4'-азидонуклеозиди, активні щодо hcv

 

ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ

Згідно з цим винаходу запропоновані ацілірованная нуклеозиди, які являють собою проліки інгібітора РНК-залежної вірусної РНК-полімерази вірусу гепатиту С (HCV). При пероральному введенні дані сполуки легко поглинаються з ЖК (шлунково-кишковий) тракту і ефективно перетворюються назад в батьківський нуклеозид в крові. Ці проліки являють собою інгібітори РНК-залежної реплікації вірусної РНК і є корисними в якості інгібіторів полімерази NS5B HCV, як інгібітори реплікації HCV і для лікування інфекції гепатит С у ссавців. Зокрема, винахід стосується застосування ацильованих піримідинових нуклеозидних сполук, які забезпечують поліпшене поглинання лікарського засобу при пероральному введенні нуклеозиду.

ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Вірус гепатиту С є провідною причиною хронічного захворювання печінки у всьому світі. (Boyer, N. et al., J. Hepatol. 2000 32:98-112). Пацієнти, інфіковані HCV, піддаються ризику розвитку цирозу печінки і подальшої гепатоклітинній карциноми, і, отже, HCV є головним показанням для трансплантації печінки.

HCV класифікували як ѹ включає віруси гепатиту С (Rice, С. М., Flaviviridae: The viruses and their replication. In: Fields Virology, Editors: B. N. Fields, D. М. Knipe and P. М. Howley, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa., Chapter 30, 931-959, 1996). HCV являє собою оболонковий вірус, що містить геном у вигляді одноланцюговою РНК позитивної полярності, яка має розмір приблизно 9,4 т. п. н. Вірусний геном складається з висококонсервативной нетрансліруємій 5'-області (UTR), довгої відкритої рамки зчитування, кодує полибелковий попередник з приблизно 3011 амінокислот, і короткої 3' UTR.

Генетичний аналіз HCV ідентифікував шість головних генотипів, які дивергируют по послідовності ДНК більш ніж на 30%. Розрізняли більш ніж 30 підтипів. У США приблизно 70% інфікованих індивідуумів мають інфекцію Типу 1а і 1b. Тип 1b є самим основним підтипом в Азії. (X. Forns and J. Bukh, Clinics in Liver Disease 1999 3:693-716; J. Bukh et al., Semin. Liv. Dis. 1995 15:41-63). На жаль, інфекції типу 1 є більш стійкими до терапії, ніж генотипи типу 2 або 3 (N. N. Zein, Clin. Microbiol. Rev.. 2000 13:223-235).

Вірусні структурні білки включають коровий білок нуклеокапсида (С) і два глікопротеїну оболонки, Е1 і Е2. HCV також кодує дві протеази, цинк-залежну металлопротеиназу, кодовану областю NS2-NS3, і сериновую протеазу, кодовану областю NS3. Дані протеая половина неструктурного білку 5, NS5B, містить РНК-залежну РНК-полімеразу. Функція інших неструктурних білків, NS4A і NS4B, і функція NS5A (аминоконцевой половини неструктурного білку 5) залишається невідомою. Вважається, що більшість неструктурних білків, що кодуються РНК-геномом HCV, бере участь у реплікації РНК.

В даний час для лікування інфекції HCV доступно обмежене число схвалених терапій. Були зроблені огляди нових та існуючих терапевтичних підходів для лікування інфекції HCV та інгібування активності полімерази NS5B HCV: R. G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, October: 1999 80-85; G. Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis З Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; P. Hoffmann et al., Recent patent on experimental therapy for hepatitis З virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11): 1707-1723; M. P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investing. Drugs 2003 12(8): 1269-1280; S.-L. Tan et al., Hepatitis З Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867-881; J. Z. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy, Curr. Drug Targ. - Infect. Dis. 2003 3(3):207-219.

В даний час мається обмежене число схвалених терапій, доступних в даний час, для лікування інфекції HVC. Були зроблені огляди нових та існуючих терапевтичних підходів для лікування HCV та інгібування полімерази NS5B HCV: R. G. Gish, Sem. Liverg. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; P. Hoffmann et al., Recent patents on experimental therapy for hepatitis З virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11): 1707-1723; F. F. Poordad et al. Developments in Hepatitis З therapy during 2000-2002, Exp. Opin. Emerging Drugs 2003 8(1):9-25; M. P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investig. Drugs 2003 12(8); 1269-1280; S.-L Tan et al., Hepatitis З Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867-881; R. De Francesco ef al. Approaching a new era for hepatitis З virus therapy: inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polymerase, Antiviral Res. 2003 58:1-16; Q. M. Wang ef al. Hepatitis З virus encoded proteins: targets for antiviral therapy, Drugs of the Future 2000 25(9):933-8-944; J. A. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B-Dependent RNA Polymerase forAnti-HCV Chemotherapy Cur. Drug Targ. - lnf. Dis.2003 3:207-219. В оглядах процитовані сполуки, які в даний час знаходяться на різних стадіях процесу розробки. Комбінована терапія двома або трьома агентами, спрямованими на однакові або різні мішені, стала стандартною терапією для запобігання або уповільнення розвитку стійких штамів вірусу, і з'єднання, розкриті в наведених вище оглядах, могли б використовувати в комбінованій терапії з сполуками по справжньому винаходу, і ці огляди тим самим є включеними допомогою посилання у всій їх повноті.

Рибавірин (1а; амід 1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-дигідрокси-5-гідроксиметил-тетрагидро-фуран-2-іл)-�він, противірусний нуклеозидний аналог широкого спектру. Рибавірин має активність in vitro проти кількох ДНК - і РНК-вірусів, включаючи Flaviviridae (Gary L. Davis, Gastroenterology 2000 118:S104-S114). В монотерапії рибавірин знижує рівні сироваткової амінотрансферази до нормальних у 40% пацієнтів, але він не знижує сироваткові рівні РНК HCV. Рибавірин також демонструє значну токсичність, і відомо, що він викликає анемію. Рибавірин не є інгібітором инозинмонофосфатдегидрогенази. Рибовирин не схвалений у монотерапії проти HCV, але дане з'єднання схвалено у комбінованій терапії з інтерфероном α-2а та інтерфероном α-2b. Вирамидин 1b являє собою проліки, що перетворюється в 1а в гепатоцитах.

Інтерферони (IFN) були доступні для лікування хронічного гепатиту протягом майже десятиліття. IFN являють собою глікопротеїни, що продукуються імунними клітинами у відповідь на вірусну інфекцію. Розпізнають два відмінних типи інтерферону: тип 1 включає кілька інтерферонів альфа і один інтерферон β, тип 2 включає інтерферон γ. Інтерферон типу 1 продукується, головним чином, інфікованими клітинами і захищає сусідні клітини від інфекції de novo. IFN інгібують вірусну реплікацію багатьох вірусів,�шу РНК HCV до недетектируемих рівнів. Додатково IFN нормалізує рівні сироваткової амінотрансферази. На жаль, ефекти IFN є тимчасовими. Припинення терапії призводить до 70%-ної частоті рецидивів, і тільки 10-15% демонструють стійкий вірусологічна відповідь з нормальними рівнями сироваткової аланінтрансферази. (L.-B. Davis, вище).

Одним обмеженням ранньої терапії IFN був швидкий кліренс білка з крові. Хімічна дериватизация IFN поліетиленгліколем (ПЕГ) призводила до (отримання) білків зі значно поліпшеними фармакокінетичними властивостями. PEGASYS® являє собою кон'югат інтерферону α-2а і 40 кДа розгалуженого монометокси ПЕГ, і PEG-ІNTRON® являє собою кон'югат інтерферону α-2b і 12 кДа монометокси ПЕГ. (Ст. A. Luxon et al., Clin. Therap.2002 24(9): 1363-1383; A. Kozlowski and J. M. Harris, J. Control. Release, 2001 72:217-224).

Інтерферон α-2а та інтерферон α-2b в даний час схвалені в якості монотерапії для лікування HCV. ROFERON-A®(Roche) являє собою рекомбинантную форму інтерферону α-2а. PEGASYS®(Roche) являє собою ПЭГилированную (тобто модифіковану поліетиленгліколем) форму інтерферону α-2а. ІNTRON-A®(Schering Corporation) являє собою рекомбинантную форму інтерферону α-2b, та PEG-ІNTRON®(Schering Corporation) являє собою ПЭГилированндятся в клінічній розробки для лікування HCV. Наприклад, у розробці знаходяться INFERGEN®(інтерферон альфакон-1) від InterMune, OMNIFERON®(природний інтерферон) від Viragen, ALBUFERON®від Human Genome Sciences, REBIF®(інтерферон бета-1а) від Ares-Serono, Omega Interferon від BioMedicine, Oral Interferon Alpha від Amarillo Biosciences, і інтерферон γ, інтерферон τ і інтерферон γ-1b від InterMune.

Комбінована терапія HCV рибавірином та інтерфероном-α в даний час являє собою оптимальну терапію. Об'єднання рибавірину, і ПЕГ-IFN (нижче) призводить до стійкого вірусного відповіді у 54-56% пацієнтів. SVR (стійкий вірусний відповідь) досягає 80% для HCV типу 2 і 3 (Walker, вище). На жаль, комбінація також продукує побічні ефекти, які ставлять клінічні проблеми. Депресія, грипоподібні симптоми і шкірні реакції асоційовані з підшкірним INF-α, і гемолітична анемія асоційована з тривалим лікуванням рибавірином.

Інші макромолекулярні сполуки для лікування інфекції вірусом гепатиту С, в даний час знаходяться в доклінічній або клінічної розробки, включають: lnterleukin-10 від Schering-Plough, 1P-S01 від Intemeuron, Merimebodib (VX-497) від Vertex, HEPTAZYME®від RPI, IDN-6556 від Idun Pharma, XTL-002 від XTL, HCV/MFS9 від Chiron, CIVACIR®(імуноглобулін проти гепатиту С) від NABI, ZADAXIN®(тимозин α-1) від SciClone, тимозин плюс ПЕГ�чеську вакцину від Intercell, терапевтичну вакцину від Epimmune/Genencor, терапевтичну вакцину від Merix, терапевтичну вакцину Chron-VacC від Tripep.

Інші макромолекулярні підходи включають рібозіми, спрямовані на РНК HCV. Рібозіми являють собою короткі зустрічаються в природі молекули з эндонуклеазной активністю, які каталізують специфічне стосовно послідовності розщеплення РНК. Альтернативним підходом є застосування антисмислової олігонуклеотидів, які зв'язуються з РНК і стимулюють розщеплення, опосередковане РНКазойН.

Тепер був ідентифікований цілий ряд потенційних молекулярних мішеней для розробки лікарських засобів - терапевтичних агентів проти HCV, що включає, але не обмежується автопротеазой NS2-NS3, протеази N3, хеликазой N3 і полімеразою NS5B. РНК-залежна РНК-полімераза абсолютно необхідна для реплікації одноцепочечного, смислового РНК-генома, і цей фермент викликав значний інтерес серед медичних хіміків.

