового розчину.

(2) Фармацевтичну композицію цього винаходу в инъецируемой формі можна приготувати додаванням 10 мкг/0,1 мл SY-001 (має аминокислотную послідовність SEQ ID NO:8), 5 мг цистеиновой кислоти і 1 мг HSA (сиворотного альбуміну людини) на ампулу в дистильовану воду для ін'єкції, фільтруванням отриманого в результаті розчину по 1 мл в одну ампулу і його лиофилизацией.

Ефект ААРР на адгезію тромбоцитів до колагену

Розчин SY-001 (50 мкл) у концентрації 3, 10, 30, 100, 300, 1000 або 3000 нМ додавали в лунки 96-лункового планшета, вкриті 40 мкг/мл колагену (NYCOMED GMBH) та інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації в кожну лунку додавали 50 мкл суспензії тромбоцитів (6×108клітин/мл) та інкубували протягом 45 хвилин при кімнатній ті�PBS. Згодом у кожну лунку додавали 20 мкл PBS, що містить 1% SDS, потім перемішували похитуємо і піддавали повітряному сушінні при 45°С. Потім у кожну лунку додавали 5 мкл дистильованої води, і концентрацію білка в лунці вимірювали з використанням набору для аналізу білка Dc (BIO-RAD).

Результати продемонстровано на фіг.3.

Як видно на фіг.3, визначено, що SY-001 цього винаходу інгібує адгезію тромбоцитів до колагену залежним від дози способом, і що SY-001 проявляє сильний інгібіторний ефект щодо адгезії тромбоцитів, особливо в дозах 300 мкг/мл або більше.

Здатність SY-001 зв'язуватися з колагеном

У кожну лунку 96-лункового планшета (NUNC, 152038), покритого колагеном, або 96-лункового планшета (NUNC, 260895), не покритого колагеном, додавали блокуючий розчин (300 мкл) і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. З кожної лунки видаляли розчин, і в кожну лунку додавали 100 мкл розчину білка SY-001 в концентрації 3, 10, 30, 100 або 300 нМ і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. З кожної лунки видаляли розчин, і в лунку додавали 200 мкл 2% сахарози і інкубували протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. З кожної лунки видаляли розчин, лунку висѻяемий KPL) і інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після промивання буфером для промивок в кожну лунку додавали 100 мкл субстрату для пероксидази ABTS і обережно перемішували погойдуванням. Після закінчення реакції додавали 100 мкл 1% SDS, і вимірювали абсорбцію при довжині хвилі 405-410 з використанням зчитувального пристрою Micro Plate Reader.

Результати продемонстровано на фіг.4. Трикутники представляють реакційну криву порожнього вектора в якості контролю. Як показано на фіг.4, визначено, що SY-001 має здатність зв'язуватися з колагеном.

Як зазначено вище, змогли визначити, що SY-001 цього винаходу має не тільки ингибиторним ефектом щодо агрегації тромбоцитів, але також інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів до колагену. Також змогли визначити, що SY-001 цього винаходу має здатність зв'язуватися з колагеном.

На підставі цих результатів фармацевтична композиція, що містить в якості активного компонента SY-001 цього винаходу, може бути фармацевтичної композицією, застосовної в якості терапевтичного агента і профілактичного агента для інфаркту міокарда, емболії судин легень, інфаркту головного мозку і т. п.

Інгібіторний щодо адгез� адгезію тромбоцитів до колагену.

Фіг.4: ААРР має здатність зв'язуватися з колагеном.

Список послідовностей, вільний текст

SEQ ID NO:10 представляє послідовність праймера для перегляду SP6, SEQ ID NO:11 представляє послідовність праймера для термінатора Т7, SEQ ID NO:12 представляє послідовність праймера pAnS-1, SEQ ID NO:13 представляє послідовність праймера pAnSG-F7, SEQ ID NO:14 представляє послідовність праймера pAnSG-R1, SEQ ID NO:15 представляє послідовність праймера pAnSG-F8, і SEQ ID NO:16 представляє послідовність праймера pAnSG-F10.

