Спосіб оцінки біоактивності хімічних сполук

 

Винахід відноситься до галузі біотехнології та молекулярної біології, що може бути використано у фармацевтичній промисловості і стосується способів оцінки біоактивності хімічних з'єднань шляхом визначення функціональної активності транскрипційних факторів у эукариотической клітці.

Рівень техніки

Клітинні культури з кожним роком знаходять все більше застосування в найрізноманітніших галузях біології, медицини і сільського господарства. Однією з найважливіших областей застосування культур клітин, безумовно, є їх використання в якості тест-об'єктів при фармакологічному скринінгу. Технологія високопродуктивного скринінгу або, іншими словами, визначення біоактивності різних хімічних сполук розглядається в якості ключової на ранніх етапах пошуку і розробки лікарських засобів.

Сучасні системи фармскрининга здатні проаналізувати понад 100 тис. індивідуальних зразків в день на індивідуальній біомішені, що дозволяє виявити не більше декількох активних сполук, так званих «хітів». Інформація, отримана в процесі визначення біоактивності, використовується на наступних стадіях оптимізації хітів. ОЇно-дослідними і клінічними організаціями. Результатом є ідентифікація сполук, які після проходження клінічних випробувань можуть стати ліками.

В даний час накопичений значний експериментальний матеріал по вивченню біоактивності речовин різного походження на культурі клітин [1].

Однак процедура біотестування, у тому числі і лікарських препаратів, досить складна, дорога і вимагає значного часу [2].

У зв'язку з цим, однією з актуальних проблем при оцінці біоактивності різних речовин є розробка та валідація адекватних тест-систем, порівнянних по основним характеристикам з ссавцями, для подальшого використання таких тест-моделей замість вищих тварин. Для успішної розробки та адекватного застосування таких модельних систем необхідно детально представляти спільні механізми реалізації біоактивності на клітинному рівні.

Механізми клітинної відповіді вивчають з використанням сучасних технологій - транскриптомики і протеоміка [3,4]. Однак, незважаючи на високий технічний рівень, ці технології мають свої недоліки. Так, для високочутливої транскриптомики характерні невирішені технічні проблеми: високий рівень неспецифиих даних. З іншого боку, протеом людини набагато більш складний у порівнянні з транскриптомом і сучасна протеомная методологія, незважаючи на високу специфічність, не здатна інвентаризувати всі білки клітини.

Таким чином, розробка нових способів оцінки біоактивності різних хімічних речовин та біологічних чинників, що поєднують в собі чутливість транскриптомики і специфічність протеоміки, є актуальним завданням.

Областями застосування способів оцінки біоактивності, безумовно, є фармакологія та токсикологія. Першим етапом валідації кандидатних фармакологічних субстанцій є їх тестування на предмет токсичності та біологічної дії на культурі клітин і на лабораторних тварин.

Таким способом оцінки біоактивності хімічних сполук може стати вимірювання активності транскрипційних факторів (ТФ) під дією досліджуваного хімічної речовини. Транскрипционная активність ТФ (тобто здатність ініціювати транскрипцію) регулюється різними сигнальними каскадами [5]. В ядрі клітини ТФ зв'язуються зі специфічними послідовностями в регуляторних елементах генів-мішеней і активують або пригнічують транскрип�сигнального каскаду. Вимірювання профілю активності всіх ТФ є інструментом для аналізу функціонального стану глобальної регуляторної мережі клітини. Функціональна активність багатьох ТФ добре охарактеризована, тобто, стежачи за зміною активності певних ТФ, можна отримувати повну інформацію про механізм дії різних хімічних речовин і біологічних факторів.

