Засоби для лікування пухирчатки, що містять антитіла проти ліганду fas

 

Область техніки, до якої належить винахід

Даний винахід має відношення до застосування антагоністів ліганду Fas людини (також іменується CD95L або Apo1L, а надалі скорочено FasL), зокрема, до застосування гуманизованних антитіл проти FasL для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, особливо для профілактики та/або лікування пухирчатки (пемфигуса).

Рівень техніки

Пухирчатка (пемфігус) являє собою аутоімунне бульозні захворювання шкіри, яке характеризується втратою адгезії кератиноцитів, викликаної аутоанти-тіла, спрямованими проти десмосомних білків (десмоглеинов, dsg). Пухирчатка поширена по всьому світу з частотою приблизно 1-5 випадків на 100000 в рік і вражає переважно жінок.

Пухирчатка характеризується втратою адгезії супрабазальних кератиноцитів, які округлюються в процесі, відомому як акантолиз. Патогенез пухирчатки піддається значному перегляду, в основному з-за того, що крім антитіл до десмоглеинам акантолиз може викликати нова група антитіл до холинэргическим рецепторів (Kalish, 2000). Крім того, було показано, що утворення бульбашок не можна объясниѰно, що освіта десмосом не пригнічується при зв'язуванні аутоантитіл пухирчатки (PvIgG) з бульбашками, тоді як десмосомние з'єднання дисоціюють через 24-36 год після обробки аутоантителами PvIgG. В цей же час відбувається ряд стадій передачі сигналів, що запускаються PvIgG.

Ці спостереження припускають, що при пухирчатці певну роль відіграє апоптоз. Дійсно, пухирчатка являє собою захворювання, викликане втратою клітинної адгезії (Run AS et al., 1978), а апоптоз може виникати у зв'язку з відокремленням клітин (Marconi et al., 2004). Ці ідеї повністю підтверджуються виявленням апоптозу в ураженій пузирчаткой шкірі. Зокрема, акантолитические клітини експресують основні маркери апоптозу (Wang X et al., 2004). Ще більш цікаво те, що позначені методом TUNEL ядра також виявилися пов'язаними зі склепінням бульбашок, що свідчить про присутність апоптотичних клітин в навколишньому пошкодження шкірі перед відділенням. Крім того, апоптотические клітини, що експресують Ig і активовану каспазу-8, виявляються по краях поразок, в тих місцях, де не видно руйнування міжклітинних контактів (Wang X et I, 2004). Ці результати переконливо показують, що при пухирчатці в кератиноцитах перед акантолиз� в багато патофізіологічні процеси. Апоптоз може супроводжувати як роз'єднання клітин один від одного (Rezgui et al., 2000; Bergin et al., 2000), так і втрату взаємодії клітин і матриксу (Giancotti and Ruoslahti, 1999).

Fas (або FasR) є представником суперсімейства TNF-рецепторів, який при зв'язування з лігандом Fas (FasL) запускає апоптоз у багатьох клітинних системах (Sharma et al., 2000). Внутрішньоклітинна передача сигналу при викликаному Fas-FasL апоптозу здійснюється із залученням цілої низки адапторних молекул типу FADD (Fas-асоційований домен смерті) і FLICE (FADD-подібна ICE, каспаза 8), які в свою чергу ингибируются FLIP (білком, інгібуючим FLICE) (Juo et al., 1998). Взаємодія Fas-FasL бере участь у патологічних механізмах деяких імуно-запальних та інфекційних захворювань, таких як СНІД (Bahr et al., 1997) і системна червоний вовчак (Kovacs et al., 1997). Шкірні захворювання, що характеризуються залученням метаболічного шляху Fas-FasL, включають гостру реакцію "трансплантат проти господаря", токсичний епідермальний некроліз та меланому (Wehrii et al., 2000). Крім того, повідомлялося, що ураження, подібні з акантолитическими, спостерігаються в культурі кератиноцитів, обробленої і PvIgG, і антитілами до FasR, тоді як PvIgG викликає кластеризацію FasR, FasL і каспази-8 на клітинній мембрані з�ибитор значною мірою блокує утворення бульбашок в моделі пухирчатки на мишах (Li et al., 2006). В цілому ці результати показують, що FasL і зовнішній апоптотический шлях відіграють вирішальну роль у механізмах, що лежать в основі акантолиза.

Яка б не була природа аутоантитіл при пухирчатці, вплив PvIgG посилює експресію декількох проапоптозних генів, в тому числі FasL, за багато годин до акантолиза. Крім того, внутрішньовенне введення IgG (ivIgG) запобігає викликане PvIgG зростання FasL та апоптоз в кератиноцитах, а також запобігає акантолиз і апоптоз in vivo (Arredondo J et al., 2005).

Без лікування смертність від пухирчатки звичайної досягає 100%. Рання системна терапія необхідна для стримування пухирчатки, але побічні ефекти системної терапії є головним ускладненням. Лікування включає введення кортикостероїдів, препаратів, що містять золото, протизапального препарату дапсона або препаратів, що пригнічують імунну систему (як-то азатіоприну, метотрексату, циклоспорину, циклофосфаміду або мікофенолату мофетил). В даний час найбільш поширеним способом лікування пухирчатки є стероїди, які необхідно вводити протягом усього життя і які можуть викликати важкі побічні ефекти. Більшість хворих пузирчаткой вмирають від цих побічних еф�тривенное введення імуноглобуліну (ivIg). Плазмаферез являє собою процес, за допомогою якого з крові видаляють плазму, що містить антитіла, і замінюють її вводиться внутрішньовенно рідиною або донорської плазмою. Плазмаферез можна застосовувати на додаток до системних препаратів, щоб знизити кількість антитіл у крові. У розробці знаходяться і кілька нових молекул: микофенолат мофетил, PI-0824, PRTX-100 і антитіла проти CD20 являють собою иммуносупрессорние препарати, які впливають на Т - і В-клітини.

Поточний рівень смертності все ще становить від 5 до 25%; найбільш частою причиною смерті є інфекції, а одним з найважливіших факторів, як і раніше викликають високий рівень смертності, є довгострокова иммуносупрессорная терапія (в основному кортикостероїдами). Імуноглобулін може викликати деяке короткочасне поліпшення, але ніби як не дає тривалої ремісії, а його вартість робить довгострокове застосування недоцільним.

Також є деякі заперечення проти застосування плазмаферезу. Хворі, ослаблені застосуванням преднизона або інших иммуносупрессорних коштів, і піддаються плазмаферезу, знаходяться в групі підвищеного ризику раптової смерті від сепсису. Крім того, це�ска раптової смерті від сепсису і високої вартості плазмаферез показаний тільки в найважчих, не піддаються лікуванню випадках, коли хворий безсумнівно піддається ризику померти від самого захворювання.

Сутність винаходу

Метою справжнього винаходу є отримання терапевтичного засобу для лікування пухирчатки. Розробка нового препарату, що блокує FasL, дозволить повністю запобігти відділення клітин і виникнення уражень шкіри.