ПРОМИСЛОВА ПРИДАТНІСТЬ

У відповідності з цим винаходом можна забезпечити фармацевтичну композицію, що містить в якості активного компонента SY-001 або экспрессированний продукт цього винаходу. Вважають, що композиція цього винаходу застосовується в якості терапевтичного агента або профілактичного агента для патологічних станів після різних захворювань, наприклад, захворювань і ускладнень, спричинених тромбом або емболом, наприклад, гострого коронарного синдрому, інфаркту міокарда, емболії судин головного мозку, хронічної обструкції артерій, склерозу артерій, ішемічного інфаркту головного мозку, �рейковою недостатності, нефриту, ниркової недостатності і субарахноїдального крововиливу, в які втягуються SY-001 і полинуклеотид (ДНК-молекула), що кодує поліпептид SY-001.

Крім того, вважають, що композиція цього винаходу застосовується для профілактики утворення тромбів при ЧТКА і розміщенні стента і для запобігання рестеноза після розміщення стента шляхом включення SY-001 за допомогою нанесення SY-001 на стент або забивання SY-001 стент.

Використовуючи SY-001 і кодує SY-001 ДНК-молекулу, що забезпечуються цим винаходом, можна скринировать агоніст поліпептиду або продукту, экспрессированного за допомогою ДНК-молекули, (экспрессированного продукту цього винаходу), тобто скринировать речовина, що сприяє інгібіторної активності, властивою цим білків, щодо агрегації тромбоцитів і/або адгезії тромбоцитів, в якості речовини-кандидата.

1. Виділений поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів і складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 3.

2. Полинуклеотид, що кодує поліпептид, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцит�ательности SEQ ID NO: 4 або її комплементу.

3. Композиція, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, де композиція містить в якості активного компонента поліпептид з п. 1 та носії.

4. Композиція з п. 3, яка використовується для інгібування агрегації тромбоцитів.

5. Композиція з п. 3, яка використовується для інгібування адгезії тромбоцитів.

6. Композиція, що володіє інгібіторною активністю щодо агрегації тромбоцитів і/або інгібіторною активністю щодо адгезії тромбоцитів, де композиція містить в якості активного компонента поліпептид, який експресується полинуклеотидом, що складається з послідовності ДНК SEQ ID NO: 4, та носії.

7. Композиція з п. 6, яка використовується для інгібування агрегації тромбоцитів.

8. Композиція з п. 6, яка використовується для інгібування адгезії тромбоцитів.

9. Набір для скринінгу речовини, що інгібує агрегацію тромбоцитів, що містить компоненти (1)-(3):
(1) поліпептид з п. 1,
(2) клітинну культуральне середовище, що містить плазму, багату тромбоцитами та
(3) агент, що агрегує тромбоцити.

10. Набір для скринінгу речовини, що інгібує �s, і
(3) суспензію тромбоцитів.



 

Схожі патенти:
Винахід відноситься до медицини, а саме до стоматології, і може бути використане для діагностики карієсу зубів методом інфрачервоної спектроскопії. Для цього зразок слини пацієнта попередньо висушують, сухий залишок подрібнюють і суспензируют у вазеліновому маслі. ІЧ-спектроскопію проводять в області спектра 1200-800 см-1 і визначають висоту піків смуг поглинання з максимумами 1070, 1017, 960, 860 см-1. Потім обчислюють значення чотирьох співвідношень висоти піка з максимумом при 1070 см-1 до висоти піка з максимумом 1017 см-1, висоти піка з максимумом при 1070 см-1 до висоти піка з максимумом 960 см-1, висоти піка з максимумом при 1070 см-1 до висоти піка з максимумом 860 см-1, відношення висоти піка з максимумом при 1017 см-1 до висоти піка з максимумом 860 см-1. Карієс зубів діагностують при наступних значеннях співвідношень висот піків 1070/1017, рівних 11,64±0,14, висот піків 1070/960, рівних 1,08±0,12, висот піків 1070/860, рівних 6,40±0,41, і висот піків 1017/860, рівних 4,15±0,44. Винахід забезпечує інформативність діагностики і підвищує її точність. 3 пр.
Винахід описує спосіб інтраопераційної оцінки стану периферичних нервів шляхом виявлення позитивної активності ацетилхолінестерази. Спосіб полягає у виготовленні кріостатних зрізів нерва, промиванні їх у двох порціях малеатного буфера, інкубації в інкубаційному середовищі. Інкубацію проводять протягом 30-60 хвилин і інкубаційна середовище має наступний склад: ацетилхолін іодіда 10 мг; 0,1 М Na-малеатний буфер 2 мл; 0,1 М цитрат натрію 4 мл; 0,03 М сульфат міді 4 мл; 0,005 М феррицианид калію 4 мл; рН середовища становить від 7,4 до 7,6 і температура від 50 до 55°C. Спосіб за винаходом дозволяє в короткий час оцінити життєздатність периферичних нервів, що необхідно під час реконструктивно-відновних і високотехнологічних нейрохірургічних операцій. 2 пр.
Винахід відноситься до медицини, а саме до способу діагностики стафілококової алергії при алергічному риніті. Сутність способу полягає в тому, що з допомогою хемилюминесцентного аналізу досліджують функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів, розраховують індекс утворення активних форм кисню (ИОАФК), що представляє собою відношення площі під кривою люминолзависимой хемілюмінесценції нейтрофільних гранулоцитів, індукованої живий бактеріальною суспензією золотистого стафілокока, до часу виходу на максимум люминолзависимой хемілюмінесценції нейтрофільних гранулоцитів, індукованої живий бактеріальною суспензією золотистого стафілокока. При значенні ИОАФК більше 100 о. е./с діагностують сенсибілізацію до золотистого стафілококу у хворих алергічним ринітом. Використання заявленого способу дозволяє діагностувати стафілококову алергію при алергічному риніті до початку терапії та сприяє оптимальному вибору лікування хворих. 1 табл., 2 пр.