«Золотим» стандартом оцінки функціональної активності ТФ є так званий репортерний аналіз, в якому репортерний ген знаходиться під контролем ТФ-залежного промотору. Вимірюючи зміну концентрації репортерного білка, можна судити про активність відповідного ТФ. Однак, обмежене число репортерних білків не дозволяє виробляти мультиплексний аналіз ТФ. Ця проблема може бути вирішена шляхом використання різних нуклеотидних послідовностей в якості репортерних генів. Однак і цей методичний підхід має істотні обмеження, пов'язані з різною ефективністю транскрипції гетерогенних нуклеотидних послідовностей, їх різної вторинної структурою та стабільністю в клітці. У кінцевому рахунку, все це впливає на чутливість, специфічність і відтворюваність тих�енку активності ТФ, у цьому винаході пропонується нова технологія оцінки біоактивності хімічних сполук на основі аналізу активності ТФ эукариотической клітці з використанням флуоресцентного і хромато-мас-спектрометричного аналізу.

В роботі Romanov S. et al. [6] (найближчий аналог) був запропонований метод визначення активності різних ТФ еукаріотів. Принцип цього методу полягає в наступному. Культура клітин гепатоцитів HepG2 трансфицируется плазмидними конструкціями, в яких регуляторним елементом є ТФ-залежний промотор, під контролем якого знаходиться ген лужної фосфатази. В даній системі детектується не кінцевий продукт - лужна фосфатаза, а транскрипт кодує її гена. Гетерогенність транскриптів реалізується шляхом введення в послідовність репортерного сайту для розщеплення ендонуклеазою рестрикції на різній відстані від старту транскрипції. Після дії індуктора відбувається тотальне виділення РНК, побудова комплементарної ДНК, введення мітки в кДНК, гідроліз кДНК ендонуклеазою рестрикції і аналіз продуктів розщеплення з використанням капілярного електрофорезу. Численність, складність і трудомісткість стадій аналізу робить цю �розпорядженням кінцевого результату.

Завданням цього винаходу є розробка швидкого, високочутливого, відтвореного методу визначення активності ТФ еукаріотів з детекції кінцевого продукту - протеотипического пептиду з використанням хромато-мас-спектрометричного аналізу.

Поставлена задача вирішується шляхом транзиентной трансфекції клітин лінії еукаріотів шляхом введення в клітину плазмідного вектора, що містить регуляторні елементи для ТФ і послідовність нуклеотидів, які кодують протеотипический пептид (ПП). Протеотипическими вважаються протеолітичні пептиди, відповідні білкового продукту одного гена і не зустрічаються в інших продуктах генів у складі геному, а також здатні ионизироваться і детектувати при мас-спектрометрическом аналізі.

Плазмідний вектор містить необхідні регуляторні елементи для визначення активності ТФ і послідовність нуклеотидів, які кодують ПП, причому для кожного ТФ використовується індивідуальний ПП. Плазмідний вектор, що має назву pX-Y-neo (X - будь транскрипційний фактор еукаріотів, Y - протеотипический пептид, що відповідає даним транскрипционному фактору), отримують на основі плазміди pSEAP2-Basic (Clontech, США) шляхом іі Nhel - BglII і послідовності нуклеотидів, яка кодує протеотипический пептид по сайтах рестрикції EcoRI - BamHI та мінімальний промотор аденовірусу людини по сайтах BglII - HindIII. Таким чином, плазмідний вектор pX-Y-neo містить мінімальний промотор аденовірусу типу людини 5; ген зеленого що флуоресціює білка; послідовність нуклеотидів, які кодують сайт зв'язування транскрипційного фактора; послідовність нуклеотидів, які кодують протеотипический пептид; ген стійкості до неоміцину. Схема плазмідного вектора pX-Y-neo наведена на фіг.1. Завдяки наявності гена стійкості до неоміцину можливе отримання стабільно трансфицированних ліній на основі цього вектора.

