Аттенуірований холодоадаптированний штам вірусу грипу а/рr/8/59/m2 (h1n1), призначений для отримання вакцинних штамів вірусу грипу в якості донора аттенуации, вакцинні штами вірусу грипу а/59/м2/каліфорнія/66/2211 (н2n2) і а/59/м2/токіо/67/22111 (н2n2)

 

Винахід відноситься до медичної вірусології і може бути використане в охороні здоров'я. Створено донор аттенуации для отримання вакцинних штамів живий грипозної вакцини для профілактики грипу (Ortomyxoviridae, рід Influenza) підтипу A(H2N2) серед дорослих і дітей у разі його повернення в циркуляцію. Також отримано два вакцинних штаму вірусу грипу підтипу A(H2N2) - А/59/М2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) і А/59/М2/Токіо/67/22111 (H2N2) на основі заявляється донора аттенуации.

Відомий донор аттенуации А/Ленінград/134/17/57 (H2N2) для отримання нешкідливих живих інтраназальних вакцин для дорослих [Александрова Р. В., Клімов А. В. Жива вакцина проти грипу. - СПб.: Наука.- 1994.-151 с]. Зазначений штам А/Ленінград/134/17/57 (H2N2) за антигенними властивостями близький до вірусів A(H2N2), що циркулювали в 1957-1968 роках, і при підготовці вакцинних штамів A(H2N2) методом класичної реассортации виникають методичні складності, т. к. гипериммунная сироватка до донору А/Ленінград/134/17/57 (H2N2) перехресно реагує з епідемічними A(H2N2) вірусами, не дозволяючи утворюватися реассортантам.

Завданням, на вирішення якої спрямовано заявляється винахід, є отримання нового донора аттенуации з антигенною структурою, відмінною від A(H2N2).

Такий штааттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1). Прототипом отриманого штаму A/PR/8/59/M2 (H1N1) з'явився відомий донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) [Egorov AYu, Medvedeva ТІ, Polezhaev Fl, et al. Peculiarities of obtaining and characterization of a cold-adapted A/PR/8/34 influenza virus variant // Acta Virol.- 1984.- Vol.28.- No.1.- Р. 19-25]. Причиною створення нового донора було наступне (недоліки відомого штаму): прототип A/PR/8/59/1 (H1N1) є стійким до хіміопрепаратів адамантанового ряду (амантадин, ремантадин).

З літератури відомо, що стійкість вірусів грипу типу А до адамантанам розвивається в результаті одиничної мутації в будь-який з наступних позицій амінокислот в М2 білку: 26 (лейцин), 27 (валін), 30 (аланін), 31 (серії) або 34 (гліцин) [Belshe RB, Smith МН, Hall СВ, et al. Genetic basis of resistance to rimantadine emerging during treatment of influenza virus infection // J Virol.- 1988.-Vol.62.- P. 1508-1512; D. M. Weinstock and G. Zuccotti. Adamantane Resistance in Influenza A // JAMA.- 2006.- Vol.295, No.8, Р. 934-936]. За даними полногеномного секвенування, прототип A/PR/8/59/1 (H1N1) є стійким до адамантанам завдяки наявності амінокислот треоніна і аргініну в позиціях 27 і 31 М2 білка відповідно.

Стійкість до даних препаратів обмежує використання вакцинного штаму вірусу на його основі для масової імунізації населення, оскільки саме ремантадин є найбільш доступним засобом для лікування грипозної і�необхідно було модифікувати донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) шляхом внесення двох мутацій в М2 білок вірусу: заміна треоніна (Thr) на валін (Val) і аргініну (Агд) на серії (Ser) у позиціях 27 і 31 відповідно.

Новий донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) був отриманий генно-інженерним шляхом після модифікації набору плазмід, що несуть повнорозмірні ДНК-копії восьми сегментів «дикого» вірусу A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [Hoffmann, Тобто, Неймана, G., Hobom, G., et al. "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template // Virology.- 2000. -Vol.267.- No.2.- P. 310-317; Subbarao, K., Chen, H., Swayne, D. et al. Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics // Virology.- 2003.- Vol.305.- No.1.- Р. 192-200]. Отриманий штам A/PR/8/59/M2 (H1N1) за амінокислотною послідовності внутрішніх генів ідентичний вірусу A/PR/8/59/1 (H1N1), за винятком М2 білка, в який були внесені дві мутації (Thr-27-Val і Arg-31-Ser), які відповідають за його адамантан-чутливість.

Відомо, що штам A/PR/8/59/1 (H1N1) є аттенуированним для людей, так як володіє властивостями температурочувствительности і холодоадаптированности [Александрова Р. В., Клімов А. В. Жива вакцина проти грипу. - СПб.: Наука.- 1994.-151 с]. Отриманий нами донор A/PR/8/59/M2 (H1N1) також володіє ознаками температурочувствительности і холодоадаптированности. Тому новий донор також є аттенуированним для людини.

Приклад виконання

Штам A/PR/8/59/M2 (H1N1) був отриманий з використанням методів зворотного генетики, які включали в себе з�1N1) з використанням автоматичного секвенатора. Далі отриманий сіквенс порівнювався з нуклеотидної послідовністю генів вірусу A/PR/8/34 (H1N1), клонованих у вектори для зворотного генетики [Hoffmann, Тобто, Неймана, G., Hobom, G., et al. "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template // Virology.- 2000. -Vol.267.- No.2.- Р. 310-317].