Нуклеозидні інгібітори можуть діяти або як термінатора ланцюга, або в якості конкурентного інгібітору, який перешкоджає зв'язуванню нуклеотиду з полімеразою. Для функціонування в якості термінатора ланцюга, н� якості субстрату сайті зв'язування нуклеотиду полімерази. Це перетворення до трифосфату звичайно опосередковується клітинними киназами, які накладають додаткові структурні обмеження на будь-нуклеозид. Нуклеозидполимерази також є істотним компонентом при нормальному розподілі клітини і для обмеження потенційних токсичних побічних ефектів, нуклеозидні інгібітори повинні селективно інгібувати вірусні полімерази без істотного порушення клітинного росту і репарації допомогою інгібування полимераз господаря. Таким чином, вимога фосфорилювання ендогенними киназами і селективності по відношенню до ендогенних полімеразам накладає суворі вимоги на структуру потенційних нуклеозидних терапевтичних засобів.

НУКЛЕОЗИДНІ ПРОЛІКИ

У той час як нуклеозиди часто є потужними противірусними і хіміотерапевтичними агентами, їх практична користь часто обмежується двома факторами. По-перше, погані фармакокінетичні властивості часто обмежують поглинання нуклеозиду з кишечника; і, по-друге, субоптимальні фізичні властивості обмежують можливості приготування у вигляді препарату, які могли б застосовуватися для поліпшення доставки активного інгредієнта.кою активності, але яке здатне до метаболическому перетворенню до активної лікарської речовини (A. Albert, Selective Toxicity, Chapman and Hall, London, 1951). Нещодавно були зроблені огляди проліків (Р. Ettmayer etal., J. Med Chem. 2004 47(10):2393-2404; К. Beaumont et al., Curr. Drug Metab. 2003 4:461-485; H. Bundgaard, Design of Prodrugs: Bioreversible derivatives for various functional groups and chemical entities in Design of Prodrugs, H. Bundgaard (ed) Elsevier Science Publishers, Amersterdam 1985; G. M. Pauletti et al. Adv. Drug Deliv. Rev.1997 27:235-256; R. J. Jones and N. Bischofberger, Antiviral Res. 1995 27; 1-15 С. and R. Wagner et al., Med. Res. Rev. 2000 20:417-45). У той час як метаболічне перетворення може катализироваться специфічними ферментами, часто гидролазами, активне з'єднання також може регенерувати допомогою неспецифічних хімічних процесів.

Термін «фармацевтично прийнятні проліки» відноситься до з'єднання, яке метаболізується, наприклад гідролізується або окислюється, у господаря з утворенням сполуки з цим винаходу. При биопревращении повинно припинятися освіта фрагментів з токсикологическими схильностями. Типові приклади проліків включають сполуки, які мають біологічно лабільні захисні групи, пов'язані з функціональною угрупованням активного з'єднання. При конструюванні пронуклеотидов використовували алкілування, ацилироотиди можуть гидролизоваться або деалкилироваться in vivo з генерацією активного з'єднання.

Факторами, що обмежують пероральну біодоступність, часто є поглинання із шлунково-кишкового тракту і екскреція першого проходу стінки кишки і печінки. Оптимізація трансклеточного поглинання через РК тракт вимагає D(7,4)більшого, ніж нуль. Оптимізація коефіцієнта розподілу, однак, не гарантує успіх. Проліки можливо має уникати активних виводять транспортерів в энтероците. Внутрішньоклітинний метаболізм в энтероците може призводити до пасивного транспорту або активного транспорту метаболіту виводять насосами назад в просвіт кишки. Проліки також повинно чинити опір небажаним биопревращениям у крові до досягнення клітин-мішеней або рецепторів.

Часто потрібні високі рівні противірусних лікарських засобів в системі кровообігу для підтримання достатньо високих рівнів API (активний фармацевтичний інгредієнт) в крові для того, щоб мінімізувати ризик генерації стійких популяцій. Наприклад, у недавніх дослідженнях використовували дози складного (2R,3R,4R,5R)-5-(4-аміно-2-оксо-2Н-піримідин-1-іл)-4-фтор-2-изобутирилоксиметил-4-метил-тетрагидро-фуран-3-мулового ефіру изомасляной кислоти (II: R7128) аж до 1500 мг BID (двічі на з� 44th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver (EASL), Copenhagen, Denmark, Apr 22-Apr 26, 2009). Це часто призводить до високих добових доз, для яких потрібен великий розмір пігулки або капсули, або більш часте введення лікарської форми. Коли потрібні високі дози активного фармацевтичного інгредієнта, можливість додавання розчинників або эксципиентов для поліпшення біодоступності часто обмежується. Таким чином, розробка нових інгібіторів полімерази HCV вимагає ідентифікації сполук, які є біодоступними, перетворюються у відповідний трифосфат і є потужними інгібіторами полімерази HCV.

Обов'язкова вимога для фосфорилювання in vivo нещодавно призвело до інтересу до нуклеозидмонофосфатним пролекарствам, що містить замасковану фосфатну групу, яка є чутливою до внутрішньоклітинної активації ферментативної, що призводить до утворення) нуклеозидмонофосфата. Оскільки при утворенні нуклеозидтрифосфатов стадією, лімітуючої швидкість, є перша стадія, яка приводить до монофосфату, подальше додавання другого і третього фосфатів легко йде на основі монофосфату (дивіться, наприклад, Р. Perrone et al., J. Med. Chem., 2007, 50(8):1840; S. J. Heckerand M. D. Erion, J. Med Chem. 2008 51(8):2328).

Хімічна модифікація актЎ, яка може демонструвати небажані фізичні, хімічні і біологічні властивості, відсутні у батьківської сполуки. Нормативні вимоги для ідентифікації метаболітів можуть створювати проблеми, якщо численні шляхи приводять до безлічі метаболітів. Таким чином, ідентифікація проліків залишається невизначеною і кидає виклик завданням. Крім того, оцінка фармакокінетичних властивостей потенційних проліків є кидає виклик і витратним підприємством. Фармакокінетичні результати від тварин моделей може бути складно екстраполювати на людей.

Метою справжнього винаходу є пропозиція нових сполук, способів і композицій для лікування господаря, інфікованої вірусом гепатиту С.

КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ

В даний час відсутня запобіжне лікування або зазвичай ефективна терапія для лікування інфекцій вірусом гепатиту С (HCV). Схвалені в даний час терапії, які тільки існують проти HCV, мають обмежену ефективність і пов'язані з серйозними побічними ефектами. Отже, важливою є розробка і розвиток нових більш ефективних терапій з меншою токсичністю.і R2(1) в кожному випадку незалежно обрані з групи, що складається з водню, C1-6алкилкарбонила, З1-6алкоксикарбонила і З1-6аминоалкилкарбонила або

(2) взяті в сукупності і R1і R2угруповання разом являють собою З(=O);

R3являє собою водень, З1-6алкилкарбонил, З1-6алкоксикарбонил або C1-6аминоалкилкарбонил;

і їх фармацевтично прийнятною солі за умови, що принаймні один з R1, R2і R3відрізняється від водню.

Згідно з цим винаходу також запропонований спосіб лікування захворювання - вірусної інфекції вірусом гепатиту С (HCV) шляхом введення терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I пацієнта, що потребує цього. З'єднання можна вводити одне або вводити разом з іншими противірусними сполуками або імуномодуляторами.

Згідно з цим винаходу також запропоновано спосіб інгібування реплікації HCV в клітині шляхом введення сполуки згідно з формулою I в ефективному кількості для інгібування HCV.

Згідно з цим винаходу також запропоновано фармацевтична композиція, що містить з'єднання згідно формул�НЯ ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Фіг.1а ілюструє профіль фосфорилювання 4'-AU (4'-азидо-урацил) у клітинах з репликоном HCV.

Фіг.16 ілюструє профіль фосфорилювання 4'AU в людських гепатоцитах.

Фіг.2а ілюструє профіль фосфорилювання 4'AU в РВМС (одноядерні клітини периферичної крові). Фіг.26 і Фіг.2в ілюструють профіль фосфорилювання 4'-азидо-цитидина (4'-АС) в РВМС після 1 год інкубації і 120 год інкубації відповідно.

Фіг.3а і 3б забезпечують порівняння профілю фосфорилювання 4'-AU у первинних людських гепатоцитах, клітинах кісткового мозку і РВМС. Подібні профілі були отримані у 3 донорів.

Фіг.4 ілюструє ефективність 4'AU порівняно з 4'-АС в людських гепатоцитах.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Триацильние похідні 4'-азидо-цитидина (4'-АС) досліджували в якості інгібіторів полімерази NS5B HCV (К. Klumpp et al; J. б/о. Chem., 2008 283(4):2167-2176). На жаль, незважаючи на те, що 4'-АС являє собою потужний інгібітор вірусної реплікації, клінічні дослідження були зупинені розвитком небажаних побічних ефектів. Родинний пиримидиновий нуклеозид, 4'-азидо-уридин (4'-AU) не був активним в аналізі репликона, який широко використовується для оцінки потенційних інгібіторів полиме аналізі полімерази HCV він ингибировал фермент з Ki0,038±8 мкМ порівняно з Ki0,040±25 мкМ для 4'-азидо-цитидинтрифосфата (D. Smith et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007 17:2570). Отже, передбачалося, що відсутність активності в аналізі репликона вказує на те, що 4'AU не фосфорилировался in vivo. Це пояснення було підтримано демонстрацією того, що, в той час як 4'-АС фосфорилировался РВМС (одноядерні клітини периферичної крові), 4'-AU не перетворювався на відповідний фосфорильований нуклеозид (ФІГ.1).

Тепер несподівано виявили, що фосфорилювання 4'AU дійсно ефективно здійснюється в первинних людських гепатоцитах (ФІГ.2). Оскільки специфічне стосовно клітини фосфорилювання відбувається в тканини-мішені для реплікації HCV, є потенціал для терапії селективно фосфорилированним нуклеозидів, що додатково свідчить про те, що обмежене фосфорилювання в інших клітинах можливо буде приводити до менших можливостей для несприятливою токсичності.

Елемент в однині тут використовується стосовно одного чи більш ніж одного такого елемента, наприклад «з'єднання» відноситься до одного чи більш ніж одному з'єднанню або принаймні одному з'єднанню. Терміни у единствеЕь використовуватися як взаємозамінні.

Фраза «як визначено тут вище» відноситься до найширшого визначенням для кожної групи, як наведено в короткому викладі сутності винаходу або в самому широкому пункті формули винаходу. У всіх інших втіленнях, наведених нижче, заступники, які можуть бути присутніми в кожному втіленні і які прямо не визначені, зберігають саме широке визначення, наведене в короткому викладі суті винаходу.

Терміни «включають(ет)» і «включає» в тому вигляді, як вони використовуються в даному описі винаходу, або в перехідній фразі, або в основної частини пункту формули винаходу, слід інтерпретувати як мають значення, допускає поправки. Тобто, дані терміни слід інтерпретувати синонімічне фразам "має щонайменше" або "включає щонайменше". При використанні в контексті способу термін «включає» означає те, що спосіб включає щонайменше перераховані стадії, але може включати додаткові стадії. При використанні в контексті сполуки або композиції термін «включає» означає те, що з'єднання або композиція включає щонайменше перераховані характеристики або компоненти, але також може включати �, �то змінна використовується в будь-якому випадку незалежно від присутності або відсутності змінної, що має таку ж або інше визначення, в межах того ж самого з'єднання. Таким чином, у з'єднанні, в якому R" з'являється двічі і визначається як «незалежно вуглець або азот», обидва R" можуть представляти собою вуглець, обидва R" можуть представляти собою азот, або один R" може представляти собою вуглець, а інший - азот.

