Фармацевтична композиція, що містить индольное з'єднання


 

Область техніки, до якої належить винахід

Даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить индольное з'єднання, для запобігання або лікування захворювань, пов'язаних з окислювальним стресом, дисфункцією мітохондрій, гипоксическим пошкодженням, некроз та/або ішемічним реперфузионним пошкодженням, і до косметичної композиції, що містить индольное з'єднання, має антиоксидантний ефект.

Рівень техніки

Організми, включаючи людське тіло, отримують енергію за допомогою процесу дихання, і приблизно 2% кисню, поглиненого в ході метаболізму, перетворюється в активні форми кисню (ROS), відомі як "кисневий токсин". Під активними формами кисню мається на увазі кисень, що містить вільний радикал (загальне найменування атомів або молекул з неспареним електроном), і зазвичай така форма включає ліпідний пероксид, ліпідний пероксидний радикал, пероксинитрил і так далі. Відомо, що такі активні форми кисню є нестабільними і, таким чином, вельми реакційно-здатними у відношенні речовин середовища, викликаючи окисні пошкодження ДНК, яка несе генетичну інформацію, а також білків і�іншого боку, робиться висновок, що в таких клітинах імунної системи, як макрофаги або нейтрофіли, продукування активних форм кисню відіграє корисну роль у знищенні патогенів, які проникають ззовні. На відміну від вищеописаного випадку і нещодавно підтвердженого випадку, в якому активні форми кисню відіграють важливу роль у сигнальної трансдукції всередині клітини, активні форми кисню, загалом, розглядаються як такі, що викликають пошкодження клітини і, таким чином, є згубними для організмів. Таким чином, щоб захистити клітини від кисневого токсину, самі клітини мають антиоксиданти (наприклад, вітамін C, вітамін E, малі пептиди, такі як глутатіон) та антиоксидантні ферменти (наприклад, каталаза, супероксиддисмутаза [SOD], глутатіон-залежна пероксидаза [GPX] і так далі).

Прикладами захворювань або метаболічних процесів, пов'язаних з активними формами кисню (ROS) або антиоксидантними ферментами, є наступні:

1. Інсулінозалежний діабет розвивається внаслідок пошкодження бета-клітин підшлункової залози, що обумовлено ненормальною експресією ROS.

2. Синдром Дауна, є в даний час об'єктом клінічного уваги, як відомо, визиватиоксидантний фермент (каталаза, глутатіон-залежна пероксидаза), визначений аналізом в клітці пацієнта, страждаючого прогеріею, показує низьку ферментативну активність.

4. Навіть у процесі перетворення нормальних клітин у ракові клітини ROS активно продукується в клітинах в ході введення деяких викликають рак речовин і опромінення.

5. Крім вищезазначеного, відомо, що ROS залучені в атеросклероз, хвороба Альцгеймера, ішемічну хворобу і так далі.

Деякі вільні радикали, активні форми кисню і пероксиди продукуються в ході метаболічних процесів навіть у нормальних клітинах. Однак клітини захищають себе від таких шкідливих речовин, використовуючи антиоксидантні ферменти, такі як SOD, каталаза, пероксидаза і так далі, в якості захисної системи поряд з антиоксидантами, такими як вітамін е, вітамін C, глутатіон, убіхінон, сечова кислота і так далі. Коли така захисна система має дефект або продукування активних форм кисню перевершує функціональну здатність захисної системи внаслідок різноманітних фізичних або хімічних факторів, що індукується, однак, окислювальний стрес. Якщо захворювання суб'єкта пов'язано з дисбалансом між окислювальним стресом і антиоксид�ейшее прогресування захворювання може бути придушене шляхом додавання антиоксидантної речовини. Таким чином, антиоксидантно-функціональні речовини, такі як поглиначі вільних радикалів, або речовини, які інгібують продукування пероксидів, широко застосовуються в даний час в полімерних, харчових, косметичних областях і так далі. Вони також можуть бути використані в якості інгібуючої або терапевтичного агента у разі старіння і різних захворювань, викликаних даними оксидами, що засноване на нещодавньому відкритті того, що активні форми кисню залучені до фізіологічні явища, пов'язані з різними захворюваннями. Поступово зростає інтерес до розробки терапевтичного агента з їх застосуванням, і агент в дійсності реалізується на ринку в якості харчової добавки в США з зростаючою популярністю.

Показано, що окислювальний стрес являє собою важливий причинний фактор індукції різноманітних захворювань, включаючи старіння. Відповідно, перспективи антиоксидантно-функціональних речовин, що володіють здатністю видаляти активні форми кисню, в якості агента для придушення старіння і для лікування захворювань сильно зростають. Таким чином, потрібно розробити нове антиоксидантно-функціональний речовина, кіт�ий.

Існує багато антиоксидантів, але більшість з них не доставляється ефективно в мітохондрії, і, таким чином, вони проявляють слабку або незначну ефективність. Тому доставка антиоксидантів в мітохондрії є дуже важливою при лікуванні вищезазначених захворювань. У разі з'єднання Mito Q було можливо використовувати його в якості терапевтичного агента, оскільки він утворений конъюгацией коензиму Q10 з пептидом, націленим на мітохондрії.

З іншого боку, повідомлялося, що такий окислювальний стрес є основним механізмом ішемічного реперфузионного пошкодження. Ішемічні хвороби припускають эктомию, трансплантацію органів, емболізацію, інфаркт міокарда, інсульт і так далі.

РОЗКРИТТЯ ВИНАХОДУ

Технічна проблема

Отже, завдання цього винаходу полягає в тому, щоб надати фармацевтичну композицію, що містить индольное з'єднання, підходяще для запобігання або лікування захворювань, пов'язаних з окислювальним стресом, дисфункцією мітохондрій, гипоксическим пошкодженням, некроз та/або ішемічним реперфузионним пошкодженням, і до косметичної композиції, що містить индольное соедиармацевтическую композицію для запобігання або лікування захворювань, пов'язаних з окислювальним стресом, що включає терапевтично ефективна кількість сполуки наступної формули (1), (2) або (3), його фармацевтично прийнятною солі або ізомеру в якості активного інгредієнта, і фармацевтично прийнятний носій.

Формула 1

У вищенаведеній формулі (1) кожен із заступників конкретно визначений у публікації міжнародної патентної заявки № WO 2009/025477 наступним чином:

У формулі (1):

na позначає число від 0 до 3,

Aaпредставляє 5-членний гетероарил або гетероцикл, кожен з яких має від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, O, S,

R1aє R5a-Xa-Ba-X'a-,

Baє прямий зв'язок або становить 3-10-членний гетероцикл або гетероарил, кожен з яких має від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з N, O, S,

Xaі X'aнезалежно один від одного представляють прямий зв'язок або обрані з групи, що складається з-NR6a-, -CO-, -CONR6a-, -CO2-, -OC(O)-, -S(O)ma-, -O-(CH2)ma-, -(CH2)ma-O-, -(CH2)ma-, -NR6aCO-, -(R6aO)2P(O)- і-NHCO2-, де ma позначає число від 0 до 3 і R6aє водень, алкіл �редставляет 3-10-членний моноциклический або конденсований циклічний гетероцикл або гетероарил, кожен з яких має від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, O і S, і необов'язково заміщений оксо або алкилом, або

R5aі R6aможуть утворювати разом 4-8-членний цикл,

R2aпредставляє -(CR8aR9a)pa-Ya-R7a,

pa позначає число від 0 до 2,

R8aі R9aнезалежно один від одного представляють водень або алкіл або можуть утворювати разом 4-8-членний цикл,

Yaє прямий зв'язок або обраний із групи, що складається з-O-, -S-, -NR6a-, -NR6aC(O)-, -CO2-, -C(O)-, -C(O)NR6a-, -S(O)qa- і-S(O)qaNR6a-, де qa позначає число від 0 до 2,

R7aє водень, галоген, ціано, гідрокси, нітро, алкіл, циклоалкіл або арил або становить 3-10-членний гетероцикл або гетероарил, кожен з яких має від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, S і O і який обов'язково містить оксо,

R3aє водень, алкіл, -(CH2)qa-циклоалкіл або -(CH2)qa-гетероцикл,

R4aпредставляє -(CH2)pa-Da-R10a-,

Daє прямий зв'язок, являє циклоалкіл, необов'язково містить оксо, являє арил або становить 3-10-членний гетероцикл або рік, галоген, аміно, ціано, нітро, гідрокси, алкіл, алкилкарбонил, алкилсульфонил або -(CH2)pa-NR8aR9a,

де алкіл, алкокси, арил, циклоалкіл, гетероцикл і гетероарил можуть бути необов'язково заміщені, і заступники представляють собою один або більше, вибрані з групи, що складається з гідрокси, галогену, нітрилу, аміно, алкиламино, диалкиламино, алкила, галогеналкила, алкилсульфонила, карбоксиалкила, алкилкарбонилокси, алкилтио, алкилоксикарбонила, алкиламинокарбонила, арилалкокси і оксо.

Формула 2

У вищенаведеній формулі (2) кожен із заступників конкретно визначений у публікації міжнародної патентної заявки № WO 2009/025478 наступним чином:

У формулі (2):

nb позначає число від 1 до 3,

mb позначає 0 або 1,

Abє прямий зв'язок, являє феніл або представляє 6-членний гетероарил, має від 1 до 2 атомів азоту,

Xbпредставляє C або N за умови, що mb становить 0, коли Xbявляє собою N, і mb становить 1, коли Xbявляє собою C,

R1bє водень, алкіл, -(CH2)rbNR7bR8bабо -(CH2)rbCO2H, де rb позначає число від утворювати разом необов'язково алкилзамещенную алкіленовую ланцюг, в якій необов'язково один метилен заміщений атомом N,

R2bє водень, галоген, ціано, нітро, гідрокси, алкіл, алкокси або триалкилсилил, представляє -(CH2)pbCO2R7b, -(CH2)pbOR7b, -(CH2)pbNR7bR8b, -NHR10b, -N(H)S(O)2R7b, -NHC(O)R10b, -(CH2)pbS(O)2R7bабо (CH2)pb-гетероцикл-R10b, де pb позначає число від 0 до 3, R7bі R8bє такими, як визначено вище, R10bє водень, оксо, алкилсульфонил, алкилкарбонил, алкилоксикарбонил, алкиламинокарбонил, алкокси, алкіл або гетероцикл,

R3bє водень, ціано, галоген, алкіл або феніл або становить -(CH2)nb-гетероцикл або -(CH2)nb-арил, де nb позначає число від 0 до 3,

R4bпредставляє-YbR11b, де Ybє прямий зв'язок або -(CR7bR8b)pbY'b- де pb позначає число від 0 до 3, R7bі R8bє такими, як визначено вище, Y'bобраний із групи, що складається з-O-, -S-, -NR12b-, -NR12bC(O)-, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NR12b-, -S(O)qb- і-S(O)qbNR12b-, де R12bє водень, алкіл, арна, гідрокси, тиол, карбокси, алкіл(CH2)tbBb-R13b, де tb позначає число від 0 до 3, Bbявляє гетероцикл, гетероарил або арил, R13bє водень, ціано, галоген, гідрокси, оксо, тиол, карбокси, карбоксиалкил, алкилкарбонилокси, алкіл, алкокси, алкилтио, алкилкарбонил або алкилсульфонил,

R5bє водень, алкіл, циклоалкіл, гетероцикл або гетероциклилалкил,

R6bпредставляє -(CR7bR8b)pb-Zb-Db-Wb-R14b, де Zbє прямий зв'язок або обраний із групи, що складається з-C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NR12b- і-S(O)yb-, yb позначає число 1 або 2, Dbє прямий зв'язок або представляє циклоалкіл, гетероарил або гетероцикл, Wbє прямий зв'язок або представляє-NR7b-, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NR12b-, -S(O)yb-, -S(O)ybNR12b- або-NR12bS(O)yb-, де R14bє водень, гідрокси, алкіл, алкокси, гетероцикл, гетероарил, арил або аралкил,

R5bі R6bразом представляють алкіленовую ланцюг,

де алкіл, алкокси, арил, циклоалкіл, гетероцикл і гетероарил можуть бути необов'язково заміщені, і заступники представляють собою один або боалкила, алкокси, карбоксиалкила, алкилкарбонилокси, алкилтио, алкилоксикарбонила, алкиламинокарбонила, арилалкокси і оксо.