Загалом, даний винахід стосується лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, за допомогою введення антагоніста FasL. Антагоністи FasL можуть бути обрані з антитіл проти FasL, зокрема гуманізованих або людських антитіл проти FasL, з молекул нуклеїнових кислот, впливають на експресію Fas, як-то антисмислової молекул або молекул, здатних до інтерференції з РНК, наприклад, молекул siPHK; з розчинних молекул рецептора Fas, що нейтралізують FasL мутеинов, і низькомолекулярних хімічних сполук, які інгібують взаємодія Fas-FasL. Антагоністи FasL запобігають апоптоз кератиноцитів і подальше міжклітинний роз'єднання (акантолиз). Таким чином, антагоністи FasL особливо підходять для профілактики та/або лікування пухирчатки, напр., для профілактики та/або лікування шкірно-слизової п�динение, переважна біологічні ефекти FasL. Вираз "з'єднання, переважна біологічні ефекти FasL", справжній винахід ставиться до всіх сполук, які здатні повністю або хоча б суттєво пригнічувати або нейтралізувати біологічні ефекти FasL. Наприклад, інгібуючий або нейтрализирующий ефект може ґрунтуватися на придушенні зв'язування FasL зі своїм природним рецептором і тим самим викликаної ним передачі сигналів. Це досягається, наприклад, за допомогою антитіл, що з FasL самим по собі або з розчинними рецепторами, що імітують Fas, або з допомогою нейтрализирующих FasL мутеинов, блокуючи при цьому зв'язування FasL з клітинними рецепторами. Інтерферируются з експресією Fas або FasL, siRNA буде блокувати систему Fas/FasL.

Терапія за допомогою антагоністів FasL є або монотерапією, або комбінованої терапії разом з іншими лікарськими засобами, придатними для лікування пухирчатки або інших шкірних захворювань, зокрема, як описано вище. Наприклад, комбінована терапія антагоністами FasL і стероїдами може забезпечити радикальне зниження дозування стероїдів.

У кращому втіленні цього винаходу передбачено терапевтическт в якості активного інгредієнта. Переважно антитіло являє собою химерное, гуманізоване або людське антитіло проти FasL або його антигенсвязивающий фрагмент або похідне, напр., рекомбинантное одноцепочечное антитіло. При необхідності антитіла можуть бути конъюгировани з ефекторними молекулами, напр., цитостатичними, цитотоксичними та/або радіоактивними сполуками.

Кращі гуманізовані антитіла, які підходять для лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки, у відповідності з цим винаходом, описані в WO 1997/002290A1 ("Anti-Fas ligand antibodies and assay method using the same antibody") або в WO 1998/010070 Al ("Humanized immunoglobulin reacting specifically with Fas ligand or active fragments thereof and region inducing apoptosis originating in Fas ligand humanized antibodies"), зміст яких включено шляхом посилання. Інші бажані гуманізовані антитіла, які підходять для лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки, у відповідності з цим винаходом, описані в US 7,262,277 ("Antagonistic anti-hFas ligand human antibodies and fragments thereof), зміст якого також включено шляхом посилання.

Людські або гуманізовані антитіла мають щонайменше три можливі переваги перед мишин�орная частина відбувається людини, вона може краще взаємодіяти з іншими частинами системи людини; 2) імунна система людини не буде розпізнавати каркасний ділянку або З-ділянка гуманизированного антитіла як чужорідного, тому антитільний відповідь на таке введене антитіло повинен бути слабшим, ніж на абсолютно чужорідне мишаче антитіло або частково чужорідне химерное антитіло; 3) введені гуманізовані антитіла імовірно будуть мати період напівжиття, більш близький до природних антитілам людини, що дозволить вводити менші і менш часті дози.

Іншими кращими антагоністами FasL є розчинні молекули FasR, що включають позаклітинне розчинну частина Fas-рецептора, або молекули модифікованих антагоністів FasL, що володіють активністю конкурентних або неконкурентних антагоністів. Такі молекули інгібують взаємодії FasL/FasR тим, що FasL зв'язується з розчинним аналогом рецептора або молекула-антагоніст FasL зв'язується з природним рецептором, тим самим послаблюючи або повністю усуваючи зв'язування біологічно активного FasL з природним рецептором. При лікуванні за допомогою siRNA для визначення типу лікування і курсу терапії для лікування суб'єкта можна використовувати казания результату лікування та для визначення ефективності з'єднань і композицій, модулюючих рівень та/або активність деяких білків Fas і/або FasL, пов'язаних з яким-небудь ознакою, станом або захворюванням.

В одному особливо кращому аспекті даний винахід стосується застосування:

(i) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas людини (FasL), причому дане моноклональне антитіло включає щонайменше одну вариабельную область важкої ланцюга і щонайменше одну вариабельную область легкої ланцюга, причому амінокислотні послідовності ділянок, що визначають комплементарність (CDRs) важкої ланцюга, являють собою:

(a1) CDR H1: Asn Tyr Trp Ile Gly (SEQ ID NO:1),

(b1) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEQ ID NO:2),

(c1) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO:3) або

(d1) послідовність, отриману шляхом заміни 1, 2 або 3 амінокислот у SEQ ID NOs: 1,2 і/або 3,

та/або амінокислотні послідовності ділянок, що визначають комплементарність (CDRs) легкого ланцюга, являють собою:

2) CDR L1: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Thy Leu Gly (SEQ ID NO:4),

(b2) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO:5),

(c2) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEQ ID NO:6) або

(d2) послідовність, отриману гмента, розпізнає той самий епітоп FasL людини, що і антитіло (i),

для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки.

У другому особливо кращому аспекті даний винахід стосується застосування:

(i) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas людини (FasL), причому дане моноклональне антитіло виробляється клітинами гібрид омі з номером доступу FERM ВР-5045, або антитіла або фрагмента антитіла, відбувається з нього, або

(ii) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, що розпізнає той самий епітоп FasL людини, що і антитіло (i),

для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки.

У третьому особливо кращому аспекті даний винахід стосується застосування:

(i) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas людини (FasL), причому дане моноклональне антитіло включає щонайменше одну вариабельную �ательности ділянок, визначають комплементарність (CDRs) важкої ланцюга, являють собою:

(a1) CDR H1: Glu Tyr Pro Met His (SEQ ID NO:7),

(b1) CDR H2: Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (SEQ ID NO:8),

(c1) CDR H3: Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO:9) або

(d1) послідовність, отриману шляхом заміни 1, 2 або 3 амінокислот у SEQ ID NOs: 7, 8 та/або 9,

та/або амінокислотні послідовності ділянок, що визначають комплементарність (CDRs) легкого ланцюга, являють собою:

2) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn (SEQ ID NO:10),

(b2) CDR L2: Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEQ ID NO:11),

2) CDR L3: Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (SEQ ID NO:12) або

(d2) послідовність, отриману шляхом заміни 1, 2 або 3 амінокислот у SEQ ID NOs: 10, 11 і/або 12;

або

(ii) антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, що розпізнає той самий епітоп FasL людини, що і антитіло (i),

для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки.