Коли будь-яка змінна (наприклад, R1, R4a, Аг, X1або Het) зустрічається більше, ніж один раз у будь-якому угрупованні або формулою, що відображає і описує з'єднання, що застосовуються або заявлені в цьому винаході, її визначення при кожній появі є незалежним від її визначення при кожному іншому появі. Також комбінації заступників та/або змінних є дозволеними, тільки якщо такі сполуки призводять до стабільних сполук.

Кожен з символів«*»наприкінці зв'язку або«----»намальований через зв'язок, відноситься до точки приєднання функціональної групи або іншої хімічної угруповання до іншої молекулі, частиною якої вона є. Таким чином, наприклад:

MeC(=O)OR4деТермін «можливий» або «можливо» в тому вигляді, як він тут використовується, означає те, що подія або обставина, описане далі, може, але не обов'язково відбувається, і що опис включає випадки, коли подія або обставина відбувається, і випадки, в яких воно відбувається. Наприклад, «можливе замещенний» означає те, що можливо заміщена угруповання може включати водень або заступник.

Термін «приблизно» використовується тут для позначення приблизно, в районі, грубо або близько. При використанні терміна «приблизно» в поєднанні з числовим інтервалом він модифікує даний інтервал, розширюючи межі вище і нижче викладених числових значень. Загалом, термін «приблизно» використовується тут для модифікації числового значення вище і нижче заявленого значення на відхилення 20%.

Перерахування числового інтервалу для змінної в тому вигляді, як воно тут використовується, призначене для вираження того, що винахід можна втілювати на практиці з змінної, що дорівнює кожному зі значень в межах даного інтервалу. Таким чином, для змінної, яка є дискретною п� кінцеві точки інтервалу. Аналогічно, для змінної, яка є неперервною за своєю природою, змінна може бути дорівнює будь-якому реальному значенню з числового інтервалу, включаючи кінцеві точки інтервалу. В якості прикладу, змінна, яка описана, як має значення від 0 і 2, може становити 0, 1 або 2 для змінних, які є дискретними за своєю природою, і може становити 0,0; 0,1; 0,01; 0,001 або будь-яке інше реальне значення для змінних, які є неперервними за своєю природою.

З'єднання формули I демонструють таутомерію. Таутомерні з'єднання можуть існувати у вигляді двох або більше двох з'єднань, здатних до взаємного перетворення. Прототропние таутомери утворюються в результаті міграції ковалентно зв'язаного атома водню між двома атомами. Таутомери зазвичай існують у рівновазі, і спроби виділити індивідуальні таутомери зазвичай дають суміш, хімічні та фізичні властивості якої узгоджуються з сумішшю сполук. Положення рівноваги залежить від хімічних властивостей в межах молекули. Наприклад, у багатьох аліфатичних альдегідів та кетонів, таких як ацетальдегід, переважає кето форма, тоді як у фенолів переважає енольная форма. Звичайні прототроп�" /> і амидиновиетаутомери. Останні два є особливо звичайними в гетероарильних і гетероциклічних кільцях, і даний винахід охоплює всі таутомерні форми сполук.

У першому втіленні цього винаходу запропоновано з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище.

У другому втіленні цього винаходу запропоновано з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3являють собою1-6алкилкарбонил.

У третьому втіленні цього винаходу запропоновано з'єднання згідно з формулою I, де R1і R2являють собою1-6алкилкарбонил, і R3являє собою водень.

У четвертому втіленні цього винаходу запропоновано з'єднання згідно з формулою I, де R1і R2являють собою водень, і R3являє собою C1-6алкилкарбонил або З1-6аминоалкилкарбонил.

У п'ятому втіленні цього винаходу запропоновано з'єднання, вибране із з'єднань 1-1 -1-6 ТАБЛИЦІ I.

У шостому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, 2 і R3є такими, як зазначено тут вище. У всіх інших втіленнях, наведених нижче, заступники, які можуть бути присутніми в кожному втіленні, і які явно не визначені, зберігають саме широке визначення, наведене в короткому викладі суті винаходу.

У сьомому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3являють собою1-6алкилкарбонил.

У восьмому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1і R2являють собою1-6алкилкарбонил, і R3являє собою водень.

У дев'ятому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1і R2являють собою водень, і R3являє собою C1-6алкилкарбония HCV інфекції, включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, і спільне введення щонайменше одного модулятора імунної системи та/або щонайменше одного противірусного агента, який інгібує реплікацію HCV.

В одинадцятому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, і спільне введення щонайменше одного модулятора імунної системи, вибраного з групи, що складається з інтерферону, інтерлейкіну, фактора некрозу пухлин та колонієстимулюючого фактора.

У дванадцятому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, і спільне введення щонайменше одного модулятора імунної систеон.

У тринадцятому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, і спільне введення щонайменше одного противірусного агента, який інгібує реплікацію HCV.

У чотирнадцятому втіленні цього винаходу запропоновано спосіб лікування HCV інфекції, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, і спільне введення щонайменше одного противірусного агента, вибраного з групи, що складається з інгібітора протеази HCV, іншого нуклеозидного інгібітора полімерази HCV, ненуклеозидного інгібітора полімерази HCV, інгібітора хеликази HCV, інгібітора праймази HCV та інгібітори злиття HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як зазначено тут вище, для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні нас�ними, як визначено тут вище, для виготовлення лікарського засобу для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3являють собою C1-6алкилкарбонил, для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування сполуки формули I, де R1, R2і R3являють собою C1-6алкилкарбонил, для виготовлення лікарського засобу для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1і R2являють собою C1-6алкилкарбонил, і R3являє собою водень, для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування сполуки формули I, де R1і R2являють собою1-6алкилкарбонил, і R3являє собою водень, для виготовлення лікарського засобу для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1і R2являють собою водень, і R3представ�лощении цього винаходу запропоновано застосування сполуки формули I, де R1і R2являють собою водень, і R3являє собою1-6алкилкарбонил або З1-6аминоалкилкарбонил, для виготовлення лікарського засобу для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, у комбінації з по меншій мірі одним модулятором імунної системи та/або щонайменше одним противірусну агентом, який інгібує реплікацію HCV, для лікування інфекції HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, для лікування HCV інфекції у комбінації з по меншій мірі одним модулятором імунної системи, вибраним з групи, що складається з інтерферону, інтерлейкіну, фактора некрозу пухлини та колонієстимулюючого фактора.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, для лікування HCV інфекції у комбінації з по меншій мірі одним модулятором імунної срферон.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, для лікування HCV інфекції у комбінації з по меншій мірі одним антивірусним агентом, який інгібує реплікацію HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропоновано застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, для лікування HCV інфекції у комбінації з по меншій мірі одним антивірусним агентом, вибраним з групи, що складається з інгібітора протеази HCV, іншого нуклеозидного інгібітора полімерази HCV, ненуклеозидного інгібітора полімерази HCV, інгібітора хеликази HCV, інгібітора праймази HCV та інгібітори злиття HCV.

В іншому втіленні цього винаходу запропонована фармацевтична композиція, що містить терапевтично ефективна кількість сполуки згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як описано вище, змішаного з принаймні одним фармацевтично прийнятним носієм, розчинником або эксципиентом.

Термін «алкилкарбонил» в тому вигляді, як він тут використовується, позначає групу Ѹтся до групи-C(=O)R, яка містить від 1 до 6 атомів вуглецю. 1цильная [або «алканоильная»] група являє собою формильную групу, де R=Н, і З6ацильная група відноситься до гексаноилу, коли алкильная ланцюг є нерозгалужене. Термін «арилкарбонил» або «ароил» в тому вигляді, як він тут використовується, означає групу формули C(=O)R, де R являє собою арильную групу; термін «бензоїл» в тому вигляді, як він тут використовується, являє собою «арилкарбонильную» або «ароильную» групу, де R являє собою феніл.

Терміни «алкоксикарбонил» і «арилоксикарбонил» в тому вигляді, як вони тут використовуються, означають групу формули C(=O)OR, де R являє собою алкіл або арил відповідно, і алкіл і арил є такими, як тут визначено.

Термін «аминоалкилкарбонил» в тому вигляді, як він тут використовується, відноситься до алкилкарбонильной угруповання, як тут визначено, де один водень замінений аміногрупою. Термін «1-6аминоалкилкарбонил» визначає C1-6алкилкарбонильную групу. Приклади аминоалкилкарбонильних угруповань включають, але не обмежуються глицильной [СОСН22], аланильной [СОСН(NН2)Мо], валинильной [СОСН(NН2)СНМе22)(СН2)3Мо] і тому подібними. Це визначення не обмежується зустрічаються в природі амінокислотами.

Зазвичай використовуються скорочення включають: ацетил (Ас), водний (водн.), 4АС (4-азидоцитидин), 4AU (4-азидоуридин), 4AU-MP (4-азидоуридина монофосфат), 4AU-DP (4-азидоуридина дифосфат), 4AU-TP (4-азидоуридина трифосфат), атмосфери (атм.), mpem-бутоксикарбонил (Вос), ді-трет-бутилпирокарбонат або ангідрид Ше (ВОС2O), бензил (Вп), бутил (Ві), реєстраційний номер Chemical Abstracts (CASRN), бензилоксикарбонил (CBZ або Z), карбонилдиимидазол (CDI), N,N'-дициклогексилкарбодіімід (DCC), 1,2-дихлоретан (DCE), дихлорметан (DCM), диэтилазодикарбоксилат (DEAD), ді-ізо-пропилазодикарбоксилат (DIAD), ді-ізо-бутилалюминия гідрид (DIBAL або DIBAL-Н), ді-ізо-пропилэтиламин (DIPEA), N,N-диметилацетамид (DMA), 4-N,N-диметиламинопиридин (DMAP), N,N-диметилформамід (DMF), диметилсульфоксид (DMSO), етил (Et), етанол (ЕtOН), 1-(3-диметиламінопропіл)-3-этилкарбодиимида гідрохлорид (EDCl), етилацетат (ЕtOАс), складний етиловий ефір 2-етокси-2Н-хинолин-1-карбонової кислоти (EEDQ), діетиловий ефір (Et2O), оцтова кислота (НОАс), 1-N-гидроксибензотриазол (HOBt), високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), ізо-пропанол (IPA), метанол (МеОН), температура плавлення (Тпл.), MeSO2-(ловий ефір (МТВЕ), N-метилморфолин (NMM), N-метилпирролидон (NMP), феніл (Ph), пропіл (Рг), ізо-пропіл (i-Pr), фунти на квадратний дюйм (psi), піридин (pyr), кімнатна температура (Т кімн.), насищ. (насичений), трет-бутилдиметилсилил або t-BuMe2Si (TBDMS), триетиламін (TEA або Et3N), трифлат або СF3SO2-(Tf), трифторуксусная кислота (TFA), O-бензотриазол-1-іл-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат (TBTU), тонкошарова хроматографія (ТШХ), тетрагідрофуран (THF), тетраметилэтилендиамин (TMEDA), триметилсилил або Me3Si (TMS), пара-толуолсульфоновой кислоти моногідрат (TsOH або pTsOH), 4-Ме-6Н4SO2-або тозил (Ts), N-уретан-N-карбоксиангидрид (UNCA). Традиційна номенклатура, що включає префікси нормальний (н-), з (з-), вторинний (втор-), третинний (трет-) і нео-, які мають їх традиційне значення при використанні з алкільного угрупованням. (J. Rigaudy and D. P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979 Pergamon Press, Oxford.).