Формула 3

У формулі (3):

Bcявляє арил або становить 4-8-членний гетероцикл або гетероарил, кожен з яких має від 1 до 2 гетероатомів, вибраних з N, O, S,

R7cє водень, галоген, гідрокси, нітрил, нітро чи алкокси,

R8cпредставляє C1-C6-алкіл, C3-C8-циклоалкіл, гетероциклил, арил, арилалкил, циклоалкіл-алкіл або гетероциклил-алкіл,

R9cє водень, галоген, гідрокси, нітрил, нітро, алкокси, аллилокси, алкиламино або ариламино,

де алкіл, алкокси, арил, циклоалкіл, гетероцикл і гетероарил можуть бути необов'язково заміщені, і заступники представляють собою один або більше, вибрані з групи, що складається з гідрокси, галогену, нітрилу, аміно, C1-C6-алкиламино, ді(C1-C6-алкіл)аміно, карбокси, C1-C6-алкила, галоген-C1-C6-алкила, C1-C6-алкокси, арил-C1-C6-алкокси і оксо.

У вищенаведених визначеннях сполук формул (1), (2) і (3) термін "алкіл" означає аліфатичний кут�кинильний фрагмент, або ненасичений алкіл, який включає щонайменше один алкенильний або алкинильний фрагмент. "Алкенів" означає групу, яка містить щонайменше один вуглець-вуглецевий подвійний зв'язок, "алкинил" означає групу, яка містить щонайменше один вуглець-вуглецевий потрійну зв'язок. Алкіл може бути розгалуженим або мати нормальну ланцюг, будучи використаним сам по собі або у складовій формі, такий як алкокси.

Алкильная група може мати від 1 до 20 атомів вуглецю, якщо інше не визначено. Алкильная група може представляти собою алкіл середнього розміру, що має від 1 до 10 атомів вуглецю. В іншому випадку, алкильная група може представляти собою нижчий алкіл, має від 1 до 6 атомів вуглецю. Її типові приклади включають, але не обмежуються ними: метил, етил, пропіл, ізопропіл, н-бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, гексил, этенил, пропеніл, бутенил і так далі. Наприклад, C1-C4-алкіл має від 1 до 4 атомів вуглецю в алкільного ланцюга і обраний із групи, що складається з метилу, етилу, пропилу, изопропила, н-бутилу, изобутила, втор-бутилу і трет-бутилу.

Термін "алкокси" означає алкилокси, має від 1 до 10 атомів вуглецю, якщо не визначено інше.

Термін “цикло�чають такі, але не обмежуються ними: циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклогексил і так далі.

Термін "арил" включає щонайменше одне кільце, що має ковалентную π-електронну систему, наприклад моноциклические або поліциклічні конденсовані (тобто цикли, які ділять суміжні пари атомів вуглецю) групи. У цьому описі арил означає ароматичне 4-10-членное, переважно 6-10-членное, моноциклическое або полициклическое кільце, включаючи феніл, нафтил і так далі, якщо не визначено інше.

Термін "гетероарил" означає ароматичний 3-10-членний, переважно 4-8-членний, більш переважно 5-6-членний, цикл, який має від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з N, O і S, і може бути конденсирован з бензо - або C3-C8-циклоалкилом, якщо не визначено інше. Моноциклический гетероарил включає наступні, але не обмежується ними: тіазол, оксазол, тиофен, фуран, пірол, імідазол, изоксазол, изотиазол, піразол, триазол, триазин, тиадиазол, тетразол, оксадиазол, піридин, пірідазін, піримідин, пиразин тощо. Біциклічною гетероарил включає наступні, але не обмежується ними: індол, индолин, бензотиофен, бензофуран, бензімідазол, бензоксазол, бензизоксазол, бензтиаз�кл" означає 3-10-членний, переважно 4-8-членний, більш переважно 5-6-членний, цикл, який має від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з N, O, S, може бути конденсирован з бензо - або C3-C8-циклоалкилом і є насиченим або містить 1 або 2 подвійні зв'язки, якщо не визначено інше. Гетероцикл включає наступні, але не обмежується ними: пирролин, піролідин, імідазолін, имидазолидин, пиразолин, пиразолидин, піран, пиперидин, морфолин, тиоморфолин, піперазин, гидрофуран тощо.

Інші терміни та скорочення у цьому описі можуть бути зрозумілі як мають значення, що традиційно використовується в даній області кваліфікованим фахівцем, якщо не визначено інше.

Кращі приклади сполук формули (1) або (2) можуть бути подані наступним чином:

З'єднання 1:

[(S)-2-(7-циклопентиламино-5-метил-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидротиазол-4-іл]оцтова кислота

З'єднання 2:

{(S)-2-[5-метил-7-(тетрагидропиран-4-іламіно)-1H-індол-2-іл]-4,5-дигидротиазол-4-іл}оцтова кислота

З'єднання 3:

[(S)-2-(7-циклопентиламино-5-метил-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидрооксазол-4-іл]оцтова кислота

З'єднання 4:

[(S)-2-(7-циклопентиламино-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидротиазол-4-іл]оцтова кислота

З'єднання 5>-{2-[(S)-2-(7-циклопентиламино-5-фенокси-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидротиазол-4-іл]етил}піперазин-2-він

З'єднання 7:

циклопентил-(2-{(S)-4-[2-(3-метил-5,6-дигідро-8H-[1,2,4]триазоло[4,3-a]пиразин-7-іл)етил]-4,5-дигидротиазол-4-іл}-5-фенокси-1H-індол-7-іл)амін

З'єднання 8:

((S)-2-{7-[(тетрагидропиран-4-ілметил)аміно]-1H-індол-2-іл}-4,5-дигидротиазол-4-іл)оцтова кислота

З'єднання 9:

(тетрагидропиран-4-іл)-[2-феніл-5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-1H-індол-7-іл]амін

З'єднання 10:

[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іл]-(тетрагидропиран-4-іл)метиламин

З'єднання 11:

[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іл]-біс-[(тетрагидропиран-4-іл)метил]амін

З'єднання 12:

{4-[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іламіно]пиперидин-1-іл}-(тетрагидропиран-3-іл)метанон

З'єднання 13:

[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іл]-(1-метилсульфонилпиперидин-4-іл)амін

З'єднання 14:

((S)-2-{5-метил-7-[(тетрагидропиран-4-ілметил)аміно]-1H-індол-2-іл}-4,5-дигидротиазол-4-іл)оцтова кислота

Переважними сполуками серед сполук вищенаведеної формули (3) є ті, в яких

Bcявляє арил або становить 5-6-членний гетероцикл або гетероа�ген, нітрил або алкокси,

R8cпредставляє C1-C6-алкіл, C3-C8-циклоалкіл, гетероциклил, арилалкил, циклоалкіл-алкіл або гетероциклил-алкіл,

R9cє водень, галоген, нітрил, алкокси, аллилокси, алкиламино або ариламино.

Більш переважно, у формулі (3) Bcявляє феніл або піридин.

Більш переважно, у формулі (3) R7cє водень, галоген або алкокси і найбільш переважно - водень

Більш переважно, у формулі (3) R8cпредставляє C1-C6-алкіл, гетероциклил, циклоалкіл-алкіл, гетероциклил-алкіл або арилалкил і найбільш переважно - циклопентил або тетрагидропиран.

Більш переважно, у формулі (3) R9cє водень, галоген або алкокси і найбільш переважно - водень.

Ілюстративні з'єднання формули (3) включають наступні:

циклопентил-(2-феніл-3H-бензімідазол-4-іл)амін,

(2-феніл-3H-бензімідазол-4-іл)-(тетрагидропиран-4-іл)амін,

циклопентил-(2-піридин-2-іл-3H-бензімідазол-4-іл)амін.

Фармацевтична композиція цього винаходу може бути ефективно використана для запобігання і лікування захворювання, спричиненого окислита для запобігання і лікування захворювання, викликаного окислювальним стресом, який опосередкований активними формами кисню (ROS) або активними формами азоту (RNS).

Фармацевтична композиція цього винаходу може пригнічувати ішемічне реперфузійне пошкодження.

Фармацевтична композиція цього винаходу може бути ефективно використана для запобігання і лікування захворювання, спричиненого гипоксическим пошкодженням.

Фармацевтична композиція цього винаходу може бути ефективно використана для запобігання і лікування захворювання, спричиненого некротичної смертю клітин.

Фармацевтична композиція цього винаходу може пригнічувати мітохондріальну дисфункцію.

Фармацевтична композиція цього винаходу може бути ефективно використана для запобігання і лікування синдрому MELAS, викликаного мітохондріальної дисфункцією (мітохондріальна міопатія, енцефалопатія, лактацидоз і инсультоподобние епізоди), синдрому MERRF (миоклоническая епілепсія з рваними м'язовими волокнами) або синдрому Кирнса-Сейра, які все викликаються мітохондріальної дисфункцією.

Фармацевтична композиція цього винаходу може пригнічувати некроз клітин, средотвращать та/або лікувати захворювання, опосередковане HMGB1, зокрема опосередковане або пов'язане із запаленням захворювання. Такі захворювання включають сепсис, ревматичний артрит, остеоартрит, цироз печінки, геморагічну хворобу, різні некротичні захворювання, вірусну чи бактеріальну інфекцію і так далі.

Захворювання, які можна запобігти та/або лікувати, використовуючи даний винахід, включають захворювання печінки, захворювання серця, судинне захворювання, дегенеративне захворювання головного мозку, захворювання, викликане ішемічним реперфузионним пошкодженням, і інфекційне захворювання, спричинене вірусом або бактеріями; стан при пересадці печінки, резекцію печінки, емболізацію печінки, фіброз печінки, цироз печінки, алкогольну/безалкогольну жирову дистрофію печінки і гепатит, викликаний вірусом або лікарським засобом (наприклад, протиракову агентом, ацетаминофеном і так далі); серцеві або серцево-судинні захворювання, такі як аритмія, кардиоплегия, інфаркт міокарда і так далі; дегенеративні захворювання головного мозку, такі як хвороба Лу Геріга, інсульт, деменція, хвороба Паркінсона, хвороба Хантінгтона і так далі; діабетичний комплекс, артеріосклероз, і�, викликане інфекцією вірусом, таким як вірус грипу, HBV, HCV, ВІЛ і так далі, або бактеріями.

