Спосіб отримання аргініну з використанням corynebacterium glutamicum атсс 21831 або corynebacterium glutamicum атсс 21493 в ферментаційної середовищі, що містить в якості джерела вуглецю жом маніока або насіння джекфрута

 

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Даний винахід відноситься до біотехнологічного способу отримання L-аргініну ферментацією. Варіанти здійснення включають відновлюючі цукри, отримані ферментативним гідролізом крохмалю з недорогих крохмаловмісних агропромислових відходів, таких як жом маніоки і порошку насіння джекфрута, кожне з яких широко поширене у країнах Азії та Африки. Економічність способу отримання аргініну з джерел нерафінованої цукру можна підвищити шляхом заміни дорогих синтетичних джерел вуглецю, таких як глюкоза або сахароза.

Зростаючий ринковий попит на амінокислоти сподвиг наукове співтовариство і промисловців на розробку нових, ефективних та економічно доцільних способів отримання амінокислот. Ця технологічна гонка сприяла виробництву амінокислот, головним чином, чотирма способами: екстракцією з білкових гідролізатів, хімічним синтезом, ферментативним гідролізом і ферментацією. З економічної точки зору ферментація є промислово виправданою і широко застосовується за винятком кількох випадків, коли не були досягнуті високі виходи продукції. Економічність цього процеѽого продукту та продуктивності процесу в цілому. Зростання ринкової вартості амінокислот, отриманих з допомогою дифтериеподобних бактерій, привів до значного розвитку в області біотехнології і технології виробництва та виділення цільового продукту. Це спричинило за собою необхідність докладання зусиль по підвищенню ефективності виробництва і зниженню витрат виробництва (Thomas Hermann, "Industrial production of amino acids by coryneform bacteria".Journal of Biotechnology104 155-172 (2003)). Отже, будь-який природний процес, який впливає на вихід L-аргініну, затребуваний для використання у промисловому виробництві.

L-аргінін є умовно незамінною амінокислотою зважаючи залежно від стадії розвитку і стану здоров'я індивідуума. Аргінін стимулює імунну систему за допомогою збільшення виходу Т-клітин, сприяє розширенню кровоносних судин, підтримання здоров'я м'язової системи, видалення аміаку з тіла і виробленню гормонів. Виробництво L-аргініну здійснюється трьома традиційними способами: (i) екстракцією з білкових гідролізатів; (ii) хімічним синтезом, та (iii) ферментативним гідролізом (Takishi Utagawa, "Production of Arginine by fermentation", " J. Nutr.134:2854S-2857S (2004)). Пізніше було виявлено, що L-аргінін можна отримати в невеликих кількостей�ті штами виробляють ще більшу кількість вуглеводів (патент Великобританії № 1278917).

Серед регуляторних мутантів різних мікроорганізмівCotymbacterium glutamicumпоказав найбільш високу здатність виробництва L-аргініну (Hajime Yoshida, Kazumi Araki and Kiyoshi Nakayama, "Arginine Production by Arginine Analog-resistant Mutants of Microorganisms", Agric, Товарbiol. Chem., 45(4), 959-963 (1981)). Деякі з найбільш типових мутантів, що продукують аргінін, відносяться до видуCorynebacterium, стійкого до 2-тиазолаланину (патент США № 3723249 і патент США № 3878044) і канаванину (патент США № 3849250; Патент Великобританії № 1351518). Крім того, було виявлено, що мутанти видуBacillus(Патент США № 3734829, патент США № 4086137 і патент США № 4430430) та Escherichia (патент США № 4430430, патент США № 6897048) також виробляють аргінін у значних кількостях.

Виробництво L-аргініну в значних кількостях допомогою мікробіологічної ферментації було вперше описано Kisumi et al,"Production of L-Arginine by Arginine Hydroxamate-Resistant of Mutants Bacillus subtilis", Appl. Microbiol. 22,987 (1971). Як відомо, кисневе харчування надає великий вплив на аеробний виробництво амінокислот мікроорганізмами (Takishi Utagawa, "Production of Arginine by fermentation", J. Nutr. 134:2854S-2857S (2004)). Зростання в анаеробних умовах часто призводить до утворення токсичних побічних продуктів, таких як оцтова кислота і етиловий спирт, які, в свою чергу,hin. J. Biotech.9 (1) 9-18 (1993)).

Жом маніоки (Manihot esculenta) використовується для виробництва L-(+)-молочної кислоти штамами Lactobacillus casei та Lactobacillus delbrueckii.(Rojan John P., K. MadhavanNampoothiri and Ashok Pandey, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 34, p 263-272 (2006); Rojan John P., K. MadhavanNampoothiri and Ashok Pandey, "Solid state fermentation for L-lactic acid production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckii," Process Biochemistry Vol 41, p 759-763 (2006).Він також використовується у виробництві гибберелловой кислоти (A. Tomasini I, C. Fajardo і J. Barrios-Gonza'lez, "Gibberellic acid production using different solid-state fermentation systems," Vol 13.p203-206 (1997)) і лимонної кислоти шляхом одночасного сахарообразования і ферментації (SSF) (Flavera Camargo Prado, Luciana Porto de Souza Vanderberghe and Carlos Ricardo Soccol "Relation between Citric Acid Production by Solid-State Fermentation from Cassava Bagasse and Respiration of Aspergillus niger LPB Semi-Pilot Scale," Brazilian archives of Biology and Technology, Vol.48, Special n.: pp. 29-36 (2005)).За недавнім повідомленням Ubaidet al.жом маніоки використовується для отримання гамма-ліноленової кислоти (Syed Ubaid et al., "Enrichment of γ-linolenic acid in the lipid extracted from Mucor zychae MTCC 5420", " Food Research International, Volume 42, issue 4, May 2009, Pages 449-453)).