Знайдені амінокислотні відмінності представлені в Таблиці 1. З допомогою цілеспрямованого точкового мутагенезу були модифіковані шість генів вірусу A/PR/8/34 (H1N1) таким чином, щоб їх амінокислотна послідовність стала ідентичною вірусу A/PR/8/59/1 (H1N1). Далі у М ген були внесені додаткові мутації AC-792,793-GT і A-805-G, відповідальні за адамантан-чутливість вірусу. Мутагенез ДНК-копій генів вірусу A/PR/8/34 (H1N1) проводили при використанні набору для мутагенезу «QuikChange XL Multi site-directed mutagenesis kit» (Stratagene, La Jolla, Каліфорнія, США) згідно з інструкціями виробника.

Новий донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) був отриманий в результаті трансфекції лінії клітин 293Т набором з восьми плазмід: шість модифікованих плазмід, що несуть внутрішні гени вірусу A/PR/8/59/1 (H1N1), та дві плазміди, що несуть гени гемаглютиніну і нейрамінідази вірусу A/PR/8/34 (H1N1). Далі отриманий вірус накопичували в 10-денних курячих ембріонах, що розвиваються при оптимальних умовах: 33°�дная послідовність штаму A/PR/8/59/M2 (H1N1), що підтвердило ідентичність амінокислотної послідовності його внутрішніх генів вихідного вірусу A/PR/8/59/1 (H1N1), за винятком двох позицій М2-білку (Val-27 і Ser-31).

Нуклеотидна послідовність генів гемаглютиніну і нейрамінідази була ідентична вірусу A/PR/8/34 (H1N1).

Новий донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) характеризується ознаками температурочувствительности і холодоадаптированности, характерними для вихідного вірусу A/PR/8/59/1 (H1N1). Він володіє зниженим рівнем репродукції в курячих ембріонах при 39°С (RCT39різниця в активностях репродукції клону при 33°С-39°С становить 6,4 lg ЕІД50/0,2 мл), і активно розмножується при температурі 26°С (RCT26різниця в репродукціях при 33°С і 26°С становить 2,3 lg ЕІД50/0,2 мл). Таким чином, за цими двома ознаками модифікований донор не відрізняється від вихідного донора аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) (Таблиця 2).

Аттенуацию нового донора оцінювали за інтенсивністю його репродукції в респіраторному тракті (носових ходах і легенів) мишей лінії СВА в порівнянні з вихідним вірусом A/PR/8/59/1 (H1N1) і вірусом «дикого» типу A/PR/8/34 (H1N1). Репродукція в носових ходах мишей всіх досліджених вірусів коливалася в межах 3.9-5.3 lg ЕІД50/мл

«Дикий» вІии A/PR/8/59/M2 (H1N1) та його прототипу в порівнянні з «диким» вірусом (1,5 Ig ЕІД50/мл проти 6,8 Ig ЕІД50/мл відповідно) (Таблиця 2). Зниження рівня репродукції вірусу грипу в легенях мишей більш ніж в 10000 разів порівняно з «диким» вірусом є досить суттєвим для створеного донора.

Чутливість нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) до препаратів адамантанового ряду оцінювали шляхом титрування вірусу в культурі клітин MDCK в присутності або відсутності в ростовий середовищі похідного адамантану - ремантадин (0,5 або 5,0 мкг/мл). Титр вірусу виражали в Ig TCID50/мл, при цьому чутливість вірусу до ремантадіну оцінювали за ступенем зниження титру вірусу в присутності ремантадину порівняно з титром вірусу без препарату. В якості контрольного адамантан-стійкого вірусу брали «дикий» штам вірусу грипу A/PR/8/34 (H1N1).

З таблиці 3 видно, що додавання ремантадину до нового донору аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) призводило до істотного зниження титру вірусу в культурі клітин MDCK. Так, додавання рементадина в концентрації 0,5 мкг/мл знижувало титр вірусу на 1,8 Ig TCID50, а збільшення концентрації препарату до 5,0 мкг/мл призвело до зниження титру вірусу на 2,3 Ig TCID50, тобто в 200 разів.

Контрольний вірус A/PR/8/34 (H1N1) не виявляв чутливості до рема�/59/M2 (H1N1) за своїми характеристиками відповідає вимогам, пред'являються до донорам аттенуации для живої грипозної вакцини.

Штам A/PR/8/59/M2 (H1N1) депонований 10.03.2011 року в Державній колекції Росспоживнагляду збудників вірусних інфекцій, рикетсіозів ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» під № V-654.

Прототипом отриманих на основі нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) вакцинних штамів є відомий холодоадаптированний штам вірусу грипу A/Москва/21/17/65 (H2N2), який входив до складу живої грипозної вакцини для дітей в 1967 році [Александрова Р. В., Микуцкая Б. А., Сиротенко Е. А. та ін Підсумки вивчення спеціалізованого варіанта живий грипозної вакцини для імунізації дітей дошкільного і молодшого шкільного віку // Вісник АМН СРСР. - 1968. - №9. - С. 41-45]. Даний вакцинний штам був приготований серійними пасажами при зниженій температурі епідемічного вірусу, виділеного у 1965 році.

Однак в останні роки циркуляції (1966-1967) віруси H2N2 зазнали значних антигенні зміни, і вакцинний штам А/Москва/21/17/65 (H2N2) у разі повернення в людську популяцію вірусів, які циркулювали в кінці H2N2 хвилі, не зможе викликати захисну реакцію у щеплених людей [Lindstrom SE, Сох NJ, Klimov A. Genetic analysis of human H2N2 and early H3N2 influenza viruses, 1957-1972: evidence for genetic divergence and multiple reassortment сь на дві гілки, значно розрізняються за антигенними властивостями.

Завданням, на вирішення якої спрямовано заявляється винахід, є отримання потенційно пандемічних вакцинних штамів для дорослих і дітей з антигенною структурою вірусів H2N2, що діяли в кінці епідемічного циклу - вірусів А/Каліфорнія/1/66 (H2N2) і А/Токіо/3/67 (H2N2), що належать двом різним гілкам вірусів H2N2 кінця епідемічної хвилі 1966-1967 рр ..