Спосіб визначення ймовірності збереження міокарда від інфарктного ушкодження у хворих з гострим коронарним синдромом

Винахід відноситься до кардіології і являє собою спосіб визначення ймовірності збереження міокарда від інфарктного пошкодження, для чого створюється «база даних» на основі дослідження на момент надходження 7 параметрів периферичної крові, 11 параметрів біохімічного аналізу крові та 6 параметрів стандартної 12-канальної електрокардіограми у 200 хворих з Q-інфарктом міокарда і 200 хворих, у яких розвиток інфаркту міокарда не відбувалося. Параметри стратифікують відповідно 7 інтервалів, в яких шляхом розрахунку відношення хворих, у яких не розвивається інфаркт міокарда, до усім хворим з гострим коронарним синдромом знаходять величини, пов'язані з ймовірністю збереження міокарда від інфарктного пошкодження. Розрахунок ймовірності у конкретного хворого здійснюють шляхом дослідження зазначених вище параметрів, пошуку в «базі даних» відповідних інтервалів і величин, пов'язаних з можливістю збереження міокарда. Підсумовуючи знайдені величини, розраховують інтегральний показник, який нормалізують, призводять до розмірності від 0 до 100%. Винахід дозволяє підвищити точність прогнозу збереження міокарда у хворих з гострим коронарним синдромом. 1 табл., 2 пр.

Тест-система для визначення активності інтерферону людини

Група винаходів відноситься до медицини, а саме до імунології, і може бути використана в лабораторній діагностиці як тест-система і спосіб визначення антивірусної активності інтерферону альфа (ІФН-α) в сироватці крові людини. Тест-система для визначення рівня активності ІФН-α у сироватці крові людини, що включає диплоїдні клітини, вируссодержащую рідину і стандартний інтерферон-α (ІФН-α) людини. Як диплоїдних клітин тест-система включає клітини охарактеризованной лінії диплоїдних клітин - фібробластів людини М-20 на рівні 20-33 пасажів, культивовані в середовищі з додаванням 10% фибринолитически активної плазми (ФАП). А в якості вірусу - адаптований до клітин лінії М-20 вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана, при цьому тест-система додатково включає вітальний барвник на основі двох флурохромів - тріпафлавіна і родаміну С. Група винаходів включає також спосіб визначення рівня активності ІФН-α у сироватці крові людини з використанням розробленої системи. Використання даних винаходів дозволяє кількісно, з хорошою відтворюваністю, визначити активність ІФН-α у зразках досліджуваної сироватки крові за допомогою люмиил., 1 табл., 4 пр.
Винахід відноситься до медицини і описує спосіб діагностики інфікованого панкреонекрозу з встановленням показань до оперативного втручання шляхом обстеження хворого, де газохроматографічної методом визначають у крові вміст оцтової, пропіонової, масляної та ізовалеріанової кислоти і при концентрації оцтової кислоти більше 0,11 ммоль/л встановлюють наявність інфікованого панкреонекрозу, а при концентрації будь-якої з трьох кислот: пропіонової більше 0,0095 ммоль/л, масляної більше 0,0035 ммоль/л, ізовалеріанової більше 0,0003 ммоль/л - встановлюють наявність інфікованого панкреонекрозу з активним розвитком анаеробної інфекції, що вимагає одного з варіантів оперативного втручання. Винахід дозволяє підвищити об'єктивність і точність діагностики переходу панкреонекрозу в стадію інфікування за рахунок використання кількісних параметрів без появи небажаних побічних ефектів. 2 пр.