У четвертому кращому аспекті даний винахід стосується застосування:

(i) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas людини (FasL), причому дане монантитела або фрагмента антитіла, що відбувається з нього, або

(ii) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, що розпізнає той самий епітоп FasL людини, що і антитіло (i),

для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки.

В особливо кращому втіленні даний винахід спрямовано на застосування людських антитіл проти FasL або їх антигенсвязивающих частин, що включають вариабельную область легкого ланцюга і/або вариабельную область важкої ланцюга, як описано в US 7262277, зміст якого включено шляхом посилання. Зокрема, кращі людські антитіла проти FasL, придатні для лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів у відповідності з цим винаходом, включають вариабельную область легкої ланцюга, що включає поліпептид з послідовністю, наведеною в SEQ ID NO 2 з US 7262277 (включеного шляхом посилання), а також включають вариабельную область важкої ланцюга, що включає поліпептид з послідовністю, наведеною в SEQ ID NO 10 або 18 з US 7262277 (включеного шляхом посилання). Зокрема, винахід стосується застосування людського антитіл�доми з номером доступу АТСС РОТА-4018) проти hFas, як описано в US 7262277 (включеному шляхом посилання) для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки.

В наступному кращому аспекті даний винахід стосується застосування:

(i) моноклонального людського антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas людини (FasL), причому дане моноклональне антитіло включає щонайменше одну вариабельную область важкої ланцюга і щонайменше одну вариабельную область легкої ланцюга, причому амінокислотні послідовності ділянок, що визначають комплементарність (CDRs) важкої ланцюга, являють собою:

(a1) CDR H1: Arg His Gly Ile Thr (SEQ ID NO:13) або

2) CDR H1: Ser His Gly Ile Ser (SEQ ID NO:14),

(b1) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO:15) або

(b2) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (SEQ ID NO:16),

(c1) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO:17) або

(c2) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEQ ID NO:18), або

(d1) послідовність, отриману шляхом заміни 1, 2 або 3 амінокислот у SEQ ID NOs 13, 14, 15, 16, 17 і/або 18,

та/або амінокислотні послідовності ділянок, определяющО:19),

(b3) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO:20),

3) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO:21) або

(d3) послідовність, отриману шляхом заміни 1, 2 або 3 амінокислот у SEQ ID NOs: 19, 20 і/або 21;

або

(ii) антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, що розпізнає той самий епітоп FasL людини, що і антитіло (i),

для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки.

У заключному кращому аспекті даний винахід стосується застосування:

(i) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas людини (FasL), причому дане моноклональне антитіло виробляється клітинами гибридоми з номером доступу АТСС РОТА-4017 та/або АТСС РОТА-4018, або антитіла або фрагмента антитіла, відбувається з нього, або

(ii) моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, що розпізнає той самий епітоп FasL людини, що і антитіло (i),

для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема пухирчатки.

Клітини гібридом� культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 (США).

Лікарський засіб цього винаходу може бути представлено у вигляді фармацевтичної композиції разом з фармацевтично прийнятним носієм. Переважно фармацевтична композиція вводиться за допомогою ін'єкції або інфузії, напр., внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, внутрішньошкірно, внутрішньочеревно або іншим відповідним способом. Композиція може вводитися місцево або системно. Переважно композиція вводиться системно.

Фармацевтичні композиції, які підходять для застосування у винаході, включають активний засіб ефективного кількості для досягнення наміченої мети. Ефективна доза лікарського засобу справжнього винаходу може становити від 0,1 мкг до 100 мг, аж до загальної дози в 1 г, в залежності від способу введення. Фармацевтичні композиції можна вводити щоденно, напр., один або кілька разів, або кожні 2-4 дні, щотижня або раз на два тижні. Лікарський засіб можна вводити в одному циклі лікування, що складається з введення одного або кількох лікарських засобів, або в декількох циклах лікування, кожен з яких складається з введення одного або кількох лікарських засобів. КаждѾэтому, у відповідності з цим винаходом лікарський засіб можна застосовувати в комбінованій терапії разом із щонайменше однією додатковою терапією, ефективною проти шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів, зокрема, проти пухирчатки. Лікарський засіб має застосовуватись саме по собі або в комбінації з іншими иммуносупрессорними препаратами, зокрема, зі стероїдами, з тим, щоб зменшити їх дозу і/або звести до мінімуму хронічні побічні ефекти. При комбінованому застосуванні лікарський засіб переважно вводиться на щомісячній основі. При застосуванні лікарського засобу самого по собі воно переважно вводиться постійно протягом якогось терміну, що залежить від індивідуального випадку.

Далі даний винахід буде розкрито більш детально на прикладах.

ПРИКЛАДИ

Спочатку методом фарбування TUNEL оцінювали наявність апоптозу в епідермісі шкіри навколо вогнищ ушкодження у заморожених зрізах від хворих пузирчаткой, що не отримували лікування. Флуоресцентні зразки аналізували методом скануючої конфокальної лазерної мікроскопії. У супрабазальних шарах епідермісу навколо вогнищ� щоб підтвердити наявність апоптозу в пухирчастих пошкодженнях, ми використовували фіксовані формаліном і залиті парафіном біопсії і детектировали активної форми каспази-3. Методика фарбування виконувалась за допомогою системи Ultra Vision LP Detection System АР Polymer і Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA) згідно з інструкцією виробника. Візуалізацію проводили за допомогою таблеток Fast Red у нафтол-фосфатному субстраті. В уражених пузирчаткой зразках виявилося, що фрагмент каспази-3 локалізовано і в зводі, і на підставі бульбашок, а деякі клітини були позитивними в епідермісі навколо вогнищ ушкодження (фіг.2). Мабуть, цей результат свідчить про те, що клітинна загибель кератиноцитів відбувається до відділення кератиноцитів, що веде до акантолизу.

Оскільки апоптозні кератиноцити широко представлені при пухирчатці, ми вирішили дослідити, чи здатна сироватка крові хворих пузирчаткой викликати апоптоз в нормальних кератиноцитах людини. Для цього кератиноцити висівали на планшети і культивували у вільній від сироватки середовищі (KGM) до стану предконфлюэнтности. Потім клітини культивували у базальній середовищі для кератиноцитів і обробляли протягом 48 годин додаванням 25% сироватки від хворих, що не отримували лікування, або від хворих, �поптоз оцінювали методом фарбування TUNEL in situ. Оцінювали приблизно 100 клітин в обраних випадковим чином полях і підраховували зміст TUNEL-позитивних клітин. Сироватка хворих пузирчаткой, але не сироватка здорових суб'єктів або хворих, що піддавалися лікуванню стероїдами, викликала апоптоз в кератиноцитах людини (фіг.3 А-В).

Оскільки система Fas/FasL залучена у багато апоптотические процеси також і на рівні шкіри (Wehrli et al., 2000), ми вимірювали рівень FasL в сироватці крові у хворих пузирчаткой методом двухцентрового ферментативного иммуноанализа (ELISA). Концентрацію в сироватці визначали за поглинання при 450 нм проти стандарту - рекомбінантного білка FasL людини. Рівень FasL був дуже високим в сироватці хворих, що не отримували лікування, та знаходився нижче межі виявлення в сироватці хворих, які отримували кортикостероїди, або в сироватці здорових суб'єктів. В якості позитивного контролю використовували сироватку хворих на HBV (фіг.4А). У одного хворого рівень FasL прогресивно знижувався при системної стероїдної терапії (фіг.4В).