Вакцинний штам вірусу грипу А/59/М2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) отримано методом генетичної реассортации епідемічного вірусу А/Каліфорнія/1/66 (H2N2) з холодоадаптированним температурочувствительним донором аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), з подальшою селекцією при зниженій до 26°С температурі інкубації в присутності антисироватки до донору аттенуации.

Вакцинний штам А/59/М2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) є температурочувствительним (різниця в показниках інфекційної активності при температурі інкубації 33°С-39°С становить 7,5 lg ЕІД50/0,2 мл) і холодоадаптированним (різниця в показниках інфекційної активності при температурі інкубації 33°С і 26°С дорівнює 3,1 lg ЕІД50/0,2 мл).

Відповідальний за антигенну специфічність поверхневий білок вакцинного штаму - гемагглютир>Методом полногеномного секвенування встановлено, що вакцинний штам А/59/М2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) успадкував шість генів, що кодують внутрішні білки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), від донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), а поверхневі білки гемаглютинін і нейрамінідазу (NA) від епідемічного вірусу А/Каліфорнія/1 /66 (H2N2).

Таким чином, представлений вакцинний штам А/59/М2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) характеризується поєднанням корисних ознак, необхідних вакцинному штаму: антигенної специфічністю епідемічного вірусу А/Каліфорнія/1/66 (H2N2), структурою геному, оптимальної для реассортантних вакцинних штамів, температурочувствительностью і холодоадаптированностью, що корелює з аттенуацией для людини, характерною для донора аттенуации.

Морфологія штаму - поліморфна, типова для вірусу грипу.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАМУ

Інфекційна активність при репродукції в курячих ембріонах при 33-34°С протягом 48 годин - 9,2 lg ЕІД50/МЛ. Гемагглютинирующая активність -1:1024.

Штам виявляє генетичну стабільність біологічних ознак після 5 пасажів на курячих ембріонах (при використанні великих заражають доз).

Приклад отримання вакцинного штаму А/59/М2/Каии їм. Д. І. Іванівського під №2652.

ПАСПОРТ ШТАМУ

1. Назва штаму А/59/М2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2).

2. Серія: серія 1 (перша).

3. Метод отримання - реассортация; характеристика батьківських вірусів:

а) епідемічний вірус-А/Каліфорнія/1/66 (H2N2);

б) донор аттенуации: A/PR/8/59/M2 (H1N1).

4. Кількість пасажів: 5 в процесі реассортации.

5. Характеристика штаму до ліофілізації:

а) оптимальні умови репродукції: 33°С, 48 годин;

б) гемагглютинирующая активність: 1:1024;

в) інфекційна активність: 8.5 lg ЕІД50/0,2 мл;

г) чутливість до інгібіторів: ингибитороустойчивий в РГГА з нормальною сироваткою крові коня і морської свинки;

д) різниця в показниках інфекційної активності при 33°С / 39°С: 7,5 lg ЕІД50/0,2 мл;

е) різниця в показниках інфекційної активності при 33°С / 26°С: 3,1 lg ЕІД50/0,2 мл;

ж) структура геному реассортанта за даними часткового секвенування генів:

гени від вірусу епідемічного: НА, NA;

гени від донора аттенуации: РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS.

6. Антигенна специфічність гемаглютиніну:

гемаглютинін в РГГА ідентичний вірусу А/Каліфорнія/1 /66 (H2N2), щурячої антисивороткой до якого повністю нейтралізується. Антигенна специфичностр>7. Характеристика штаму після ліофілізації:

а) дата ліофілізації - 25 квітня 2011 р.;

б) обсяг матеріалу в ампулі - 1,0 мл;

в) інфекційна активність - 7,7 lg ЕІД50/0.2 мл;

8. Бактеріологічний контроль: дата обліку - 1 червня 2011 року, результат - стерильний.

9. Нешкідливість для мишей і морських свинок при підшкірному та внутрішньоочеревинному введенні: нешкідливий.

Вакцинний штам А/59/М2/Токіо/67/22111 (H2N2) отримано методом генетичної реассортации епідемічного вірусу А/Токіо/3/67 (H2N2) з холодоадаптированним температурочувствительним донором аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) з подальшою селекцією при зниженій до 26°С температурі інкубації в присутності антисироватки до донору аттенуации.

Вакцинний штам А/59/М2/Токіо/67/22111 (H2N2) є температурочувствительним (різниця в показниках інфекційної активності при температурі інкубації 33°С-39°С становить 6,9 lg ЕІД50/мл) і холодоадаптированним (різниця в показниках інфекційної активності при температурі інкубації 33°С і 26°С дорівнює 3,2 lg ЕІД50/мл).

Відповідальний за антигенну специфічність поверхневий білок вакцинного штаму - гемаглютинін (НА) - в РГГА ідентичний вірусу А/Токіо/3/67 (H2N2), антисивороткой до якого він повністю н�H2N2) успадкував шість генів, кодують внутрішні білки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), від донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), а поверхневі білки гемаглютинін і нейрамінідазу (NA) від епідемічного вірусу А/Токіо/3/67 (H2N2).

Таким чином, представлений вакцинний штам А/59/М2/Токіо/67/22111 (H2N2) характеризується поєднанням корисних ознак, необхідних вакцинному штаму: антигенної специфічністю епідемічного вірусу А/Токіо/3/67 (H2N2), структурою геному, оптимальної для реассортантних вакцинних штамів, температурочувствительностью і холодоадаптированностью, що корелює з аттенуацией для людини, характерною для донора аттенуации.