Спосіб прогнозування ризику зниження швидкості клубочкової фільтрації після операції аортокоронарного шунтування на працюючому серці

Винахід відноситься до медицини, а саме до способу прогнозування ймовірності зниження швидкості клубочкової фільтрації (СКФ) через 3 місяці спостереження після аортокоронарного шунтування без штучного кровообігу (АКШ без ІК). Сутність способу полягає в тому, що визначають концентрацію молекули ниркового пошкодження типу 1 (КІМ-1) в сироватці крові, розраховують відношення концентрацій биомаркера KIM-1 у двох часових точках через 48 годин і 7 днів після операції і при його значенні більше 1,5 роблять висновок про ймовірність зниження СКФ у віддаленому періоді після АКШ без ІК. Використання заявленого способу дозволяє ефективно і точно спрогнозувати ймовірність зниження швидкості клубочкової фільтрації (СКФ) через 3 місяці спостереження після аортокоронарного шунтування без штучного кровообігу. 1 табл., 1 іл., 1 пр.
Винахід відноситься до медицини, а саме до лабораторних методів діагностики і може бути використане для діагностики загрози оцінки формування анемії на третьому триместрі вагітності внаслідок зниження процесів оксигенації гемоглобіну при загостренні цитомегаловірусної інфекції. Спосіб включає визначення титру антитіл до цитомегаловірусу, вмісту в еритроцитах 2,3 ДФГ (2,3-дифосфоглицерата), оксигемоглобіну. При збільшенні титру антитіл до цитомегаловірусу до 1:1600, наростанні 2,3 ДФГ до 6,7±0,3 мкмоль/мл, зміст HbO2 95,0±1,7%, при зниженні питомої оптичної щільності гемоглобіну до 0,70±0,01 роблять висновок про формування загрози розвитку анемії. Спосіб дозволяє вивчити характер порушення оксигенації гемоглобіну за допомогою визначення питомої оптичної щільності.
Винахід відноситься до медицини, а саме до неврології. Проводять нейровизуализационное дослідження головного мозку, визначають коефіцієнт коморбідності Cirs і коефіцієнт коморбідності Kaplan-Feinstein, виявляють кохлеовестибулярний синдром, окорухові розлади, тип цукрового діабету. Розраховують значення дискримінантної функції (D). При значенні D більше нуля діагностують наслідки ішемічного мозкового инстульта (НИМИ), перенесеного з гіпергомоцистеїнемією (РР), при D менше нуля - наслідки НИМИ, перенесеного без РР. Спосіб дозволяє підвищити достовірність діагностики наслідків НИМИ, що досягається за рахунок комплексного аналізу зазначених вище показників. 2 пр.
Винахід відноситься до галузі ветеринарії і призначене для неінвазивної експрес-діагностики запального процесу в кишечнику у телят. Спосіб включає визначення в калі лейкоцитів, білка, гемоглобіну та pH-реакції калу. Пробу калу розводять у дистильованій воді і наносять по краплі на відповідні тест-поля тест-смужки, призначеної для аналізу сечі. По зміні забарвлення протягом 1 хвилини вважають реакцію позитивною. При рн менше 7,0 або більше 7,5 і наявності в калі одночасно розчинного білка, гемоглобіну і лейкоцитів діагностують наявність запального процесу в кишечнику. Заявлений винахід дозволяє швидко і точно діагностувати запальний процес у кишечнику. 1 з.п. ф-ли, 2 ін.