Транзиентную трансфекцію плазмидним вектором pX-Y-neo клітин ссавців здійснюють шляхом липофекции. Після додавання до цим клітинам хімічної речовини або біологічного фактора, що змінює (активуючого або інгібуючої) активність ТФ, відбувається активація або пригнічення утворення комплексу досліджуваного ТФ з сайтом його зв'язування, що призводить до підвищення або зниження рівня транскрипції гена, що кодує протеотипический пептид, і гена зеленого флуоресцентного білка, що приводить, у свою чергу, до-спектрометричним аналізом і зміни концентрації зеленого що флуоресціює білка, який детектується флуоресцентним аналізом з використанням планшетного флуориметра або флуоресцентного мікроскопа.

Таким чином, даний спосіб оцінки біоактивності хімічних сполук поєднує в собі простоту виконання (відсутність стадії зворотної транскрипції і мічення), чутливість (детекція не транскриптів гена, а кінцевого продукту - пептиду), специфічність (точний мас-спектрометричний аналіз), відтворюваність (можливість стандартизації протоколу на кожному етапі), мультиплексность (одночасна оцінка активності 50 ТФ), масштабність (аналіз в планшетному форматі), а також можливість нормалізації даних по флуоресценції репортерного.

Розкриття винаходу

Для оцінки біоактивності хімічних сполук був розроблений протокол, який складається з двох послідовних стадій: (1) транзиентной трансфекції лінії клітин еукаріотів плазмидним вектором, що містить регуляторні елементи для певного транскрипційного фактора, послідовність, що кодує протеотипический пептид і ген, що кодує зелений флуоресцентний білок і (2) безпосередньо визначення біоактивності досліджуваного хімічного з'єднання по зміні активності ТФим вектором pX-Y-neo з використанням липофектамина 2000 (Invitrogen, США).

На другій стадії проводять:

1) додавання до стабільно трансфицированним клітинах речовини, що змінює активність транскрипційного фактора;

2) вимір концентрації протеотипического пептиду з використанням хромато-мас-спектрометра і флуоресценції зеленого що флуоресціює білка GFP з використанням флуоресцентного мікроскопа або планшетного спектрофлуориметра.

Приклад реалізації винаходу

Визначення зміни активності транскрипційного фактора CREB в транзиентно трансфицированной лінії клітин НЕК 293 після додавання індуктора транскрипційного фактора CREB - адреналіну.

1.1. Клітини лінії НЕК 293 вирощують у середовищі DMEM (Invitrogen, США), що містить 10% ембріональної бичачої сироватки (ЕБС), 4.5 мг/мл глюкози в 24 лунковому планшеті (Nunc, США) при температурі 37°С при 5% CO2.

1.2. Трансфекцію проводять з використанням липофектамина 2000 (Invitrogen, США) і плазмідного вектора pCREB-glix-neo. В одній пробірці до 1 мкг рекомбінантного плазмідного вектора додають 15 мкл середовища MEM без ЕБС. В іншій пробірці до 15 мкл середовища MEM без ЕБС додають 5 мкл липофектамина. Перемішують обережним пілотуванням, після чого вміст пробірок об'єднують і інкубують при кімнатній темперя зміни активності транскрипційного фактора CREB в транзиентно трансфицированной плазмидним вектором pCREB-glix-neo лінії клітин НЕК 293, клітини вирощують і трансфицируют як описано в п. 1.1-1.2.

2.2. До клітин додають адреналін (Sigma, США) до кінцевої концентрації 10 мкМ і 100 мкМ і інкубують протягом 24 годин.

2.3. Реєстрацію флуоресценції виробляють на эпифлуоресцентном мікроскопі ECLIPSE E800 з конфокальним модулем Nicon ECLIPSE Cl (Nicon, Японія) з аргоновим лазером. Конфокальні зображення отримують з використанням 40Х 1,25 NA об'єктива, з роздільною здатністю 512×512 пікселів і обробляють за допомогою програмного забезпечення до мікроскопу EZ-C1 2.00.

2.4. Про збільшення активності транскрипційного фактора судять по збільшенню інтенсивності вітальної GFP-флуоресценції зразка монослойной культури клітин у присутності адреналіну в порівнянні з інтактним зразком. Результати наведені на фіг.2.