У цьому винаході захворювання печінки може являти собою одне або більше, обраний із групи, що складається з стану при пересадці печінки, резекції печінки, емболізації печінки, фіброз печінки, цирозу печінки, алкогольної/безалкогольної жирової дистрофії печінки і гепатиту, викликаного вірусом або лікарським засобом (наприклад, протиракову агентом, ацетаминофеном і так далі).

У цьому винаході сердечне або серцево-судинне захворювання може являти собою одне або більше, обраний із групи, що складається з аритмії, кардиоплегии, інфаркту міокарда, серцевої недостатності та грудної жаби.

Фармацевтична композиція цього винаходу може бути ефективно використана для запобігання і лікування захворювання печінки, серцевого або серцево-судинного захворювання, кожне з яких викликано ішемічним реперфузионним пошкодженням, де ішемічне реперфузійне пошкодження може виникати в результаті мітохондріальної дисфункції, гіпоксичного пошкодження та/або некротичної смерті клітин.

Фармацевтична композиція настояще�, �ибранних з групи, що складається з діабетичного комплексу, артеріосклерозу та інсульту, кожен з яких викликаний ішемічним реперфузионним пошкодженням.

Конкретні варіанти здійснення синтезу сполук формули (1) або (2) цього винаходу розкриті в WO 2009/025477 і WO 2009/025478 відповідно.

Справжній винахід також надає з'єднання формули (3) і способи їх отримання. Тут далі способи отримання сполук формули (3) будуть пояснені на основі ілюстративних реакційних схем, щоб сприяти розумінню цього винаходу. Проте слід розуміти, що фахівець, який має звичайну кваліфікацію в даній області, зміг би отримати з'єднання формули (3) різними способами, ґрунтуючись на структурі формули (3), і всі такі способи входять в обсяг цього винаходу. Іншими словами, слід розуміти, що з'єднання формули (3) можуть бути отримані будь-яким поєднанням різних способів синтезу, описаних тут або розкритих у відомому рівні техніки, і таке поєднання входить в обсяг цього винаходу. Способи отримання сполук формули (3) не обмежені наведеними нижче способами.

По-перше, з'єднання формули (3) можуть бути синтезовані восстанстановительного амінірованіе (RA) за утворилася аміногрупи з участю сполук формули (6) згідно способу, показаному на нижченаведеної реакційної сміху 1.

Реакційна схема 1

де

Bc, R7c, R8cі R9cє такими, як визначено у формулі (3);

R10cявляє алкіл, циклоалкіл, гетероциклил, гетероарил або арил;

R11cявляє водень або алкіл; або

R10cі R11cможуть замикатися в цикл з утворенням циклоалкила або гетероциклу.

З'єднання формули (5) можуть бути отримані відновленням сполук формули (4). Реакції відновлення можуть бути проведені з використанням кислих каталізаторів і металів або з використанням металевих каталізаторів в присутності газоподібного водню.

Приклади кислоти, яка може бути використана в реакції відновлення, яка включає застосування кислих каталізаторів і металів, включають неорганічну кислоту, таку як кислота хлористоводнева, сірчана кислота, азотна кислота фосфорна кислота; органічну карбонову кислоту, таку як оцтова кислота і трифторуксусная кислота; і сіль аміна і кислоти, таку як хлорид амонію. Переважними кислотами є хлористоводнева кислота, оцтова кислота, хлоров і переважно від 0,1 до 5 еквівалентів на 1 еквівалент сполук формули (4). Приклади металу, який може бути використаний, містять залізо, цинк, літій, натрій і олово (зазвичай хлорид олова). Переважними металами є залізо, цинк, хлорид олова і так далі. Кількість металів, що підлягають використанню, становить типово від 1 до 20 еквівалентів і переважно від 1 до 10 еквівалентів на 1 еквівалент сполук формули (4). Реакції з металами в присутності кислих каталізаторів можуть бути проведені в інертному розчиннику. Приклади інертного розчинника включають алкиловий спирт, такий як метанол і етанол; простий ефір, такий як тетрагідрофуран і діетиловий ефір; і алкиловий складний ефір, такий як етилацетат. Переважними розчинниками є метанол, етанол, тетрагідрофуран і етилацетат і так далі. Температура реакції становить типово від -10 до 200°C і бажано від 25 до 120°C. Час реакції складає типово від 10 хв до 60 годин і переважно від 10 хв до 12 годин.

Приклади металевого каталізатора, який може бути використаний в реакції відновлення, яка включає застосування металевих каталізаторів в присутності газоподібного водню, містять паладій, нікель, платину, рутеній, родій тощо. Прихильності�атализатора, підлягає використанню, становить типово від 0,001 до 2 еквівалентів і переважно від 0,01 до 1 еквівалента на 1 еквівалент сполук формули (2). Тиск газоподібного водню становить типово від 1 до 10 атм і переважно від 1 до 3 атм. Реакції можуть бути проведені в інертному розчиннику, наприклад, в алкиловом спирті, такому як метанол і етанол; простому ефірі, такому як тетрагідрофуран і діетиловий ефір; і алкилацетате, такому як метилацетат та етилацетат. Переважними розчинниками є метанол, етанол, етилацетат і так далі. В реакції відновлення, яка включає застосування металевих каталізаторів, температура реакції становить типово від -10 до 200°C і бажано від 25 до 50°C. Час реакції складає типово від 10 хв до 60 годин і переважно від 10 хв до 12 годин.

З'єднання формули (6) комерційно доступні і можуть бути використані в реакції відновного амінірованіе по аміногрупі сполук формули (5).

Реакція відновного амінірованіе може бути проведена за допомогою реакції альдегіду або кетону з відновником і кислим каталізатором, якщо необхідно. Кількість альдегіду або кетону, який підлягає використанню, склад (5). Приклади відновника, який може бути використаний, включають боргидрид натрію, цианоборгидрид натрію (NaBH3CN) і триацетоксиборгидрид натрію (NaBH(OAc)3). Кількість відновника, який підлягає використанню, становить типово від 1 до 10 еквівалентів і переважно від 1 до 3 еквівалентів на 1 еквівалент сполук формули (5). Приклади кислого каталізатора, який може бути використаний, включають неорганічну кислоту, таку як кислота хлористоводнева, сірчана кислота, азотна кислота фосфорна кислота; органічну карбонову кислоту, таку як оцтова кислота і трифторуксусная кислота; і сіль аміна і кислоти, таку як хлорид амонію. Переважними кислотами є хлористоводнева кислота, оцтова кислота і так далі. Кількість кислот, що підлягають використанню, становить типово від 0,1 до 10 еквівалентів і переважно від 1 до 5 еквівалентів на 1 еквівалент сполук формули (5). Реакції можуть бути проведені в інертному розчиннику, наприклад в простому ефірі, такому як тетрагідрофуран і діетиловий ефір; і хлоралкане, такому як дихлорметан, хлороформ і дихлоретан, і переважно в дихлоретані, хлороформі і так далі. Температура реакції складових�дпочтительно від 10 хв до 12 годин.

З'єднання формули (4) можуть бути отримані реакцією сполучення і реакцією циклізації альдегідних сполук формули (7) з сполуками формули (8), як показано на нижченаведеної реакційної схемі 2.

Реакційна схема 2

де Bc, R7cі R9cє такими, як визначено у формулі (3).

По-перше, комерційно доступні альдегіди, такі як сполуки формули (7), і комерційно доступні диаминние сполуки, такі як сполуки формули (8), нагрівають при перемішуванні, що призводить до циклізації. Потім, нагрівання в присутності кислих каталізаторів могло б дати з'єднання формули (4). Приклади кислого каталізатора, який може бути використаний, включають неорганічну кислоту, таку як кислота хлористоводнева, сірчана кислота, азотна кислота фосфорна кислота; органічну карбонову кислоту, таку як оцтова кислота і трифторуксусная кислота; і сіль аміна і кислоти, таку як хлорид амонію. Переважними кислими каталізаторами є хлористоводнева кислота, оцтова кислота і так далі. Кількість кислот, що підлягають використанню, становить типово від 0,1 до 10 еквівалентів і переважно від 1 до 5 е�льзованием органічних кислот, таких як оцтова кислота, в якості розчинника.

У цьому описі "фармацевтично прийнятна сіль" включає нетоксическую кислотно-адитивну сіль, що містить фармацевтично прийнятний аніон, наприклад сіль з неорганічними кислотами, такими як сірчана кислота, кислота хлористоводнева, азотна кислота, фосфорна кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота і так далі; сіль з органічними карбоновими кислотами, такими як винна кислота, мурашина кислота, лимонна кислота, оцтова кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконова кислота, бензойна кислота, молочна кислота, фумарова кислота малеїнова кислота, саліцилова кислота і так далі; або сіль з сульфоновиє кислотами, такими як метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, нафталинсульфоновая кислота і так далі. З'єднання формули (1) можуть також утворювати фармацевтично прийнятну основно-адитивну сіль, наприклад сіль з лужними металами або лужно-земельними металами, такими як літій, натрій, калій, кальцій, магній і так далі; сіль з амінокислотами, такими як лізин, аргінін, тиламином, діетаноламін, холіном, триетиламіну і так далі. З'єднання формул (1), (2) і (3) цього винаходу можуть бути перетворені в свої солі за будь-яким із загальноприйнятих способів, і формування солей може бути з легкістю проведено фахівцем у цій галузі на основі структурних формул (1), (2) і (3) без додаткових пояснень в цьому відношенні.

Термін "ізомер" в цьому описі означає з'єднання, що мають ту ж хімічну або молекулярну формулу, що і з'єднання формули (1) або їх солі, але оптично або стерично відрізняються від них. З'єднання формул (1), (2) і (3) цього винаходу можуть мати асиметричний(е) вуглецевий(і) центр(и) в структурі і, таким чином, можуть існувати у формі оптичного ізомеру (R або S-ізомеру), рацемата, суміші діастереомерів або індивідуального діастереомера і так далі. Якщо з'єднання мають подвійну зв'язок, вони можуть існувати у формі геометричних ізомерів (транс - або цис-ізомер). Всі ізомери та їх суміші також покриваються цим винаходом.

Тут далі з'єднання формул (1), (2) і (3) включають фармацевтично прийнятні солі та їх ізомери, якщо не пояснено інше. Солі та ізомери слід розглядати як покриваються цим і�омянутая "фармацевтична композиція" може включати фармацевтично прийнятні носії, розріджувачі, эксципиенти або їх поєднання, якщо необхідно, разом з сполуками цього винаходу. Фармацевтична композиція полегшує введення сполуки живого організму. Існує ряд методик введення сполуки, і вони включають, але не обмежуються ними: пероральне, ін'єкційне, аерозольне, парентеральне та місцеве введення.

Використаний тут "носій" означає речовину, яка полегшує входження з'єднання в клітини або тканини. Наприклад, диметилсульфоксид (ДМСО) являє собою типовий носій, який застосовується, щоб полегшити введення різних органічних сполук в клітини або тканини живих організмів.

Використаний тут "розчинник" визначено як речовина, що розчинено у воді, яка розчиняє з'єднання, а також стабілізує біологічно активну форму з'єднання зазначеного з'єднання. Солі, розчинені в буферному розчині, що використовуються в даній області в якості розріджувачів. Типово застосовуваним буферним розчином є забуференний фосфатом сольовий розчин, який імітує сольовий склад сольового розчину людського організму. Буферні розчинники рідко змінюють біологічну активність з� тут "фармацевтично прийнятний" означає властивість не погіршувати біологічну активність і фізичні властивості з'єднання.

