Спосіб отримання экзосом з крові

 

Винахід відноситься до галузі біохімії та діагностичної медицини, а саме до способів отримання экзосом з крові, є джерелом опухолеспецифичних маркерів для ранньої діагностики та моніторингу онкологічних захворювань.

Экзосоми являють собою мікровезикули розміром 30-100 нм, активно секретируемие через каскад екзоцитозу, зазвичай використовується для розвантаження рецептора і внутрішньоклітинних перехресних сигналів. На додаток до білків головного комплексу гістосумісності (МНС I, МНС II) і білків, залученим до подання антигену, экзосоми можуть містити мембранні та цитозольние білки, залучені в безліч клітинних функцій. Экзосоми секретуються в певних фізіологічних умовах з різних типів клітин, таких як дендритні клітини (DC), лімфоцити, огрядні клітини і епітеліальні клітини.

В даний час ведуться дослідження в області розробки тестів, заснованих на використанні циркулюючих в крові экзосом, оскільки кров безпосередньо контактує з усіма органами/тканинами, і ряд процесів, зокрема розвиток пухлин, супроводжується зміною складу циркулюючих экзосом навіть на самих ранніх етапах розвитку цих процессоецифичних мРНК (1), микроРНК (2) і білків (3).

Відомий спосіб отримання экзосом з сироватки крові (4), що включає: збір крові з послідовним центрифугуванням для осадження клітин, дебриса, а потім ультрацентрифугування при 160000 g протягом 1 години. Для визначення концентрації микроРНК сумарну РНК виділяли з экзосом з допомогою реагенту Trizol (Invitrogen, Carlsbad, СА) згідно протоколу виробника і проводили зворотну транскрипцію (ВІД) з використанням набору TaqManH MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, СА). Кількісну ПЛР проводили з використанням комерційних специфічних праймерів (TaqMan MicroRNA Assay, Applied Biosystems) і реакційної суміші (TaqMan Універсальний PCR Master Mix, Applied Biosystems) за протоколом, рекомендованому виробником (4).

Недоліками способу є високий вміст у цільовому продукті частинок неэкзосомального походження (діаметром більше 100 нм), обмежена кількість экзосом, виділених із сироватки крові, домішки баластних нуклеїнових кислот із зруйнованих у процесі формування тромбу формених елементів крові. Як наслідок, отримані результати про зміст микроРНК у складі экзосом є недостовірними.

Відомий спосіб отримання экзосом з плазми крові (5), що полягає в наступному. Про�их частинок і поділяли компоненти плазми за допомогою білкової рідинної хроматографії. Фракції об'єднували і концентрували шляхом центрифугування за допомогою 3 кДа-відтинають фільтрів (Millipore). Потім сконцентрований препарат наносили на сахарозний градієнт (0.2-2.5 М в 20 мМ трис, pH 8.0) і ультрацентрифугировали (175000 g, 16 год). Частинки, що знаходяться в діапазоні концентрації сахарози 1.08-1.15 г/мл, об'єднували, відмивали розчином PBS (10 мМ фосфатний буфер, 0,15 М NaCl, pH 7,5) і осаджували за допомогою ультрацентрифугирования (175000 g, 2 год). Асоційовані з экзосомами білки розділяли за допомогою 4-12% ПАА-SDS-диск-електрофорезу, гель розрізали на частини, трипсинолиз та екстракцію пептидів з гелю проводили за стандартною схемою (5). За допомогою мас-спектрометрії у складі экзосом було ідентифіковано 66 білків.

Недоліками способу є недостатня чистота цільового продукту (домішка мікрочастинок діаметром 100-220 нм), трудомісткість і тривалість виділення экзосом (більше 23 год), обмежена кількість экзосом, виділених із плазми крові. Як наслідок, не всі з ідентифікованих білків входять до складу экзосом.

Відомий спосіб отримання экзосом з плазми крові (6), полягає в наступному. Клітини і дебрис видаляли шляхом послідовного центрифугування периферичної крові, супернатант фільтр�kтмExosome Precipitation Solution (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA). Сумарну РНК з экзосом виділяли за допомогою комерційного набору Qiagen miRNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) з протоколом виробника та проводили за стандартною схемою (7). Кількісну ПЛР проводили з використанням комерційної реакційної суміші SYBR® Premix Ex TaqтмII, Perfect Real Time (TaKaRa, Dalian, China) за протоколом, рекомендованого виробником.