2.5. Хромато-мас-спектрометричний аналіз проводять на мас-спектрометрі TripleTOF 5600+, оснащеному джерелом іонів NanoSpray III (ABSciex, Canada) і поєднаному з нано-потокової хроматографічної системою NanoLC Ultra 2D+(Eksigent). ВЕРХ система використовується в конфігурації предколонка - розділяє колонка. Для хроматографічного розділення використовуються такі буферні розчини: буфер для завантаження зразка на предколонку і буфер А - 98.9% H2O, 1% МеОН, 0.1% FA (v/v); буфер - 99.9% CH8 HLB Oasis (Waters), наносять на предколонку Chrom ХР С18 3 µm 120 Å 350 µm*0.5 mm (Eksigent, Dublin, CA) при швидкості потоку 3 мкл/хв протягом 10 хв. Поділ здійснюють на колонці 3C18-CL-120 (3 µm 120 Å) 75 µm*150 mm (Eksigent, Dublin, CA) при швидкості потоку 300 нл/хв в лінійному повишающемся градієнті буфера від 5 до 40% за 120 хв.

2.6. Для ідентифікації пептидів використовують дані - залежний режим роботи мас-спектрометра. Кожен цикл включає 1 оглядовий MS1 спектр з наступними 50 залежними MS2 спектрами. Для MS1 аналізу використовуються наступні параметри роботи приладу: діапазон мас для аналізу і подальшого відбору іонів для фрагментационного аналізу 300-1250 m/z, час накопичення сигналу 250 мс. Іони для MS2 аналізу вибираються на підставі інтенсивності іонного струму з пороговим значенням 250 cps і зарядом від +2 до +5. Для MS2 аналізу використовують наступні параметри: дозвіл квадруполя UNIT (0.7 Da), діапазон мас 200-1800 m/z, оптимізація фокусування іонного пучка - для отримання максимальної чутливості (дозвіл ~20000), час накопичення сигналу 50 мс для кожного іона. Для зіткненої дисоціації використовують азот. Енергія зіткнень повинна бути однаковою для всіх іонів і лінійно змінюватися від 25 до 55 В протягом 50 мс часу накопичення сигналу. Іони, для котия MS2 спектру у вищій точці хроматографічного піку пептиду (середня ширина піка для компонентів становила 30 сек).

2.6. Для аналізу результатів хромато-мас-спектрометрії використовують алгоритм Paragon (програма ProteinPilot, версія 4.5.0.0., ABSciex). Пошук здійснюється по базі даних SwissProt, таксою HomoSapiens. Перевірку статистичної достовірності ідентифікацій здійснюють на підставі пошуку по реверсированной базі даних білкових послідовностей.

Короткий опис креслень

Фіг.1

Х - послідовності нуклеотидів, які кодують сайти зв'язування відповідних транскрипційних факторів

MLP - головний пізній промотор аденовірусу типу людини 5

SAV - ген стрептавидина

Y - послідовність нуклеотидів, яка кодує протеотипический пептид

GFP - ген зеленого що флуоресціює білка

SV40poly A - файт полиаденилирования з вірусу SV40

Kan promoter - промотор гена стійкості до неоміцину/канаміцину

SV40 early promoter і SV40 ORI - промотор і точка початку реплікації з вірусу SV40

Kan/NeoR - ген стійкості до неоміцину/канаміцину

HSV TK polyA - сигнал полиаденилирования з гена тимідинкінази вірусу простого герпесу

AmpR - ген стійкості до ампіциліну

Synthetic polyA site - синтетичний сигнал полиаденилирования

Фіг.2

Зміна активності транскрипційного фактора CREB (розрахована за флуоресценцок НЕК 293 після додавання адреналіну в концентрації 10 мкМ і 100 мкМ.

Література

[1] Astashkina A, B Mann, Grainger DW. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacol Ther. 2012. V. 134. P. 82-106.

[2] Azad MA, Wright GD. Determining the mode of action ofbioactive compounds. Bioorg Med Chem. 2012. V. 20. P. 1929-1939.