Морфологія штаму - поліморфна, типова для вірусу грипу.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАМУ

Інфекційна активність при репродукції в курячих ембріонах при 33-34°С протягом 48 годин - 9,0 lg ЕІД50/мл Гемагглютинирующая активність -1:1024.

Штам виявляє генетичну стабільність біологічних ознак після 5 пасажів на курячих ембріонах (при використанні великих заражають доз).

Приклад отримання вакцинного штаму А/59/М2/Токіо/67/22111 (H2N2) представлений в паспорті, що додається.

Депонований штам в колекції Інституту вірусології ім. Д. І. Іванівського під №2653.

Преассортация; характеристика батьківських вірусів:

а) епідемічний вірус - А/Токіо/3/67 (H2N2);

б) донор аттенуации: A/PR/8/59/M2 (H1N1).

4. Кількість пасажів: 5 в процесі реассортации.

5. Характеристика штаму до ліофілізації:

а) оптимальні умови репродукції: 33°С, 48 годин;

б) гемагглютинирующая активність: 1:1024;

в) інфекційна активність: 8.8 lg ЕІД50/0,2 мл;

г) чутливість до інгібіторів: ингибиторочувствительний в РГГА з нормальною сироваткою крові коня і морської свинки;

д) різниця в показниках інфекційної активності при 33°С / 39°С: 6,9 lg ЕІД50/0,2 мл;

е) різниця в показниках інфекційної активності при 33°С / 26°С: 3,2 lg ЕІД50/0,2 мл;

ж) структура геному реассортанта за даними часткового секвенування генів:

гени від вірусу епідемічного: НА, NA;

гени від донора аттенуации: РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS.

6. Антигенна специфічність гемаглютиніну:

гемаглютинін в РГГА ідентичний вірусу А/Токіо/3/67 (H2N2), щурячої антисивороткой до якого повністю нейтралізується. Антигенна специфічність нейрамінідази:

нейраминидаза ідентична вірусу А/Токіо/3/67 (H2N2) за даними повного секвенування генів.

7. Характеристика штаму після ліофілізації:

а) ІД50/0.2 мл;

8. Бактеріологічний контроль: дата обліку - 1 червня 2011 року, результат - стерильний.

9. Нешкідливість для мишей і морських свинок при підшкірному та внутрішньоочеревинному введенні: нешкідливий.

Таблиця 1
Нуклеотидні і амінокислотні відмінності внутрішніх генів донора аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) і генів вірусу A/PR/8/34 (H1N1), клонованих у вектори для зворотного генетики.
ГеннуклеотидБілокамінокислота
позиція59/11PR-wt2позиція59/11PR-wt2
РВ2342АGРВ2105НеMet
251ArgLys
923GА299ArgLys
1106АЗ360ТугSer
1537АG504llеVal
1660ТG545LeuVal
1916АGspan="1">2132АG702LysArg
РВ1196GАРВ158AspAsn
549ЗА175AsnLys
639GА205MetHe
647АG208LysArg
670an="1">SerGly
1335ЗG437CysTrp
294GАPB1-F259ArgLys
297GА60ArgGin
РА65ЗТРА14AlaVal
497АG158LysТ359LysAsn
1672АЗ550lleLeu
NP98GАNP18GlyGlu
328ТЗ95SerPro
1102ЗG353LeuVal
1318АG1334АЗ430AsnThr
М434АGМ1137ThrAla
476АТ151SerCys
NS94ЗТNS123AlaVal
329ЗА71AspGlu
span="1">25GlyGlu
763АG88lleVal
1донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1);
2гени вірусу A/PR/8/34 (H1N1), клоновані у вектори для зворотного генетики.

Таблиця 2
Фенотипічна характеристика нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) і вихідного донора A/PR/8/59/1 (H1N1) в порівнянні з вірусом «дикого» типу A/PR/8/34 (H1N1)
ВірусиПоказники репродукції в РКЕ ((Ig ЕІД50/мл)Титр вірусу (Ig ЕІД50/мл) в легенях і носових ходах мишейФенотип
RCT26RCT39носові ходилегкі
6,8non-ca, non-ts, non-att
A/PR/8/59/12,87,33,91,5Ca, ts, att
A/PR/8/59/M22,36,44,31,5Ca, ts, att

Таблиця 3
Вивчення чутливості нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) до ремантадіну в порівнянні з вірусом «дикого» типу A/PR/8/34 (H1N1)
ВірусТитр вірусу, Ig TCID50/млЗниження титру вірусу в присутності ремантадину, Ig TCID50
без ремантадинуремантадин 0,5 мкг/млремантадин 5,0 мкг/мл0,5 мкг/мл5,0 мкг/мл
A/PR/8/348,8
A/PR/8/59/M28,66,86,31,82,3

Приклад 1. РЕЗУЛЬТАТИ ВИВЧЕННЯ ІМУНОГЕННОСТІ І ЗАХИСНОЇ ЕФЕКТИВНОСТІ ВАКЦИННИХ ШТАМІВ H2N2 В ЕКСПЕРИМЕНТАХ НА МИШАХ

Імуногенність вакцинних штамів H2N2

Імуногенність вакцинних штамів A/59/M2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) (59/Кал/2211) і A/59/M2/Токіо/67/22111 (H2N2) (59/Ток/22111) оцінювали шляхом дворазової імунізації мишей лінії СВА (18 тварин у групі) вакцинними штамами, взятими в дозах 100 МЗС50і 1000 МЗС50(50%-них мишачих інфікуючих доз). Контрольні тварини отримували препарат плацебо (PBS). Забір зразків сироваток крові проводили на 28 день після першої вакцинації, і на 28 день після другої імунізації. Титри антигемагглютинирующих антитіл виявляли в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА). В якості антигенів в РГГА використовували епідемічні віруси A/Каліфорнія/1/66 (H2N2) і A/Токіо/3/67 (H2N2). З таблиці 4 видно, що імунізація вакцинними штамами призводила до формування гуморальних антитіл не тільки проти гомологичного вірусу, але і проти гетерологічного штаму. Імунізація мишей більш висологичних антитіл. Тварини контрольної групи не виробляли антитіла до вірусу H2N2.