Оскільки FasL міститься у великій кількості в сироватці крові хворих пузирчаткой, ми вивчили експресію його власного рецептора FasR. Для цього використовували фіксовані формаліном і залиті п�и UltraVision LP Detection System АР Polymer і Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA) згідно з інструкцією виробника. Візуалізацію проводили за допомогою таблеток Fast Red у нафтол-фосфатному субстраті.

В той час, як у нормальній шкірі FasR експресувався тільки в базальних кератиноцитах, в осередках ушкодження при активній пухирчатці FasR виявлявся як у базальних, так і в супрабазальних клітинах. Ще більш цікаво те, що при шкірно-слизової пухирчатці (РМС) FasR ніби експресується у всіх шарах епідермісу і навіть ще до утворення пухирців (фіг.5).

FasL є одним з головних спускових механізмів активується каспазой-8 зовнішнього апоптотического шляху. Тому ми вирішили оцінити, чи він грає якусь роль у апоптозу при пухирчатці. Для цього сироватку крові хворих попередньо обробляли нейтралізує антитілом проти FasL або інгібітором каспази-8, які додавали до культури кератиноцитів. Кератиноцити культивували в середовищі КОМ і обробляли сироваткою хворих пузирчаткой або сироваткою хворих, що не отримували лікування. Сироватки попередньо обробляли нейтралізує антитілом проти FasL (2,5 мг на мл протягом 30 хвилин) або інгібітором каспази-8 Z-IETD-FMK (100 мкМ протягом 30 хвилин). Апоптоз оцінювали методом фарбування TLTNEL. Додаванні викликаний сироваткою хворих пузирчаткой (фіг.6).

Крім того, кератиноцити обробляли так само, як на фіг.6 і додавали або антитіло проти FasL, або сторонні імуноглобуліни. Потім клітини гомогенизировали в буфері RIPA для аналізу методом western-блот. Мембрани інкубували з антитілами проти каспази-8 людини або проти β-актину. Відносну інтенсивність смуг на авторадиограммах аналізували кількісно методом скануючої лазерної денситометрії. Результати показали, що каспаза-8 помітно активувалася в кератиноцитах, оброблених сироваткою хворих пузирчаткой, порівняно з необробленими клітинами, тоді як каспазная активність частково ингибировалась при попередній обробці антитілом проти FasL (фіг.7).

В цілому ці результати свідчать про те, що сироватка хворих пузирчаткой викликає апоптоз кератиноцитів через зовнішній апоптотический шлях, який запускається системою Fas/FasL.

Недавні дослідження показали, що компоненти комплексу адгезії кадгерин-катенин в епітеліальних адгезійних контактів є мішенями для каспаз в процесі апоптозу (Weiske et al., 2001). Щоб оцінити, чи здатна апоптотический шлях, індукований Fas/FasL, викликати поділ десмосом, ми обробляли протягом 72 часой хворих пузирчаткой, піддавалися або не піддавалися терапії. Білкові екстракти з культур аналізували методом western-блот, використовуючи антитіла проти Dsg1 і Dsg3. В якості внутрішнього контролю використовували β-актин. Ми виявили, що сироватка хворих пузирчаткой здатна розщеплювати Dsg1 і Dsg3. Зокрема, сироватка хворих, що не отримували лікування, але не хворих при терапії стероїдами, разюче розщеплювало Dsg1 і Dsg3 (фіг.8).

Найбільш важливо те, що обробка кератиноцитів зростаючими дозами FasL (0,1, 10, 100 нг/мл) протягом 72 годин викликала розщеплення білків dsg дозозалежним чином. Білкові екстракти з культур аналізували методом western-блот, використовуючи антитіла проти Dsg1 і Dsg3. В якості внутрішнього контролю використовували β-актин. Такі дози відповідають дозам, виявлених у сироватці крові хворих пузирчаткой (фіг.9).

Враховуючи те, що FasL відіграє важливу роль у патогенезі пухирчатки, ми протестували антитіло проти FasL (NOK2 - антитіло, що виробляється лінією клітин гибридоми NOK2, номер доступу FERM ВР-5045). Досягли конфлюэнтности кератиноцити, культивовані в KGM з 1,8 мМ CaCl2, обробляли протягом 72 годин: 1) тільки KGM; 2) антитілом до FasL (NOK2, 15 мкг/мл), 3) FasL (500 нг/мл); 4) FasL + антитілом до FasL. Ми�то антитіло проти FasL (NOK2) інгібує апоптоз, викликаний каспазой-8 (фіг.10А). З фіг.10В видно, що антитіло проти FasL (NOK2) запобігає викликане FasL міжклітинний роз'єднання, тобто акантолиз.

Для того, щоб додатково підтвердити центральну роль FasL, ми використовували і інші антитіла проти FasL (F918-7-3 - антитіло, що виробляється лінією клітин гибридоми з номером доступу FERM BP-5533; F918-7-4 - антитіло, що виробляється лінією клітин гибридоми з номером доступу FERM BP-5534; F919-9-18 - антитіло, що виробляється лінією клітин гибридоми з номером доступу FERM ВР-5535). Досягли конфлюэнтности кератиноцити, культивовані в KGM з 1,8 мМ CaCl2, обробляли протягом 72 годин: тільки KGM; рекомбінантним FasL (50 нг/мл); гібридомної середовищем, розведеної 1:1 в KGM; FasL + гібридомної середовищем в різних розведеннях у KGM. Ми отримали дані про те, що антитіла до FasL запобігають викликане FasL розщеплення dsg3 дозозалежним чином (фіг.11А і фіг.11В), інгібуючи викликану каспазой-8 активацію апоптозу (фіг.11А). З фіг.11С видно, що антитіло до FasL, що міститься в середовищі з лінії клітин гибридоми FERM BP-5535, запобігає викликане FasL міжклітинний роз'єднання, тобто акантолиз.

Щоб встановити, чи викликає зовнішній апоптотический шлях розщеплення dsg, ми попередньо обробляли досяг�мкг/мл). Потім клітини інкубували протягом 72 годин з сироваткою крові здорових суб'єктів або не отримували лікування хворих пузирчаткой. Білкові екстракти з культур аналізували методом western-блот, використовуючи антитіла проти Dsg3 і проти каспази-8. В якості внутрішнього контролю використовували винкулин (фіг.12А). З фіг.12В видно, що роз'єднання клітин (тобто акантолиз) запобігається антитілом до FasL або інгібітором каспази-8. Ці результати вказують на те, що інгібування FasL або апоптотического шляху, який активується каспазой-8, запобігає як активацію каспази-8, так і розщеплення dsg, тим самим блокуючи акантолиз.