Аналогічним чином, порошок насіння джекфрута використовується у виробництві фарбників

і у виробництві полигидроксибутирата

До деяких із недоліків існуючого процес�на, на відміну від глутамату, де штам дикого типуС. glutamicumздатний до виробництва у великих обсягах. Крім того, труднощі викликає отримання ауксотрофних мутантів, здатних до виробництва аргініну, і існує необхідність в генній інженерії для поліпшення придатних для виробництва аргініну штамів. Більш того, собівартість виробництва аргініну відносно висока у зв'язку з використанням чистої глюкози як єдиного джерела вуглецю. Таким чином, кращі недорогі альтернативи для підвищення кількості виходу продукції з використанням наявних штамів.

СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ

Подальший опис докладно характеризує і встановлює природу цього винаходу і те, яким чином воно повинно бути виконано. “Мікробіологічний синтез L-аргініну з використанням виробничого середовища, що містить гідролізати субстратів крохмаловмісних сільськогосподарських відходів, наприклад порошок насіння джекфрута або жом маніоки, в якості основного джерела вуглецю, які раніше не були випробувані для виробництва таких амінокислот, як аргінін, з використаннямCorynebacterium glutamicum".

Характерним варіантом здійснення цього изобр�х цукрів для вирощування штамівCorynebacterium glutamicum, здатних до виробництва амінокислот. Додатковим варіантом здійснення цього винаходу є розвиток біологічного процесу, придатного для виробництва L-аргініну з використанням гідролізатів агропромислових відходів в якості основного джерела вуглецю і ферментації джерела вуглецю у присутностіCorynebacterium glutamicum. Ще одним додатковим варіантом здійснення цього винаходу є очищення аргініну від ферментованої рідини після ферментації.

Згідно з характерним варіантом здійснення цього винаходу передбачений спосіб отримання аргініну за допомогою ферментації агропромислових відходів, що складається з: ферментації агропромислових відходів в присутності щонайменше одного з штамівCorynebacterium glutamicumATCC 21831 абоCorynebacterium glutamicumATCC 21493 до отримання ферментованої рідини, що містить аргінін; і виділення аргініну з ферментованої рідини.

Згідно з іншим характерним варіантом здійснення цього винаходу, запропоновано спосіб одержання L-аргініну з крохмаловмісних агропромислових відходів, обираних з жому маніока, порошку насіння джекфрута і їх 85%, переважно від 60% до 75% і більш переважно від 65 до 68% субстрату агропромислових відходів переробляється в відновлюють цукру; ферментацію відновлюючих цукрів (переважно, в якості єдиного джерела вуглецю) в присутності щонайменше одного зCorynebacterium glutamicumATCC 21831 абоCorynebacterium glutamicumATCC 21493 до отримання ферментованої рідини, що містить аргінін; і виділення аргініну з ферментованої рідини.

Ці та інші характерні особливості і переваги цього винаходу стануть очевидними з нижченаведеного докладного опису.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС

Далі викладені наступні визначення і загальні положення, що не мають обмежувального характеру, які повинні бути розглянуті при аналізі викладеного опису цього винаходу. Використовувані в цьому документі заголовки (такі як «Рівень техніки» та «Суть винаходу») і підзаголовки (наприклад, «Композиції», «Способи») призначені тільки для загальної організації тим в рамках розкриття сутності винаходу і не призначені для обмеження розкриття сутності винаходу чи будь-якого його об'єкта. Зокрема, зміст, розкриту в розділі «Рівень техЕтний рівень техніки. Зміст, викладене в розділі «Суть винаходу», не є вичерпним або повністю розкриває весь обсяг винаходу чи будь-якого варіанта здійснення. Класифікація або пояснення матеріалу в рамках розділу опису винаходу з метою конкретизації (наприклад, уточнення компонента як «активного речовини» або «носія») представлена для зручності, при цьому не слід вважати, що матеріал повинен обов'язково або виключно володіти функцією відповідно до вказаної тут класифікацією при використанні його в тій чи іншій композиції.

Посилання, наведені в цьому документі, не є визнанням їх посиланнями на вже відомий рівень техніки або того, що вони мають якесь відношення до патентоспроможності винаходу, розкритого в цьому документі. Будь-яке пояснення змісту посилань, наведених у розділі «Вступ», призначене лише для загального ознайомлення з твердженнями авторів даних посилань і не встановлює точність змісту таких посилань.

Опис і конкретні приклади, що показують варіанти здійснення винаходу, передбачені лише з метою ілюстрації та не призначені для обмеження обсягу винаходу. Крім не передбачає виключення інших варіантів здійснення винаходу, мають додаткові відмітні ознаки, або інших варіантів здійснення винаходу, що включають різні комбінації зазначених відмінних ознак. Конкретні приклади наведені для ілюстрування того, як зробити і використовувати композиції і способи згідно з цим винаходом, і, якщо не обумовлено особливо, не передбачається, що вони несуть в собі твердження або заперечення того, що запропоновані варіанти здійснення цього винаходу були зроблені або апробовані.