Таблиця 4
Імуногенність вакцинних штамів H2N2, введених в дозах 100 МЗС50і 1000 МЗС50в експериментах на мишах
Вакцинна групаДоза, МЗС50Середнє геометричне зворотних титрів антигемагглютинирующих антитіл в РГГА з антигеном H2N2
A/Каліфорнія/1/66A/Токіо/3/67
День 28День 56День 28День 56
59/Кал/22111006,8156,65,012,3
100022,3255,85,041,2
10,260,3
10006,942,520,6122,8
Плацебо-5,05,05,05,0

Захисна ефективність вакцинних штамів H2N2

Захисну ефективність вакцинних штамів A/59/M2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) і A/59/M2/Токіо/67/22111 (H2N2) оцінювали шляхом експериментального зараження імунізованих мишей епідемічними вірусами A/Каліфорнія/1/66 (H2N2) і A/Токіо/3/67 (H2N2), взятими в дозі 105ЕІД50. За 9 мишей з кожної вакцини групи заражали вірусом A/Каліфорнія/1/66, а решта 9 - вірусом A/Токіо/3/67 (H2N2). На 3 добу після челлендж у 4 мишей з кожної групи забирали органи: легені, носові ходи, мозок, селезінку. Титр вірусу в органах мишей визначали шляхом титрування гомогенатов тканин в курячих ембріонах методом граничних розведень. За рештою 5 мишами в групі вели спостереження, зважуючи кожні 2 дні протягом 14 днів після заражеполностью захищені від розмноження як гомологичного, так і гетерологічного «дикого» вірусу. Миші, імунізовані меншою дозою 100 МЗС50, були повністю захищені від розмноження гомологичного вірусу, тоді як гетерологичний вірус виявлявся в легенях мишей в незначних титрах. Дані титри були достовірно нижче таких у мишей контрольних груп (p < 0,001 за критерієм Манна-Уїтні).

Вивчення динаміки зміни ваги мишей, імунізованих штамами A/59/M2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) і A/59/M2/Токіо/67/22111 (H2N2), також вказує на захисний ефект вакцинації. Як видно з рисунка 2, зниження ваги у вакцинованих мишей не перевищувало 7,5%, тоді як у мишей контрольної групи втрата ваги досягала 15-18% на 8-10 добу після челлендж.

Таким чином, вивчення вакцинних штамів A/59/M2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2) і A/59/M2/Токіо/67/22111 (H2N2), отриманих з використанням нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), довело їх імуногенність і профілактичну ефективність від хвороби, викликаної як гомологічним вірусом, так і гетерологічних H2N2 штамом.

1. Аттенуірований, холодоадаптированний штам вірусу грипу, Ortomyxoviridae, рід Influenza, A/PR/8/59/M2 (H1N1), депонований у Державній колекції Росспоживнагляду збудників вірусних інфекцій, рикетсіозів ФБУН ГНЦ ВБ «Векто� A(H2N2).

2. Реассортантний вакцинний штам вірусу грипу, Ortomyxoviridae, рід Influenza, A/59/M2/Каліфорнія/66/2211 (H2N2), депонований в Інституті вірусології ім.Д.І.Іванівського під № 2652, отриманий за допомогою донора аттенуации за п. 1, і використовується для отримання живої грипозної интраназальной вакцини для дорослих і для дітей.

3. Реассортантний вакцинний штам вірусу грипу, Ortomyxoviridae, рід Influenza, A/59/M2/Токіо/67/22111 (H2N2), депонований в Інституті вірусології ім.Д.І.Іванівського під № 2653, отриманий за допомогою донора аттенуации за п. 1 і використовується для отримання живої грипозної интраназальной вакцини для дорослих і для дітей.



 

Схожі патенти:
Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується специфічних олігонуклеотидних праймерів. Представлені праймери включають сайти эндонуклеазного розщеплення, фланкуючі ділянки геному, що кодують глікопротеїни Gn і Gc, а також нуклеопротеин N, для отримання бібліотеки генів, що кодують глікопротеїни Gn і Gc і нуклеопротеин N вірусу лихоманки долини Ріфт. Охарактеризованное винахід може бути використаний у створенні банку нуклеотидних послідовностей, що кодують імунодомінантні білки вірусу лихоманки долини Ріфт Gn, Gc і N, які можна використовувати при створенні діагностичних і вакцинних препаратів на основі рекомбінантних технологій. 3пр.

Спосіб ідентифікації гетеромультимерних модифікованих убиквитинових білків зі здатністю зв'язуватися з лігандами

Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використано для ідентифікації гетеромультимерних убиквитинов зі здатністю зв'язуватися з лігандом-антигеном. Спосіб включає контактування сукупності гетеродимерних модифікованих убиквитинов, включають два мономеру убіквітину, пов'язаних між собою за схемою голова до хвоста, з потенційним лігандом дисплейним способом. При цьому кожен із згаданих мономерів модифікований по-різному і містить 5-8 заміщень в положеннях 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 і 68 SEQ ID NO:1. Далі ідентифікують гетеродимерний модифікований білок, связавшийся з лігандом з спорідненістю зв'язування Kd в діапазоні 10-7-10-12 М і одновалентной зв'язує активністю. Запропоновані ДНК-бібліотеки, що відповідають за отримання популяції згаданих гетеромультимерних убиквитинов, а також бібліотеки білків, отримані шляхом експресії згаданих ДНК-бібліотек. Винахід дозволяє отримати нові зв'язуючі білки на основі гетеромультимерного убіквітину, здатні специфічно зв'язуватися з високою спорідненістю з вибраними лігандами. 3 н. і 5 з.п. ф-ли, 17 іл., 4 пр.