З'ЄДНАННЯ І ПРЕПАРАТИ

У наступній таблиці наведено приклади репрезентативних сполук, охоплених цим винаходом і знаходяться в межах обсягу винаходу. Дані приклади і отримання, які випливають, наведено для того, щоб дати можливість фахівцям в даній області більш чітко зрозуміти і вопл�, �про просто як ілюстративні і представляють його.

Загалом, номенклатура, використовувана в даній заявці, заснована на AUTONOM™ v.4.0, комп'ютеризованій системі інституту Бельштейна для генерації систематичної номенклатури IUPAC (Міжнародний союз теоретичної та прикладної хімії). Якщо існує розбіжність між зображеної структурою і назвою, що дано цій структурі, слід надавати більшу вагу зображеної структурі. Крім того, якщо стереохімія структури або частини структури не вказана, наприклад, жирними або пунктирними лініями, структуру або частину структури слід інтерпретувати як охоплює всі її стереоізомери.

Таблиця 1
№ соед.СпосібMC (M+H)+Т пл.
R1R2СпосібMCТ пл.
1-1398118-120
1-2i-PrC(=O)i-PrC(=O)A496
1-3EtC(=O)EtC(=O)A111-113
1-4MeC(=O)MeC(=O)A158
1-5n-BuC(=O)n-BuC(=O)A64
1-6EtC(=O)HВ340 [M-H]148-150
1-7C7H15C(=O)HВ412

З'єднання по справжньому зобр�пов'язаних і описаних нижче. Вихідні речовини та реактиви, використовувані при отриманні даних сполук, зазвичай або доступні від комерційних постачальників, таких як Aldrich Chemical Co., або виходять способами, відомими фахівцям в даній області, слідуючи методиками, викладеними в посиланнях, таких як Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis; Wiley & Sons: New York, Volumes 1-21; R. C. LaRock, Comprehensive Organic Transformations, 2ndedition Wiley-VCH, New York 1999; Comprehensive Organic Synthesis, B. Trost and I. Fleming (Eds.) vol.1-9 Pergamon, Oxford, 1991; Comprehensive Heterocyclic Chemistry, A. R. Katritzky and C. W. Rees (Eds) Pergamon, Oxford 1984, vol.1-9; Comprehensive Heterocyclic Chemistry II, A. R. Katritzky and C. W. Rees (Eds) Pergamon, Oxford 1996, vol.1-11; і Organic Reactions, Wiley & Sons: New York, 1991, Volumes 1-40. Такі схеми синтетичних реакцій є лише ілюстративними для деяких способів, за допомогою яких можна синтезувати з'єднання по справжньому винаходу, і можна зробити різні модифікації даних схем синтетичних реакцій, і вони будуть запропоновані фахівця в даній області з посиланням на розкриття, що міститься в даній заявці.

Вихідні речовини та проміжні сполуки схем синтетичних реакцій, при необхідності, можна виділяти і очищати, використовуючи традиційні методики, які включають, але не обмежуються, фільтруванням, перегонкою, кристалізацією, хроматографією і тому подібну�анти і спектральні дані.

Якщо не вказано протилежне, описані реакції переважно проводять в інертній атмосфері при атмосферному тиску, в інтервалі температур реакції від приблизно -78°С до приблизно 150°С, більш переважно приблизно від 0°С до приблизно 125°С і найвпевненіше і зручно - приблизно при кімнатній (або навколишнього середовища) температурі, наприклад, приблизно 20°С.

Деякі з'єднання на таких схемах зображено з узагальненими заступниками; однак, фахівець в даній області негайно зрозуміє, що природа R груп може варіювати з отриманням різних сполук, розглянутих у цьому винаході. Крім того, умови реакцій є зразковими, і альтернативні умови добре відомі. Мається на увазі, що послідовності реакцій у наступних прикладах не обмежують обсяг винаходу, як викладено у формулі винаходу.

З'єднання по справжньому винаходу можна отримувати ацилированием 4-азидо-урацилу (CASRN 139442-01-6) або його захищеного похідного, наприклад, 2',3'-ацетонида (CASRN 690271-27-3). Обробка 4'AU активованим похідним карбонової кислоти, таким як хлорангидрид або ангідрид кислоти, дає триацильние похідні. Обробка відповідного ацетон�ак він тут використовується, належить до хімічної групи, яка (а) ефективно поєднується з реакційноздатні групи в молекулі; (б) запобігає участь реакційноздатні групи в небажаної хімічної реакції і (в) може бути легко вилучена після того, як більше не потрібен захист реакційноздатні групи. Захисні групи використовуються в синтезі для того, щоб тимчасово маскувати характерні хімічні властивості функціональної групи, оскільки вона заважає іншій реакції. Реактиви і протоколи для введення і видалення захисних груп добре відомі і розглядалися в численних публікаціях (наприклад Т. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rdedition, John Wiley & Sons, New York, 1999 і Harrison and Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 John Wiley and Sons, 1971-1996). Фахівець в галузі хімії зрозуміє, що іноді протоколи повинні бути оптимізовані для конкретної молекули, і така оптимізація знаходиться повністю в межах здібностей спеціаліста в даних областях.

2',3'-Диацил-4'-АU похідні отримували ферментативним способом. 5'-Ацил-4'-АU похідні отримували ацетилированием 2',3'-ацетонида 4'-AU (приклад 3) або селективним ацилированием 4'-AU, катализируемим ферментом.

ДОЗУВАННЯ І ВВЕДЕННЯ

З'єднання по насѵй для перорального введення. Пероральне введення може здійснюватися у формі таблеток, покритих таблеток, драже, твердих і м'яких желатинових капсул, розчинів, емульсій, сиропів або суспензій. З'єднання по справжньому винаходу є ефективними при введенні іншими шляхами введення, включаючи безперервне (внутрішньовенне крапельне введення), місцеве, парентеральне, внутрішньом'язове, внутрішньовенне, підшкірне, черезшкірне (яке може включати (застосування) агента, що посилює проникнення), буккальное, назальне, інгаляцію або введення супозиторія, поряд з іншими шляхами введення. Кращим способом введення зазвичай є пероральне з використанням зручною добової схеми дозування, яку можна коригувати відповідно до ступеня недуги і відповіді пацієнта на активний інгредієнт.

З'єднання або з'єднання по справжньому винаходу, а також їх фармацевтично корисні солі, спільно з одним чи більш ніж одним традиційним эксципиентом, носієм або розріджувачем, можна випускати у формі фармацевтичних композицій і лікарських форм. Фармацевтичні композиції і стандартні лікарські форми можуть складатися з традиційних інгредієнтів в традиційних пропорціях, з або без до�най ефективне кількість активного інгредієнта, співмірну з наміченим добовим інтервалом дози, що підлягає застосуванню. Фармацевтичні композиції можуть застосовуватися в твердому вигляді, такому як таблетки або заповнені капсули, напівтверді речовини, порошки, препарати уповільненого вивільнення, або (у вигляді) рідин, таких як розчини, суспензії, емульсії, еліксири або заповнені капсули для перорального застосування; або у формі супозиторіїв для ректального або вагінального введення; або у формі стерильних ін'еціруемих розчинів для парентерального застосування. Типовий препарат буде містити приблизно від 5% до 95% активного з'єднання або сполук (мас./мас.). Мається на увазі, що термін «препарат» або «лікарська форма» включає і тверді, і рідкі препарати активного з'єднання, і фахівець в даній області зрозуміє, що активний інгредієнт може існувати в різних препаратах, в залежності від органу або тканини-мішені і від бажаної дози і фармакокінетичних параметрів.

Термін «эксципиент» в тому вигляді, як він тут використовується, відноситься до з'єднання, яке є корисним при отриманні фармацевтичної композиції, зазвичай безпечним, нетоксичним і ні біологічно, ні іншим способом нежелаацевтического застосування у людини. З'єднання з даного винаходу можна вводити одні, але зазвичай вони будуть вводитися в суміші з одним чи більш ніж одним відповідним фармацевтичним эксципиентом, розчинником або носієм, обраним, беручи до уваги намічений шлях введення і стандартну фармацевтичну практику.

«Фармацевтично прийнятний» означає те, що є корисним у приготуванні фармацвтической композиції, що зазвичай є безпечним, нетоксичним і ні біологічно, ні іншим способом небажаним, і включає те, що є прийнятним для фармацевтичного застосування у людини.

«Фармацевтично прийнятна сольова форма активного інгредієнта також може початково надавати активного інгредієнта бажані фармакокінетичні властивості, які відсутні у несолевой форми, і може позитивно впливати на фармакодинаміку активного інгредієнта щодо його терапевтичної активності в організмі. Фраза «фармацевтично прийнятна сіль» з'єднання означає сіль, яка є фармацевтично прийнятною і яка має бажаною фармакологічною активністю батьківського з'єднання. Такі солі включають: (1) солі приєднання кислоти, утворені � кислота, фосфорна кислота тощо; або утворені з органічними кислотами, такими як оцтова, пропіонова кислота, гексанової кислота, циклопентанпропионовая кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, молочна кислота, малоновая кислота, янтарна кислота, яблучна кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-етан-дисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбонова кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, третинна бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконова кислота, глутамінова кислота, гидроксинафтоевая кислота, саліцилова кислота, стеаринова кислота, муконовая кислота тощо; або (2) солі, що утворюються коли кислотний протон, присутній в батьківському з'єднанні або ^замінюється іоном металу, напримческим підставою, таким як етаноламін, діетаноламін, триетаноламін, трометамін, N-метилглукамин і тому подібним.

Препарати у твердій формі включають порошки, таблетки, капсули, крохмальні облатки, супозиторії та водорозчинні гранули. Твердий носій може бути одним чи більш ніж одним речовиною, яка також може діяти в якості розріджувача, корригента, солюбилизатора, мастила, суспендують агента, сполучного речовини, консерванти, агента-розпушувача таблетки або инкапсулирующего речовини. В порошках носій зазвичай являє собою дрібно подрібнене тверда речовина, яка є сумішшю з дрібно подрібненим активним компонентом. У таблетках активний компонент зазвичай змішують з носієм, що має необхідну зв'язуючу здатність, у відповідних пропорціях і пресують до бажаної форми і розміру. Відповідні носії включають, але не обмежуються, карбонатом магнію, стеаратом магнію, тальком, цукром, лактозою, пектином, декстрином, крохмалем, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, натрій карбоксиметилцелюлоза, низкоплавким воском, маслом какао і тому подібним. Препарати у твердій формі, крім активного компонента, можуть містити барвники, коррсолюбилизирующие агенти тощо.