Спосіб кількісного визначення флавоноїдів у жовчогінний збір № 3

Винахід відноситься до хіміко-фармацевтичної промисловості і може бути використане в контрольно-аналітичних лабораторіях при проведенні аналізу флавоноїдів в лікарській рослинній збір Жовчогінний збір №3». Спосіб заснований на кількісному визначенні суми флавоноїдів методом диференційної спектрофотометрії, в перерахунку на цинарозид, при довжині хвилі 400 нм, водно-спиртового витягу та використанням в якості екстрагента 70% етилового спирту, при цьому вміст суми флавоноїдів у перерахунку на цинарозид і абсолютно суху сировину у відсотках (X) обчислюють за формулою. Спосіб дозволяє оцінити вміст суми флавоноїдів як біологічно активних компонентів, що надають основна терапевтична дія - жовчогінний ефект. 3 пр., 14 іл., 2 табл.

Спосіб вилучення з водного розчину новокаїну

Винахід відноситься до аналітичної хімії та фармацевтики і може бути використане при аналізі залишкового вмісту новокаїну у водних середовищах. Спосіб вилучення новокаїну з водних розчинів включає приготування водно-сольового розчину новокаїну шляхом його розчинення у насиченому розчині висаливателя, екстракцію та аналіз рівноважної водної фази, при цьому в якості екстрагента застосовують розчин сольвотропного реагенту в хлороформі з концентрацією 10 мас.%, для чого готують водно-сольовий розчин новокаїну з pH 8,0±0,5 внаслідок застосування в якості висаливателя насиченого розчину сульфату амонію і додавання амонійного буферного розчину, екстрагують новокаїн протягом 5-7 хв розчином сольвотропного реагенту в хлороформі при співвідношенні обсягів водно-сольового розчину новокаїну і екстрагента 5:1, далі відокремлюють водно-сольову фазу від органічної і аналізують методом УФ-спектрофотометрії при довжині хвилі 291 нм, градуировочному графіком знаходять концентрацію новокаїну у водному розчині; розраховують коефіцієнт розподілу (D) і ступінь вилучення (R, %) новокаїну за формулами. Пропонований спосіб вилучення новокаїну з водного розчину, що характеризується ексі витяг новокаїну з водно-сольового розчину і може бути застосований при аналізі водних розчинів, містять новокаїн. 1 пр.

Спосіб визначення тіосульфату натрію у розчинах

Винахід відноситься до аналітичної хімії і може бути використано в системі контролю за вмістом тіосульфату натрію у розчинах. Спосіб визначення тіосульфату натрію у розчинах характеризується введенням аналізованої проби в реакційний посудину, що містить відповідну кількість фотогенерированного йоду, отриманого шляхом продування 1-2 хвилини повітрям і опромінення стабілізованим джерелом світла реакційної суміші, що складається з 0,5 М розчину йодиду калію, ацетатного буферного розчину з рн 5,6 і сенсибілізатора эозината натрію, фіксуванням зміни струму в комірки і по досягненні його сталості повторним продуванням реакційної суміші повітрям протягом 2-3 хвилин і повторним її опроміненням стабілізованим джерелом світла до досягнення початкового кількості йоду в посудині, фіксуванням часу генерації йоду, витраченого на заповнення його убутку, визначенням кількості тіосульфату натрію по градуировочному графіку по зміні сили струму і часу генерації. Винахід забезпечує спрощення способу визначення тіосульфату натрію у розчинах, а також відсутність дорогого обладнання. 10 табл., 5 іл.

Спосіб визначення ліпоєвої кислоти у біологічно активних добавках методом катодного вольтамперометрії

Винахід відноситься до медицини і описує спосіб визначення ліпоєвої кислоти у біологічно активних добавках методом катодного вольтамперометрії, що включає переклад речовини з проби в розчин і вольтамперометрического визначення, при цьому проводять катодну вольтамперометрию на ртутно-плівковому електроді при потенціалі -0.373 В відносно насиченого хлорид-срібного електрода на тлі боратного буферного розчину рн 9,18 при постійно струмового формі розгортки потенціалу зі швидкістю 0,06 В/с з областю визначених змістів ліпоєвої кислоти від 4.5·106 до 1.1·10-3 моль/л. Винахід забезпечує збільшення чутливості та експресності способу визначення ліпоєвої кислоти у таблетованій формі БАД методом катодного вольтамперометрії. 1 табл., 1 пр., 3 іл.