Недоліками способу є недостатня чистота цільового продукту (домішка мікрочастинок діаметром 100-200 нм), тривалість виділення экзосом (більше 10 год), висока вартість комерційного набору для виділення экзосом, обмежена кількість экзосом, виділених із плазми крові. Як наслідок, отримані результати про зміст микроРНК у складі экзосом є недостовірними.

Найбільш близьким до заявленого способом - прототипом - є спосіб отримання экзосом з крові (8), що включає наступні стадії: (1) одержання сироватки крові шляхом трьох послідовних центрифугирований протягом 20 хв при 300 g, 3000 g і 10000 g; (2) одержання фракції экзосом шляхом ультрацентрифугирования (100000 g, 2,5 год) сироватки, розведеної в буферному розчині PBS, через подушку з 40% сахарози; (3) концентрування экзосом шляхом улатов экзосом виділяли за допомогою комерційного набору АllРrер DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) за протоколом, рекомендованого виробником. ВІД і кількісну ПЛР проводили за протоколом, рекомендованому виробником (Applied Biosystems).

Недоліками способу є тривалість виділення экзосом (більше 6 годин), обмежена кількість экзосом, виділених із сироватки крові, низький вихід экзосом, наявність домішки баластних нуклеїнових кислот із зруйнованих у процесі формування тромбу формених елементів крові. Як наслідок, отримані результати про зміст микроРНК у складі экзосом є недостовірними.

Завданням винаходу є збільшення виходу экзосом, підвищення чистоти цільового продукту і скорочення тривалості способу.

Технічним результатом є підвищення виходу і чистоти цільового продукту, а також скорочення тривалості і зниження трудомісткості способу.

Поставлена задача досягається пропонованим способом, що полягає в наступному.

Проводять збір периферичної крові у вакутейнер або інші пробірки для збору та консервування крові (наприклад, Cell-Free DNA ВСТ, Streck, США). Кров поділяють на плазму і клітинну фракцію шляхом центрифугування при 300 g протягом 10 хв. Клітинну фракцію крові піддають последоват з подальшим центрифугуванням 20 хвилин при 300 g, збір супернатанту №1); потім обробці клітин рівним обсягом 0,15-0,35% розчину трипсину в PBS (5 хвилин інкубація, додавання інгібітору трипсину, перемішування з подальшим центрифугуванням 20 хвилин при 300 g, збір супернатанту №2). Плазму і отримані супернатанти (1,2) з клітинної фракції, що містять экзосоми, пов'язані з поверхнею формених елементів, об'єднують і використовують в якості вихідного матеріалу для отримання сумарного пулу экзосом крові. Для цього з об'єднаного зразка видаляють клітинний дебрис центрифугуванням при 15000-20000 g протягом 10-20 хвилин, частинки неэкзосомального походження видаляють шляхом фільтрації через фільтри з діаметром пор 0,1 мкм, экзосоми осаджують ультрацентрифугированием при 100000-160000 g протягом 60-120 хвилин.

В результаті отримують сумарний пул экзосом крові, який включає экзосоми плазми і экзосоми, пов'язані з поверхнею клітин крові, що дозволяє підвищити вихід цільового продукту і в подальшому підвищити чутливість діагностичних систем шляхом збільшення кількості діагностичного матеріалу (мРНК, микроРНК і білків) в аналізі.

Для подальшого використання в діагностичних тестах в препаратах экзосом виявляють білки або ом на екстракції фенол-хлороформом (9); гуанідинів-фенольним методом (10); методом виділення нуклеїнових кислот за допомогою дрібнодисперсного скла або скловолокнистих фільтрів в присутності хаотропних солей (11).

Кількісний аналіз мРНК або микроРНК крові також проводять будь-яким відомим методом дослідження нуклеїнових кислот, як то: кількісна ПЛР і ВІД-ПЛР, метод вимірювання концентрації нуклеїнових кислот за допомогою флуоресцентних барвників (RiboGreen, SYBR Green II і т. д.). Для визначення білків використовують як вихідний препарат экзосом, так і препарати экзосом, оброблені детергентами. Вимірювання білків виконують за допомогою імунохімічних методів, методів мас-спектрометричного аналізу або цитофлуорометрии.