Для того, щоб оцінити і роль людських антитіл проти FasL (людське антитіло 3Е1, що виробляється лінією клітин гибридоми з номером доступу АТСС РОТА-4017 (антитіло РОТА-4017), і людське антитіло 4G11, що виробляється лінією клітин гибридоми з номером доступу АТСС РОТА-4018 (антитіло РОТА-4018)), кератиноцити культивували в КОМ (1,8 мМ CaCl2) і обробляли рекомбінантним FasL (50 нг/мл) одним або у комбінації з антитілами РОТА-4017 та РОТА-4018 при різних розведеннях. В якості контролю використовували гуманізовані антитіла ВР-5035 і ВР-5045 проти FasL, вже протестовані на фіг.10-1� РОТА-4017 та РОТА-4018 і гуманізовані антитіла ВР-5035 і ВР-5045 запобігають цей ефект (western-блоттінг). З фіг.13В видно, що в той час, як FasL сам по собі викликає роз'єднання клітин і акантолиз, людські антитіла РОТА-4017 та РОТА-4018 проти FasL в різних концентраціях запобігають цей ефект.

На закінчення ми показали, що FasL виявляє подвійну активність, активуючи як зовнішній апоптотический шлях, опосередкований каспазой-8, так і розщеплення Dsg. Згідно з нашою роботою Wang і співавтори (Wang et al., 2004) припустили, що апоптоз може бути причиною явища акантолиза. Вони показали, що PV-IgG і антитіла проти Fas-рецептора (анти-FasR) викликають пошкодження in vitro подібним чином, викликаючи: (1) секрецію розчинної FasL; (2) підвищення клітинного змісту FasR, FasL (розчинної і мембранного), білків Вах і р53; (3) зниження рівня клітинного Bcl-2; (4) зростання каспази-8 і активацію каспаз 1 і 3; (5) спільну агрегацію FasL і FasR з каспазой-8 в мембранному сигнальному комплексі, индуцирующем клітинну смерть (DISC), Тому сигнальний шлях клітинної смерті, опосередкований Fas, мабуть, бере участь в утворенні вогнищ ушкодження.

Для вивчення пухирчатки довгий час широко застосовувалася добре обґрунтована модель на тварин. Пасивний перенесення PvIgG у новонароджених мишей викликає роз'єднання клітин і образів�і підшкірно PvIgG (5 мг/г маси тіла), очищений з сироватки хворих, новонародженим мишам C57BL/6N CrI. В якості контролю використовували нормальних новонароджених мишей, які отримували IgG, очищені із сироватки здорових суб'єктів (NIgG). Тварин забивали через 20 годин після ін'єкції.

Фарбування гематоксилином та еозином показало, що бульбашки виникають тільки у мишей, що отримували PvIgG, але не у мишей, що отримували нормальний IgG людини (фіг.14А). Апоптоз виявлявся або методом TUNEL, або по активації каспази-3 тільки у мишей, що отримували PvIgG (фіг.14В).

Для того, щоб оцінити роль FasL in vivo, мишей обробляли з допомогою PvIgG або PvIgG плюс антитіло проти FasL (клон MFL3, специфічний для миші). Антитіло проти FasL (40 мкг/мишу) вводили через 3 години після ін'єкції PvIgG, і воно запобігало утворенню бульбашок у мишей, як видно з фарбування Н&Е. Крім того, протяжність щілин у мишей, оброблених антитілом до FasL, значно зменшувалася (фіг.15).

Для порівняння ефективності різних анти-FasL антитіл (фіг.16) людські кератиноцити культивували в KGM з 1,8 мМ СаСl2і обробляли PVIgG (1,5 мг/мл), очищеної від сироватки пацієнтів, що містить антитіла проти Dsgl і Dsg3, або окремо, або в комбінації з анти-FasL антитілами в концентрації 10 мкг/мл мною клітинною лінією АТСС РОТА-4017, людські антитіла проти людського FasL, що продукуються гібридомної клітинною лінією АТСС РОТА - 4018, і мишачі антитіла проти людського FasL рівня техніки (Puviani et al., 2003). Вестерн-блоттінг демонструє, що хоча PVIgG індукує розщеплення Dsg3, людські анти-FasL РОТА-4017 є більш ефективними в запобіганні розщеплення десмоглеина (акантолиз) порівняно з людськими анти-FasL РОТА-4018 і мишачими анти-FasL рівня техніки (Puviani et al., 2003). На панелі праворуч показано денситометрический аналіз Вестерн-блот.

На закінчення ми показали, що FasL виявляє подвійну активність, активуючи як зовнішній апоптотический шлях, опосередкований каспазой-8, так і розщеплення Dsg. Найбільш важливо те, що блокування FasL захищає від акантолиза in vitro та in vivo.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Aoudjit F and Vuori K. Matrix attachment regulates FAS-induced apoptosis in endothelial cells: a role for c-FLIP and implications for anoikis: J Cell Товарbiol 152:633-643, 2001

Arredondo J et al., Am J Pathol 167:1531-1544, 2005

Bahr GM, Capron A, Dewulf J, Nagata S, Tanaka M, Bourez JM, Mouton Y: Elevated serum level of Fas ligand correlates with the asymptomatic stage of human immunodeficiency virus infection. Blood 90:896-898, 1997

Bergin E, Levine JS, Koh JS, Lieberthal W: Mouse proximal tubular cell-cell adhesion inhibits apoptosis by a cadherin-dependent mechanism. Am J Physiol Renal Physiol 278:F758-F768, 2000

Du Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 226, 595-600

Frisch SM: Evidence for a function of deatl Товарbiol 124:619-626, 1994

Frisch SM, Screaton RA: Anoikis mechanisms. Curr Opin Cell Товарbiol 13:555-562, 2001

Giancotti FG, Ruoslahti E: Integrin signaling. Science 285:1028-1032, 1999

Gniadecki R, Jemec GBE, Thomson BM, Hansen M: Relationship between keratinocyte adhesion and death: anoikis in acantholytic diseases. Arch Dermatol Res 290:528-532, 1998

Grossman J, Walther K, Artinger M, Kiessling S, Scholmerich J: Apoptotic signaling during initiation of detachment-induced apoptosis ("anoikis") of primary human intestinal epithelial cells. Cell Growth & Diff 12:147-155, 2001

Jolles S, Hughes J, Whittakeроку S: Dermatological uses of high-dose intravenous immunoglobulin. Arch Dermatol 134:80-86, 1998

Juo P, Kuo CJ, Yuan J, Blenis J: Essential requirement for caspase-8/FLICE in the initiation of the Pas-induced apoptotic cascade. Curr Товарbiol 8:1001-1008, 1998

Kalish RS: Пухирчатка vulgaris: the other half of the story. J Clin Invest 106:1433-1435, 2000

Kitajima Y: Mechanisms of desmosome assembly and disassembly. Clin Exp Dermatol. 27:684-90, 2002

Kovacs, Liossis SN, Dennis GJ, Tsokos GC: Increased expression of functional Fas ligand in activated T-cells from patients with systemic lupus erythematosus. Autoimmunity 25:213-221, 1997