Використовувані тут слова «найкращий» і «бажано», відносяться до варіантів здійснення винаходу, які при певних умовах надають певні переваги. Однак інші варіанти здійснення винаходу також можуть бути кращими за аналогічнихабо інших умовах. Крім того, перерахування одного або більше кращих варіантів здійснення винаходу не означає, що інші варіанти здійснення непридатні і не передбачає виключення інших варіантів здійснення з обсягу винаходу. Разом з тим, композиції і способи можуть містити, складатися по суті з або складатися з описаних у ній елементів.

Диаключения значення, знаходиться в межах діапазону. Будь-яке значення в межах діапазону може бути обрано в якості кінцевого діапазону. Крім того, всі наведені посилання, включені в цей документ у всій повноті допомогою посилання. У разі протиріччя у визначенні, поданому в цьому описі винаходу, і зміст наведеної посилання, слід керуватися цим описом.

Якщо не вказано інше, всі процентні змісту і кількості речовини, виражені тут і в будь-якому іншому місці цього опису, слід відносити до відсотків, обчислюється від ваги. Дані кількості речовини засновані на активному вазі речовини. Перераховані конкретні значення, що відносяться до відповідної кількості компонентів або інших ознак різних варіантів здійснення винаходу, надані для позначення цього значення плюс-мінус ступінь мінливості для обліку помилок у вимірах. Наприклад, величина в 10% може включати 9,5% або 10,5% з урахуванням ступеня похибки у вимірюваннях, які будуть оцінені і зрозумілі фахівця в даній області.

Вираз «Агропромислові відходи» означає будь-які відходи, отримані в результаті переробки сільськогосподарської продукції�rial Research, (2003); Carcia-Reyes Refugio, et al., "Contribution of agro-waste material main components (hemicelluloses, and lignin) to the removal of chromium (III) from aqueous solution," J. of Chem. Tech. & Biotech., Vol. 84, № 10, 1522-1538 (Okt.10, 2009). У КРАЩИХ ВАРІАНТАХ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ, АГРОПРОМИСЛОВІ ВІДХОДИ МІСТЯТЬ ЖОМ, ЦЕЛЮЛОЗУ, ЛІГНІН, ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗУ, ПОРОШОК НАСІННЯ, ЖОМ МАНІОКИ АБО ПОРОШОК НАСІННЯ ДЖЕКФРУТА.

Даний винахід включає спосіб отримання аргініну за допомогою ферментації агропромислових відходів, що складається з: ферментації агропромислових відходів в присутності щонайменше одного з Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 або Corynebacterium glutamicum ATCC 21493, переважно при температурі в межах від 20°C до 50°С і значенні рн у межах від 5 до 8, на період часу від 12 годин до 2 тижнів до отримання ферментованої рідини, що містить аргінін; і виділення аргініну з ферментованої рідини.

Відомо використання агропромислових відходів в якості основного джерела вуглецю для різних виробок мікробних метаболітів, таких як ферменти, органічних кислот, таких як молочна кислота, пігментів. Не маючи зв'язку з якою-небудь теорії, автори цього винаходу вважають, що біотехнологічні способи отримання амінокислот з такого дешево�обама хімічного отримання. Наприклад, авторами винаходу було обрано два субстрату, беручи до уваги високий вміст у них крохмалю і свідчення їх успішного застосування в різних биопроцессах - джекфрут і жом маніоки.

Джекфрут (Artocarpus heterophyllus) - один з найбільш популярних тропічних фруктів, що ростуть в Азії. Найбільший з усіх фруктів, які ростуть на деревах, джекфрут містить від 100 до 300 насінин в одному фрукті. Насіння складають близько 10-15% від загальної маси фрукта і володіють високим вмістом білків і вуглеводів (Kumar S., A. B. Singh, A. B. Abidi, R. G. Upadhyay, A. Singh., "Proximate composition of jackfruit seeds", " J. Food Sci Technol. 25.141-152 (1988)).

Насіння зазвичай викидають або випарюють і з'їдають як закуску або використовують у деяких місцевих стравах. Насіння сушать і товчуть для отримання порошку або борошна з насіння джекфрута. Цукру, отримані з борошна після гідролізу крохмалю, можуть ефективно використовуватися для ферментативного отримання органічних сполук. Крохмаль насіння джекфрута має вузьким діапазоном температур желатинізації і вимагає менше енерговитрат для желатинізації порівняно з модифікованими крохмалями, що, в кінцевому підсумку, знижує вартість гідролізу крохмалю. Фізико-хімічні властивості насіння джекфрута п�">Таблиця 1
Фізико-хімічний склад насіння джекфрутаПараметрВид Artocarpus heterophyllus Lam.Вологовміст2,78Зола6,72Неочищені білки20,19Неочищені жири11,39Сира клітковина7,10Вуглеводи51,82Джерело: Ibironke Adetolu Ajayi, “Comparative study of the chemical composition and mineral element content ofArtocarpus heterophyllusandTreculia africanaseeds and seed oils". Bioresource Technology, Vol 99(11),5125-5129 (2007).