Рідкі препарати також підходять для перорального введення (і) включають рідкі препарати, що включають емульсії, сиропи, еліксири, водні розчини, водні суспензії. Вони включають препарати у твердій формі, які призначені для перетворення на препарати в рідкій формі незадовго до застосування. Емульсії можна готувати в розчинах, наприклад, у розчинах водного пропіленгліколю, або вони можуть містити емульгуючі агенти, такі як лецитин, сорбитана моноолеат або аравійську камедь. Водні розчини можна готувати розчиненням активного компонента у воді та додаванням відповідних барвників, корригентов, стабілізаторів і загусників. Водні суспензії можна готувати диспергуванням дрібно подрібненого активного компонента у воді з в'язким речовиною, таким як природні або синтетичні камеді, смоли, метилцелюлоза, натрій карбоксиметилцелюлоза та інші добре відомі суспендирующие агенти.

З'єднання по справжньому винаходу можуть бути приготовлені у вигляді препарату для парентерального введення (наприклад, шляхом ін'єкції, наприклад, болюсної ін'єкції або безперервної інфузії) і можуть бути представлені в стандартних лікарських формах - в ампулах, попередньо зерванта. Композиції можуть приймати такі форми, як суспензії, розчини або емульсії в масляних або водних наповнювачах, наприклад, розчини у водному полиэтиленгликоле. Приклади масляних або неводних носіїв, розріджувачів, розчинників або наповнювачів включають пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії (наприклад, оливкова олія) і инъецируемие органічні складні ефіри (наприклад, этилолеат), і вони можуть містити агенти для приготування препарату, такі як консерванти, зволожувачі, емульгуючі або суспендирующие, стабілізуючі та/або диспергуючі агенти. В якості альтернативи, активний інгредієнт може бути у формі порошку, отриманого асептичним виділенням стерильного твердої речовини або лиофилизацией з розчину, для розведення перед застосуванням відповідним наповнювачем, наприклад, стерильної апірогенної водою.

З'єднання по справжньому винаходу можуть бути приготовлені у вигляді препарату для місцевого введення в епідерміс у вигляді мазей, кремів або лосьйонів, або у вигляді черезшкірного пластиру. Мазі і креми, наприклад, можуть бути приготовлені у вигляді препаратів з водною або масляною основою з додаванням відповідних загусників та/або гелеобразующ�удут містити один або більше ніж один емульгатор, стабілізатор, диспергирующий агент, суспендують агент, загущувач або барвник. Препарати, що підходять для місцевого введення в рот, включають ромбоподібні коржі, що містять активні агенти в ароматизованої основі, зазвичай сахарозі і аравійської камеді або трагакантовой камеді; пастилки, що містять активний інгредієнт в інертному основі, такий як желатин і гліцерин або сахароза і аравійська камедь; і полоскання для порожнини рота, що містять активний інгредієнт у відповідному рідкому носії.

З'єднання по справжньому винаходу можуть бути приготовлені у вигляді препарату для введення у вигляді супозиторіїв. Низкоплавкий віск, такий як суміш гліцеридів жирних кислот або масла какао, спочатку плавлять, і активний компонент гомогенно диспергируют, наприклад, перемішуванням. Розплавлену гомогенну потім вливають суміш в форми зручного розміру, дають охолонути і затвердіти.

З'єднання по справжньому винаходу можуть бути приготовлені у вигляді препарату для вагінального введення. У цій області відомі як відповідні песарії, тампони, креми, гелі, пасти, піни або спреї, що містять, крім активного інгредієнта, такі носії. З'єднання по справжньому винаходу можуть бути пса традиційними способами, наприклад, крапельницею, піпеткою або (у вигляді спрею. Препарати можна надавати в одно - або многодозовой формі. В останньому випадку крапельниці або піпетки, це може досягатися введенням пацієнтом відповідного заданого об'єму розчину або суспензії. У разі спрею, це може досягатися, наприклад, за допомогою дозуючого атомизирующего насоса для розпилення.

З'єднання по справжньому винаходу можна готувати у вигляді аерозольного препарату для введення, зокрема, у респіраторний тракт і включаючи введення в ніс. З'єднання зазвичай буде мати маленький розмір частинок, наприклад, близько п'яти (5) мікрометрів або менше. Такий розмір часток може бути отриманий способами, відомими в даній галузі, наприклад, микронизацией. Активний інгредієнт надається в упаковці під тиском з відповідним пропеллентом, таким як хлорфторуглерод (CFC), наприклад, дихлордифторметан, трихлорфторметан або дихлортетрафторэтан, або діоксид вуглецю, або інший відповідний газ. Аерозоль також із зручністю може містити поверхнево-активна речовина, таке як лецитин. Доза лікарського засобу може контролюватися дозуючим клапаном. В якості альтернативи, активні інгредієнти можуть �ове, такий як лактоза, крохмаль, похідні крохмалю, такі як гідроксипропілметилцелюлоза і полівінілпіролідон (PVP). Порошковий носій буде утворити гель в порожнині носа. Порошкова композиція може бути представлена у звичайній лікарській формі, наприклад, у капсулах або картриджах з, наприклад, желатину, або в блистерних упаковках, порошок з яких можна вводити за допомогою інгалятора.

При необхідності препарати можуть бути отримані з энтеросолюбильними покриттями, адаптованими для уповільненого введення активного інгредієнта або введення з контрольованим вивільненням. Наприклад, з'єднання по справжньому винаходу можна готувати у вигляді препаратів в пристроях для черезшкірної або підшкірної доставки лікарського засобу. Дані системи доставки є корисними, коли необхідним є уповільнене вивільнення з'єднання, і коли вирішальним є дотримання пацієнтом схеми лікування. З'єднання в системах черезшкірної доставки часто приєднані до твердої підкладки, яку можна приклеїти на шкіру. Цікавить з'єднання також може бути об'єднано з підсилювачем проникнення, наприклад, Azone (1-додецилаза-циклогептан-2-он). Системи доставки з за�імплантанти інкапсулюють з'єднання в липидорастворимой мембрані, наприклад, силіконової гуми, або в биодеградирующем полімері, наприклад полімолочної кислоті.

Відповідні препарати, поряд з фармацевтичними носіями, розчинниками і эксципиентами, описані в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19 th edition, Easton, Pennsylvania. Кваліфікований вчений в області приготування препаратів може модифікувати препарати в межах доктрини специфікації для надання численних препаратів для конкретного шляху введення, не роблячи композиції по справжньому винаходу нестабільними або не піддаючи ризику їх терапевтичну активність.

Модифікація цих сполук для того, щоб зробити їх більш розчинними у воді або іншому носії, наприклад, може легко здійснюватися мінорними модифікаціями (препарат у вигляді солі, етерифікації та ін), які цілком перебувають у межах звичайної кваліфікації в даній області. Також цілком в межах звичайної кваліфікації в даній області є модифікація шляху введення і схеми дозування конкретного з'єднання для того, щоб управляти фармакокінетики цих сполук для максимально корисного ефекту в пацієнтів.

Термін «терапевтично ефективний кількісних�ня у індивідуума. Доза буде коригуватися до індивідуальних вимог у кожному конкретному випадку. Ця доза може варіювати в широких межах, залежно від численних факторів, таких як тяжкість захворювання, що підлягає лікуванню, вік і загальний стан здоров'я пацієнта, інші лікарські засоби, якими лікують пацієнта, шлях і форма введення, і переваги і досвід бере участь лікаря. Для перорального введення у монотерапії та/або у комбінованій терапії повинна бути відповідною добова доза приблизно від 0,01 до приблизно 1000 мг/кг маси тіла на добу. Бажана добова доза становить приблизно від 0,1 до приблизно 500 мг/кг маси тіла, більш переважно від 0,1 до приблизно 100 мг/кг маси тіла і найбільш переважно від 1,0 до приблизно 10 мг/кг маси тіла на добу. Таким чином, для введення людині, весящему 70 кг, інтервал дозування був би приблизно від 7 мг до 0,7 г на добу. Добову дозу можна вводити у вигляді одиночної дозування або у роздільних дозах, типово від 1 до 5 доз на добу. Загалом, лікування починають із найменших доз, які менше, ніж оптимальна доза з'єднання. Потім дозування збільшується малими приростами, поки не досягається без надмірного експериментування та покладаючись на власні знання, досвід і розкриття даної заявки, зможе встановити терапевтично ефективна кількість з'єднань по справжньому винаходу для даного захворювання і пацієнта.

У втіленнях винаходу активне з'єднання або сіль можна вводити в комбінації з іншим противірусну агентом, таким як рибавірин, нуклеозидний інгібітор полімерази HCV, інший ненуклеозидний інгібітор полімерази HCV або інгібітор протеази HCV. При введенні активного з'єднання або його похідного, або солі в комбінації з іншим противірусну агентом, активність може збільшуватися порівняно з батьківською сполукою. Коли лікування представляє собою комбіновану терапію, таке введення може бути одночасним або послідовним щодо введення нуклеозидних похідних. Таким чином, термін «супутнє введення» в тому вигляді, як він тут використовується, включає введення агентів в той же або в різний час. Введення двох або більше двох агентів в той же самий час може досягатися за допомогою одного препарату, що містить два або більше ніж два активних інгредієнта, або по суті одночасним введенням двох або більше двох лікарських форм з одним активним агентом.

існуючих умов. Крім того, термін «лікування» інфекції HCV в тому вигляді, як він тут використовується, також включає лікування або профілактику захворювання або стану, асоційованого з або опосередкованого HCV інфекцією, або його клінічних симптомів.

Термін «терапевтично ефективна кількість» в тому вигляді, як він тут використовується, означає кількість, необхідну для послаблення симптомів захворювання, у індивідуума. Доза буде коригуватися в кожному конкретному випадку щодо індивідуальних вимог. Ця доза може варіювати в широких межах, залежно від численних факторів, таких як тяжкість захворювання, що підлягає лікуванню, вік і загальний стан здоров'я пацієнта, інші лікарські засоби, якими лікують пацієнта, шлях і форма введення, і переваги і досвід бере участь лікаря. Для перорального введення у монотерапії та/або у комбінованій терапії повинна бути відповідною добова доза приблизно від 0,01 до приблизно 1000 мг/кг маси тіла на добу. Бажана добова доза становить приблизно від 0,1 до приблизно 500 мг/кг маси тіла, більш переважно від 0,1 до приблизно 100 мг/кг маси тіла і найбільш переважно від 1,0 до приблизно 10 мг/кг ммг до 0,7 г на добу. Добову дозу можна вводити у вигляді одиночної дозування або у роздільних дозах, типово від 1 до 5 доз на добу. Загалом, лікування починають із найменших доз, які менше, ніж оптимальна доза з'єднання. Потім дозування збільшується малими приростами, поки не досягається оптимальний ефект для індивідуального пацієнта. Звичайний фахівець в лікуванні описаних тут захворювань, без надмірного експериментування та покладаючись на власні знання, досвід та розкриття даної заявки, зможе встановити терапевтично ефективна кількість з'єднань по справжньому винаходу для даного захворювання і пацієнта.