Lee J. et al., Endocrinology, 1997, 138, 2081-2088

Li N, Zhao M, Liu Z, Diaz LA: Pathogenic role of apoptosis in experimental пухирчатка. J Invest Dermatol 126:173 Abstract, 2006

Marconi A, Atzei P, Panza C, Fila C, Tiberio R, Truzzi F, Wachter T, Leverkus M, Pincelli C: FLICE/caspase-8 activation triggers anoikis induced by β1integrin blockade in human keratinocytes. J Cell Sci 117:5815-5823, 2004

Marconi A, Vaschieri C, Zanoli S, Giannetti A, Pincelli C: Nerve growth factor protects human keratinocytes from ultraviolet-B-induced apoptosis. J Invest Dermatol 113:920-927, 1999

Nishimura S, Adachi M, Ishida T, Matsunaga T, Uchida H, Hamada H, Imai K: Adenovirus-mediated transfection of caspase-8 augments anoikis and inhibits peritoneal dissemination of human gastric carcinoma cells. Cancer Res 61:7009-7014, 2001

O'connell J. et annetti A: Autocrine nerve growth factor protects human keratinocytes from apoptosis through its high affinity receptor (trk): a role for bcl-2. J Invest Dermatol 109:757-764, 1997

Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534

Reed JC: Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol 157:1415-1430

Rezgui SS, Honore S, Rognoni J-B, Martin P-M, Penel C: Up-regulation of α2β1 integrin cell-surface expression protects A431 cells from epidermal growth factor-induced apoptosis. Int J Cancer 87:360-367, 2000

Rytomaa M, Martins LM, Downward J: Involvement of FADD and caspase-8 signalling in detachment-induced apoptosis. Current Товарbiol 9:1043-1046, 1999

Sharma K, Wang RX, Zhang LY, Yin DL, Luo XY, Solomon JC, Jiang RF, Markos K, Davidson W, Scott DW, Shi YF: Death the Fas way: regulation and of pathophysiology Fas and its ligand. Pharmacol Ther. 88:333-347, 2000

Tiberio R, Marconi A, Fila C, Fumelli C, Pignatti M, Krajewski S, Giannetti A, Reed JC, Pincelli C: Keratinocytes enriched for stem cells are protected from anoikis via an integrin signaling pathway, in a Bcl-2 dependent manner. FEBS Letters 26318:1-6, 2002

Turley J. M. et al., Cancer Res., 1997, 57, 881-890

Viard I, Wehril P, Bullani R, Schneider P, Holler N, Salomon D, Hunzinker T, Saurat J-H, Tschopp J, French L: Inhibition of toxic epidermal necrolysis by blockade of Fas with human intravenous immunoglobulin. Science 282:490-493, 1998

Wang X et al.: Possible apoptotic mechanism in epidermal cell acantholysis induced by пухирчатка vulgaris autoimmunoglobulins. Apoptosis 9:131-143, 2004

Wehrli P, Viard I, Bullani R, Tschopp J, French LE: Death receptors in cutaneous biology and disease. J Invest Dermatol 115:141-148, 2000

Weiske J, Schoneberg T, Schroder W, Hatzfeld M, Tauber R, Huber O: The fate of desmosomal proteins in apoptotic cells. J Товарbiol Chem 276:41175-41181, 2001

Yang Y. et al., J. Exp. Med., 1995, 181, 1673-1682

Yu W. et al., Cancer Res., 1999, 59, 953-961

1. Застосування моноклонального людського антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas чол�лой ланцюга, являють собою:
(a1) CDR H1: Arg His Gly Ile Thr (SEQ ID NO:13)
(b1) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO:15)
(c1) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO:17)
і амінокислотні послідовності ділянок, що визначають комплементарність (CDRs) легкого ланцюга, являють собою:
3) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO:19)
(b3) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO:20)
(c3) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO:21)
для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератиноцитів.

2. Застосування п. 1, в якому антитіло або його антигенсвязивающий фрагмент вибрано частково або повністю гуманізованих антитіл, частково або повністю гуманізованих одноланцюгових антитіл або їх фрагментів.

3. Застосування п. 1, в якому шкірне захворювання пов'язане з активацією апоптотического шляху та/або розщепленням десмоглеина.

4. Застосування п. 1, в якому шкірним захворюванням є пухирчатка (пемфігус).

5. Застосування по кожному з пп.1-4 комбінованої терапії разом із щонайменше однією додатковою терапією, ефективною проти даного шкірного захворювання.

6. Застосування п. 5 в комбинац додатковим стероїдом.

7. Застосування моноклонального антитіла або його антигенсвязивающего фрагмента, специфічного до білка ліганду Fas людини (FasL), продукованого клітинами гибридоми з номером доступу АТСС РОТА-4017, для виготовлення лікарського засобу для профілактики та/або лікування шкірних захворювань, пов'язаних з акантолизом кератинопитов.

8. Застосування п. 7, в якому шкірне захворювання пов'язане з активацією апоптотического шляху та/або розщепленням десмоглеина.

9. Застосування п. 7, в якому шкірним захворюванням є пухирчатка (пемфігус).

10. Застосування по кожному з пп.7-9 у комбінованій терапії разом із щонайменше однією додатковою терапією, ефективною проти даного шкірного захворювання.

11. Застосування п. 10 в комбінації з принаймні одним додатковим иммуносупрессорним препаратом, зокрема з принаймні одним додатковим стероїдом.



 

Схожі патенти:

Анти-ifnar1 антитіла зі зниженою спорідненістю з лігандом fc

Пропонований винахід відноситься до імунології. Запропоновано моноклональне анти-IFNAR1 антитіло з мутаціями L234F, L235E і P331S в області Fc людського IgG1, володіє зниженим спорідненістю щодо Fcgamma RI, Fcgamma RIIIА і c1q рецепторів порівняно з немодифікованим антитілом. Описана виділена нуклеїнова кислота, що забезпечує експресію зазначеного антитіла, яка кодує антитіло нуклеотидну послідовність, і фармацевтична композиція на основі зазначеного антитіла. Використання винаходу забезпечує антитіло із зниженою спорідненістю до рецепторів Fcgamma RI, Fcgamma RIIIА і c1q, що забезпечує зниження небажаних ефекторних функцій при лікуванні хронічного запалення та аутоімунних станів. 3 н. і 6 з.п. ф-ли, 34 іл., 7 табл., 36 пр.