Композиція, застосовна як ротавірусної вакцини, і спосіб її отримання

Представлені композиція та спосіб її отримання. Охарактеризована композиція містить: ефективне кількість вірусного антигену, який представляє собою живий аттенуірований ротавірус, попередньо оброблений 0,1% сироватковим альбуміном людини, і фармацевтично прийнятний буфер. Спосіб одержання композиції включає вирощування культури клітин Vero, спочатку культивированной в присутності 5% фетальної сироватки теляти і 0,1% сироваткового альбуміну людини, інфікування такої культури клітин Vero живим аттенуированним ротавирусом, розмноження вірусу в клітинній культурі і додавання до вказаного вірусу фармацевтично прийнятного буфера. Представлені винаходу можуть бути використані для профілактики ротавірусної інфекції та/або ротавірусного гастроентериту. 2 н. і 9 з.п. ф-ли, 17 іл., 4 табл., 2 пр.

Вакцини на основі свинячого вірусу torque teno і способи діагностики інфекцій, викликаних цим вірусом

Винаходи стосуються інфекційної молекули нуклеїнової кислоти, кодує інфекційний вірус Torque teNO свиней (PTTV), яка містить щонайменше одну копію геномної послідовності, обраної з групи, що складається з послідовностей, відповідних генотипам або підтипів PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA і PTTV2c-VA, а також біологічно функціональної плазміди або вірусного вектора, що містить таку інфекційну нуклеотидну геномну послідовність, і клітини-господаря, що містить таку плазміду або вектор. Крім того, представлені винаходи передбачають живі, аттенюированние, экспрессируемие при використанні вектора і очищені рекомбінантні капсидние субодиничні або вбиті вірусні вакцини для захисту проти PTTV інфекції, а також способи імунізації свиней проти PTTV вірусної інфекції шляхом введення такої вакцини. Охарактеризовані винаходу можуть бути використані для запобігання інфекції, спричиненої вірусом Torque teNO свиней. 11 н. і 12 з.п. ф-ли, 53 іл., 5 табл., 24 пр.

Штам вірусу ящуру aphtae epizooticae типу а для контролю антигенної і иммуногенной активності і для виготовлення біопрепаратів для діагностики і специфічної профілактики ящуру типу а

Винахід відноситься до галузі ветеринарної вірусології і біотехнології і стосується штаму вірусу ящуру Aphtae epizooticae типу А сем. Picomaviridae, роду Aphtovirus. Охарактеризований штам виділений від хворих свиней і отриманий шляхом послідовних пасажів на чутливих гетеро - і гомологічних культурах клітин і депоновано в колекції ФГБУ «ВНИИЗЖ» під реєстраційним номером штам вірусу ящуру А №2187/Кути/2013 (виробничий). Представлений штам репродукується в монослойной культурі клітин нирки свині (СП), перещеплюваних культурах клітин нирки сибірського гірського козерога (ПСГК-30), ВНК-21 і IB-RS-2. Протягом 18÷24 годин інкубування урожай вірусу в зазначених культурах клітин досягає значень 6,0÷7,0 lg ТЦД50/см3. При високій множинності зараження (1÷10 ТЦД/клітина) викликає ЦПД через 5 годин, зберігаючи вихідні характеристики при пассировании в клітинних культурах протягом 5 пасажів. Винахід може бути використано для контролю антигенної і иммуногенной активності і для виготовлення біопрепаратів для діагностики і специфічної профілактики ящуру типу А. 6 табл., 6 пр.

Аттенуірований штам вірусу сендай

Винахід відноситься до медицини, а саме до онкології. Об'єктом винаходу є новий штам вірусу Сендай Sen293nsk1, адаптований до ефективного розмноження в культурі клітин людини НЕК293. Отриманий штам вірусу Сендай має меншу вірулентність для лабораторних мишей і підвищеною здатністю знищувати пухлинні клітини людини. Штам передбачається використовувати для випробувань в якості терапевтичного онколитического препарату для лікування злоякісних захворювань. Винахід дозволяє підвищити ефективність лікування онкологічних захворювань за рахунок використання непатогенного для людини мишачого вірусу Сендай, що володіє посиленою онколитической активністю і посилює протипухлинний імунітет. Винахід може бути використаний при лікуванні онкологічних захворювань. 1 табл. .
Даний винахід має відношення до таких композицій і фармацевтичним композиціям, які включають поксвируси, і більш конкретно, які включають позаклітинні оболонкові віруси. Цей винахід також має відношення до такого способу, який призначений для того, щоб продукувати поксвируси, а також поксвируси, одержані відповідно до цього винаходу. Крім того, цей винахід також має відношення до використання зазначеного поксвируса і зазначеної композиції для приготування лікарського засобу. 2 н. і 15 з.п. ф-ли, 3 іл.