[3] Mendrick DL. Transcriptional profiling to identify biomarkers of disease and drug response. Pharmacogenomics. 2011. V. 12. P. 235-249.

[4] Govorun VM, Archakov AI. Proteomic technologies in modem biomedical science. Biochemistry (Mosc). 2002. V. 67. P. I 109-1123.

[5] Шпіц F, Furlong ЇЇ. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genet. 2012. V13. P. 613-626.

[6] Romanov S, Medvedev A, Gambarian M, Poltoratskaya N, Moeser M, Medvedeva L, Gambarian M, Diatchenko L, Makarov S. Homogeneous reporter system enables quantitative functional assessment of multiple transcription factors. Nat Methods. 2008 V. 5. P. 253-260.

Спосіб оцінки біоактивності хімічних сполук, що відрізняється тим, що на першій стадії проводять транзиентную трансфекцію клітин лінії HEK 293 плазмидним вектором pX-Y-neo (X - будь транскрипційний фактор еукаріотів, Y - протеотипический пептид, що відповідає даним транскрипционному фактору), містить мінімальний промотор аденовірусу типу людини 5; ген зеленого що флуоресціює білка; послідовність нуклеотидів, які кодують сайт зв'язування транскрипційного фактора; послідовність нуклеотидів, які кодують протеотипический пептид; ген стійкості до неоміцину, потім на другій стадії визначають активність трания протеотипического пептиду в трансфицированной культурі клітин у присутності досліджуваного речовини в порівнянні з трансфицированной інтактної культурою клітин.



 

Схожі патенти:

Пристрій для дослідження фізико-механічних властивостей корнеклубнеплодов

Винахід відноситься до галузі сільського господарства і може бути використане для дослідження фізико-механічних властивостей корнеклубнеплодов. Пристрій для дослідження фізико-механічних властивостей корнеклубнеплодов містить раму (1) з прикріпленими до неї електродвигуном (2), на валу якого встановлений змінний диск (3) з досліджуваною поверхнею, і направляючої (4), на якій встановлена рухома візок (5). Рухома візок (5) пов'язана з одного боку з гвинтовим механізмом (7) через пружину (6), а з іншого боку з вантажем (8) через блок (9). Пристрій забезпечений частотним перетворювачем (13), що дозволяє плавно регулювати частоту обертання змінного диска (3), а також гвинтовим механізмом (15) з направляючою, з допомогою якого здійснюється зазор між візком (5) і змінним диском (3). Винахід забезпечує підвищення точності результатів досліджень процесу тертя спокою і руху корнеклубнеплодов про різні поверхні. 1 іл.

Спосіб лихеноиндикации ступеня забрудненості атмосферного повітря

Винахід відноситься до області оцінки ступеня забрудненості атмосферного повітря і може бути використане при моніторингу атмосферного повітря фонової і урбанізованої території. Спосіб передбачає виділення території пробної площадки розміром 25×25 м, визначення зовнішніх ознак лишайників на пробній майданчику, визначення наявних індикаторних видів лишайників та частоти їх зустрічання. На основі отриманих даних розраховується лихеноиндкекс, представленої класифікації лихеноиндекса визначається ступінь забруднення атмосферного повітря. Винахід дозволяє визначити ступінь забрудненості атмосферного повітря за лишайниками. 4 табл., 1 пр.
Винахід відноситься до області зондової мікроскопії. Сутність способу дослідження нано - та мікрооб'єктів методом зондової мікроскопії полягає в тому, що об'єкт поміщають на пористу основу, фіксують на поверхні підкладки і сканують зафіксований об'єкт методом зондової мікроскопії. Використовують підкладку з наскрізними порами, розмір яких менше розміру досліджуваного об'єкта, а фіксацію об'єкта здійснюють ламінарним потоком рідини або газу, що подається на підкладку з боку, що підлягає перевірці, причому величина притискної сили, що діє з боку потоку на об'єкт, знаходиться в діапазоні 10-12-10-3 ньютон. Використання заявленого способу дозволяє досліджувати структури і механічні властивості об'єктів органічної і неорганічної природи, підвищувати його інформативність для дослідження нано - та мікрооб'єктів методом зондової мікроскопії. 7 пр.