Маніока (Manihot esculenta Cranz)- тропічний коренеплід, який є третім по значимості джерелом калорій в тропіках після рису і кукурудзи. Маніока займає четверте місце у світі серед основних продовольчих культур і споживається більш ніж 800 мільйонами чоловік (Elkholy H, Eltantawy A, "The world of cassava production: an overview". Journal of Root Crops, 26: 1-5 (2000)). Промислова обробка бульб маніоки осущесчения борошна утворюються тверді відходи, у той час як при отриманні крохмалю утворюється більше рідких відходів). Тверді відходи включають коричневу шкірку, внутрішню сторону шкірки, непридатні коріння, жом і борошняні відходи, серед яких основний обсяг становить жом. Після обробки близько 250-300 т. свіжих бульб утворюється близько 280 т вологого жому маніоки. Жом маніоки утворений волокнистим матеріалом коренів і містить крохмаль, який не міг бути виділений в ході фізичного способу обробки. Погані умови обробки можуть призвести ще до більш високого вмісту крохмалю в жомі маніоки. Фізико-хімічний склад жому маніоки показаний нижче в Таблиці 2.

Таблиця 2
Фізико-хімічний склад жому маніоки
СкладSoccol (1994)Cereda (1994)Sterz (1997)Vandenberghe (1998)
Вологовміст5,029,5210,7011,20
Білки1,57">Жири1,060,830,530,54
Клітковина50,5514,8822,2021,10
Зола1,100,661,501,44
Вуглеводи40,5063,8563,4063,00

Джерело: Pandey A., Soccol C. R., Nigam P., Soccol V T, Vandenberghe LPS, Mohan R, "Biotechnology potential of agro-industrial residues, II: cassava bagasse", Bioresourse Technology 74:81-87 (2000).

Аргінін, переважно L-аргінін, може бути отриманий шляхом ферментації агропромислових відходів, таких як описано вище, окремо або в комбінації, у присутності мікроорганізмів для виробництва суміші, що містить аргінін, а потім, необаятельно, відділенням аргініну з суміші. Відповідні мікроорганізми включають варіанти, вибору�mentum ATCC 21801, Brevibacterium lactofermentum ATCC 21086, Brevibacterium flavum ATCC 21475, Brevibacterium flavum ATCC 21127, Brevibacterium flavum ATCC 21128, Brevibacterium flavum ATCC 21.129, Brevibacterium flavum ATCC 21.474, Brevibacterium flavum ATCC 21493, Brevibacterium flavum ATCC 21406, Brevibacterium flavum ATCC 21605, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19355, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21.476, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21407, Corynebacterium glutamicum ATCC 21831, Corynebacterium glutamicum ATCC 13286, Corynebacterium glutamicum ATCC 21659, Corynebacterium glutamicum ATCC 21339, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491, або їх суміші.

Домінуючими мікроорганізмами, що використовуються у цьому винаході, є мутантні штами Corynebacterium glutamicum,особливо мутантні штами, стійкі до аналогів аргініну, позначені як Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 (Патент США № 3849250, який включений в цьому описі у всій повноті допомогою посилання) та Corynebacterium glutamicum ATCC 21493(Brevibacterium flavum ATCC 21493) (Патент США № 5196326, включений у цьому описі у всій повноті допомогою посилання) з Американської колекції типових культур. Переважно, культури містяться в LBG середовищі (Бульйон Луриа-Бертрани, доповнений глюкозою) і пересеиваются кожні два тижні.

У цьому винаході переважно, що культуральної середовищем є природне середовище, що містить переважний кількість джерел вуглецю, джерел азоту, неорганічних солей і небольшильние джерела вуглецю в цьому винаході включають глюкозу або гідролізати крохмалю будь-якого крохмалевмісної матеріалу, переважно жому маніоки або порошку насіння джекфрута, отримані їх ферментативним гідролізом з використанням відповідних осахаривающих крохмаль ферментів. Ферменти, осахаривающие крохмаль, відомі з рівня техніки. Відповідні осахаривающие крохмаль ферменти включають ті, які описані, наприклад, в Sasaki, et al., "Screening of Microorganisms for Raw Starch Saccharifying Enzyme Production", Agric. Товарbiol. Chem., 50(6), 1661-1664 (1986), Achi, et al., "Production of raw starch, saccharifying amylase by Bacillus alvei grown on different agricultural substrates," World J Microbiol. And Biotech., 8,206-207 (1991). Такі ферменти включають, наприклад, амілазу, глюкоамилазу, пуллуланазу,Corticium rolfsiiAHU 9627, і подібні. Процес гідролізу може бути оптимізовано для кожного субстрату з допомогою методів, відомих в даній області техніки, поряд з описаними тут методичними рекомендаціями. У кращому варіанті здійснення винаходу ферментація гідролізатів крохмалю жому маніоки і/або порошку насіння джекфрута забезпечує більший вихід, порівняно з ферментацією чистих цукрів, таких як декстроза, при використанні тих же мікроорганізмів.

В якості джерел азоту можуть бути використані неорганічні солі азоту, такі як хлорид амонію та інші традиційні органічні джерела азоту, т�и неорганічні солі, такі як моногидрофосфат калію, дигидрофосат калію, сульфат магнію, сульфат заліза, сульфат марганцю, карбонат кальцію, і т. д. Невелика кількість таких речовин, як біотин і тіамін, також може бути додано в середу у всіх випадках, коли це потрібно для видів штамів, що використовуються у цьому винаході.