Визначальною відмінністю пропонованого способу, у порівнянні з прототипом, є те, що після розділення вихідного зразка крові на плазму та клітинну останню фракцію піддають послідовній обробці буферним розчином PBS, що містить 5 мМ ЕДТА, потім обробляють клітини 0,15-0,35% розчином трипсину, клітини осаджують центрифугуванням, а супернатанти використовують в якості додаткового джерела экзосом. Проведення послідовної двохстадійної елюції экзосом, неспецифічно пов'язаних счной поверхні, дозволяє кількісно виділяти экзосоми, пов'язані з поверхнею формених елементів крові і підвищити вихід сумарного пулу экзосом.

Пропонований спосіб має наступні переваги в порівнянні з прототипом:

- забезпечує отримання додаткової кількості экзосом з того ж об'єму крові;

- дозволяє збільшити кількість экзосом як мінімум удвічі порівняно з виділенням экзосом виключно з плазми крові;

- дозволяє майже в 3 рази знизити необхідний для вимірювання маркерних молекул об'єм донорської крові, що зменшує трудовитрати, пов'язані з забором крові, зменшує незручності, що доставляються пацієнта;

- зменшити тривалість способу з 6 до 4 годин.

Винахід ілюструється такими прикладами виконання конкретного способу.

Приклад 1.

У групі здорових донорів (n=10) було проведено виділення экзосом способом-прототипом і пропонованим способом. У всіх здорових донорів-добровольців було взято по 8 мл периферичної крові.

Зібрану кров розділили на плазму і клітинну фракцію крові шляхом центрифугування при 300 g протягом 10 хв. Клітинну фракцію, що містить экзосоми, пов'язані з поверхнею формених елементів крові, посл� хвилин. Клітини осаджували центрифугуванням протягом 20 хвилин при 300 g і збирали супернатант №1. Потім клітини обробляли рівним обсягом 0,15% розчину трипсину в PBS, додавали інгібітор трипсину, перемішували, клітини осаджували центрифугуванням протягом 20 хвилин при 300 g і збирали супернатант №2. Плазму, супернатант №1 і супернатант №2 об'єднували і використовували в якості вихідного матеріалу для отримання сумарного пулу экзосом крові. Для цього з об'єднаного зразка видаляли клітинний дебрис і частинки неэкзосомального походження центрифугуванням при 20000 g протягом 10 хвилин з подальшою фільтрацією через фільтри з діаметром пор 0,1 мкм, а экзосоми облягали ультрацентрифугированием при 160000 g протягом 60 хвилин.

Для оцінки кількості виділених экзосом з використанням способу-прототипу та запропонованого способу була виміряна концентрація білка з використанням комерційного набору NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) за протоколом, рекомендованого виробником. Результати дослідження представлені в таблиці 1. Як видно з таблиці 1, використання запропонованого способу дозволяє збільшити вихід экзосом в середньому в 3 рази.

Розмір частинок в препаратах оцінювали за допомогою трансмиссиировали на мідну сітку, покриту формварной плівкою, протягом 30 с і контрастували 0,5 М уранилацетатом протягом 20 с, сітки вивчали за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа JEM 1400 (Jeol, Японія), робили знімки за допомогою цифрової камери Veleta. Показано, що в препаратах экзосом, отриманих за способом-прототипом, 10±4% частинок мають діаметр більше 0,1 мкм, а значить не є экзосомами. В препаратах экзосом, отриманих запропонованим способом, частка мікрочастинок діаметром більше 0,1 мкм становить 0,3±0,05%. На фіг. 1 зображена електронна мікрофотографія экзосом крові, отриманих способом прототипом (А, Б) і пропонованим способом (В). Довжина масштабної лінії відповідає 200 нм, стрілками виділені экзосоми, овалами - мікрочастинки неэкзосомального походження і клітинний дебрис. З фіг. 1 видно, що використання запропонованого способу дозволяє отримувати препарати экзосом, вільні від клітинного дебриса і частинок неэкзосомального походження (розміром більше 0,1 мкм).