Спосіб визначення якості навколишнього середовища методом епр-спектроскопії лишайників

Винахід відноситься до екології. Винахід являє спосіб визначення якості навколишнього середовища методом ЕПР-спектроскопії лишайників, що включає збір зразків талломов лишайників зі стовбурів дерев, які ростуть в індустріальній і фонової зоні, забрудненій антропогенними викидами в навколишнє середовище, очищення, сушіння, подрібнення, відрізняється тим, що сушку проводять при температурі 85-95°C до постійної ваги і подрібнюють, знімають ЕПР-спектри, за якими визначають концентрацію парамагнітних центрів, при перевищенні концентрації парамагнітних центрів у зразках лишайників, зібраних в індустріальній зоні, над концентрацією парамагнітних центрів зразків лишайників з фонової зони судять про низьку якість навколишнього середовища в індустріальній зоні, а при рівності концентрацій парамагнітних центрів - про допустимому якості навколишнього середовища, причому в дослідженнях використовують зразки одного і того ж виду лишайника. Винахід забезпечує удосконалення способу лихеноиндикации, підвищення якості оцінки досліджуваних об'єктів, отримання об'єктивного результату. 2 пр., 2 табл., 3 іл.

Спосіб визначення амонійних сполук в атмосфері тваринницьких комплексів

Винахід відноситься до екології, а саме моніторингу стану довкілля методом біоіндикації. Спосіб визначення амонійних сполук в атмосфері тваринницьких комплексів включає збір зразків лишайника з дерев, що ростуть в фонової зоні, що не має викидів полютантів в атмосферу. Дані для зразків лишайника, зібраних у зоні викиду полютантів в атмосферу, порівнюють з даними для лабораторних стандартів методом ІЧ-спектроскопії. Для отримання стандартів в лабораторних умовах моделюють процес взаємодії лишайника фонової зони з викидами полютантів, що сприяють утворенню сульфату амонію. У якості біоіндикатора використовують лишайник Parmelia sulcata. Винахід дозволяє визначати рівень амонійних сполук в атмосфері тваринницьких комплексів. 2 табл., 1 іл.

Спосіб визначення хімічного складу шлакових матеріалів

Винахід відноситься до галузі чорної металургії і може бути використане при визначенні хімічного складу матеріалів, що містять кусковий метал, що використовуються в якості сировини при виробництві чавуну. Спосіб включає поділ матеріалу на металеву та шлакову складові, вимірювання маси металевої складової, подрібнення шлакової складової до крупності не більше 5 мм і визначення в ній за допомогою повного кислотного розкладання масової частки заліза загального та необхідних компонентів, розрахунок масової частки заліза загального і компонентів в матеріалі, причому після подрібнення відбирають пробу крупністю від 0,16 мм, але менше 5 мм, і виконують хімічний аналіз. Досягається підвищення інформативності та надійності аналізу.