Культивування переважно здійснюють в аеробних умовах, створених перемішуванням або струшуванням. Наприклад, культивування клітин у лабораторних умовах може здійснюватися аеробно в занурених у воду 250 мл колбах Эрленмейера в ротаційному шейкері з відповідним перемішуванням. Фахівці в даній області здатні масштабувати даний процес для отримання аргініну в комерційних масштабах. Температура інкубації може бути в межах від 20°C до 50°C, переважно від 25°C до 40°C, ще більш переважно від 27°C до 36°C, і найбільш переважно від 30°C до 32°C. Бажано, щоб значення рН ферментації знаходилося в межах від 4 до 9, переважно від 5 до 8, більш переважно від 5,5 до 7,5, ще більш переважно від 6 до 7, і найбільш бажано, щоб підтримувався нейтральний рівень рН. Незначна (1-5 одиниць) добавка бета-лактамнидлится протягом від 12 годин до 2 тижнів, переважно від 1 дня до 10 днів, і найбільш переважно від 2 до 6 днів для того, щоб накопичити достатню кількість аргініну в залежності від стану культури і початкового рівня вмісту цукру.

Після ферментації протеїн, що міститься в ферментованої рідини, може бути відокремлений, наприклад, видаленням мікробних клітин і будь-яких інших опадів з допомогою стандартних методів, таких як застосування іонообмінної смоли або осадження. Якісне визначення аргініну накопиченого в культуральній рідині (ферментованої рідини) може бути здійснено за допомогою тонкошарової хроматографії та кількісного ВЕРХ після дериватизации дансил-хлориду. Часткова очищення і відновлення аргініну можуть бути стандартизовані за допомогою сильнокислотної катіонообмінної смоли, такий як Amberlite.

Фахівцям в даній області техніки буде зрозуміло, що описаними тут способами можна також отримати інші амінокислоти, такі як, наприклад, глутамінова кислота та інші основні L-амінокислоти або кислі L-амінокислоти, такі як лізин.

Після опису цього винаходу в загальному сенсі більш глибоке розуміння може бути досягнуто шляхом розгляду т�НАЛЕЖНОГО ВИНАХОДУ

Приклад 1:

18-годинний інокулянт штамуCorynebacterium glutamicumATCC 831 інокулював в ферментаційне середовище в композиції, що містить гідролізат порошку насіння джекфрута, еквівалентного 6% декстрози, 0,05% K2HOP4, 0,05% KH2PO4, 3% (NH4)2SO4, 0,025% MgSO4·7H2O, 0,001% FeSO4·7H2O, 0,001% MnSO4·4 H2O, 0,5% Nz-аміна, 50 мкг/л біотину, 2 мг/л тіаміну, 500 мкл рідкого кукурудзяного екстракту і 2% CaCO3. Значення pH підтримували нейтральним. В результаті інкубації, проведеної в загальній складності 120 годин при 32°C при перемішуванні, кінцевий вміст аргініну становило 2,27 мг/мл Кількість аргініну, одержуваного протягом 120-годинного періоду, визначали з інтервалом в 24, 48, 72, 96 і 120 годин. Результати показано нижче в Таблиці 3:

Таблиця 3
Отримання аргініну культурою C. glutamicum ATCC 21831 в гідролізаті порошку насіння джекфрута
Час (год)24487296120
Концентрація аргініну (мг/мл)2,27

Приклад 2:

Для отримання посівної культури для ферментації мутантний штам Corynebacterium glutamicum (ATCC 21831), що продукує L-аргінін, культивували в середовищі, що містить 0,5% декстрозу, 0,5% хлориду натрію, 0,5% дріжджового екстракту, 0,5% пептона, 0,2% ферментативного гідролізату казеїну, при перемішуванні протягом 18 годин. Ферментаційне середовище (25 мл) розподіляли в 250 мл колбі Эрленмейера, засівали посівну культуру і інкубували при 32°c в ротаційному шейкері. Ферментаційна середовище містило гідролізат жому маніоки, еквівалентний 8% декстрозе, 0,05% K2HOP4, 0,05% KH2P04, 3% (NH4)2S04, 0,025% MgS04·7H20, 0,001% FeS04·7 H20, 0,001% MnS04·4H20, 0,5% Nz-аміна, 50 мкг/л біотину, 2 мг/л тіаміну, 500 мкл рідкого екстракту кукурудзи, 2% CaCO3.Значення pH підтримували нейтральним. В ході інкубації в ферментативну середовище додавали лактамні антибіотики. Через 48 годин інкубації вміст L-аргініну, накопиченого в ферментованої рідини, становила 1,63 мг/мл, що являло собою максимальну концентрацію L-аргініну. Кількість аргініну виробленого протягом 120-годинного періоду визначався з інтервалом в 24, 48, 72, 96 і 120 годин. Результати olspan="0">Таблиця 4
Отримання аргініну культуроюС. glutamicumATCC 21831 в гідролізаті жому маніокиЧас (год)24487296120Концентрація аргініну (мг/мл)0,871,631,101,101,41

Приклад 3:

Для виробництва L-аргініну за допомогою глибинної ферментації з використанням мутантного штамуCorynebacterium glutamicumзокрема, " Corynebacterium glutamicumATCC 21493, инокулят підготовляли при перемішуванні при 30°С протягом 18 год в середовищі, що складається з 0,5% розчину декстрози, 0,5% хлориду натрію, 0,5% дріжджового екстракту, 0,5% пептона, 0,2% ферментативного гідролізату казеїну. 5% від інокулята, отриманого таким чином, переносилося на 25 мл порції ферментаційної середовища. Вищевказана ферментаційна середовище являє собою водну природне середовище, що містить гідролізат порошку насіння джекфрута, еквівалентний 8% декстрозе, 0,05% K2HOP4, 0,05% KH2P04, 3% (NH4)2S04,�иамина, 500 мкл рідкого екстракту кукурудзи і 2% CaCO3.