Таким чином, з прикладу 1 видно, що пропонований спосіб дозволяє одержувати препарати экзосом без домішки великих мікрочастинок (діаметром понад 0,1 мкм) і в 3 рази збільшити кількість экзосом, що виділяються з крові порівняно з экзосомами, виделеннимижелези (n=20) на I-II стадіях захворювання була зібрана кров і виділені экзосоми з крові заявляється способом і з плазми. В препаратах виділених экзосом було проведено порівняльне дослідження вмісту 28S рРНК, концентрація якої є відображенням змісту экзосом в препараті.

У всіх пацієнтів була взята кров під час первинного встановлення діагнозу. Зібрану кров здорових донорів та онкологічних хворих розділили на плазму і клітинну фракції крові за допомогою центрифугування протягом 10 хв при 300 g. Экзосоми крові одержували аналогічно прикладу 1, за винятком того, що клітинну фракцію крові обробляли 0,35% розчином трипсину, а з об'єднаного зразка видаляли клітинний дебрис і частинки неэкзосомального походження центрифугуванням при 15000 g протягом 20 хвилин з подальшою фільтрацією через фільтри з діаметром пор 0,1 мкм, а экзосоми облягали ультрацентрифугированием при 100000 g протягом 90 хвилин.

Для виділення экзосом плазми, з плазми видаляли клітинний дебрис і частинки неэкзосомального походження центрифугуванням при 17000 g протягом 20 хв з наступною фільтрацією через фільтри з діаметром пор 0,1 мкм, а экзосоми облягали ультрацентрифугированием при 100000 g протягом 90 хв.

Виділення РНК з экзосом плазми і з экзосом крові проводили за допомогою набору для вибировали з 2 одиницями активності Днкази, не містить Рнказа (Fermentas, EN0531), протягом 1 год при 37°С. Реакцію ВІД проводили з використанням набору для зворотної транскрипції (Біосан, Росія) згідно протоколу виробника.

Для оцінки концентрації 28S рРНК проводили ПЛР в режимі реального часу з використанням наступних праймерів та флуоресцентної проби:

Прямий праймер: 5'-AAGCGGGTGGTAAACTCCAT-3'

Зворотний праймер: 5'-TTCACGCCCTCTTGAACTCT-3'

Проба: 5'-ТАМРА-TACCGGCACGAGACCGATAGTCAA-BHQ-3'

Ампліфікацію проводили в реакційній суміші об'ємом 30 мкл, містить буфер для Taq-полімерази (65 мМ трис-HCl рн 8,8, 16 мМ (NH4)2SO4, 0,05% Tween-20), 0,3 мм dNTP, 8MM MgCl2, 1 e.a. Taq-полімерази, за 0,6 мкМ праймерів, проби до кінцевої концентрації 0,3 мкМ, 5 мкл розчину ДНК-матриці. Вимірювання зразків проводили в дублях. В якості негативного контролю використовували воду. Для побудови калібрувальної кривої використовували ПЛР-продукт довжиною 114 п. н. ПЛР у реальному часі проводили на амплификаторе з оптичним модулем iCycler5 (Bio-Rad, США) згідно з протоколом: 95°C - 3 хв; потім 40 циклів: 95°C - 15 ° с, 60°C - 45 с. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення iQ5 (Bio-Rad, США).

Результати аналізу концентрації копій 28S рРНК у складі экзосом плазми і экзосом крові у здорових жінок і боженщин склала в плазмі 45·105копій/мл і в крові 305·105копій/мл, у хворих на рак молочної залози - 125·105копій/мл і 325·105копій/мл у крові відповідно. Даний приклад показує, що використання запропонованого способу отримання экзосом дозволяє не менше ніж в 3 рази підвищити ефективність виділення экзосом зразка з крові здорових донорів, так і онкологічних хворих. Збільшення кількості виділених экзосом дозволить в подальшому підвищити ефективність виявлення пухлинних маркерів у складі экзосом крові.

Приклад 3.

У хворого Н., 1935 р., що надійшов в онкологічний диспансер з підозрою на рак передміхурової залози, була визначена концентрація пухлинних микроРНК (miR-200a і miR-141) у складі экзосом плазми, отриманих аналогічно прикладу 2 і экзосом крові, отриманих аналогічно прикладу 1, за винятком того, що клітинну фракцію крові обробляли 0,25% розчином трипсину.