Спосіб прогнозування ранньої стадії апоптозу

Винахід відноситься до медицини і може бути використане для прогнозування ранньої стадії апоптозу лімфоцитів. Для цього виділяють клітини, інкубують їх 48 годин при температурі 37°C і 5% вмісті CO2 з додаванням індуктора апоптозу дексаметазону в концентрації 10-4 моль/мл Життєздатність лімфоцитів визначають кількісно по включенню трипанового синього з наступним визначенням концентрації відновленого і окисленого глутатионов в лізаті лімфоцитів після попередньої інкубації протягом 30 хвилин з 10 мМ 2-вінілпіридину. Ранню стадію апоптозу лімфоцитів прогнозують при одночасному комплексному зниження концентрації відновленого глутатіону на 17% і більше і збільшенні концентрації окисленого глутатіону на 19% і більше порівняно з контролем. Використання запропонованого способу у медичній практиці дозволяє прогнозувати статус антиоксидантної системи організму при різних захворюваннях за оцінкою ранній стадії апоптозу лімфоцитів. 1 табл.
Спосіб визначення величини вільнорадикальної активності твердих матеріалів відноситься до області екологічного тестування, контролю якості будівельних та інших матеріалів і може бути використаний для визначення негативного впливу твердих матеріалів на живі організми. Спосіб включає вибір і підготовку досліджуваних зразків, відбір заданих обсягів розчинів компонентів тестової системи, приміщення в кювету досліджуваних зразків і компонентів тестової системи, реєстрацію хемілюмінесценції з наступною кількісною оцінкою її величини з урахуванням фонового сигналу хемілюмінесценції. При цьому беруть масу наважки зразка досліджуваного матеріалу, відповідну величиною питомої поверхні 0,20±0,05 м2/г, а у разі, коли не представляється можливим визначити величину питомої поверхні досліджуваного зразка, беруть наважку 0,010±0,005 р. Поміщають наважку зразка досліджуваного матеріалу в кювету і послідовно додають компоненти тестової системи: 0,01 М розчин люмінолу в 0,5 М розчині NaOH та розчин пероксиду водню 20-30% концентрації до заповнення робочого об'єму кювети, дотримуючись співвідношення люмінол:пероксид водню рівним 2:5. І потім реєструють значення хемилюм�ический результат полягає у виявленні вільнорадикальної активності твердих матеріалів методом реєстрації хемілюмінесценції за допомогою системи хімічних реагентів без використання біологічних субстратів в тестовій системі. 3 табл., 3 пр.
Винахід відноситься до способу оцінки антиоксидантної активності рослинної сировини з вовчого тіла болотного (Comarum palustre L.). Спосіб оцінки антиоксидантної активності рослинної сировини з вовчого тіла болотного (Comarum palustre L.) полягає у визначенні антиоксидантної активності у водних настоях шабельника болотного по зниженню рівня вільно-радикального окислення, який визначають за рівнем малонового діальдегіду (МДА) за методом взаємодії з тиобарбитуровой кислотою в модельній системі перекисного окислення ліпідів, представленої отриманими з лецитину ліпосомами. Вищеописаний спосіб знижує трудомісткість визначення антиоксидантної активності і спрощує обробку отриманих результатів, знижує вартість проведення аналізу, підвищує точність визначення. 1 табл.

Спосіб оцінки фармакологічних і токсикологічних властивостей речовин - радіо-, токсикопротекторов і радіо-, токсикосенсибилизаторов

Винахід відноситься до галузі радіобіології та експериментальної медицини. Спосіб оцінки фармакологічних і токсикологічних властивостей речовин полягає в тому, що досліджувана речовина вносять в живильне середовище личинок та мух Drosophila melanogaster, що поєднують у своєму геномі гипоморфние мутації ss - і СG5017-генів. Опромінюють личинок та мух іонізуючими променями в дозі 1-10 рентген. Оцінюють життєздатність, структури кінцівок і рівень транскрипції генів CG 1681, CYP6G1 і ss. Порівнюють отримані характеристики мух, вирощених на середовищі, що містить досліджувана речовина, та мух, вирощених на середовищі, що не містить досліджувана речовина, опромінених і неопромінених, і визначають фармакологічні властивості речовини за результатами порівняння життєздатності, кількості тарзальних сегментів кінцівки і рівня транскрипції генів CG 1681, CYP6G1 і ss у мух всіх сформованих груп. Спосіб дозволяє здійснити ефективний швидкий спрямований відбір і визначити властивості речовин з токсикопротекторними, радіопротекторні, токсикосенсибилизирующими і радиосенсибилизирующими властивостями. 7 іл., 2 табл., 2 пр.