Терапевтично ефективна кількість з'єднання по справжньому винаходу і можливо одного чи більш ніж одного додаткового противірусного агента являє собою ефективне кількість для зниження вірусного навантаження або досягнення тривалого відповіді вірусу на терапію. Корисні індикатори тривалого відповіді, крім вірусного навантаження, включають, але не обмежуються фіброзом печінки, підвищенням сироваткових рівнів трансамінази та некровоспалительной активності в печінці. Одним звичайним прикладом маркера, який розуміється як прим�тичними аналізами. У деяких втілень винаходу ефективною схемою лікування є схема, яка знижує рівні ALT до менше, ніж приблизно 45 IU(міжнародна одиниця)/мл сироватки.

Модифікація цих сполук для того, щоб зробити їх більш розчинними у воді або іншому носії, наприклад, може легко здійснюватися мінорними модифікаціями (препарат у вигляді солі, етерифікації та ін), які цілком перебувають у межах звичайної кваліфікації в даній області. Також цілком в межах звичайної кваліфікації в даній області знаходиться модифікація шляху введення і схеми дозування конкретного з'єднання для того, щоб управляти фармакокінетики цих сполук для максимально корисного ефекту в пацієнтів.

Наступні приклади ілюструють отримання і біологічну оцінку з'єднань у межах обсягу винаходу. Дані приклади і отримання, які випливають, наведено для того, щоб дати можливість фахівцям в даній області більш чітко зрозуміти і втілити на практиці даний винахід. Вони не повинні розглядатися як обмежуючі обсяг винаходу, але просто як ілюстративні і представляють його.

Приклад 1

Спосіб: одержання 2',3',5'-триацилнуклеозидних �усній кислоти (22)

До перемешиваемому розчину, що містить 4'-азидоуридин, (0,330 г, 1,15 ммоль), піридин (2 мл) і оцтовий ангідрид (2 мл), додавали DMAP (0,010 г, 0,08 ммоль). Через 12 год реакційну суміш упарюють насухо при зниженому тиску. Залишок розчиняли в дихлорметане і промивали насиченим водним розчином гідрокарбонату натрію, сушили над сульфатом магнію і упарюють насухо з отриманням 0,42 г(88%) 2',3',5'-триацетокси-4'-азидоуридина (22: Р=СН3, 1-4).

Складний етиловий ефір (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2Н-піримідин-1-іл)-4-этоксикарбонилокси-2-этоксикарбонилоксиметил-тетрагидро-фуран-3-іл-карбонової кислоти (22 R=OEt) можна отримувати аналогічно, за винятком того, що оцтовий ангідрид замінюється зтилхлорформиатом.

Приклад 2

Спосіб Б: отримання 5'-ацилнуклеозидних похідних

Складний (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2Н-піримідин-1-іл)-3,4-дигідрокси-тетрагидро-фуран-2-илметиловий ефір пропіонової кислоти (1-6)

250 мл круглодонную колбу, оснащеної магнітним стрижнем для перемішування, завантажували 20 (5,94 м), винилпропионатом (15 мл) і THF (150 мл). Додавали ліпазу В Candida antarctica (0,74 м, Sigma-Aldrich, рекомбінантна з Aspergillus oryzae, 5865 і(одиниця)/р), иммобилизированную на Immobead 150, і Ѹлпропионата (6 мл) і ферменту (1,11 г), поряд з 10 г 3 А звт. Через одну добу реакційну суміш фільтрували для видалення иммобилизированного ферменту і концентрували у вакуумі. Неочищений продукт очищали SiO2хроматографією, элюируя градієнтом ЕtOАс/гексан (від 50% до 100% ЕtOАс). Після видалення розчинника і сушіння в сильному вакуумі отримували білу піну (4 р). Дана речовина (3,25 г) суспендованих в 3/1 гексани/IPA і перемішували 2 год при Т кімн. Утворюється кристалічна речовина збирали фільтруванням і сушили у вакуумній печі при 75°С з отриманням 3,18 м 1-6: Т пл. 148-150°С.

Фахівець в даній області зрозуміє, що інша загальна методика одержання 5'-ацильних похідних включає ацилювання 4'-азидо-2',3'-O-(1-метилэтилиден)-уридина (CASRN 690271-27-3) хлорангидридами та ангідридами кислот і подальше видалення изопропилиденовой захисної групи при м'яких кислотних умовах, таких як HCI у водних спиртах. (J. A. Martin et al., WO2004/046159, опублікована 3 червня 2004 року, яка тим самим включена допомогою посилання у всій її повноті).

Приклад 3

Складний (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2Н-піримідин-1-іл)-3,4-дигідрокси-тетрагидро-фуран-2-илметиловий ефір пропіонової кислоти (1-6) - альтернативна методика

3-Галі 24 (10 г, 30,7 ммоль, Екв.: 1,00, CASRN 139442-01-6), DMAP (376 мг, 3,07 ммоль, Екв.: 0,1), DIPEA (7,95 м, 10,7 мл, 61,5 ммоль, Екв.: 2,0), ацетонітрилом (47,2 г, 60,0 мл, Екв.: -). Суспензію перемішували 0,5 год, додавали пропионилхлорид (3,05 м, 2,86 мл, 32,3 ммоль, Екв.: 1,05) при 0-10°С протягом 10 хв. Реакційна суміш ставала гомогенної і була нагріта до Т кімн. Реакційну суміш розподіляли між H2O (30 мл) і ЕtOАс (50 мл), і органічну фазу промивали 2 н. HCl (2×30 мл), насищ. водн. NaHCO3(20 мл), розсолом (10 мл), сушили, фільтрували і концентрували у вакуумі з отриманням 15,2 г масла. Отриманий у такий спосіб продукт (5,37 м) розчиняли в розчині IPA (25 мл), 6 н. водн. HCl (12 мл) та гідроксиламіну гідрохлориду (0,8 г). Реакційну суміш перемішували при Т кімн. Реакційну суміш перемішували протягом 5 год, розподіляли між Н2O (30 мл), DCM (50 мл). Органічний шар послідовно промивали насищ. водн. NаНСО3(30 мл), водою (10 мл), сушили, фільтрували і концентрували у вакуумі. Залишок розтирали з гептаном (30 мл) з отриманням 1,27 г 1-6 у вигляді піни.

Приклад 4

Спосіб: одержання 2',3'-диацильних нуклеозидних похідних

Складний (2R,3R,4S,5R)-5-азидо-2-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2Н-піримідин-1-іл)-5-гідроксиметил-4-пропионилокси-тетрагидро-фуран-3-муловий ефір пропіонової до-метилпропионат (28) отримують, як описано в прикладі 1, за винятком того, що оцтовий ангідрид замінюють пропионилхлоридом або пропіоновим ангідридом.

До розчину 28 (4,42 м), розчиненого в гарячому (близько 40°С) МТВЕ (20 мл) додавали фосфатний буфер (27 мл, рН=6,5) і розсіл (0,5 мл). Додавали розчин липолази (5 мл), і реакційну суміш перемішували при 30-35°С протягом приблизно 3 ч. Виявили, що швидкість гідролізу є досить низькою. Додавали додаткову кількість розчину ферменту (6 мл), і реакційну суміш перемішували при 30-35°С протягом 3 діб з досягненням приблизно 95%-ного перетворення. Реакційну суміш екстрагували ЕtOАс (30 мл). Під час екстракції утворилася емульсія, яку розчиняли, додаванням метанолу (приблизно 10 мл). Органічний екстракт промивали водою і розсолом і потім упарюють насухо до 5,7 г масла (89%-ний вихід неочищеного продукту, приблизно 94% дипропіонату при визначенні ВЕРХ з нормуванням по площі). В'язке масло додатково сушили у вакуумній печі приблизно при 50°С з отриманням піни. Неочищений продукт додатково очищали SiO2хроматографією, элюируя градієнтом MeOH/DCM з отриманням 1-1 у вигляді восковидні твердого речовини, яка кристаллизовалось при стоянні.

Примовий ефір (R)-2-аміно-3-метил-масляної кислоти

Стадія 1. До перемешиваемому розчину, що містить 24 (1,00 г, 3,07 ммоль), Вос-(L)-валін (6,14 ммоль) і EDCl (6,14 ммоль) в DMF (20 мл) додають DMAP (3,07 ммоль). Утворюється розчин перемішують в атмосфері азоту і при Т кімн. Через 12 год реакційну суміш упарюють насухо при зниженому тиску. Неочищений продукт очищають SiO2хроматографією, элюируя градієнтом ЕtOАс/гексан з отриманням 24 (R=CH(NHBoc)CHMe2).

Стадія 2. Вос і ацетонидние захисні групи можуть бути видалені в розчині TFA і DCM або НСl і діоксану або метанолу.

Приклад 6

Фармакокінетика в плазмі

Для визначення плазматичних рівнів 4-аміно-1-((2R,3R,4S,5R)-5-азидо-3,4-дигідрокси-5-гідроксиметил-тетрагидро-фуран-2-іл)-1Н-піримідин-2-ону (II) після введення однієї пероральної дози 5 мг/кг проліки II використовували фармакокінетичні методики. Препарат являє собою розчин/суспензію, що містить 0,0176 ммоль проліки в 5 мл відповідного носія.

Трьом самцям яванського макака (6-9 кг) встановлювали не натщесерце катетер в підшкірну вену ноги або плечової катетер для полегшення відбору крові. Весь час протягом дослідження буде дозволений вільний доступ до їжі та води. У добу дослідження у кожної мавпи відбирали пробу крові (2-3 �ий з наступних моментів часу (0,25; 0,5; 1; 3; 5; 7; 10; 24; 32 і 48 годин) після дозування в літієві пробірки, вкриті гепарином, будуть відібрані приблизно 0,5 мл крові. Кров центрифугували з отриманням плазми, яку заморожували до аналізу.

Концентрацію Ia (R1-R4=Н) у кожному зразку плазми визначали за допомогою аналізу РХ-МС. Стандартні криві отримували в контрольній плазмі мавп. AUC являє собою площу під графіком концентрації щодо всього часу, яка описує концентрацію лікарського засобу у великому колі кровообігу як функцію часу (L. Z. Benet, D. L. Kroetz and L. Ст. Sheiner Pharmacokinetics in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, J. G. Hardman & L. E. Limbird Eds., 9thEdition, McGraw Hill, New York, p 17-23). Cmaxявляє собою пікову концентрацію, яка виявляється.

№ соед.Доза2мг/кг4'-AU
Cmax(мкг/мл)AUC (год.*мкг/мл)
4'-AU1103,143

101
1-3*5,075
4'-AU30022,0328
1-1*85,71420
1-3*55,51020
1.4-азидоуридин
* Доза 1-1 і 1-3 являє собою молярний еквівалент дози 4'AU

Приклад 7

Активність РНК-полімерази NS5B HCV

Нуклеозидмонофосфати можна отримувати за загальною методикою, описаною М. Yoshikawa et al., Tetrahedron Lett. 1967 50:5065-5068. Також було зроблено огляд способів отримання нуклеозидтрифосфатов (К. Burgess and Dan Cook, Chem. Rev.2000 100:2047).

Ферментативну активність полімерази HCV (NS5B570n-Con1) вимірювали як включення радіоактивно мічених нукпеотидмонофосфатов в нерозчинні кислоти РНК-продукти. Невключенний радіоактивно мічений субстрат видаляли фільтруванням, і на промиту і висушену фільтрувальний пластинк�ного NS5B570n-Con1 в кінці реакції, було прямо пропорційним кількості світла, випромінюваного сцинтиллятором.