МикроРНК з экзосом плазми і экзосом крові були виділені за допомогою набору MirVana (США) за протоколом, рекомендованого виробником. ВІД проводили з використанням набору TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (США) за протоколом, рекомендованого виробником. Концентрація микроРНК (визначена методом 2-дельта-Ct�топографічних праймерів TaqMan MicroRNA assay (США) і TaqMan Універсальний PCR Master Mix (США). Вимірювання зразків проводили в дублях. В якості негативного контролю використовували воду. ПЛР у реальному часі проводили на амплификаторе з оптичним модулем iCycler5 (Bio-Rad, США), дані аналізували за допомогою програмного забезпечення iQ5 (Bio-Rad, США). Було виявлено, що miR-200a у складі экзосом плазми не детектується, концентрація miR-141 склала 2 умовні одиниці. Концентрація микроРНК у складі экзосом крові становила 4 і 8 умовних одиниць для miR-200a і miR-141 відповідно. Даний приклад ілюструє підвищення ймовірності виявлення онкологічного захворювання з використанням відомих пухлинних маркерів за рахунок використання запропонованого способу виділення экзосом крові.

Використання запропонованого способу дозволить підвищити вихід экзосом з початкового об'єму крові як мінімум в 2 рази, з одночасним зниженням трудовитрат і тривалості отримання экзосом, а також забезпечити можливість зменшення об'єму крові для отримання того ж кількості экзосом або підвищення кількості аналізованих маркерів з одного і того ж об'єму крові.

Джерела інформації

1. Pant S., Hilton H., Burczynski M. E. The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function and frontiers for ez-Dorantes M. MicroRNAs transported by exosomes in body fluids as mediators of intercellular communication in cancer // Onco Targets Ther. 2014. V. 7. P. 1327-1338.

3. Choi D.-S., Kim D.-K., Kim Y.-K., Gho Y. S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes // Proteomics. 2013. V. 13. P. 1554-1571.

4. Gallo A., Tandon M., Alevizos I., Illei G. G. The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes // PLoS ONE. 2012. V. 7. P. e30679.

5. Looze C, Yui D., Leung L., Ingham M., Kaler M., Yao X., Wu W. W., Shen R.-F., Daniels M. P., Levine S. J. Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPAR as an exosome-associated protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 378. P. 433-438.

6. Ge Q., Zhou Y, Lu J., Bai Y., Xie X., Lu Z. miRNA in plasma exosome is stable under different storage conditions // Molecules. 2014. V. 19. P. 1568-1575.

7. Mestdagh P., Feys Т., Bernard N., Guenther S., Chen C, Speleman F., Vandesompele J. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. el43.

8. Rupp A.-K., Rupp C, Keller S., Brase J. C., Ehehalt R., Fogel M., Moldenhauer G., Marmé F., Sültmann H., Altevogt P. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage // Gynecologic Oncology. 2011. V. 122. P. 437-446.

9. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995. P. 4-4-4-5.

10. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V. 10. P. 221-224.

11. Boom R., Sol C. J. A. Rapid and simple method for purification nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495-503.

1. Спосіб отримання экзосом з крові, що включає поділ крові на бесклеточную і клітинну фракції за допомогою центрифугування з подальшим отриманням экзосом шляхом ультрацентрифугирова�у дві стадії, спочатку обробляють буферним розчином PBS, що містить 5 мМ ЕДТА, потім рівним обсягом 0,15-0,35% розчину трипсину в PBS, далі плазму і отримані супернатанти об'єднують, видаляють клітинний дебрис і домішки неэкзосомального походження шляхом центрифугування при 15000-20000 g протягом 10-20 хвилин і фільтрують через фільтри з діаметром пор 0,1 мкм, а сумарний пул экзосом осаджують ультрацентрифугированием при 100000-160000 g протягом 60-120 хвилин.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обробку буферним розчином PBS, що містить 5 мМ ЕДТА здійснюють протягом 5 хвилин з наступним центрифугуванням протягом 20 хвилин при 300 g і збором супернатанту.

3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обробку 0,15-0,35% розчином трипсину в PBS здійснюють протягом 5 хвилин з наступним додаванням інгібітору ферменту, перемішуванням, осадженням клітин крові центрифугуванням протягом 20 хвилин при 300 g і збором супернатанту.