Ферментацію проводили при 32°C протягом 96 годин. У початковій стадії інкубації додавали лактамні антибіотики. Після 96 годин інкубації в ферментованої рідини накопичувалося максимум 1,93 мг/мл аргініну. Кількість аргініну, виробленого за період 120 годин, визначали з інтервалом в 24, 48, 72, 72, 96 і 120 годин. Результати показано нижче в Таблиці 5:

Таблиця 5
Отримання аргініну культурою C. glutamicum ATCC 21493 в гідролізаті порошку насіння джекфрута
Час (год)24487296120
Концентрація аргініну (мг/мл)0,150,651,491,931,72

Приклад 4:

У нижченаведеній Таблиці 6 показано порівняння максимального виробництва L-аргініну, одержуваного ферментацією з культурою C. Glutamicum ATCC 21831 в різних виробничих середовищах відповідно до опрео виявили, що виробництво аргініну відрізнялося більш високими показниками у середовищі, заснованої на гідролізаті, порівняно зі стандартною середовищем, де в якості джерела вуглецю використовувалася чиста декстроза.

Таблиця 6
Виробництво L-аргініну штамом C. glutamicum ATCC 21831 в різних середовищах
СередаСтандартна, (чиста декстроза)Гідролізат жому маніокиГідролізат насіння джекфрута
Концентрація аргініну (мг/мл)0,451,632,27

Описані варіанти здійснення винаходу забезпечують унікальні переваги для виробництва аргініну, а також несподівано чудовий вихід аргініну з недорогих агропромислових відходів, порівняно з виходом з чистого джерела вуглецю, такого як декстроза. Перевагою є використання чи переробка агропромислових відходів, таких як жом маніоки або насіння джекфрута, які в іншому випадку залишилися б неиспользоения використання в цілях ферментації дорогих рафінованих цукрів, таких як декстроза. Ще однією перевагою є відносно більш високий вихід виробленого аргініну в середовищі на основі гідролізату у порівнянні з більш дорогою середовищем з декстрозою.

Описане вище винахід містить посилання на ілюстративні приклади, при цьому повинно бути зрозуміло, що винахід не обмежується цими варіантами його здійснення. Зміни та модифікації, які можуть бути вирішені фахівцями в даній області техніки після прочитання опису, також знаходяться в межах обсягу винаходу, який визначений в прикладеній формулі винаходу.

1. Спосіб отримання аргініну за допомогою ферментації агропромислових відходів, що включає:
ферментацію агропромислових відходів в присутності щонайменше одного з Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 або Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 в аеробних умовах при pH 5,5-7,5, при температурі 27-36°C протягом від 1 до 10 днів до отримання ферментованої рідини, що містить аргінін;
виділення аргініну з ферментованої рідини, де агропромисловими відходами є джерело вуглецю, одержаний шляхом гідролізу крохмаловмісних матеріалів з осахаривающим крохмаль ферментом, де крохмалевмісні матеріали �військові відходи включають в себе джерело вуглецю, обраний із групи, що складається з жому маніоки, порошку насіння джекфрута і їх суміші.

3. Спосіб за п. 1, де агропромислові відходи є джерелом вуглецю, отриманого шляхом гідролізу крохмаловмісних матеріалів з осахаривающим крохмаль ферментом.

4. Спосіб за п. 2, де джерело вуглецю проводиться гідролізом, щонайменше, одного з жому маніоки, порошку насіння джекфрута або їх суміші, з осахаривающим крохмаль ферментом.

5. Спосіб за п. 1, де ферментація являє собою аеробну ферментацію.

6. Спосіб за п. 1, де ферментація проводиться в діапазоні температур від 27°C до 36°C.

7. Спосіб за п. 6, де температура становить від 30°C до 32°C.

8. Спосіб за п. 1, де ферментацію проводять при значенні рн у межах від 5,5 до 7,5.

9. Спосіб за п. 8, де значення pH становить від 6 до 7.

10. Спосіб за п. 1, де ферментацію проводять за період часу від 1 дня до 10 днів.

11. Спосіб за п. 10, де період часу становить від 2 днів до 6 днів.

12. Спосіб за п. 1, додатково включає додавання лактамних антибіотиків в процесі ферментації.

13. Спосіб отримання L-аргініну з крохмаловмісних агропромислових відходів, вибраних з жому маніоки, порошку насіння джекфрута або їх суміші, включсахара;
ферментацію відновлюють цукрів в присутності щонайменше одного з штамів Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 або Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 в аеробних умовах при pH 5,5-7,5, при температурі 27-36°C протягом від 1 до 10 днів до отримання ферментованої рідини, що містить аргінін;
виділення аргініну з ферментованої рідини.