З сполук цього винаходу можуть бути складені рецептури у вигляді різних фармацевтичних дозувальних форм згідно з бажаною метою. Для отримання фармацевтичної композиції цього винаходу активний інгредієнт, зокрема сполуки формули (1), (2) або (3), їх фармацевтично прийнятні солі або ізомери, змішують разом з різними фармацевтично прийнятними носіями, які можуть бути обрані у відповідності з підлягає отриманню рецептурою. Наприклад, фармацевтичної композиції цього винаходу може бути надана форма инъецируемого препарату, препарату для перорального введення і так далі, згідно бажаної мети.

З сполук цього винаходу можуть бути складені рецептури способами, відомими в даній галузі, які використовують фармацевтичні носії і эксципиенти, відомі в цій галузі, і можуть бути укладені в контейнери одиничної дозировочной форми або мультидозировочной форми. Форма препарату може представляти собою розчини, суспензії або емульсії в масляних або водних середовищах, і вони типово містять диспергуючі агенти, суспендирующие агенти або стабілізатори. Додатково, наприклад, пре�льзованием шляхом розчинення у стерильній, апірогенної води. З сполук цього винаходу також можуть бути складені рецептури у вигляді суппозиторних форм, використовуючи типову основу для супозиторіїв, таку як масло какао або інші гліцериди. Можуть бути отримані тверді дозовані форми для перорального введення, капсули, таблетки, порошки і гранули, капсули і таблетки є особливо підходящими. Переважно, таблетки та пігулки отримують у вигляді форм з энтеросолюбильним покриттям. Тверді дозовані форми можуть бути отримані змішуванням сполук цього винаходу разом з носіями, такими як один або більше інертних розріджувачів, таких як сахароза, лактоза, крохмаль і так далі, змащувальні речовинами, такими як стеарат магнію, дезінтеграторами, сполучними і так далі.

Справжній винахід також надає косметичну композицію, що володіє антиоксидантним ефектом, що включає з'єднання вищевказаної формули (1), (2) або (3), його фармацевтично прийнятну сіль або ізомер, в якості активного інгредієнта; і прийнятний носій.

Забезпечують перевагу ефекти винаходу

Фармацевтична композиція цього винаходу має чудову антиоксидантом та ефективно�ві з окислювальним стресом.

Крім того, фармацевтична композиція цього винаходу може ефективно запобігати або лікувати серцеві або серцево-судинні захворювання придушенням дисфункції мітохондрій в клітинах серцевого м'яза, гіпоксичного пошкодження, некрозу та ішемічного реперфузионного пошкодження. Крім того, вона може бути використана в якості агента для захисту серця при реперфузійному лікуванні, такому як оперативна терапія, що включає обхідні шунти коронарної артерії або черезшкірну транслюминальную коронарну ангіопластику, і лікарську терапію з використанням агентів тромболізису або тому подібне.

Короткий опис креслень

На фіг.1 представлена фотографія, показує антиоксидантний ефект (тетрагидропиран-4-іл)-[2-феніл-5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-1H-індол-7-іл]аміна (з'єднання 9) у клітинах, при використанні зонда DHR123.

На фіг.2 представлена фотографія, показує антиоксидантний ефект сполуки 9 в клітинах, при використанні зонда MitoSOX red.

На фіг.3 представлена фотографія, на якій зіставлені результати з групи, яка отримувала лікування з'єднанням 9, з результатами групи, яка не отримувала лікування.

На фіг.4 представлена диаграммдинением 9.

На фіг.5 представлена фотографія, показує порівняння фарбування тканини між групою, в якій введено 13 мг/кг з'єднання 9, і групою, в якій з'єднання 9 не введено (IR: ішемічне реперфузійне пошкодження).

На фіг.6 представлена діаграма, що показує порівняння результатів у групі, що одержувала лікування з'єднанням 9, і в групі, яка не отримувала лікування, на основі мікроскопічного спостереження (дегенерація гепатоцитів, синусоїдальна конгестия, запальна клітинна інфільтрація).

На фіг.7 представлена діаграма, що показує порівняння рівня MGB1 між групою, в якій введено 13 мг/кг з'єднання 9, і контрольною групою з ішемічним реперфузионним пошкодженням.

На фіг.8 представлена діаграма, що показує порівняння активності мітохондріального комплексу I після ішемічного реперфузионного пошкодження між групою, що одержувала лікування з'єднанням 9, і групою, що не одержувала лікування.

На фіг.9 представлена діаграма, що показує вивільнення HMGB1 після лікування з'єднанням 9.

На фіг.10 представлена діаграма, що показує зміна вмісту АТФ, викликаного з'єднанням 9, після лікування з'єднанням 9.

На фіг.11 представлена фотографія, одержан�т з'єднання 9 проти некротичної смерті клітин.

На фіг.12 представлена діаграма, що показує прямий підрахунок клітин для ілюстрації захисного ефекту сполуки 9 проти некротичної смерті клітин.

На фіг.13 представлена діаграма, що показує результати аналізу FACS, що ілюструє захисний ефект сполуки 9 проти некротичної смерті клітин.

На фіг.14 представлена діаграма, що показує інгібіторний ефект сполуки 9 щодо набухання мітохондрій.

На фіг.15 представлена фотографія, отримана на флуоресцентному мікроскопі, показує мітохондріальний захисний ефект сполуки 9.

На фіг.16 представлена діаграма, що показує інгібіторний ефект сполуки 9 щодо набухання лівого шлуночка у моделі ішемічного реперфузионного пошкодження.

На фіг.17 представлена діаграма, що показує інгібіторний ефект сполуки 9 щодо фракції укорочення лівого шлуночка після ішемічного реперфузионного пошкодження.

На фіг.18 представлено зображення, що показує фіброз серця при фарбуванні за методом, що використовує MT (Masson-Trichrome), для порівняння з'єднання 9 з циклоспорином A.

На фіг.19 представлена фотографія, показує хід проведення операції на печінці экспериментальнано більш докладно з посиланням на такі приклади, але обсяг цього винаходу не повинен тлумачитися як обмежений ними яким-небудь чином.

Приклад 1: Отримання циклопентил-(2-феніл-3H-бензоимидазол-4-іл)аміну

Стадія A: 4-нітро-2-феніл-2,3-дигідро-1H-бензоимидазол

До розчину 3-нітро-бензол-1,2-диамина (1,0 г, 6,5 ммоль) в метанолі (10 мл) додавали бензальдегід (0,69 м, 6,7 ммоль) і перемішували при 80°C протягом 2 днів. Після завершення реакції розчинник видаляли у вакуумі і залишок очищали колонковою хроматографією з отриманням названого сполуки в кількості 1,1 г (вихід 70%).

1H-ЯМР (500 МГц, ДМСО): δ 8,68 (з, 1H), 7,43-7,31 (м, 5H), 7,18 (з, 1H), 6,95 (д, 1H), 6,44 (з, 1H), 6,36 (т, 1H), 6,29 (д, 1H).

Стадія B: 7-нітро-2-феніл-1H-бензоимидазол

4-нітро-2-феніл-2,3-дигідро-1H-бензоимидазол (1,1 г, 4,6 ммоль), отриманий на стадії A, розчиняли в оцтовій кислоті (10 мл) і перемішували при 80°с протягом 3 годин. Після завершення реакції додавали воду, екстрагували етилацетатом і промивали 1 н гідроксидом натрію. Після сушіння безводним сульфатом магнію фільтрат відганяли у вакуумі і залишок очищали колонковою хроматографією з отриманням названого сполуки в кількості 0,91 г (83%).

1H-ЯМР (400 МГц, ДМСО): δ 13,3 (уш. з, 1H), 8,37 (д, 2H), 8,15 (д, 2H), 7,65-7,56 (м, 3H), 7,46 (т, 1H).

1H-ЯМР (500 МГц, ДМСО): δ 12,5 (з, 1H), 8,10 (д, 2H), 7,55-7,45 м, 3H), 6,87 (т, 1H), 6,67 (д, 1H), 6,32 (д, 1H), 5,21 (з, 1H).

Стадія D: Циклопентил-(2-феніл-3H-бензоимидазол-4-іл)-амін

2-феніл-3H-бензоимидазол-4-иламин (0,040 г, 0,19 ммоль), отриманий на стадії C, розчиняли в дихлоретані (5 мл). До розчину додавали оцтову кислоту (0,012 г, 0,19 ммоль), циклопентанон (0,048 г, 0,57 ммоль) і триацетоксиборгидрид натрію (0,049, 0,23 ммоль) і перемішували при кімнатній температурі протягом 18 годин. Після завершення реакції додавали воду, екстрагували дихлорметаном і промивали насиченим розчином хлориду натрію. Після сушіння безводним сульфатом магнію фільтрат відганяли у вакуумі і залишок очищали колонковою хроматографією з отриманням названого сполуки в кількості 0,026 г (вихід 49%).

1

Приклад 2: Отримання (2-феніл-3H-бензімідазол-4-іл)-(тетрагідрофуран-4-іл)аміну

Використовуючи 2-феніл-3H-бензоимидазол-4-иламин (0,040 г, 0,19 ммоль), отриманий на стадії C прикладу 1, і тетрагідрофуран-4-карбальдегид (0,026 г, 0,23 ммоль), назване з'єднання в кількості 0,030 г (вихід 51%) отримували дотримуючись того ж способом, який описаний на стадії D приклад 1.

1H-ЯМР (40 МГц, CDCl3): 8,02 (м, 2H), 7,56-7,45 м, 3H), 7,17 (т, 1H), 6,85 (д, 1H), 6,44 (д, 1H), 4,05 (дд, 1H), 3,45 (тд, 2H), 3,27 (д, 2H), 2,02 (m, 1H), 1,85 м, 2H), 1,45 м, 2H).

Приклад 3: Циклопентил-(2-феніл-2-іл-3H-бензоимидазол-4-іл)амін

Використовуючи 2-карбоксиальдегид-3-нітробензол-1,2-діамін та циклопентанон, назване з'єднання отримували дотримуючись того ж способом, який описаний у прикладі 1.

1H-ЯМР (40 МГц, CDCl3): 1,64 (м, 6H), 2,10 (м, 2H), 4,14 (з, 1H), 6,38-6,34 (д, 1H), 6,69-6,71 (д, 1H), 7,09-7,13 (т, 1H), 7,25-7,26 (m, 1H), 7,75-7,79 (m, 1H), 8,40-8,41 (д, 1H), 8,54-8,55 (m, 1H).