Синтетичні олігонуклеотидні праймери та їх використання в способі виявлення і диференціації геному вакцинного штаму в-82 від польових ізолятів вірусу миксоми кролів методом полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу

Група винаходів відноситься до галузі біотехнології і стосується синтетичних олігонуклеотидних праймерів та способу їх використання. Запропонований спосіб виявлення і диференціації геному вакцинного штаму В-82 від польових ізолятів вірусу миксоми кроликів включає: виділення ДНК з біологічного матеріалу, постановку мультиплексного полімеразної ланцюгової реакції з використанням синтезованих праймерів, комплементарних ділянок генів M130R і M151R вірусу миксоми кролика і мають наступний нуклеотидний склад: ампліфікацію ДНК вірусу і оцінку проведення реакції. Представлені винаходу можуть бути використані ветеринарної вірусології для виявлення і диференціації вакцинного штаму B-82 вірусу миксоми кроликів від польових ізолятів. 2 н. п. ф-ли, 6 табл., 6 пр.

Новий пташиний астровирус

Винахід відноситься до галузі біотехнології, вірусології та імунології. Зокрема, даний винахід відноситься до нового пташиному астровирусу; до антитілам і їх фрагментів, спрямованим проти вказаного вірусу; до антигенних препаратів, білків і ДНК-молекул нового пташиного астровируса; до вакцин на основі зазначеного нового вірусу або до його антигенних препаратів, білку або ДНК; до способів одержання таких вакцин і до діагностичних наборів. Даний винахід може бути використано в ветеринарії. 8 н. і 3 з.п. ф-ли, 5 іл., 4 табл., 12 пр.

Способи культивування клітин, розмноження і очищення вірусів

Винахід відноситься до галузі біотехнології і вірусології. Запропоновано спосіб отримання вірусів грипу А або в культурі клітин, і композиція клітинної культури для отримання вірусів грипу А або Ст. Винахід забезпечує нову вільну від сироватки культуральне середовище, усуває необхідність етапу заміни середовища для культури клітин, що забезпечує отримання вірусів грипу з високим загальним добуванням живого вірусу і може використовуватися для активної імунізації суб'єктів або для отримання антитіл для різноманітних застосувань, включаючи пасивну імунізацію та діагностичні иммуноанализи. 3 н. і 19 з.п. ф-ли, 24 іл., 47 табл., 1 пр.

Композиції для лікування та попередження комплексу респіраторних захворювань собак

Група винаходів відноситься до галузі ветеринарії та біотехнології. Імуногенні композиції, які містять вірус собачого грипу та собачий респіраторний коронавірус, а також вони можуть додатково містити Bordetella bronchiseptica, пертактин, вірус собачого парагрипу і собачий аденовірус серотипу 2 є ефективними для лікування або попередження комплексу інфекційних респіраторних захворювань собак. При використанні імуногенних композицій не спостерігається імунологічно негативний взаємодія між різними вірусними і бактеріальними антигенами. 4 н. і 16 з.п. ф-ли, 3 іл., 4 табл., 5 пр.

Вакцини на основі модифікованого вірусу грипу

Винахід відноситься до галузі біотехнології і вірусології. Запропонований спосіб приготування иммуногенной композиції. Спосіб передбачає отримання рекомбінантної молекули гемаглютиніну (НА) вірусу грипу А субтипу Н5 (Н5) та змішування рекомбінантної молекули з фармацевтичним прийнятним носієм або/і эксципиентом. При цьому рекомбінантна молекула містить заміну на аспарагін на позиції 223 амінокислотної послідовності порівняно з відповідною молекулою дикого типу. Заміна конкретних залишків НА, така як інтродукція аспарагіну в положення 223 НА Н5, дозволяє підвищувати чутливість реакції гальмування гемаглютинації в результаті зміни рецепторної специфічності та/або здатності до зв'язування антитіло-антиген. Винахід може бути використаний в медицині. 13 з.п. ф-ли, 3 іл., 7 табл., 7 пр.

Иммуногенний епітоп вірусу грипу

Винахід відноситься до галузі біотехнології і вірусології. Запропоновано спосіб отримання вирусоподобних частинок вірусу грипу (ВПЛ) в рослині або його частини. Спосіб включає експресію нового білка НА вірусу грипу в рослинах та його очищення. Винахід також спрямовано на ВПЛ, що включають НА білок вірусу грипу і рослинні ліпіди. Винахід відноситься до нуклеїнової кислоти, кодує вдосконалений НА вірус грипу, а також до векторів. Такі ВПЛ можуть бути використані при розробці вакцин проти грипу або для збагачення вже існуючих вакцин. Запропонована група винаходів може бути використана в медицині. 6 н. і 12 з.п. Ф-ли, 44 іл., 1 пр.
Винахід відноситься до медицини, а саме до імунології, і може бути використане для профілактики грипу. Для цього спільно одноразово вводять цитокін, в якості якого використовують інтерферон гамма, і інактивовану протигриповою вакцину. Інтерферон гамма вводять внутрішньом'язово або підшкірно у дозі 0,5 мл 100000 МО±10% у верхню третину плеча однієї руки, а потім внутрішньом'язово у верхню третину плеча іншої руки вводиться 0,5 мл інактивованої протигрипозної вакцини на основі вакцинних штамів вірусу грипу (H5N1) «Орнифлю» з вмістом мінімальної дози гемаглютиніну для цієї вакцини 15 мкг/доза. Спосіб дозволяє підвищити імуногенність і протективну активність вакцини при одноразової вакцинації і зниження побічних ефектів за рахунок модуляції імунної відповіді на антиген. 9 табл., 1 пр.