14. Спосіб за п. 13, де ферментативний гідроліз агропромислових відходів перетворює від 55 до 85% агропромислових відходів у відновлюють цукру.

15. Спосіб за п. 13, де ферментація проводиться при температурі в діапазоні від 27°C до 36°C.

16. Спосіб за п. 15, де температура становить від 30°C до 32°C.

17. Спосіб за п. 13, де ферментація проводиться при значенні рн у межах від 5,5 до 7,5.

18. Спосіб за п. 17, де значення pH становить від 6 до 7.

19. Спосіб за п. 13, де ферментація проводиться за період часу від 1 дня до 10 днів.

20. Спосіб за п. 13, додатково включає додавання лактамних антибіотиків під час процесу ферментації.



 

Схожі патенти:

Спосіб отримання l-аргініну з використанням бактерії родини enterobacteriaceae, що містить n-ацетилорнитиндеацетилазу з порушеною активністю

Винахід відноситься до біотехнології і являє собою спосіб отримання L-амінокислоти, такий як L-аргінін, ферментацією з використанням бактерії роду Escherichia, яка модифікована таким чином, що містить ген argJ, який кодує фермент, що має, щонайменше, орнитинацетилтрансферазную активність, і при цьому бактерія модифікована таким чином, що містить N-ацетилорнитиндеацетилазу з порушеною активністю. Винахід дозволяє отримувати L-аргінін з високим ступенем ефективності. 2 н. і 8 з.п. ф-ли, 2 іл., 4 табл., 7 пр.
Винахід відноситься до галузі біохімії

Бактерії роду escherichia - продуцент l-аргініну, в якій инактивировани один або кілька генів кластера artpiqm-artj, і спосіб отримання l-аргініну

Винахід відноситься до галузі біотехнології та мікробіологічної промисловості, зокрема до способу отримання L-аргініну з використанням бактерії роду Escherichia, яка модифікована таким чином, що у зазначеній бактерії инактивировани один або кілька генів, що входять до складу кластера artPIQM-artJ

Спосіб мікробіологічного отримання амінокислот сімейства аспартатов та/або глутаматов і використовувані в способі кошти

Винахід відноситься до способу мікробіологічного отримання амінокислот сімейства аспартатов та/або глутаматов за п.п.1-17 формули винаходу, генам піруваткарбоксилази за п.п.18-23 формули винаходу, генних структур п.24 формули винаходу, векторам за п.25 формули винаходу, трансформованим клітин за п.п.26-31 формули винаходу, а також до їх застосування за п.п.32-37 формули винаходу

Спосіб отримання l-аргініну, штам escherichia coli - продуцент l-аргініну

Винахід відноситься до біотехнології

Живі вакцини аттенуйовані

Винаходи належать до галузі біотехнології і стосуються способу запобігання або лікування захворювання у суб'єкта, зумовленого патогенним організмом шляхом введення вакцини композиції, вакцини композиції та її застосування. Охарактеризована вакцинна композиція містить бактерії, аттенуйовані мутацією в гені, що кодує АВС-пептидний транспортерні білок ОppD, які можуть персистувати в суб'єкті. Зазначена мутація робить кодований АВС-пептидний транспортерні білок нефункціональним. Представлені винаходу можуть бути застосовні в імунології для отримання і застосування вакцин. 3 м. і 16 з.п. ф-ли, 10 іл., 21 табл., 5 пр.

Lactobacillus johnsonii la1 nсс533 (cncm 1-1225) та імунні порушення

Винахід відноситься до композиції для лікування або запобігання порушень, пов'язаних із зниженим рівнем дефензинов. Композиція містить від 0,005 до 1000 мг Lactobacillus johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) на щоденну дозу. Причому при температурі 110-140 протягом 5-30 з щонайменше 90% L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) переведені в стан, при якому вони стають нереплицирующимися. Винахід забезпечує посилення експресії мРНК дефензина hBD1. 4 з.п. ф-ли, 2 іл.

Ферментаційна середовище та спосіб отримання рекомбінантних білків

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до ферментаційної середовищі і способу отримання рекомбінантних білків з використанням даного середовища. Ферментаційна середовище для отримання рекомбінантних білків, вибраних з групи, що включає Г-КСФ, стрептокиназу і ліпазу, з використанням мікроорганізмів, виділених з групи, що включає: E. Coli, Streptomyces sp. і Rhizomucor sp., характеризується підтримуваної концентрацією сечовини або її похідних в інтервалі від 0,5 г/л до 2 г/л. Середовище містить на літр води основні солі в наступних кількостях: ортофосфорну кислоту (85%) від 2,67 до 133,5 мл, сульфат кальцію від 0,093 до 4,65 м, сульфат калію від 1,82 до 91 м, сульфат магнію-7H2O від 1,49 до 74,5 г, гідроксид калію від 0,413 до 20,65 г, гліцерин від 4 до 200 р. Середовище містить на літр води мікроелементи в наступних кількостях: сульфат міді-5H2O від 0,6 до 30 м, йодид натрію від 0,008 до 0,4 г, сульфат марганцю-H2O від 0,3 до 15 м, модібдат натрію-H2O від 0,02 до 1 м, борна кислота від 0,002 до 0,1 г, хлорид кобальту від 0,05 до 2,5 г, хлорид цинку від 2 до 100 м, сульфат заліза двовалентного-7H2O від 6,5 до 325 м, біотин від 0,02 до 1 м, сірчану кислоту від 0,5 до 25 мл Винахід забезпечує підвищений вихід цільових продуктів. 2 н. і 4 з.п. ф-ли, 27 іл., 3 табл., 16 пр.