Анти-cd79b антитіла і иммуноконъюгати і способи їх застосування

Даний винахід відноситься до галузі біотехнології. Запропоновані варіанти гуманизированного анти-CD79b антитіла, кожен з яких характеризується наявністю легкої і важкої ланцюга і набором 6 CDR з встановленою амінокислотною послідовністю і щонайменше одним вільним цистеиновим амінокислотним залишком, вибраним з А118С (за Європейською нумерації) важкої ланцюга і V205C (по нумерації Кэбат) в легкій ланцюга. Розглянуто: варіанти з'єднання-кон'югату антитіла з лікарським засобом, де антитіло пов'язано з лікарським засобом через вільний цистеїн; фармацевтичний препарат для лікування раку на основі антитіла; способи детекції CD79b або ракових клітин, а також спосіб інгібірування клітинної проліферації, що використовують з'єднання-кон'югат. Описаний спосіб одержання сполуки-кон'югату. Цей винахід може знайти подальше застосування в терапії ракових захворювань, асоційованих з CD79b, в тому числі при лікуванні гемопоетичних пухлин у ссавців. 8 н. і 62 з.п. ф-ли, 20 табл., 9 пр., 51 іл.
Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до моноклональним антитілам, связивающимся з-Met, здатних інгібувати як ліганд-залежну, так і ліганд-незалежну активацію з-Меt. Зазначені антитіла, а також включає їх композиція, можуть застосовуватися для одержання лікарського засобу для лікування раку. Винахід дозволяє специфічно інгібувати як ліганд-залежну, так і ліганд-незалежну активацію з-Мет, зокрема інгібувати з-Мет-димеризації. 17 н. і 17 з.п. ф-ли, 111 іл., 4 табл., 27 пр.
Пропонований винахід відноситься до галузі імунології. Описані варіанти антитіл або антигенсвязивающих фрагментів, пов'язані з людським 4-1ВВ. Один з варіантів характеризується наявністю відповідних 3 CDR ділянок легкого ланцюга і 3 CDR ділянок важкої ланцюга. Інший варіант характеризується наявністю важкої і легкої ланцюга з відповідними амінокислотними послідовностями. Описані варіанти фармацевтичної композиції для зниження пухлинного росту або для лікування раку у суб'єкта, а також способи зниження пухлинного росту або лікування раку у суб'єкта, що використовують варіанти антитіл або антигенсвязивающих фрагментів у терапевтично ефективній кількості. Описаний спосіб лікування раку з використанням комбінації антитіла і імунотерапевтичне агента. Розкриті: варіанти кодують нуклеїнових кислот, вектор експресії і клітина-господар, що містить вектор для експресії антитіла. Описаний спосіб одержання антитіла з використанням клітини. Винахід забезпечує нові агонистические антитіла до 4-1ВВ (також званого CD137 або TNFRSF9) людини, які розпізнають епітоп, розташований в області амінокислотних залишків K115, C121, R134, R154, V156 антигену, мають спорідненість Kd, з� терапії раку і пухлинних захворювань. 12 н. і 7 з.п. ф-ли, 8 іл., 11 табл., 9 пр.

Гуманізоване моноклональне антитіло, специфічне до синдекану-1

Дане винахід відноситься до імунології, біотехнології та медицини, а саме до області протипухлинних лікарських препаратів на основі моноклональних антитіл, і може бути використане в медицині для лікування онкологічних захворювань. Запропоновано гуманізоване моноклональне антитіло (MAb), специфічне до синдекану-1 (CD138), охарактеризованное амінокислотними та нуклеотидними послідовностями. Антитіло по справжньому винаходу належить изотипу IgG4 каппа, при цьому константние фрагменти повністю людські та модифіковані введенням ділянок IgG3, додають антителу самостійну антитіло-залежну і комплемент-залежну цитотоксичність, і амінокислотних замін, що дозволяють збільшити час напівжиття антитіла. Вариабельние області представлені мишачими гипервариабельними і людськими каркасними ділянками, що забезпечують збільшення афінності зв'язування з лігандом. Кожна ланцюг додатково містить сигнальну секреторну послідовність на N-кінці, отщепляющуюся при секреції з клітин-продуцентів. Нуклеотидні послідовності оптимізовані для збільшення продукції антитіла в клітинах ссавців. Даний винахід може знайти та� 1 з.п. ф-ли, 2 іл., 3 пр.

Анти-cemx антитіла, здатні зв'язуватися з mige людини в лімфоцитах

Винахід відноситься до галузі імунології. Розглянуто застосування пептиду з амінокислотною послідовністю GLAGGSAQSQRAPDRVL для відбору СεmX-специфічних антитіл і антигенсвязивающих таких фрагментів антитіл. Запропоновано СεmX-специфічне антитіло, а також спосіб, який передбачає відбір антитіл, специфічно зв'язують пептид щодо винаходу, і спосіб лікування захворювань, опосередкованих IgE, що включає введення суб'єкту антитіла щодо винаходу. Виявлено, що моноклональні антитіла, специфічно зв'язують сегмент СεmX GLAGGSAQSQRAPDRVL, можуть ефективно зв'язуватися з mIgE на людських В клітинах і придатні для спрямованого впливу на ці клітини для лікування захворювань, опосередкованих IgE. 4 н. і 10 з.п. ф-ли, 5 іл., 4 пр.

Анти-icos антитіла та їх застосування в лікуванні онкологічних, пов'язаних з трансплантацією та аутоімунних захворювань

Винахід відноситься до галузі імунології. Запропоновано виділене антитіло до білка ICOS людини з підвищеною ефекторній функцією. Також описані клітка і спосіб отримання антитіла по справжньому винаходу, фармацевтична композиція, способи лікування аутоімунного захворювання або розлади, відторгнення трансплантата і злоякісності Т-клітин у людини, а також спосіб виснаження ICOS-експресують Т-клітин, спосіб руйнування структури зародкового центру у вторинному лимфоидном органі примату, способи виснаження В-клітин зародкового центру вторинного лімфоїдного органу і циркулюючих В-клітин, які пройшли перемикання класу, у примату. Даний винахід може знайти подальше застосування в терапії захворювань, опосередкованих Т-клітинами. 14 н. і 19 з.п. ф-ли, 21 іл., 3 табл.

Білки специфічного зв'язування та їх застосування

Даний винахід відноситься до галузі імунології. Запропоновано антитіло, здатне зв'язуватися з амплифицированним рецептором епідермального фактора росту (EGFR) і з усіченим варіантом EGFR - de2-7 EGFR, і охарактеризованное послідовностями варіабельних доменів. Також розглянуті засновані на використанні антитіла щодо винаходу набір для діагностування пухлини, иммуноконъюгат, фармацевтичні композиції і способи лікування злоякісної пухлини, а також одноклітинний господар для освіти антитіла по справжньому винаходу. Цей винахід може знайти подальше застосування у діагностиці та терапії раку. 8 н. і 35 з.п. ф-ли, 98 іл., 20 табл., 26 пр.