Ефект цього винаходу конкретно ілюструється експериментальними прикладами, наведеними нижче. В експериментальних прикладах використані наступні з'єднання:

З'єднання 1:

[(S)-2-(7-циклопентиламино-5-метил-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидротиазол-4-іл]оцтова кислота

З'єднання 2:

{(S)-2-[5-метил-7-(тетрагидропиран-4-іламіно)-1H-індол-2-іл]-4,5-доксазол-4-іл]оцтова кислота

З'єднання 4:

[(S)-2-(7-циклопентиламино-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидротиазол-4-іл]оцтова кислота

З'єднання 5:

[(S)-2-(7-циклопентиламино-5-фенокси-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидротиазол-4-іл]оцтова кислота

З'єднання 6:

4-{2-[(S)-2-(7-циклопентиламино-5-фенокси-1H-індол-2-іл)-4,5-дигидротиазол-4-іл]етил}піперазин-2-він

З'єднання 7:

циклопентил-(2-{(S)-4-[2-(3-метил-5,6-дигідро-8H-[1,2,4]триазоло[4,3-a]пиразин-7-іл)етил]-4,5-дигидротиазол-4-іл}-5-фенокси-1H-індол-7-іл)амін

З'єднання 8:

((S)-2-{7-[(тетрагидропиран-4-ілметил)аміно]-1H-індол-2-іл}-4,5-дигидротиазол-4-іл)оцтова кислота

З'єднання 9:

(тетрагидропиран-4-іл)-[2-феніл-5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-1H-індол-7-іл]амін

З'єднання 10:

[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іл]-(тетрагидропиран-4-іл)метиламин

З'єднання 11:

[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іл]-біс-[(тетрагидропиран-4-іл)метил]амін

З'єднання 12:

{4-[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іламіно]пиперидин-1-іл}-(тетрагидропиран-3-іл)метанон

З'єднання 13:

[5-(1,1-диоксотиоморфолин-4-іл)метил-2-феніл-1H-індол-7-іл]-(1-метилсульфонилпиперидин-4-іл)амін

З'єднання 14:

((S)-2-{5-метил-7-[(тетрагидропиран-4-ілметил)аміно]-1H-індол-2-іл}-4,5-диил-3H-бензімідазол-4-іл)-(тетрагидропиран-4-іл)амін

Експериментальний приклад 1: Антиоксидантні ефекти інгібіторів некрозу

Для вимірювання антиоксидантного ефекту кожного з'єднання були проведені наступні експерименти: вимірювання загального антиоксидантного ефекту DPPH-методом, вимірювання антиоксидантного ефекту методом, використовують дигидрородамин 123, вимірювання інгібування некрозу методом, використовують tBOOH, який викликає окислювальний стрес клітин, вимірювання методом, що визначає здатність видаляти ONOO-(пероксінітріт), і вимірювання методом, визначальним прямі антиоксидантні ефекти відносно H2O2(пероксид водню) і tBOOH.

Експериментальний приклад 1-1: Вимірювання антиоксидантного ефекту з використанням DPPH

DPPH (1,1-дифеніл-2-пикрилгидразил) являє собою стабільний вільний радикал і має пурпурний колір. Антиоксидантний ефект з'єднання вимірювали використовуючи принцип, згідно з яким колір DPPH змінюється на жовтий, коли DPPH відновлюється з'єднанням. DPPH показує сильне поглинання при 517 нм, а коли DPPH відновлений, колір змінюється на жовтий і поглинання при 517 нм зменшується. Тут термін “IC50"відноситься до концентрації сполуки, яка зменшує поглощениого планшета і додавали до неї 20 мкл сполук, які послідовно розбавляли вдвічі, виходячи з 2000 мкМ. Потім їх добре змішували і витримували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Через 30 хвилин вимірювали величину оптичної щільності (O. D.) при 517 нм, використовуючи ELISA-рідер SpectraMAX. Результати представлені в нижченаведеній таблиці 1.

Таблиця 1
Номер з'єднанняАнтиоксидантний ефект у відношенні DPPH (IC50, мкМ)
З'єднання 124
З'єднання 224
З'єднання 317,5
З'єднання 415
З'єднання 520
З'єднання 623
З'єднання 725
З'єднання 820,5
З'єднання 916
12,5
З'єднання 1219
З'єднання 1317
З'єднання 1428

Експериментальний приклад 1-2: Вимірювання антиоксидантного ефекту з використанням дигидрородамина 123

Дигидрородамин 123 сам не є флуоресцентним, але перетворюється в флуоресцентний родамін 123, коли він окислюється ROS (активними формами кисню) або RNS (активними формами азоту). Антиоксидантні ефекти в клітинах або in vitro вимірювали використовуючи таку властивість. Клітини H9C2 розподіляли в кожну лунку 96-лункового планшета (1,5×104клітин/100 мкл/лунка). На наступний день клітини попередньо обробляли кожним з'єднанням, яке послідовно розбавляли втричі, виходячи з найбільшої концентрації, протягом 1 години і потім обробляли 10 мкл основного розчину DHR123 з концентрацією 12,5 мкМ (остаточна концентрація 1,25 мкМ) в інкубаторі при 37°C протягом 30 хвилин. Потім клітини негайно обробляли 400 мкМ tBOOH і інкубували протягом 2 годин. Потім вимірювали флуоресценцію, яку спалахувала при 480 нм і испускалась при 538 нм, використовуючи ридеает інгібування на 25% значення, де флуоресценцію через 2 год після обробки tBOOH, яка испускалась за рахунок окислення DHR123 внаслідок посилення окисного стресу, приймали за 100%. Результати представлені в таблиці 2. Крім того, щоб перевірити, чи дійсно з'єднання мають антиоксидантний ефект на клітини, після вищеописаного аналізу клітини в 96-лунковому планшеті фіксували 4% формальдегідом і промивали тричі PBS. Потім 100 мкл PBS додавали в кожну лунку 96-лункового планшета і вимірювали флуоресценцію кожної клітини иммунофлуоресцентной мікроскопією (флуоресцентний мікроскоп Olympus). (Оскільки DHR123 знаходиться в клітинах, флуоресценція випускається пропорційно окислення). Результати представлені на фіг.1. Крім того, інгібування генерації супероксиду вимірювали за допомогою зонда MitoSOX red (кінцева концентрація 5 мкМ) тим же методом.

Таблиця 2
Результати визначення антиоксидантного ефекту з використанням DHR 123
Номер з'єднанняIC25(мкМ)
З'єднання 90,10
<0,1

Експериментальний приклад 1-3: Ефект захисту клітин від окислювального стресу, індукованого tBOOH

Відомо, що тре-бутилгидропероксид (tBOOH) індукує некроз клітин, викликаючи окислювальний стрес в різних клітинах. Таким чином, інгібування некрозу клітин за рахунок антиоксидантного ефекту вимірювали обробкою tBOOH клітин H9C2. Клітини H9C2 розподіляли кожну лунку 96-лункового планшета (1,5×104клітин/100 мкл/лунка). На наступний день клітини попередньо обробляли кожним з'єднанням і потім обробляли tBOOH (кінцева концентрація 400 мкМ) протягом 2 годин. У кожну лунку додавали 50 мкл формальдегіду, щоб фіксувати клітини. Клітини фіксували протягом 30 хвилин і промивали дистильованою водою три рази. Потім планшет повністю висушували в сушильній шафі при 50°C і додавали розчин SRB в лунки, щоб забарвити білок, що залишився. Планшет промивали 1% оцтовою кислотою і сушили. Потім 100 мкл розчину Tris (10 мМ) додавали в лунки планшета для повторного розчинення барвника і розраховували IC50шляхом вимірювання оптичної щільності (O. D.) при 590 нм і 650 нм за допомогою ELISA-рідера SpectraMAX. Тут термін "IC50"відноситься до концентрації сполуки, яка це 3.

Експериментальний приклад 1-4: Вимір здатності видаляти ONOO-(пероксінітріт) з використанням дигидрородамина 123

ONOO-(пероксінітріт), який відомий як вид RNS, грає дуже важливу роль в окисному стресі. Таким чином, вельми важливим є оцінювання здатності інгібіторів некрозу видаляти ONOO-. Добре відомо, що зонд DHR123 окислюється ONOO-. Таким чином, використовуючи таку властивість, вимірювали цю здатність кожного з'єднання.

10 мкл кожного з'єднання, яке послідовно розводили 3-кратно, виходячи з 50 мкМ, розподіляли в кожну лунку 96-лункового планшета і потім у кожну лунку додавали 170 мкл суміші для проведення аналізу (10 мкМ DHR123, 1×PBS, 100 мкМ DPTA без ONOO-). В кінці додавали 20 мкл розчину ONOO-(кінцева концентрація 1 мкМ), щоб ініціювати реакцію. Тут термін “IC50"відноситься до концентрації сполуки, яка викликає 50% інгібування окислення DHR123 під дією ONOO-.

Результати дослідження залежності "структура-активність" (SAR) щодо здатності сполук видаляти ONOO-представлені в таблиці 4.

Номер з'єднанняЗдатність видаляти ONOO-(IC50, мкМ)
З'єднання 53,4
З'єднання 90,5
З'єднання 120,21
З'єднання 130,9

Експериментальний приклад 1-5: Прямий антиоксидантний ефект у відношенні H2O2і tBOOH

Щоб визначити антиоксидантні ефекти інгібіторів некрозу, мають индольную структуру, оцінювали прямі антиоксидантні ефекти щодо особливих ROS, H2O2(пероксиду водню) і tBOOH.

Додавали 10 мкл зонда DHR123 (кінцева концентрація 1,25 мкМ) до 10 мкл кожного з'єднання, яке розводили 100 мкл повної середовища DMEM. Додавали H2O2і tBOOH в концентрації, показаної в нижченаведеній таблиці 5, і через 2 год вимірювали флуоресценцію при довжинах хвиль (480 нм (збудження)/538 нм (випускання)) з допомогою SpectraMAX Gemini. Тут термін “IC25"відноситься до концентрації сполуки, яка викликає зменшення на 25% флуоресценції в припущенні, що до� width="90%" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" frame="all">Таблиця 5
Прямий антиоксидантний ефект у відношенні H2O2і tBOOHЗ'єднання №IC25(мкМ)H2O2(0,6 мМ)H2O2(0,3 мМ)tBOOH (0,4 мМ)tBOOH (0,2 мМ)З'єднання 32,152,22,42З'єднання 43,62,35,83З'єднання 920,852,91,45З'єднання 1221,6531,95

Експериментальний приклад 2: Захисний ефект сполуки 9 проти ушкодження печінки внаслідок ішемії/реперфузії у соб�ла 8,5-11,5 кг). Дослідження проводили після отримання дозволу від комісії з етики Asan Hospital Ethics Commission. Щоб мінімізувати накопичення глікогену в печінці, собаки голодували протягом 24 годин перед операцією; і у них видаляли шерсть. Собак рандомизированно ділили на контрольну групу (n=9), групи B (n=6), групу C (n=6) і групу D (n=6). Проводили ендотрахеальну інтубацію та анестезировали собак золетилом і 2,5% энфлурана. Цефазолін і кеторолак використовували, відповідно, у якості антибіотика і анальгетика згідно з процедурою, затвердженою комісією.