Полімераза HCV, яка використовується в аналізі ферментативної активності, являє собою 21-аминокислотную С-кінцева делецию повнорозмірною полімерази HCV, отриманої з штаму Соп1 HCV, генотип 1b (GenBank номер доступу AJ242654) (NS5B570n-Con1). NS5B570n-Con1 субклонировали нижче за течією від промотору Т7 плазмідної экспрессионной конструкції рЕТ17b і трансформували у штам BL21(DE3) pLysS Е. соli для експресії білка. Одиночну колонію використовували в якості вихідного інокулята 10л культури в середовищі LB, доповненої 100 мкг/мл ампіциліну при 37°С. Експресію білка индуцировали додаванням 0,25 мМ ізопропіл-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG), коли оптична густина культури при 600 нМ становила 0,8. Індукцію експресії білка проводили при 30°С протягом 16 год, після якої клітини збирали центрифугуванням. NS5B570n-Con1 очищали до гомогенності з використанням протоколу очищення з трьома колонками, що включає послідовну колонкову хроматографію на смолах Ni-NTA, SP-Sepharose HP і Superdex 75.

Ферментативні реакції в присутності РНК-матриці cIRES (дивіться розділ 0004) містили 20 нМ РНК cIRES, 20 нМ фермент NS5B570n-Con1, 0,5 мкКи (микрокюри) тритированного UTP (Perkin Elmer, каталитиотрейтол), 4 мМ MgCl2, 5 мкл з'єднання, послідовно розведеного в DMSO, і воду, що не містить нуклеази, для доведення кінцевого обсягу реакції до 50 мкл. Ферментативні реакції в присутності полі матриці А РНК (дивіться розділ 0004) містили 20 нМ попередньо змішаного полі А:оліго(ua)16 (дивіться розділ 0004), 20 нМ ферменту NS5B570n-Con1, 1 мкКи тритированного UTP (Perkin Elmer, каталожний № TRK-412; питома активність: 30-60 Кі/ммоль), 40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 40 мМ NaCl, 4 мМ DTT (дитиотрейтол), 4 мМ MgCl2, 5 мкл з'єднання, послідовно розведеного в DMSO, і воду, що не містить нуклеази, для доведення кінцевого обсягу реакції до 50 мкл. Реакційні суміші створювали в 96-лункових фільтрувальних планшетах (кат. № MADVNOB, Millipore Co.) і інкубували протягом 2 год при 30°С. Реакцію зупиняли додаванням 10% (об./про.) у кінцевому обсязі трихлороцтової кислоти та інкубували протягом 40 хв при 4°С. Реакційні суміші фільтрували, промивали 8 реакційними обсягами 10% (об./про.) трихлороцтової кислоти, 4 реакційними обсягами 70% (про./про.) етанолу, сушили на повітрі і в кожну реакційну лунку додавали 25 мкл сцинтилятора (Microscint 20, Perkin-Elmer).

Для аналізу описаних тут сполук використовували дві РНК-матриці. РНК-матриця cIRES мала довжину 377 нуклеот�м 341 нуклеотидом комплементарної послідовності ділянки внутрішньої посадки рибосоми. Матриця - полі А РНК (GE Amersham, каталожний номер 27-4110) являла собою гомополимерную РНК, піддану попереднього відпалу з праймером оліго(ua)16 в молярному співвідношенні 3 до 1 (праймер-матриця).

Кількість світла, випромінюваного від сцинтилятора, перетворювали в імпульси в хвилину (СРМ) на планшет-рідері Topcount® (Perkin-Elmer, інтервал енергії: низький, режим ефективності: нормальний, час рахунка: 1 хв, віднімання фону: ні, зниження перешкод: вимкнено).

Дані аналізували в Excel® (Microsoft®) і ActivityBase® (idbs®). Для визначення фонового сигналу, який вираховували з ферментативних реакцій, використовували реакційну суміш у відсутність ферменту. Реакції позитивного контролю проводили в відсутність з'єднання, активність яких з поправкою на фон була прийнята за 100% полімеразної активності. Всі дані виражали як відсоткову частку від позитивного контролю. Концентрацію сполуки, при якій швидкість синтезу РНК, катализируемого ферментом, знижувалася на 50% (IC50), розраховували за допомогою апроксимації рівняння (i)

Y=%Min+(%Max%Min)[](i)

до даних, де "Y" відповідає відносній активності ферменту (в %), "%Min" являє собою залишкову відносну активність при насичує концентрації сполуки, "%Мах" являє собою відносну максимальну ферментативну активність, "X" відповідає концентрації сполуки, і "S" являє собою коефіцієнт Хілла (або нахил).

Експериментальне значення для IC504'-AU трифосфату одно 0,46±0,088 мкМ, яке є аналогічним (значенням) 4'-АС-трифосфату, який дорівнює 29±0,13 мкМ.

Приклад 8

Освіта 4АU-трифосфату в людських гепатоцитах, одноядерних клітинах периферичної крові (РВМС) та клітинах кісткового мозку (ВМС). Аналіз поглинання і фосфорилювання нуклеозидного аналога 4AU в первинних людських гепатоцитах проводили так само, як було опубліковано раніше (Ма, Н. et al. J. Вiоl. Chem. 2007, 282:29812-29820). Свіжі людські гепатоцити висаджували на чашки інкубували з 4AU, меченним3H протягом різних проміжків часу. Під час збору клітин середу культури клітин аспирировали, і клітини один раз промивали холодним фосфатно-сольовим бу� мМ EDTA, і екстрагували в метанолі протягом 24 год при -20°С. Екстраговані зразки потім центрифугували при 10000 × g протягом 15 хв для видалення уламків клітин. Супернатант переносили в нові пробірки і упарюють у струмі розрідженого повітря при кімнатній температурі. Висушені опади клітинних екстрактів розчиняли в Н2О. Перед аналізом ВЕРХ в зразки клітинних екстрактів вводили немечение контрольні стандарти 4AU і моно-, ді - і трифосфатних похідних 4AU.

Поглинання і фосфорилювання 4AU в людських одноядерних клітинах периферичної крові (РВМС) та клітинах кісткового мозку (ВМС) проводили инкубированием клітинних суспензій РВМС або ВМС в концентраціях 2-4×105клітин/мл або 5-6 105кпеток/мл відповідно з3H-RO1080713 протягом різних періодів часу. Середовища культури клітин, що містять3H-RO1080713, поповнювали кожні 24 год. Зразки у подвійній повторності, еквівалентні 2×106життєздатних клітин на момент часу, відбирали в кінці експериментів, осаджували центрифугуванням протягом 5 хв і промивали один раз холодним PBS (фосфатно-сольовий буферний розчин). Кінцеві клітинні опади швидко заморожували на сухому льоду і зберігали при -80°С до екстракції. Экстракцодние 4AU поділяли іонообмінної ВЕРХ з (використанням) колонки Whatman Partisil 10 SAX (4,6×250 мм), пов'язаної з радіометричним детектором ((3-RAM, IN/US Systems, Inc.). Градієнт рухомої фази лінійно змінювався від 99% буферу А (Н2О) і 1% буфера Б (0,5 М КН2РВ4+0,8 М KCl) до 100% буфера Б від 4 до 16 хвилини. 100%-ний буфер Б проганяли від 16 хвилини до 26 хвилини і проводили заміну назад на 100% А за 1 хвилину. Буфер А проганяли до 32 хвилин. Швидкість струму протягом усього 32-хвилинного прогону була постійною - 1 мл/хв. Використовували співвідношення 5:1 Ultima-Flo™ АР (PerkinElmer) до элюенту колонки.

Похідні RO 1080713 в зразках ідентифікували порівнянням часів утримування радіоактивних метаболітів у радиохроматограмме з часом утримування нерадіоактивних контрольних стандартів, введених в зразки.

Фіг.3 графічно ілюструє ефективне фосфорилювання 4'-AU, яке приблизно в 10 разів більше, ніж (фосфорилювання) 4'-АС.

Приклад 9

Фармацевтичні композиції розглянутих Сполук для введення за допомогою декількох шляхів були отримані, як описано в даному Прикладі.

Композиція для перорального введення (А)

Інгредієнт% мас./мас.
Активний ингред1">Лактоза79,5%
Стеарат магнію0,5%

Інгредієнти змішують і розподіляють в капсули, що містять приблизно 100 мг кожного з них; одна капсула була б приблизно дорівнює повній добовій дозі.

Композиція для перорального введення (Б)

Інгредієнт% мас./мас.
Активний інгредієнт20,0%
Стеарат магнію0,5%
Натрію кроскармелоза2,0%
Лактоза76,5%
PVP (полівінілпіролідон)1,0%

Інгредієнти об'єднують і гранулюють з використанням розчинника, такого як метанол. Препарат потім сушать і формують в таблетки (містять приблизно 20 мг активного з'єднання) підходящою таблетировочной машиною.

Композиція для перорального введення (В)

1,0 г
Фумарова кислота0,5 г
Хлорид натрію2,0 г
Метилпарабен0,15 г
Пропілпарабен0,05 р
Гранульований цукор25,5 м
Сорбіт (70%-ний розчин)12,85 м
Вигум До (Vanderbilt Co.)1,0 г
Корригент0,035 мл
Барвники0,5 мг
Дистильована водаскільки потрібно до 100 мл

Інгредієнти змішують з утворенням суспензії для перорального введення.

Парентеральний препарат(Р)

Інгредієнт% мас./мас.
Активний інгредієнт0,25 г

Вода для ін'єкції до
100 мл

Активний інгредієнт розчиняють в частині води для ін'єкції. Потім додають достатню кількість хлориду натрію з перемішуванням для того, щоб зробити розчин изотоничним. Розчин доводять до (що вимагається) маси залишком води для ін'єкції, фільтрують через 0,2 мкм мембранний фільтр і упаковують в стерильних умовах.

Для реалізації винаходу в його різних формах можна використовувати характеристики, розкриті в наведеному вище описі або в наступній формулі винаходу, виражені в їх конкретних формах або в термінах кошти для здійснення розкритої функції або способу, або процесу для досягнення розкритого результату, згідно з обставинами, окремо або в будь-якій комбінації таких характеристик.

Наведене вище винахід було описано з деякими подробицями в якості ілюстрації та прикладу для цілей ясності і розуміння. Для фахівця в даній галузі буде очевидно, що в межах обсягу доданої формули винаходу можна практикувати зміни і модифікації. Отже, слід розуміти, що наведене вище опис призначене для того, посиланням на наведене вище, але, замість цього, повинен визначатися посиланням на наступну прикладену формулу винаходу, поряд з повним обсягом еквівалентів, яким така формула дає право.

Патенти, опубліковані заявки і наукова література, на які дається посилання, встановлюють знання фахівців в даній області і є тим самим включеними допомогою посилання у всій їх повноті в тій же самій мірі, як якщо б кожна була конкретно і індивідуально вказана як включена допомогою посилання. Будь-який конфлікт між будь процитованої тут посиланням та конкретними ідеями даного опису винаходу повинна бути розв'язана в користь останнього. Подібним чином, будь-який конфлікт між зрозумілим в даній області ухвалою слова або фрази і визначенням слова або фрази, як конкретно наведено в даному описі винаходу, має бути вирішено на користь останнього.