Спосіб визначення фунгіцидної активності хімічних препаратів

Винахід відноситься до галузі сільського господарства і може бути використане при визначенні фунгіцидної активності хімічних препаратів у відношенні грибів роду Fusarium - збудників хвороб рослин. Спосіб характеризується тим, що в агаровій пластинці, що знаходиться в чашці Петрі і засіяної одним з видів грибів роду Fusarium, нарізають круглі лунки діаметром 8 мм, вносять по 0,05 мл робочого розчину випробуваного препарату і поміщають в термостат при температурі 24,5-25,0°C, через 2-5 діб в залежності від виду гриба проводять вимірювання діаметру зони затримки росту міцелію гриба і розраховують активність препаратів за формулою , і вважають, що при А=1 фунгіцид неефективний - зона затримки росту не утворюється (D=d), при А=2-3 активність препарату низька, при А=4 середня і А≥5 висока. Винахід забезпечує точність визначення активності протруйників насіння і фунгіцидів, що застосовуються в сільськогосподарському виробництві. 1 табл.

Спосіб доклінічних досліджень кардиотропних антиаритмічних засобів

Винахід відноситься до експериментальної фармакології і являє собою спосіб доклінічних досліджень кардиотропних антиаритмічних засобів, що включає визначення біоелектричних параметрів ізольованих багатоклітинних перфузируемих препаратах та оцінку зміни тривалості потенціалів дії, який відрізняється тим, що в якості ізольованих багатоклітинних перфузируемих препаратів використовують міокард легеневих вен щури, причому зміни параметрів отримують у трьох режимах роботи багатоклітинних препаратів, додатково оцінюють потенціал спокою і змін ДПД 90%, відносини ДПД 50%/ДПД 90%, швидкості спонтанного зсуву потенціалу спокою, найбільш позитивного значення мембранного потенціалу в покоящемся препараті, частоти проходження пачок спонтанної активності, частоти та варіабельності проходження спонтанних ПД в пачці, кількості та інтенсивності постдеполяризаций, а також зміщення мембранного потенціалу, відповідного початку пачкового активності, оцінюють ознаки антиаритмічного або аритмогенної дії. Винахід забезпечує підвищення надійності прогнозування антиаритмічної дії потенційних фармакологічних се�

Спосіб визначення резистентності тромбоцитів до ацетилсаліцилової кислоти

Винахід відноситься до способу визначення резистентності тромбоцитів до ацетилсаліцилової кислоти (АСК) шляхом імпедансного дослідження агрегаційної функції тромбоцитів in vitro, при якому досліджують агрегаційну активність після інкубації зразка біологічного матеріалу з АСК з використанням індуктора агрегації, причому агрегацію тромбоцитів індукують колагеном в оптимальній концентрації 2 мг/мл і одночасно з вимірюванням імпедансу проводять визначення динаміки звільнення гранул тромбоцитів люмінесцентним методом, де перед проведенням агрегації проби калібруються за допомогою стандарту аденозинтрифосфату (АТФ), за отриманими агрегатограммам визначають значення амплітуди агрегації в Омах і привласнюють отриманих значень бали: значення ≤6 відповідають 0 балів, значення 7-9 відповідають 1 балу, значення 10-12 відповідають 2 балам, значення >12 відповідають 3 балами; потім визначають інтенсивність вивільнення АТФ з гранул тромбоцитів в нмолях і привласнюють отриманих значень бали: значення <0,5 відповідають 0 балів, значення 0,5-1,0 відповідають 1 балу, значення 1,0-1,5 відповідають 2 балам, значення >1,5 відповідають 3 балам, і далі розраховують индек�нтности тромбоцитів. Винахід забезпечує проведення швидкого комплексної діагностики резистентності тромбоцитів до АСК з оцінкою функціонального стану гранул тромбоцитів до початку лікування та можливість запобігання розвитку небажаних тромботичних або геморагічних ускладнень. 2 іл., 1 табл., 2 пр.