Проведення операції: Собак укладали на операційний стіл з теплими ковдрами і пляшками з теплою водою по обом сторонам. Ліву зовнішню яремну вену і праву велику підшкірну вену ноги канюлировали IV катетером 21 калібру через відкритий підхід. Праву внутрішню сонну артерію розсікали і канюлировали, так що в ході операції можна було спостерігати за гемодинамікою. Після отримання повного внутрішньовенного доступу анестезію підтримували інгаляцією 2,5% энфлурана. Кристаллоидний розчин вводили зі швидкістю інфузії 15 мл/кг/год

За 20 хвилин до проведення оклюзії судин лівої частки печінки вводять 13 мг/кг, 4,5 мг/кг і 1,5 мг/кг лікарського засобу, соответстмл (при 20 хв) відповідала стаціонарної концентрації Css5 мг/мл В ході операцій кров'яний тиск, частоту ударів серця, частоту дихання та насичення артеріальної крові киснем відстежували кожні 15 хвилин для всіх собак. Операції проводили шляхом зворотного Т-подібного розрізу. Печінково-дуоденальную зв'язку ізолювали після поділу малого сальника. Жовчний міхур і 4-ю частку печінки фіксували і вищерозміщені структури обережно оглядали поряд з кореневими структурами. На фіг.19a показано ліві і праві частки печінки, які поділяли уздовж лінії Кантлі На фіг.19b показані звичайні кореневі структури. У людей права ніжка утворює 60-70% загального печінкового обсягу. Оклюзію печінкових судин проводили протягом 90 хвилин, щоб викликати ішемічне пошкодження, і затиск відокремлювали, щоб викликати реперфузійне пошкодження протягом 60 хвилин (фіг.19c). Отже, дана модель являє собою систему, що використовує 90-хвилинне ішемічне пошкодження і 60-хвилинне реперфузійне пошкодження. Після операції черевну порожнину і шкіру закривали.

Забір зразків крові і біопсія: Забір зразків крові і біопсію проводили в задані інтервали, включаючи повний підрахунок формених елементів крові (FBE; гемоглобін Hb, лейкоцитарна формула WCC, гематМСНС), функціональні проби печінки (LFT; AST, ALT, LDH і загальний білірубін), визначення сечовини, електролітів (U&E; BUN і креатин), біопсію печінки (гистопатология і H&E-фарбування) і вимірювання HMGB1. Світлову микрофотографию та електронну микрофотографию використовували для дослідження форми клітин печінки. Собак породи бігль містили після операції в теплій і чистій середовищі з введенням анальгетиків постійної дії і забезпеченням м'якою і високобілкової дієти. Через 48 годин їх убивали згідно з процедурою. Результати показані на фіг.3, 4 і 5.

Гістологічний аналіз після IR-пошкодження: Біопсійні зразки печінки фіксували і дегидратировали і потім заливали в парафін. Парафінові блоки нарізали з товщиною 4 мкм, фарбували по методу Майера гематоксилином-еозином і досліджували в світловому мікроскопі. Кожен зразок розподіляли випадковим чином і аналізували сліпим способом. Досліджували дегенерацію та некроз гепатоцитних клітин, синусоїдальний і портальний венозний застій і запальну клітинну інфільтрацію. Результати гістологічного аналізу кількісно ранжирували згідно опублікованому методом (Hafez T at al., Journal of Surgical Research 2007; 138: 88-99): 0 (0%, немає), 1 (1-25%, слабо), 2 (26-50%, помірно) або �ля, використовуючи набір для проведення ELISA-аналізу на HMGB1. Результати показані на фіг.7.

Вимірювання активності мітохондріального комплексу I: Тканини печінки промивали 2 рази охолодженим льодом Буфером A (320 мМ сахарози, 1 мМ ЕДТА, 10 мМ Tris (pH 7,5)). Їх нарізали на маленькі шматки і гомогенизировали, використовуючи 4 мл AT-буфера (75 мМ сахарози, 225 мМ маніту, 1 мМ ЭГТА і 0,01% BSA, pH 7,4) на 1 г шматків, скляно-тефлоновом гомогенизаторе. Гомогенат центрифугували при 4°C протягом 5 хвилин при 1000 g і утворився супернатант центрифугували два рази при 13000 g. Збагачену мітохондріями масу використовували для вимірювання активності мітохондріального комплексу I. Активність комплексу I (NADH: CoQ-оксидоредуктаза) вимірювали моніторингом ротенон-чутливого відновлення NADH в присутності децилубихинона при 340 нм. Результати показані на фіг.8.

Експериментальний приклад 3: Профілактичний ефект щодо вивільнення HMGB1 з'єднання 9 після обробки tBOOH

Добре відомо, що HMGB1 вивільняється, коли відбувається некроз клітини. Таким чином, після обробки 400 мкМ tBOOH, який викликає окислювальний стрес, тестували профілактичний ефект сполуки 9 щодо вивільнення HMGB1.

Клітини H9C2 распрецентрации 10 мкМ протягом 30 хвилин. Після обробки tBOOH (кінцева концентрація 400 мкМ) вимірювали рівень HMGB1 з 50 мкл супернатанту протягом години ELISA-аналізом на HMGB1. Результати показані на фіг.9.

Експериментальний приклад 4: Спостереження зміни загального вмісту АТФ після обробки tBOOH

Клітини показують зменшення вмісту АТФ у процесі некрозу. Підтримання кількості АТФ дуже важливо для виживання клітин. Таким чином, після обробки tBOOH спостерігали зміна вмісту АТФ.

Клітини H9C2 розподіляли в кількості 1,5×104клітин/100 мкл/лунка. На наступний день проводили обробку з'єднанням 9 в концентрації 10 мкМ протягом 30 хвилин. Після обробки tBOOH (кінцева концентрація 400 мкМ) вимірювали кількість АТФ, що залишилася в клітинах, з допомогою набору для моніторингу АТФ (Perkin Elmer Life Science). Результати представлені на фіг.10.

Експериментальний приклад 5: Захисний ефект сполуки 9 щодо некрозу клітин після in vitro ішемічного реперфузионного пошкодження

Для вимірювання захисного ефекту сполуки 9 щодо некрозу H9C2 клітин після ішемічного реперфузионного пошкодження були проведені наступні експерименти: подвійне фарбування FDA і PI, підрахунок числа клітин, FACS-аналіз і вимірювання набухан�містить FBS і антибіотик. Коли 80-90% клітин виявлялося конфлюэнтними, проводили експеримент. За 24 год до експерименту клітини H9C2 висівали в 35-мм посудину і 150-мм посудину. Коли приблизно 80% клітин виявлялося конфлюэнтними, середовище змінювали на середовище DMEM, що містить 0,5% FBS і антибіотик. Клітини інкубували в гіпоксичної камері протягом 24 год. В точці 23,5 год гіпоксичної камері клітини обробляли різними хімікатами (0,01% ДМСО, з'єднання 9 (20 мкМ), вітамін C (10 мкМ) та z-VAD-fmk (20 мкМ)). Клітини переносили в інкубатор (37°C) і потім обробляли H2O2(400 мкМ) безпосередньо реинкубацией. Реоксигенацию проводили протягом 1,5 ч.

Експериментальний приклад 5-1: Вимірювання захисного ефекту шляхом подвійного фарбування FDA і PI після ішемічного реперфузионного пошкодження в H9C2

Клітини H9C2, инкубированние в 35-мм посудині для виміру флуоресценції, двічі фарбували FDA (диацетатом флуоресцеїну, Sigma) і PI (йодидом пропидиума). Готували маткові розчини FDA і PI. Клітини промивали PBS і до 1,5 мл клітинної культурного середовища додавали 4,5 мкл розчину FDA (5 мг/мл) та 4 мкл розчину PI (2 мг/мл). Використовуючи флуоресцентний мікроскоп отримували зображення, пофарбовані FRA/PI. Результати показані на фіг.11.

Експериментальний приклад 5-2: Вимірювання захисно�го пошкодження в H9C2

Після отримання зображення, пофарбованого FRA/PI, з використанням флуоресцентного мікроскопа в експериментальному прикладі 5-1 підраховували кількість живих клітин і мертвих клітин, використовуючи Image Pro. Результати представлені на фіг.12.

Експериментальний приклад 5-3: Вимірювання захисного ефекту FACS-аналізом клітин, підданих подвійного фарбування аннексином V і PI після ішемічного реперфузионного пошкодження в H9C2

Апоптозні або некротичні клітини фарбували використовуючи набір для виявлення, включає FITC і аннексином V, і потім аналізували використовуючи проточний цитометр. Клітини, инкубированние в 35-мм посудині, ділили на три (3) групи згідно фарбування PI і аннексином V - FITC: не оброблені, одиночне фарбування і подвійне фарбування. Після реоксигенации зібрані клітини центрифугували при 2000 об/хв при 4°C протягом 10 хвилин. Після видалення супернатантной середовища клітини повторно суспендованих за допомогою буфера, що зв'язує аннексин V, фарбували 5 мкл PI і 5 мкл аннексина V - FITC протягом 15 хвилин у темряві і потім аналізували за допомогою FACS (клітинний сортер флуоресцентно-активованих клітин). Результати показані на фіг.13.

Експериментальний приклад 5-4: Вимірювання ингибит�>�літки H9C2, инкубированние в 150-мм посудині, використовували для вимірювання набухання мітохондрій. Клітини збирали, використовуючи 0,05% трипсину, і потім центрифугували при 2000 об/хв при 4°C протягом 10 хвилин. Після видалення супернатанту клітини промивали PBS. Клітини повторно центрифугували при 2000 об/хв при 4°C протягом 10 хвилин, і потім супернатант відкидали. Отриману клітинну масу додавали до 500 мкл фільтрованого буфера для виділення (300 мМ маніту, 0,2 мМ ЕДТА, 5 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 1% бичачого сироваткового альбуміну) і використовували для подальших експериментів. Клітини, зруйновані шприцом, тестували, використовуючи розчин трипанового синього для фарбування. Коли більшість клітин було зруйновано, клітинний розчин негайно центрифугували при 2000 об/хв протягом 4 хвилин. Супернатант, що містить мітохондрії, відокремлювали і центрифугували при 13000 об/хв при 4°C протягом 10 хвилин. Після відкидання супернатанту отриману масу мітохондрій повторно суспендованих в 100 мкл буфера для інкубації (150 мМ KCl, 20 мМ Trіs-HCl (pH 7,4)). Концентрацію білка вимірювали за допомогою набору для кількісного визначення білка. Деякі з виділених мітохондріальних білків розподіляли 96-лунковому планшеті і потім измерѸе мітохондріального помутніння і некрозу ядер з використанням подвійного фарбування MitoTracker і PI після ішемічного реперфузионного пошкодження в H9C2

Візуалізація мітохондрій і тривимірне зображення: Щоб візуалізувати мітохондрії клітин H9C2, інкубували в 35-мм соуде, готували 1 мМ MitoTracker Green FM, розчинений у ДМСО. Клітини промивали середовищем для клітинних культур і потім піддавали подвійний фарбуванні 0,5 мМ MitoTracker Green FM і 4 мкл розчину PI. Через 1 год клітини аналізували у флуоресцентному мікроскопі і отримували тривимірне зображення, використовуючи програму Imaris.

Електронний мікроскоп: Використовували клітини H9C2, які інкубували в 24-лунковому планшеті, що має на дні покривне скло. Клітини фіксували 0,1 М натрій-фосфатним буфером (pH 7,4), що містить 2% глутарового альдегіду. Клітини промивали PBS буфером і потім постфиксировали 1% OsO4і 1,5% калію протягом 1 ч. Клітини послідовно промивали PBS буфером і двічі дистильованою водою і потім обробляли фільтрованим 0,5% уранилацетатом при 4°C протягом ночі. Клітини промивали двічі дистильованою водою, дегидратировали етанолом і двічі заливали в Epon протягом 1 год кожен раз. Клітини в смолу Epon полимеризовали при 60°C протягом 2 днів і потім аналізували електронною мікроскопією.