1. З'єднання згідно з формулою I

де
R1і R2у кожному разі, незалежно обрані з групи, що складається з водню, З1-6алкилкарбонила;
R3являє собою водень, З1-6алкилкарбонил, або
його фармацевтично прийнятна сіль за умови, що за меншою заходів�не є складним (2R,3R,4S,5R)-4-ацетоксі-5-ацетоксиметил-5-азидо-2-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2Н-піримідин-1-іл)-тетрагидро-фуран-3-иловим ефіром оцтової кислоти.

2. З'єднання по п. 1, де R1, R2і R3являють собою1-6алкилкарбонил.

3. З'єднання по п. 1, де R1і R2являють собою1-6алкилкарбонил, і R3являє собою водень.

4. З'єднання по п. 1, де R1і R2являють собою водень, і R3являє собою1-6алкилкарбонил.

5. З'єднання по п. 1, обраний із групи, що складається з:
складного (2R,3R,4S,5R)-5-азидо-2-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2H-піримідин-1-іл)-5-гідроксиметил-4-пропионилокси-тетрагидро-фуран-3-мулового ефіру пропіонової кислоти;
складного (2R,3R,4S,5R)-5-азидо-2-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2H-піримідин-1-іл)-4-изобутирилокси-5-изобутирилоксиметил-тетрагидро-фуран-3-мулового ефіру изомасляной кислоти;
складного (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2H-піримідин-1-іл)-3,4-біс-пропионилокси-тетрагидро-фуран-2-илметилового ефіру пропіонової кислоти;
складного (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2H-піримідин-1-іл)-3,4-біс-пентаноилокси-тетрагидро-фуран-2-илметилового ефіру пентановой кислоти;
складного (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-діоксо-3,4-дигідро-2H-піримідин-1-іл)-3,4-дигідрокси-тетрагидро-фуран-2-илметилового ефіру пропіонової кислоти.

6. Спосіб лікування інфекції вірусом гепания за п. 1.

7. Спосіб за п. 6, де R1, R2і R3являють собою1-6алкилкарбонил.

8. Спосіб за п. 6, де R1і R2являють собою1-6алкилкарбонил, і R3являє собою водень.

9. Спосіб за п. 6, де R1і R2являють собою водень, і R3являє собою C1-6-алкилкарбонил.

10. Застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як зазначено в п. 1, для лікування інфекції HCV.

11. Застосування з'єднання згідно з формулою I, де R1, R2і R3є такими, як зазначено в п. 1, для виготовлення лікарського засобу для лікування інфекції HCV.

12. Фармацевтична композиція для лікування інфекції HCV, що містить терапевтично ефективна кількість з'єднання по п. 1, змішаного з принаймні одним фармацевтично прийнятним носієм, розчинником або эксципиентом.



 

Схожі патенти:

Нуклеиновое основу, що має перфторалкильную групу та спосіб його одержання

Винахід відноситься до способу отримання нуклеїнового підстави, що має групу перфторалкильную

- або-кристалічні модифікації 5'-дезокси-n4-карбопентилокси-5-фторцитидина, спосіб їх отримання та фармацевтичні композиції на їх основі

Винахід відноситься до біологічно активних сполук, зокрема до- і-кристалічним модифікаціям 5'-дезокси-N4-карбопентилокси-5-фторцитидина, способу їх отримання і фармацевтичним композицій на їх основі

Безводний кристалічний азидоцитозинполусульфат

Винахід відноситься до безводної поліморфної солі, що представляє собою полусульфат 1-[4(S)-азидо-2(S),3(R)-дигідрокси-4-(гідроксиметил)-1(R)-циклопентил]-цитозина формули (Ia), що володіє підвищеною стабільністю і покращеними фізичними властивостями, що полегшує виробництво, транспортування з'єднання і приготування композицій на основі сполуки формули I

Нові нуклеозидні та олігонуклеотидні аналоги

Винахід відноситься до нуклеозидним аналогам формули (1), у якій R1являє собою Н або групу, що захищає гідроксил, R2являє собою Н, групу, захищає гідроксил, групу фосфорної кислоти, захищену групу фосфорної кислоти або групу формули P(R3)R4, у якій R3і R4є однаковими або різними і являють собою гідроксильну групу, захищену гідроксильну групу, алкоксигруппу, алкилтиогруппу, цианоалкоксигруппу, аміногрупу, замещенную алкільного групою; А являє собою алкіленовую групу, що містить від 1 до 4 атомів вуглецю, і являє собою замещенную пурин-9-ильную групу або замещенную 2-оксопиримидин-1-ильную групу, що містять принаймні один заступник, вибраний з гідроксильної групи, захищеної гідроксильної групи, аміногрупи, захищеної аміногрупи, алкільного групи

Похідні капурамицина, що володіють антибактеріальною активністю, що містять їх фармацевтичні композиції, спосіб лікування інфекційних захворювань, мікроорганізм, здатний виробляти вищевказані похідні, та спосіб отримання таких похідних з допомогою цього мікроорганізму

Винахід відноситься до похідних капурамицина і їх фармацевтично прийнятним солей загальної формули Iде R1являє метильної групи, R2являє метильної групи, R4являє гидроксигруппу і X являє метиленовим групу; R1являє метильної групи, R2є атом водню, R4являє гидроксигруппу і X являє метиленовим групу; R1являє метильної групи, R2являє метильної групи, R4є атом водню і X являє метиленовим групу; R1є атом водню, R2є атом водню, R4являє гидроксигруппу і X являє метиленовим групу; або R1являє метильної групи, R2являє метильної групи, R4являє гидроксигруппу і X являє атом сірки

Спосіб отримання похідного дезоксіурідіна

Винахід відноситься до способу отримання 5'-дезокси-5-фторуридина формули I, включає (а) взаємодія 2',3'-O-изопропилиден-5-фторуридина формули II з функціональним похідним сульфокислоти R-SO3H, де R є (З1-З4)алкільного, тріфторметільной, незамещенной, моно-, ди - або тризамещенной фенильной групою, (b) взаємодія похідного формули IV з иодидом лужних або лужноземельних металів (з) гідроліз похідного формули V в кислому середовищі та (d) відновлення похідного формули VI воднем або донором водню

Складні ефіри нуклеозидів, фармацевтична композиція

Винахід відноситься до групи нових сполук формули I Nu-O-Fa, де O - кисень, Nu - нуклеозид або аналог нуклеозиду, що включає таке азотне підстава, як аденін, изанин, цитозин, урацил, тимін; Fa - ацил мононенасищенной C18млі C20-9-жирної кислоти, в якому жирна кислота этерифицирована гідроксильної групи у положенні 5 цукрового фрагмента нуклеозиду або аналог нуклеозиду або гідроксильної групою нециклической ланцюга аналог нуклеозиду

Фосфорамидатние похідні нуклеозидів

Винахід відноситься до сполук для лікування гепатиту С формули I: його стереоизомерним формами, фармацевтично прийнятним солей або сольватам, де R1 являє собою водень; R2 являє собою водень, нафтил або феніл, необов'язково замещенний 1, 2 або 3 заступниками, призначеними з галогену і C1-С6алкила; R3 і R4 являють собою водень або C1-С6алкил; R5 являє собою C1-С10алкил, необов'язково замещенний C1-С6алкоксигруппой, C3-С7циклоалкил або бензил; R8 являє собою водень. Запропоновані нові ефективні проти гепатиту С сполуки й композиції на їх основі. 4 н. і 8 з.п. ф-ли, 4 ін., 1 табл.

Засіб для прискорення загоєння ран і регенерації тканин

Винахід відноситься до фармацевтичної промисловості і являє собою засіб для прискорення загоєння ран і регенерації тканин, що містить оксиметилурацил, лоратадин, альгінат натрію, гліцерин, стабілізатор, консервант і воду дистильовану, причому компоненти в засобі знаходяться в певному співвідношенні в мас.%. Винахід забезпечує прискорення загоєння ран і регенерації тканин, а також має виражену імуномодулюючу, протизапальну, протиалергічну, протисвербіжну, протинабрякову і ранозагоювальну діями. 1 з.п. ф-ли, 3 ін., 1 табл.

Спосіб лікування респіраторних захворювань, фармацевтична композиція та її застосування

Запропонована група винаходів, вона включає спосіб активації відновлення життєздатності ураженої запаленням епітеліальної клітини дихальних шляхів, пов'язаних з кашлем, з поствирусной або бактеріальною інфекцією, гострий/хронічний бронхіт або з хронічним обструктивним легеневим захворюванням (COPD) шляхом введення сполуки формули (1) і/або формули (2), композицію того ж призначення на основі зазначеного з'єднання, відповідний спосіб лікування запального респіраторного стану, фармацевтичну композицію для лікування запального респіраторного стану і застосування сполуки формули (1) і/або формули (2) для одержання лікарського засобу для лікування кашлю, поствирусной або бактеріальної інфекції, гострого/хронічного бронхіту або COPD. Технічний результат полягає у відновленні життєздатності респіраторної клітини протягом 48 годин за показником сиалилированних гликоконъюгатов на її поверхні після обробки її нейраминидазами вірусу або бактерії, а також у зниженні частоти кашлю у морських свинок після сенсибілізації їх розчином лимонної кислоти. 5 н. і 5 з.п. ф-ли, 37 пр.
Винахід відноситься до живильної терапії і призначене для лікування та/або попередження порушення функції відстроченого пригадування у суб'єкта, який має 24-26 балів за короткою шкалою оцінки психічного статусу (MMSE). Запропоновано застосування композиції для отримання продукту для ентерального введення. Композиція містить уридин або фосфат уридина, докозагексаеновую кислоту (ДГК) та/або ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК), фосфоліпіди, холін, вітамін Е, вітамін С, селен, вітамін В12, вітамін В6 і фолієву кислоту. Пропоноване винахід забезпечує поліпшення пам'яті, зокрема функції відстроченого пригадування у пацієнтів з 24-26 балами за MMSE. 4 з.п. ф-ли, 1 табл., 2 пр.

Комбіноване застосування похідних холестанола

Даний винахід відноситься до медицини і описує хіміотерапевтичне засіб проти раку, що містить, в комбінації, похідне холестанола, представлене формулою (1) де G являє собою GlcNAc-Gal - або GlcNAc-, або його з'єднання включення з циклодекстрином, і протираковий засіб, що представляє собою один або кілька видів засобів, обраних з групи, що складається з паклітакселу, доцетаксела, циклофосфаміду, пеметрекседа, 5-FU, цисплатину та оксаліплатину. Хіміотерапевтичне засіб проти раку має більш слабке побічна дія та чудову ефективність. 3 н. і 4 з.п. ф-ли, 9 іл., 6 пр.,
Винахід відноситься до медицини, а саме фтизіатрії і інфекційних хвороб, і може бути використане для лікування хворих з лікарсько-стійким туберкульозом та ВІЛ-інфекцією
Винахід відноситься до хіміко-фармацевтичної промисловості, і стосується фармацевтичних композицій, що застосовуються для профілактики і лікування захворювань нервової системи
Винахід відноситься до харчування немовлят, народжених за допомогою кесаревого розтину
Up!