Спосіб хромосомної інтеграції і заміни послідовності днк в clostridia

Винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до способу заміни послідовності ДНК-мішені за допомогою гомологічною рекомбінації в Clostridium acetobutylicum, способу заміни двох або більше генів-мішеней за допомогою гомологічною рекомбінації в одній і тій же клітині С.acetobutylicum, трансформованій клітині Clostridium acetobutylicum, трансформирующему вектору

Генетична конструкція для експозиції білка на поверхні клітинної стінки дріжджів yarrowia lipolytica

Винахід відноситься до генної інженерії та мікробіологічної промисловості і стосується генетичної конструкції для експозиції білка на поверхні клітинної стінки Yarrowia lipolytica

Генетична конструкція для отримання стабільних трансформантів грибів роду rhizopus

Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості і стосується вектора, призначеного для отримання стабільно трансформованих штамів грибів Rhizopus oryzae

Кодована ядерної днк система транскрипції в пластидах вищих рослин

Винахід відноситься до генної інженерії рослин, зокрема до трансформації пластид вищих рослин

Спосіб селекції генетично трансформованих рослинних клітин з популяції клітин

Винахід відноситься до способу виділення генетично трансформованих клітин, в які введена задана послідовність нуклеотидів, що полягає в тому, що трансформовані клітини отримують виборчі переваги без руйнування нетрансформированних клітин, а також до нових сполук, які використовуються у зазначеному способі

Пептиди, які проникають у клітини, і їх застосування

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до інтерналізації терапевтичних молекул всередину клітини, і може бути використане в медицині. Отримують композицію для доставки молекул нуклеїнових кислот в клітини, що містить щонайменше один пептид з щонайменше 92% ідентичністю до GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); або YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), приєднаний до однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот. Винахід дозволяє підвищити ефективність доставки молекул нуклеїнових кислот всередину клітини ссавця за рахунок пептиду, здатного интернализироваться всередину клітини ссавця з ефективністю, що становить щонайменше 200% від ефективності інтерналізації пептиду ТАТ, має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1). 5 н. і 3 з.п. ф-ли, 16 іл., 1 табл., 8 пр.

Інсулін, стабілізований галогеном

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до отримання аналогів інсуліну, і може бути використане в медицині в якості лікарського засобу для зниження рівня глюкози в крові у пацієнта. Аналог інсуліну містить полипептидную В-ланцюг, що включає галогенированний фенілаланін у положенні В24, що забезпечує збільшену стабільність у порівнянні з негалогенированним інсуліном або аналогом інсуліну. При цьому галогенированний фенілаланін являє собою орто-монофторфенилаланин, орто-монобромфенилаланин або орто-монохлорфенилаланин. Обумовлена галогенированием стабілізація інсуліну дозволяє спростити лікування пацієнтів з цукровим діабетом у країнах, де відсутній доступ до холодильного обладнання. 5 н. і 6 з.п. ф-ли, 8 іл., 7 табл.

Спосіб отримання препаративних кількостей вірусних частинок флоэмно-органиченних вірусів

Винахід відноситься до біотехнології та фундаментальної вірусології. Запропоновано спосіб отримання препаративних кількостей вірусних частинок, що імітують віріони вірусу скручування листя картоплі (ВСЛК). Спосіб передбачає отримання химерного вірусу шляхом вставки гена білка оболонки икосаэдрического низкокопийного флоэмно-обмеженого вірусу (ИНФОВ) в ефективний вірусний вектор на основі РНК тобамовируса. Далі проводять зараження рослини отриманим химерним вірусом для розмноження та його накопичення в тканинах рослин. У висновку проводять виділення химерного вірусу з тканин рослини. Також описані плазміда для здійснення такого способу, препарат химерного вірусу, одержуваного з допомогою описаного способу, спосіб отримання антисироватки до природних изолятам ВСЛК та її використання. Винахід може бути використано в галузі сільського господарства. 7 н. і 3 з.п. ф-ли, 12 іл.
Up!