Флуоресцентне иммуноокрашивание: Зрізи тканин, залиті OCT, промивали крижаним 0,05% TBST в плині ча�ре протягом 1 ч. Для проведення иммунофлуоресцентного фарбування на серцевий міозин з важкої ланцюгом зрізи тканин обробляли антитілом до тяжких ланцюгах серцевого міозину (1:100, Abcam) в якості первинного антитіла. Зрізи тканин двічі промивали PBS-Tween 20 і потім фарбували вторинним антитілом, ослячим антимишиним 633 IgM (Invitrogen) та промивали двічі PBS-Tween 20. Для фарбування агглютинином з проростків пшениці зрізи тканин обробляли агглютинином з проростків пшениці Alexa Fluor 555 (Invitrogen) при 37°с протягом 10 хвилин. Для проведення иммунофлуоресцентного фарбування на альфа-саркомерний актин зрізи тканин обробляли первинним антитілом, антитілом проти альфа-саркомерного актину, при 4°C протягом 24 годин. Зрізи тканин двічі промивали 0,05% TBST і потім фарбували вторинним антитілом, ослячим антимишиним IgG Alexa Fluor 555 (Invitrogen). Зрізи тканин забарвлювали гематоксилином протягом 5 секунд, щоб забарвити ядро. Після монтування препаратів зрізів тканин на флуоресцентному мікроскопі отримували зображення. Результати показані на фіг.15.

Експериментальний приклад 6: Захисний ефект сполуки 9 проти ушкодження серця ішемією/реперфузией у SD-щурів

Утримання тварин: Самців SD-щурів (270-360 г) купували у Seoul National ся і вимикався з 12-годинним циклом, температуру і вологість підтримували при 22°C і 55%, відповідно. Забезпечували стандартний твердий корм для гризунів і питну воду ab libitum. Перед експериментом, який проводився з дозволу IACUC при Seoul National University, кожній тварині надавався адаптаційний період в 1 тиждень.

Підготовка до операції: після адаптаційного періоду в 1 тиждень щурів анестезировали сумішшю кетаміну (100 мг/кг, Yuhan Corp., Сеул, Корея) і ксилазином (10 мг/кг, Bayer, Shawnee Mission, Канзас, США) інтраперитонеальної інфузією. Після відповідної анестезії виконували базове ехокардіографічне дослідження і потім всім щурам подавали 100% кисню.

Ішемічну реперфузию индуцировали тимчасової перев'язкою передньої низхідної гілки лівої артерії (LAD) протягом 45 хвилин. LAD перев'язували з допомогою 8-0 Ethilon (Ethicon) з використанням поліетиленової трубки 10 протягом 45 хвилин. Ішемію визначали неозброєним оком по знебарвленню міокарда і вентрикулярну тахіаритмії.

Щурів ділили на три групи: контрольну групу (5 мл 0,9% сольового розчину), групи, що одержувала циклоспорин (25 мг/кг у 5 мл 0,9% сольового розчину), і групи, що одержувала з'єднання 9 (30 мг/кг у 5 мл 5% декстрози). Лікарські засоби вводили інфузією �яя лігатуру і поліетиленову трубку 10 і характеристики, викликані типовим гіперемичну зміною пошкодженого міокарда в ході перших декількох хвилин, визначали як реперфузию. Вільні шматочки швів зберігали для визначення ішемічної області для закінчення.

Після операції, у випадку групи, що одержувала 9 з'єднання, з'єднання 9 вводили перорально один раз на добу в одній і тій же дозі протягом 3 діб. Рештою груп проводили введення в цій же дозі.

Дослідження функції інфарктного серця щурів ехокардіографії: Під анестезією видаляли шерсть лівої половини грудної клітки. Трансторакальную ехокардіографію проводили негайно перед коронарної перев'язкою і збирали дані, використовуючи допплерівську эхокардиографическую систему з лінійним датчиком. Зображення серця отримували у двовимірному режимі перегляду по окологрудной довгої осі і короткої осі. Вид по короткій осі, що включає папілярну м'яз, був використаний для орієнтування курсору М-режиму вертикально щодо міжшлуночкової перегородки і задньої стінки лівого шлуночка. Зображення, отримані в ході тренувального періоду, не реєструвалися. Кінцево-діастолічні (LVEDD) і кінцево-систолічний (LVESD) розміри лівого шлуночка вимірювали згідно вого шлуночка (LV) розраховували за рівнянням 100×(LVEDD-LVESD)/LVEDD.

Аналіз тканини інфарктного серця щурів: Через 3 доби після події ішемії міокарда щурів анестезировали. Щоб оцінити розмір порушення, залиті парафіном репрезентативні зрізи LV нарізали в зрізи товщиною 4 мкм. Нейтрофіли фарбували гематоксилином та еозином і потім досліджували в світловому мікроскопі. На площі 1 мм2кожного зрізу вимірювали кількість запальних клітин. Площа фіброзу, забарвлену трихромом за Масону, досліджували з використанням системи аналізу зображень (Image Pro версія 4.5; MediaCybernetics, Бетезда, Меріленд, США). Вимірювання площі фіброзу проводили для 2 індивідуальних зрізів, і середнє значення використовували для чисельного аналізу.

Для иммуногистологического фарбування і дослідження щурячі серця поміщали у OCT-компаунд, що має зрізи 8 мкм (Tissue-Teck, Sakura, Торранс, Каліфорнія, США), швидко заморожували і зберігали. Фарбування кількісно вимірювали за кількістю позитивних клітин до фарбування в 10 полях зору під великим збільшенням (HPF) для кожної тварини (n=3). Для оцінки апоптозу проводили TUNEL-аналіз (набір Chemicon S7100, Chemicon, Темекула, штат Каліфорнія, США) і иммуногистологическое фарбування на каспазу-3. Позитивні клітини за TUNEL-аналізу або по фарбуванню на до�.

Иммунофлуоресцентное фарбування проводили використовуючи противосердечний тропонин I (Santa Cruz Biothechnology). Для детектування використовували конъюгированное з FITC козяче антикроличье антитіло до IgG (Molecular Probes). Фарбування червоним PI проводили, щоб показати ядро, та фарбування Alexa HMGB1 з допомогою Fluro 350 проводили, щоб показати ядро. Колокализацию червоних Dil-мічених MSC і зеленого коннексина-43 або експресію кардиотропонина I досліджували у флуоресцентному мікроскопі (LSM 510 META, Carl Zeiss, Пібоді Массачусетс, США).

Вимір розміру інфаркту: Розмір інфаркту визначали через 72 години після того, як I/R-пошкодження (ішемічне реперфузійне пошкодження) міокарда оцінювали відсотком AAR (площа, підвладна ризику). Ставлення AAR до LV (лівий шлуночок) представляє рівень I/R-пошкодження тканини міокарда. Ставлення IS/AAR являє собою точний індекс для визначення IS в пошкодженому міокарді і є первинною кінцевою точкою оцінки ефективності лікарської терапії. Щоб визначити AAR, ліву коронарну артерію знову перев'язували і 4% барвника Evans Blue вводили інфузією через грудну аорту ретроградним методом. Серце швидко видаляли, промивали у 0,9% сольовому розчині і потім зберігали в морозильнику (-2разолия протягом 15 хв при 37°C і потім поміщали в розчин формальдегіду. Нормальна тканина забарвлювалася в червоний, а інфарктна тканина набувала білий. Зображення зрізів серця отримували в цифровому режимі (Canon EOS 400D) під мікроскопом і, використовуючи програмне забезпечення ImagePro (версія 1.34), вимірювали IS, AAR і загальну площу LV.

Чисельний аналіз: Усі дані були представлені середнім значенням (SE). Послідовні змінні порівняні з використанням t-критерію Стьюдента, і множинні порівняння проводили дисперсійним аналізом з апостеріорної корекцією Бонферроні. Якщо p-значення менше 0,05, значення розглядали як статистично значуще, і всі аналізи проводили використовуючи SPSS, версія 17.0 (SPSS, Чикаго, Іллінойс, США).

Ефект придушення з'єднанням 9 збільшення маси лівого шлуночка (LV) показано на фіг.16, а ефект придушення з'єднанням 9 фракції укорочення LV після I/R-пошкодження показано на фіг.17, і результат порівняльного аналізу для з'єднання 9 і CsA (циклоспорин A) стосовно фіброзу міокарда показано на фіг.18.

Фармацевтична композиція для запобігання або лікування захворювань, пов'язаних з окислювальним стресом, вибраних з групи, що складається з MELAS (мітохондріальна міопатія, енцефалопатія, лактацидоз і инсультоподобние епізоди), синдрому MER�чи інфаркту міокарда, містить терапевтично ефективна кількість сполуки наступної формули (1) або (2), його фармацевтично прийнятною солі або ізомеру в якості активного інгредієнта, і фармацевтично прийнятний носій:

у формулі (1):
na позначає число 1 або 2,
Аапредставляє 5-членний гетероарил або гетероцикл, кожен з яких має 2 гетероатома, вибрані з N, О і S,
Rlaє R5a-Xa-Ba-X'а-,
Ває прямий зв'язок,
Хаі Х'анезалежно один від одного представляють прямий зв'язок або-ОС(О)-,
R5aявляє водень або 6-9-членний моноциклический або конденсований циклічний гетероцикл або гетероарил, кожен з яких має від 1 до 3 гетероатомів, вибраних з N, О і S,
і необов'язково заміщений оксо або З16-алкилом,
R2aпредставляє -(CR8aR9a)pa-Ya-R7a,
pa позначає число від 0 або 1,
R8aі R9aнезалежно один від одного представляють водень,
Yaє прямий зв'язок або-Про-,
R7aявляє водень або феніл,
R3aє водень,
R4aпредставляє -(СН2)R10aє водень,

у формулі (2):
nb позначає число 1,
mb позначає 1,
Abявляє феніл,
Xbпредставляє З,
R1bє водень,
R2bє водень,
R3bє водень,
R4bпредставляє-YbR11b, де Ybє прямий зв'язок, R11bпредставляє -(СН2)tbBb-R13b, де tb позначає число 1, Bbпредставляє 6-членний гетероцикл, який має 2 гетероатома, вибрані з N, S і Про, R13bявляє оксо,
R5bявляє водень або 6-членний гетероциклилС16-алкіл, де гетероциклил має 1 гетероатом, вибраний з N, S і О,
R6bпредставляє -(CR7bR8b)pb-Zb-Db-Wb-R14b, де R7bR8bнезалежно один від одного представляють водень, pb позначає число 0 або 1, Zbє прямий зв'язок, Dbє прямий зв'язок або 6-членний гетероцикл, який має 1 гетероатом, вибраний з N, S і О, Wbє прямий зв'язок, -С(О)- або-S(O)yb-, yb позначає число 2, де R14bпредставляє З16-алкіл або 6-

 

Схожі патенти:

Спосіб отримання 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу з 2',4,4'-тринитробензанилида

Винахід відноситься до галузі органічної хімії і стосується способу отримання 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу каталітичним гідруванням 2',4,4'-тринитробензанилида в середовищі амідного розчинника з ряду: диметилформамід, диметилацетамид, N-метилпирролидон, з виділенням утворюється 2',4,4'-триаминобензанилида з гідрогенізатів у вигляді моносернокислой солі з наступними циклодегидратацией моносернокислой солі 2',4,4'-триаминобензанилида при нагріванні у водній сірчаної кислоти, виділенням сірчанокислої солі 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу кристалізацією і фільтрацією і нейтралізацією її підставою, що відрізняється тим, що виділення моносернокислой солі 2',4,4'-триаминобензанилида ведуть у присутності нижчого аліфатичного спирту або ацетону і циклодегидратацию ведуть у присутності активованого вугілля. Технічний результат: розроблено новий спосіб отримання 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу, що відрізняється підвищеною продуктивністю і низькими витратами на реагенти. 1 з.п. ф-ли, 1 іл., 4 табл., 6 пр.