Штам вірусу грипу в/60/массачусетс/2012/10 для виробництва живий грипозної интраназальной вакцини для дорослих і для дітей

Винахід відноситься до медичної вірусології і стосується штаму вірусу грипу. Вакцинний штам В/60/Массачусетс/2012/10 - реассортант, отриманий шляхом схрещування дикого» вірусу В/Массачусетс/2/2012 з холодоадаптированним температурочувствительним вірусом/СРСР/60/69 - донором аттенуации. Штам В/60/Массачусетс/2012/10 депонований у Державну колекцію вірусів ФГБУ «Науково-дослідний інститут вірусології ім. Д. І. Іванівського» Моз Росії, під №2740, активно розмножується в курячих ембріонах при оптимальній температурі 32°C, характеризується температурочувствительностью і холодоадаптированностью і нешкідливістю для лабораторних тварин. Реассортант успадкував гени, що кодують поверхневі антигени вірусу грипу гемаглютинін (ГА) і нейрамінідазу (NA), від епідемічного батьківського вірусу і решта шість генів, що кодують внутрішні негликозилированние білки, від донора аттенуации. Представлене винахід може бути використано в практичній охороні здоров'я для профілактики захворюваності на грип серед дорослих і дітей. 4 табл.
Винахід відноситься до медичної вірусології і стосується штаму вірусу грипу. Вакцинний штам А/17/Індіана/2011/72 (H3N2v) - реассортант, отриманий шляхом схрещування дикого» вірусу А/Індіана/10/2011 (H3N2v) з холодоадаптированним температурочувствительним вірусом А/Ленінград/13 4/17/57 (H2N2) - донором аттенуации. Штам А/17/Індіана/2011/72 (H3N2v) депонований у Державну колекцію вірусів ФГБУ «Науково-дослідний інститут вірусології ім. Д. І. Іванівського» Моз Росії, під №2739, активно розмножується в курячих ембріонах при оптимальній температурі 32°C, характеризується температурочувствительностью і холодоадаптированностью і нешкідливістю для лабораторних тварин. Реассортант успадкував гени, що кодують поверхневі антигени вірусу грипу гемаглютинін (НА) і нейрамінідазу (NA), від епідемічного батьківського вірусу і решта шість генів, що кодують внутрішні негликозилированние білки, від донора аттенуации. Представлене винахід може бути використано в практичній охороні здоров'я для профілактики захворюваності на грип серед дорослих і дітей. 4 табл.

Вакцинний штам вірусу грипу в/60/вісконсін/2010/125

Винахід відноситься до медичної вірусології і стосується вакцинного штаму вірусу грипу. Охарактеризований штам В/60/Вісконсін/2010/125 - реассортант, отриманий шляхом схрещування вірусу епідемічного В/Вісконсін/1/2010 холодоадаптированним температурочувствительним вірусом/СРСР/60/69 - донором аттенуации. Штам В/60/Вісконсін/2010/125 характеризується температурочувствительностью і холодоадаптированностью. Реассортант успадкував гени, що кодують поверхневі антигени вірусу грипу гемаглютинін (НА) і нейрамінідазу (NA), від епідемічного вірусу і решта шість генів, що кодують внутрішні негликозилированние білки, від донора аттенуации. Штам депонований у Державній колекції вірусів ФГБУ «Науково-дослідний інститут вірусології ім. Д. І. Іванівського» Мінздоровсоцрозвитку Росії під №2723. Винахід може бути використано в практичній охороні здоров'я для профілактики захворюваності на грип серед дорослих і дітей. 1 іл., 4 табл.

Варіанти гемаглютиніну і нейрамінідази грипу

Винахід відноситься до галузі біотехнології і вірусології. Описаний реассортантний вірус грипу. Вірус грипу містить 6 внутрішніх геномних сегментів від одного або декількох вірусів-донорів і геномні сегменти, які кодують HA поліпептид і NA поліпептид. При цьому, HA поліпептид містить аминокислотную послідовність SEQ ID NO:6. Описані також иммуногенная композиція і вакцини, содержашие такий вірус, а також його застосування для одержання лікарського засобу. Винахід може бути використаний в медицині. 7 н. і 9 з.п. ф-ли, 4 іл., 3 табл.

Спосіб отримання високоочищених концентратів вирионних

Винахід відноситься до галузі медицини і може бути використане для виробництва різних інактивованих вакцин проти грипу. Для цього проводять зараження курячих ембріонів, збір вируссодержащей аллантоисной рідини (ЗНА), очищення ВАЖ методом мікрофільтрації. Очищення ВАЖ здійснюють з використанням поліетиленгліколю з молекулярною масою 6000 у концентрації 1,5% з подальшою мікрофільтрацією на глибинних фільтри з діаметром пор 1,0 мкм і 10,0 мкм. Далі очищена ВАЖ концентрується методом ультрафільтрації на мембранах з відсіченням молекулярного ваги 100 килодальтон і отриманий концентрат очищається в градієнті густини сахарози за методом ультрацентрифугирования. Використання даного способу дозволяє підвищити якість очищення віріонів, а також збільшити кількість вірусних антигенів, одержуваних з одного курячого ембріона. 1 табл., 1 іл., 6 пр.

Штам вірусу грипу а/17/вікторія/2011/89 (h3n2) для виробництва живий грипозної интраназальной вакцини для дорослих і для дітей

Винахід відноситься до медичної вірусології та біотехнології. Штам А/17/Вікторія/2011/89 (H3N2) активно розмножується в курячих ембріонах при оптимальній температурі 32°С. Характеризується температурочувствительностью і холодоадаптированностью. Реассортант успадкував гени, що кодують поверхневі антигени вірусу грипу гемаглютинін (НА) і нейрамінідазу (NA), від епідемічного батьківського вірусу і решта шість генів, що кодують внутрішні негликозилированние білки, від донора аттенуации. Штам депонований у Державній колекції вірусів ФГБУ «Науково-дослідний інститут вірусології ім. Д. І. Іванівського» під номером 2724. Винахід може бути використано в практичній охороні здоров'я для профілактики захворюваності сезонним грипом серед дорослих і дітей з допомогою живої грипозної интраназальной вакцини із зазначеного штаму. 1 іл., 6 табл.,
Up!