Штам бактерії bacillus subtilis - високоактивний продуцент пектолитических ферментів, мацерирующих рослинну тканину

Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості. Запропоновано штам бактерії Bacillus subtilis ВКПМ B-11964 - високоактивний продуцент пектолитических ферментів, мацерирующих рослинну тканину. Даний штам проявляє високі пектат-лиазную і пектин-лиазную активності по відношенню до пектинам з різних джерел. 2 табл., 5 пр.

Штам bacillus sp. для біологічної боротьби з saprolegnia sp. і його застосування

Група винаходів відноситься до галузі біотехнології і мікробіології. Запропоновано штам Bacillus sp. КССМ11143Р, володіє протигрибковою активністю щодо Saprolegnia sp., культуральна рідина, одержаний при культивуванні штаму, пробіотична композиція, кормова добавка, протигрибковий засіб і засіб для поліпшення якості води, що містять штам Bacillus sp. КССМ11143Р або його культуральну рідину. Також запропоновано спосіб культивування риби або ракоподібних, спосіб запобігання сапролегниоза у тварин і спосіб поліпшення якості води з використанням штаму Bacillus sp. КССМ11143Р або його культуральної рідини. Штам Bacillus sp. КССМ11143Р має високий рівень продуктивності сидерофоров з проявом високої здатності захоплення заліза, і таким чином інгібує ріст інших патогенних бактерій і Saprolegnia sp., сприяє збільшенню швидкості споживання їжі рибою і швидкості збільшення ваги, а також зниження рівня екскреції, що призводить до поліпшення якості води. 9 н. і 1 з.п. ф-ли, 4 іл., 11 табл., 15 пр.

Штам microbacterium species для очищення прісноводних водойм та їх донних відкладень від нафти і нафтопродуктів

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано штам Microbacterium species BKM Ac-2614D для очищення забруднених і хронічно забруднених прісноводних об'єктів в температурному діапазоні від +2ºC до +25ºC. Винахід дозволяє здійснювати очищення води і донних відкладень від нафтових вуглеводнів при низькій концентрації кисню у воді і в умовах високих широт. 3 табл., 2 пр.
Винахід відноситься до гідролізної промисловості, зокрема до способів очищення гідролізатів лігноцеллюлозного сировини від інгібіторів ацетонобутилового бродіння, і може бути використано при підготовці поживних середовищ для отримання біоетанолу, біобутанолу, ацетону. Спосіб включає обробку гідролізатів групою мікроорганізмів, причому в якості консорціуму мікроорганізмів використовується активний мул каналізаційних очисних споруд, попередньо адаптований до живильного субстрату на основі речовин, які інгібують ацетонобутиловое бродіння. Використовується активний мул міських каналізаційних очисних споруд, бактеріальна компонента якого представлена бактеріями родів Pseudomonas (64%), Bacillus (18%), Zooglea (7%), Micrococcus(5%), Chromobacterium (3%), Acinetobacter (2%), Citrobacter (1%). Також використовується активний мул каналізаційних очисних споруд свинарських підприємств, бактеріальна компонента якого представлена бактеріями родів Nocardia (35%), Rhodococcus (28%), Micrococcus (18%), Pseudomonas (13%), Bacillus (6%). Винахід дозволяє позбутися від інгібуючих факторів у процесі зброджування гідролізатів лігноцеллюлозного сировини, дозволяє уникнути корозії гідролізного обладнання, а також сприяє оптимиз

Штам бактерій pseudomonas aeruginosa для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней

Винахід відноситься до біотехнології та ветеринарії. Штам бактерій Pseudomonas aeruginosa №6-ДЕП депонований у колекції ФГБУ ВГНКИ. Штам має високу імуногенну активність і призначений для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней. При використанні вакцини на основі запропонованого штаму титр антитіл до соматичного антигену О6 Pseudomonas aeruginosa у сироватці крові кролів та свиней через 14 днів після останньої імунізації становить відповідно 1:819,2 і 1:1024. 3 табл., 4 пр.

Штам бактерій pseudomonas aeruginosa для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней

Винахід відноситься до біотехнології та ветеринарії. Штам Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП депонований у колекції ФГБУ ВГНКИ. Штам має високу імуногенну активність і призначений для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней. При використанні вакцини на основі запропонованого штаму титр антитіл до соматичного антигену О3 Pseudomonas aeruginosa у сироватці крові кролів та свиней через 14 днів після останньої імунізації становить відповідно 1:768 і 1:1024. 3 табл., 4 пр.

Штам бактерій pseudomonas aeruginosa для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней

Винахід відноситься до біотехнології та ветеринарії. Штам бактерій Pseudomonas aeruginosa №25-ДЕП депонований у колекції ФГБУ ВГНКИ. Штам має високу імуногенну активність і призначений для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней. При використанні вакцини на основі запропонованого штаму титр антитіл до соматичного антигену О19 Pseudomonas aeruginosa у сироватці крові кролів та свиней через 14 днів після останньої імунізації становить відповідно 1:512 і 1:716,8. 3 табл., 4 пр.
Up!