 

Схожі патенти:

Штам клітин яєчників китайського хом'яка - продуцент рекомбінантного антитіла проти фактора некрозу пухлини альфа людини

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до рекомбінантної продукції білків людини, і може бути використане у виробництві химерних антитіл до фактора некрозу пухлини людини. Отриманий штам клітин яєчників китайського хом'яка CHO-Inflix 20/5, трансфекованих векторами, экспрессирующими легку і важку ланцюга химерного антитіла проти фактора некрозу пухлини альфа (ФНП-α) людини. Депонований штам в Російську колекції клітинних культур під №РККК(П)760Д. Винахід дозволяє отримувати химерное антитіло з питомою продуктивністю не менш 33,5 пикограмм на клітку в добу. 4 іл., 2 табл., 4 пр.

Культуральна середовище для епітеліальних стовбурових клітин і органоїдів, що містять зазначені стовбурові клітини

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано спосіб культивування епітеліальних стовбурових клітин або виділених фрагментів тканини, що містять зазначені епітеліальні стовбурові клітини, що включає забезпечення позаклітинного матриксу, інкубування епітеліальної стовбурової клітини або виділеного фрагмента тканини, що містить зазначені епітеліальні стовбурові клітини, з позаклітинним матриксом, культивування епітеліальної стовбурової клітини або виділеного фрагмента тканини в присутності клітинної культурального середовища, що містить базальну середовище для клітин тварини або людини, в яку додані інгібітор морфогенетичного білка кістки (BMP) і 5 - 500 нг/мл митогенного фактора росту, а також клітинна культуральна середовище, її застосування, спосіб культивування тривимірного органоида, спосіб його отримання, тривимірний органоид і його застосування. 9 н. і 23 з.п. ф-ли, 10 пр., 34 іл.

Культура плюрипотентних стовбурових клітин на микроносителях

Винахід відноситься до біотехнології. Розкрито спосіб вирощування ембріональних стовбурових клітин людини. Спосіб передбачає прикріплення популяції клітин до микроносителю в середовищі, що містить інгібітор Rho-кінази. Далі проводять культивування клітин, відділення клітин від микроносителя і прикріплення отриманих клітин до другого микроносителю в середовищі, що містить інгібітор Rho-кінази. Винахід може бути використаний в медицині. 6 з.п. ф-ли, 48 іл., 3 табл., 11 пр.

Спосіб отримання та індукції спрямованої диференціювання культури мультипотентних клітин легенів

Винахід відноситься до біотехнології та медицині. Запропоновано спосіб диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин фиброзированних легенів у фибробластние клітини, що характеризується тим, що з правої частки фиброзированних легенів виділяють клітини з фенотипом мезенхімальних стовбурових клітин (CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31-, CD34-, CD45-), здатні самообновляться in vitro протягом 60 днів, потім, при додаванні в культуру мезенхімальних стовбурових клітин фактора росту фібробластів 2 мкг/мл отримують фибробластние клітини. Спосіб дозволяє отримати донорські клітини хворих ідіопатичним з фіброзом тканин фиброзированних легенів. 3 іл., 1 пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології. ЗНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензійна сублиния клітин нирки новонародженого сирійського хом'яка задепонированна в Російській колекції клітинних культур (РКК) у спеціалізованій колекції перещеплюваних соматичних клітинних культур сільськогосподарських і промислових тварин при Всеросійському науково-дослідному інституті експериментальної ветеринарії ім. Я. Р. Коваленко (СХЖ РАСГН) під №89 і призначена для репродукції вірусу ящуру типу А, О, С, Азія-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 і вірусу сказу штам «Щелково-51», які використовуються для виготовлення противірусних вакцин проти ящура та сказу. Результат, що досягається при використанні даної клітинної культури, полягає в підвищенні імуногенності, інфекційності і концентрації клітин ВНК-21/13-13 при промисловому суспензійному культивуванні в біореакторах. 1 табл.