Спосіб спектрофотометрического кількісного визначення у листі кропиви дводомної при сумісній присутності хлорофілу, каротиноїдів та гідроксикоричних кислот

Винахід відноситься до медицини, а саме до дослідження та аналізу медичних препаратів, і може бути використане при стандартизації лікарської рослинної сировини. Спосіб ідентифікації і кількісного визначення хлорофілу, каротиноїдів та гідроксикоричних кислот при сумісній присутності у листі кропиви дводомної включає дробову екстракцію протягом години 30 хв кожна подрібненої сировини з розміром частинок 1,0 мм на водяній бані при температурі 100°C 70% етанолом у співвідношенні сировина:екстрагент 1:100, об'єднання витягів та доведення використовуваним розчинником до 100 мл, з подальшим розведенням отриманого розчину в співвідношенні 2:25 96% етанолом, вимір оптичної щільності розчину відносно 96% етанолу в максимумах поглинання 328±1 нм, 442±1 нм і 667±1 нм, обчислення вмісту суми гідроксикоричних кислот в перерахунку на хлорогенову кислоту, каротиноїдів у перерахунку на віолоксантин і хлорофілу в відсотках в перерахунку на абсолютно суху масу сировини за формулами. Спосіб забезпечує доступність, простоту виконання, економічність та малу похибку визначення. 3 іл., 1 пр.

Спосіб визначення жиророзчинних вітамінів а, d2, е і в-каротину при сумісній присутності методом тонкошарової хроматографії

Винахід відноситься до способів стандартизації лікарських препаратів, біологічно активних добавок, преміксів, лікарської рослинної сировини, рослинних олій, олійних екстрактів, виробів харчової, хімічної та косметологічної галузей промисловості за змістом основних жиророзчинних вітамінів і може бути використане у фармацевтичній, хімічній, косметологічної та харчовій галузях промисловості для визначення справжності та ступеня чистоти жиророзчинних вітамінів A, D2, E і β-каротину при сумісній присутності в одно - та багатокомпонентних препаратах. Спосіб визначення жиророзчинних вітамінів A, D2, E і β-каротину при сумісній присутності включає виділення жиророзчинних вітамінів з субстанції екстракцією 96%-ним етанолом, відділення спиртового екстракту вітамінів з допомогою ділильної лійки, послідовне хроматографирование з використанням силикагелевих пластинок марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А на полімерній підкладці за участю двох елюентів з різною величиною пробігу, час насичення камери парами елюентів - 20 хв, час элюирования - 55 хв; висушування при температурі не менше 80°C пластин в термостаті протягом 3-5 хв, обробку пласти�клієнтів використані гексан:хлороформ (19:1) і гексан:хлороформ (3:1), а детектування хроматографічної зони β-каротину проводять до обробки пластини проявником при денному світлі. Спосіб забезпечує спрощення та прискорення процесу визначення жиророзчинних вітамінів. 10 іл., 3 пр.
Заявлений винахід відноситься до галузі контролю якості лікарських препаратів і являє собою спосіб визначення справжності та кількісного вмісту бензэтония хлориду в лікарських препаратах, що включає поділ компонентів препарату за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, де в якості елюентів використовують суміш ацетонітрилу, гідрофосфату тетрабутиламмония, двозаміщений фосфат калію і води, при вмісті гідрофосфату тетрабутиламмония в кількості 2,5 мМ, двозаміщений фосфат калію в кількості 5 мМ, при цьому розділення компонентів препарату проводять при довжині колонки 125 мм. Винахід забезпечує підвищення точності та скорочення часу аналізу, так як не вимагає спеціальної пробопідготовки. 9 пр.
Винахід відноситься до області гельминтологии і стосується способу збору запліднених яєць (in vitro) від збудника Fasciola hepatica за життя. Охарактеризований спосіб включає стадії: відбір з жовчних протоків печінки заражених фасциолами домашніх та/або диких тварин тільки живих статевозрілих F. hepatica. Приміщення їх в окремі пробірки з відфільтрованої і отцентрифугированной жовчю, розведеній ізотонічним розчином натрію хлориду 1:1. Експозицію пробірок при t=38-39°С, якщо F. hepatica від великої рогатої худоби, і при t=39-40°C, якщо F. hepatica від овець та/або кіз, в умовах термостата протягом 5 годин. Подальше відмивання яєць в ізотонічному розчині хлориду натрію. Представлене винахід дозволяє отримати до 100% запліднених яєц фасціол виду Fasciola hepatica і може бути використано для досліджень в умовах лабораторії та/або польових експериментів, при вирішенні фундаментальних і прикладних наукових завдань в області епізоотології, терапії та профілактики фасциолеза домашніх і диких тварин. 2 пр.
Up!