Спосіб отримання 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу

Винахід відноситься до галузі органічної хімії і стосується способу отримання 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу, що включає каталітичне гідрування 2',4,4'-тринитробензанилида в середовищі амідного розчинника, виділення утворився 2',4,4'-триаминобензанилида з гідрогенізатів у вигляді солі мінеральної кислоти, циклодегидратацию солі 2',4,4'-триаминобензанилида в середовищі мінеральної кислоти, виділення утворився 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)-бензимідазолу у вигляді солі мінеральної кислоти з наступним очищенням солі 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу у водному розчині активованим вугіллям і нейтралізацією підставою, що відрізняється тим, що 2',4,4'-триаминобензанилид виділяють з гідрогенізатів у вигляді тригидрохлорида в присутності нижчого аліфатичного спирту або ацетону. Технічний результат: розроблено новий спосіб отримання 5(6)-аміно-2-(4-аминофенил)бензимідазолу, що відрізняється високою продуктивністю і зниженням енерговитрат на регенерацію амідного розчинника. 1 з.п. ф-ли, 4 табл., 6 пр.

Інгібітори гистондеацетилази

Винахід відноситься до сполук загальної формули (I), де являє собою заміщене 5-членное гетероарильное кільце, вибране з тиенила, тиазолила, оксазолила, пирролила, имидизолила або пиразолила, W вибирають із групи, що включає N і-З=; M вибирають із групи, що включає-C(O)N(R1)OR2, -C(O)NR1R2 і-C(O)OR1, або M являє собою-C1-С3алкил-C(O)N(R1)OR2, при цьому являє собою , ; R1 і R2 незалежно вибирають із групи, що включає-H, C1-C3-алкіл, C6-арил і C1-C3-алкіл-C6-арил; R вибирають із групи, що включає H, C1-С3алкил, галоген, NR1R2, -OR1 і С6арил; n представляє собою ціле число від 0 до 1; L і Y є такими, як зазначено у формулі винаходу; і з'єднань формули (II), де L2 вибирають із групи, що включає H, -C0-С3алкил-С6арил, -C0-С3алкил-гетероарил, де гетероарил являє собою пиридил; -C1-С6алкил, Y і M є такими, як для сполук формули (I). Винахід відноситься до фармацевтичної композиції на основі сполук (I) і (II), що володіє інгібуючої активності відносно гистондеацетилази (HDAC), способу інгібування і способу лікування захворювання, чутливого до ингибитору активності HDAC. Технічний результат - з'єднання формули (I) і (II) в якості інгібіторів гистондеацетилази. 5 н. і 13 з.п. ф-ли, 18 сх., 10 �

2-(1н-бензімідазол-2-іл)-5'-нитробензойная кислота - антидот гербіциду гормонального дії 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоти та спосіб його одержання

Винахід відноситься до сільського господарства. 2-(1Н-бензімідазол-2-іл)-5'-нитробензойная кислота формули 1 є антидотом для захисту проростків соняшника від негативної дії гербіциду 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоти: Здійснюють взаємодію про-фенилендиамина з 2-формил-5-нитробензойной кислотою у співвідношенні 1:1 в оцтовій кислоті при кімнатній температурі протягом 1,5 год. Винахід дозволяє знизити температурний режим і скоротити час проведення реакції. 2 н.п. ф-ли, 4 табл., 2 ін.

Композиції для активації ліпопротеінліпази, що включають похідні бензолу

Винахід відноситься до засобу для активації ліпопротеінліпази, що включає похідне бензолу загальної формули (1),що використовується для профілактики та лікування гіперліпідемії і ожиріння

Моногидрохлориди і натрієві солі таутомерних 5(6)-алкоксикарбониламинопроизводних 2-арил-1-гидроксибензимидазол-3-оксиду з високою протигрибковою активністю і спосіб їх отримання

Винахід відноситься до галузі хімії, точніше стосується способу отримання моногидрохлоридов і натрієвих солей таутомерних 5(6)-алкоксикарбонилпроизводних бензімідазол-3-гідроксиду, виявляють високу протигрибкову активність, мають формули I, II:Пошук малотоксичних сполук з протигрибковою активністю є актуальною проблемою

З'єднання і композиції в якості миметиков тро

Винахід відноситься до нових сполук формули Iде: n означає 0 або 1; Z означає N, CR8, де R8означає Н, С1-З6алкіл; R1, R2, R4і R5незалежно означають Н, галоген, ВІН, -XNR9R10, де X означає хімічну зв'язок, a R9і R10означають Н; R3означає-NR11S(O)2R12, -NR11C(O)R12, -C(O)OR11, -NR11R12, S(O)2NR11R12і-C(O)NR11R12, де R11і R12незалежно означають H1-З6алкіл; R6означає галоген, З1-З6алкіл; R7означає феніл, замещенний 1 або 2 групами, незалежно вибраними з фтору та З1-З6алкила, і його фармацевтично прийнятним солей

Азотовмісні похідні гетероарила

Винахід відноситься до нових сполук формули (I):,де: R1вибирають із групи, що включає-OR7і-NR8R9; де R7означає водень; R8і R9незалежно вибирають із групи, що включає водень, арил, замещенний арил, що містить від одного до трьох заступників, переважно від одного до двох заступників, незалежно вибраних з групи, що включає алкенів, замещенний алкенів, що містить від одного до трьох, переважно від одного до двох заступників, незалежно вибраних з групи, що включає карбоксил і складні ефіри карбоксила; R2і R12незалежно вибирають із групи, що включає водень, алкіл і алкіл, замещенний 5-гідрокси-индолильной групою; або R2і R12разом з атомом вуглецю, до якого вони приєднані, утворюють циклоалкильную групу; R3означає водень; кожен R4незалежно означає галоген; Q означає кисень; Х означає кисень; R5означає алкилен; R6вибирають із групи, що складається з заміщеного аріла, що містить від однламино, аріла, заміщеного аріла, що містить від одного до трьох, переважно від одного до двох заступників, вибраних з галогену; і n дорівнює від 0 до 3; або до його фармацевтично прийнятним солей

Спосіб одержання 3-заміщених 2-аміно-1-гідрокси-5,6-дицианоиндолов на основі 4-бром-5-нитрофталонитрила

Винахід відноситься до способу одержання 3-заміщених 2-аміно-1-гідрокси-5,6-дицианоиндолов загальної формули:де R-Н(а); СН3(b); ОСН3(з); Cl(d); F(e), полягає в тому, що на першому етапі 4-бром-5-нитрофталонирил піддають взаємодії з натрієвою сіллю 2-заміщеного оксобутенитрила при мольному співвідношенні 1:2 відповідно, при температурі Т=1925°С протягом 1-2 годин в розчині ДМФА, після чого реакційну масу розбавляють десятикратним надлишком води з Т=025°З, що виділився смолистий осад екстрагують хлористим метиленом, ретельно промивають водою і хроматографируют на силікагелі, елюенти (розчинник) упарюють, що випав осад проміжного продукту відфільтровують і перекристаллизовивают з спирту, на другому етапі способу до розчину двухлористого олова в концентрованій соляній кислоті додають розчин отриманого проміжного продукту в етиловому спирті при мольному співвідношенні 3,5-4,5:1 відповідно, при температурі Т=3050°З ww.fips.ru/chr/8230.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle">25°З, що випав продукт фільтрують і перекристаллизовивают з спирту

Композиції для догляду за волоссям та/або шкірою голови, включають аміно-оксо-індол-илиденовие з'єднання

Винахід відноситься до композицій для лікування волосся і/або шкіри голови

Нові похідні індол-2,3-діон-3-оксима

Винахід відноситься до нових похідних індол-2,3-діон-3-оксима формули Iде R1означає водень, З1-З6алкіл; R3означає Het або групу формулиде Het означає тетрагидрофурил, який може бути заміщений один або більше разів заступниками, призначеними з групи, що складається з галогену, З1-З6алкила, З1-З6алкокси і оксо; щонайменше один з R31, R32і R33незалежно являє собою водень, З1-З6алкіл або гідрокси1-З6алкіл і щонайменше один з R31, R32і R33незалежно являє собою (СН2)nR34, де R34являє собою гідроксил, карбоксил, З1-З6алкоксикарбонил, З3-З7-циклоалкіл-1-З6-алкоксикарбонил, изоксазолильное кільце, яке може бути заміщено один або більше разів заступниками, призначеними з групи, що складається з галогену, З1-З6алкила, З1-З6алкокси, оксо, або СОNR35R36, де R35і R36- водень, З1-З6алкіл, гUB>6алкоксикарбонил, З3-З7циклоалкіл-1-З6-алкоксикарбонил, або R35і R36разом з атомом N, до якого вони приєднані, утворюють насичене 6-членное гетероциклічна кільце, можливо містить один атом О; n-0, 1, 2 або 3; R5означає феніл, який може бути заміщений фенилом або SO2NR51R52, де R51і R52кожен незалежно означає1-З6алкіл або R51і R52разом з атомом N, до якого вони приєднані, утворюють насичене 6-членное моноциклическое гетероциклічна кільце; А є кільцем, конденсованим з бензольним кільцем в положеннях, зазначених "а" і "b", і освіченим наступними бивалентними радикалами: a-CH2-NR6-CH2-CH2-b, де R6означає1-З6алкіл, або його фармацевтично прийнятна сіль

Кристали

Кристали // 2556206
Винахід описує кристали 2-{4-[N-(5,6-дифенилпиразин-2-іл)-N-изопропиламино]бутилокси}-N-(метилсульфонил)ацетаміду ("з'єднання А"), у вигляді форми-I кристала сполуки А, яка демонструє піки дифракції при 9,4 градуси, 9,8 градуса, 17,2 градуси і 19,4 градуси в її спектрі порошкової рентгенівської дифракції, у вигляді форми-II кристала сполуки А, яка демонструє піки дифракції при 9,0 градусах, 12,9 градуси, 20,7 градуса і 22,6 градуси в її спектрі порошкової рентгенівської дифракції, і у вигляді форми-III кристала сполуки А, яка демонструє піки дифракції при 9,3 градуса, 9,7 градуси, 16,8 градуси, 20,6 градуси і 23,5 градуси в її спектрі порошкової рентгенівської дифракції. Також описуються способи отримання форм-I, II і III кристала сполуки А, фармацевтична композиція і агонистический агент щодо рецептора PGI2 на їх основі, прискорює агент при ангиогенной терапії, генної інженерії або аутоімунної трансплантації кісткового мозку та прискорює агент для ангіогенезу при відновленні периферичної артерії або при ангиогенной терапії на їх основі, а також описується профілактичне або терапевтичний засіб проти цілого ряду захворювань та станів. 11 н. п. ф-ли, 6 іл., 6 табл.,
Up!