Спосіб отримання популяції клітин, що експресують маркери плюрипотентність і маркери, характерні для лінії сформованої эндодерми

Даний винахід стосується способу отримання популяції клітин, що експресують маркери плюрипотентність і маркери, характерні для лінії сформованої эндодерми. Представлений спосіб передбачає наступні стадії (а) отримання популяції клітин, що експресують маркери HNF-3β, GATA-4, Mixl1, CXCR4, і SOX-17, характерні для лінії сформованої эндодерми, і (b) культивування популяції клітин в умовах гіпоксії на субстраті тканинної культури, не піддаються перед культивуванням попередній обробці білком або экстраклеточним матриксом, у середовищі з додаванням активіну А і ліганду Wnt і IGF-1 або інсуліну, трансферину і селену, де культивовані клітини експресують маркери лінії сформованої эндодерми і маркери плюрипотентність. Охарактеризованное винахід дозволяє отримувати клітини, здатні культивуватися в умовах гіпоксії, що не потребують живлячих ліній клітин, покриттів зі складних білків матриксу і зберігають потенціал диференціювання. 15 з.п. ф-ли, 39 іл., 9 табл., 32 пр.

Тест-система для визначення активності інтерферону людини

Група винаходів відноситься до медицини, а саме до імунології, і може бути використана в лабораторній діагностиці як тест-система і спосіб визначення антивірусної активності інтерферону альфа (ІФН-α) в сироватці крові людини. Тест-система для визначення рівня активності ІФН-α у сироватці крові людини, що включає диплоїдні клітини, вируссодержащую рідину і стандартний інтерферон-α (ІФН-α) людини. Як диплоїдних клітин тест-система включає клітини охарактеризованной лінії диплоїдних клітин - фібробластів людини М-20 на рівні 20-33 пасажів, культивовані в середовищі з додаванням 10% фибринолитически активної плазми (ФАП). А в якості вірусу - адаптований до клітин лінії М-20 вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана, при цьому тест-система додатково включає вітальний барвник на основі двох флурохромів - тріпафлавіна і родаміну С. Група винаходів включає також спосіб визначення рівня активності ІФН-α у сироватці крові людини з використанням розробленої системи. Використання даних винаходів дозволяє кількісно, з хорошою відтворюваністю, визначити активність ІФН-α у зразках досліджуваної сироватки крові за допомогою люмиил., 1 табл., 4 пр.

Спосіб лікування інфекційного перитоніту в експерименті

Винахід відноситься до медицини, а саме до експериментальної хірургії, і може бути використане для лікування інфекційного перитоніту в експерименті. Для цього щурам внутрішньовенно вводять суспензію алогенних мезенхімальних стовбурових клітин з розрахунку 1,5×106 на 100 г маси тварини у 2 мл фізіологічного розчину. Летальність тварин в основній групі склала 27%, а в контрольній - 94%. Запропонований спосіб лікування інфекційного перитоніту в експерименті відкриває нові можливості використання клітинних технологій для зниження летальності пацієнтів при перитоніті. 11 іл., 1 пр.

Система культивування плюрипотентних стовбурових клітин

Винахід відноситься до галузі біотехнології, зокрема до вирощування колоній клітин. Система культивування плюрипотентних стовбурових клітин складається з сполучених між собою системи управління і блоку культивування. При цьому блок культивування містить один або більше відсіків культивування з встановленими на ньому пристроєм введення агента, змінює эпигенетический статус клітини, принаймні, одним пристроєм введення, принаймні, одного модифікатора, відновлюючого генетичний статус клітки, що відповідає за клітинний цикл, пристроєм введення монооксиду азоту, пристроєм введення інгібітора проліферації та пристроєм для введення інгібітору апоптозу. Причому згадані пристрої виконані з можливістю переміщення по зовнішній стороні блоку культивування плюрипотентних стовбурових клітин і почергового введення їх вмісту у відсіки культивування. Система дозволяє вирощувати плюрипотентні стовбурові клітини, підтримувати їх життєзабезпечення та попереджати канцерогенез згодом отриманих з них диференційованих клітин. 2 з.п. ф-ли, 2 іл., 1 пр.

Спосіб полегшення регенерації

Винахід відноситься до галузі біотехнології та імунології. Розкрито спосіб промоції регенеративних процесів у культурі тканини або культури клітин. Спосіб передбачає введення антитіла, яке пов'язується з кінцевим продуктом глюкурування клітини. Також описано застосування такого антитіла для виробництва лікарського засобу. Винахід може бути використаний в медицині. 2 н. і 10 з.п. ф-ли, 1 іл., 2 пр.
Up!