Иммуноконъюгати, спрямовані на cd138, та їх застосування

Винахід відноситься до галузі імунології. Описаний иммуноконъюгат, спрямований на клітини, що експресують CD138, що містить: антитіло проти CD138 изотипа IgG4, що містить важку ланцюг, що має CDRs та SEQ ID NO: 1, представленої в описі, і щонайменше на 70% ідентичною SEQ ID NO: 1, і легку ланцюг, що має CDRs та SEQ ID NO: 2, представленої в описі, і щонайменше на 70% ідентичною SEQ ID NO: 2; і ефекторну молекулу, що представляє собою інгібітор полімеризації тубуліну, і де эффекторная молекула приєднана до зазначеного сконструйованому антителу проти мішені через розщеплює лінкер, який містить дисульфідні зв'язки. Крім того, описані фармацевтична композиція і набір для інгібування, уповільнення і/або запобігання росту пухлин та/або поширення пухлинних клітин, що експресують CD138, де композиція містить зазначений иммуноконъюгат в ефективному кількості і один або кілька фармацевтично прийнятних наповнювачів; а набір містить в окремих контейнерах фармацевтичні композиції, де один контейнер містить ефективне кількість фармацевтичної композиції по справжньому винаходу, а інший контейнер містить другу фармацевтичну композицію, що містить�колько фармацевтично прийнятних наповнювачів. Запропоновані такі способи, засновані на введенні зазначеного иммуноконъюгата: а) спосіб лікування множинної мієломи у суб'єкта; б) спосіб опосередкованої иммуноконъюгатом доставки лікарського засобу; в) спосіб інгібування, уповільнення і/або запобігання росту пухлинних клітин, що експресують CD138, в клітинній культурі; г) спосіб інгібування, уповільнення і/або запобігання росту пухлини, що містить CD138 пухлинні клітини, та/або поширення пухлинних клітин такої пухлини у пацієнта; д) спосіб інгібування, уповільнення і/або запобігання росту пухлини та/або розповсюдження клітин злоякісної пухлини, експресують CD138, у пацієнта; е) спосіб лікування суб'єкта, що має стан, який може поліпшуватися в результаті придушення виживання клітин мієломи; ж) спосіб інгібування, уповільнення і/або запобігання росту пухлини, що містить CD138-пухлинні клітини, та/або поширення пухлинних клітин такої пухлини у суб'єкта; з) спосіб зменшення числа клітин, що знаходяться в безпосередньому або опосередкованому контакті з пухлинними клітинами, экспрессирующими CD138, у суб'єкта; і) спосіб зменшення числа клітин, що знаходяться в безпосередньому чи опосредованенное засіб для лікування захворювань, пов'язаних з CD138. 12 н. і 33 з.п. ф-ли, 13 іл., 5 табл., 1 пр.

Модифіковані антигенсвязивающие молекули зі зміненою клітинної сигнальної активністю

Винахід відноситься до галузі імунології. Запропоновані варіанти модифікованого антитіла до CD20 або його антигенсвязивающего фрагмента. Кожен з варіантів характеризується тим, що містить вариабельную область легкої і важкої ланцюга, і викликає більш високий рівень апоптозу, в порівнянні з химерним B-Ly1 антитілом. Запропоновано: суміш антитіл, в якій щонайменше 20% олігосахаридів у Fc області мають розгалужену ланцюг і не фукозилировани, а також фармацевтична композиція для виробництва лікарського засобу для лікування злоякісного гематологічного або аутоімунного захворювання на основі антитіл або суміші антитіл. Описані: вектор експресії, клітина-господар на його основі, варіанти кодують полінуклеотидів, а також спосіб отримання антитіла в клітці. Використання винаходів забезпечує нові антитіла з поліпшеними терапевтичними властивостями, в тому числі з підвищеним зв'язування рецептора Fc і з підвищеною ефекторній функцією, що може знайти застосування для лікування злоякісного гематологічного або аутоімунного захворювання. 13 н. і 19 з.п. ф-ли, 3 ін., 9 табл., 26 іл.

Похідне індолу і його фармацевтичне застосування

Винахід відноситься до з'єднання, представленому наступною формулою [I], або його фармацевтично прийнятною солі. У зазначеній формулі кожен символ має значення, визначені у формулі винаходу. Об'єктами винаходу є також варіанти з'єднання формули [I] і конкретні з'єднання. Запропоновані з'єднання інгібують индуцируемую Т-клітинну кіназу (ITK). Крім того, винахід відноситься до фармацевтичної композиції, ингибитору ITK і засобів для лікування або профілактики запальних захворювань, алергічних захворювань, аутоімунних захворювань, відторгнення трансплантата та інших захворювань і способів лікування цих захворювань. 24 н. і 8 з.п. ф-ли, 86 табл., 6 посилальних пр. і пр. 381

Лікування аутоімунного захворювання шляхом модулювання активності аннексина-1 (липокортина-1)

Група винаходів відноситься до медицини і стосується застосування антитіла до Аннексину-1 (Anx-А1) людини, яка має послідовність SEQ ID NO: 23, для лікування захворювання, спричиненого аномальної активації Т-клітин. Група винаходів також стосується способу лікування захворювання, спричиненого аномальної активації Т-клітин, що включає введення суб'єкту, що потребує в такому лікуванні, терапевтичного кількості зазначеного антитіла; застосування зазначеного антитіла у виробництві лікарського засобу для лікування захворювання, спричиненого аномальної активації Т-клітин. Група винаходів забезпечує лікування захворювання, спричиненого аномальної активації Т-клітин. 3 н. і 6 з.п. ф-ли, 11 пр., 22 іл.

N-вмісні гетероарильние похідні в якості інгібіторів jak3 кінази

Винахід відноситься до нових N-вмісних гетероарильним похідним формули I або II або їх фармацевтично прийнятним солей, які мають властивості інгібіторів кінази JAK, зокрема JAK3, і можуть знайти застосування для лікування таких захворювань, як астма і хронічне обструктивне захворювання легенів (COPD). У формулах I або II А являє собою вуглець і являє собою азот або А являє собою азот і являє собою вуглець; W являє собою СН або N; R1 і R2, незалежно, являють собою водень, С1-4алкил, галогенС1-4алкил, -CN; R3 являє собою С1-4алкил, R9-Cl-4алкил, Cy1, де Cy1 необов'язково заміщений одним або декількома заступниками R10; R4 являє собою водень, С1-4алкил, Rl2R7N-С0алкил, де один з R7 і R12 являє собою водень, а інший являє собою С1-4алкил або групу R13, яку вибирають з С1-5алкила, Cy2-С0алкила; R5 являє собою водень; R6 являє собою водень, С1-4алкил, С1-4алкоксиС1-4алкил, гидроксиС1-4алкил, R12R7N-C1-4алкил, R16CO-С0алкил, Cy1; R7 являє собою водень або С1-4алкил; R9 являє собою галоген, -CN, -CONR7R12, -COR13, CO2R12, -OR12, -SO2R13, -SO2NR7R12, -NR7R12, -NR7COR12; R10 являє собою С1-4алкил або R9-С0-4алкил; R11 являє собою С1-4алкил, галоген, -CN, -NR7R14; R12 чи R14R7N-C1-4алкил; де Cy2 необов'язково заміщений одним або декількома заступниками R11; R14 являє собою водень або С1-4алкил; R16 являє собою С1-4алкил, галогенС1-4алкил, C1-4алкоксиС1-4алкил, гидроксиС1-4алкил або цианоС1-4алкил; Cy1 являє собою моноциклическое карбоциклическое ненасичених або насичене кільце, вибране з С3-С6циклоалкила, фенила, або насичене моноциклическое 4-6-членное гетероциклічна кільце, що містить від 1 до 2 гетероатомів, вибраних з N і S, або частково ненасичених 10-членное бициклическое гетероциклічна кільце, містить атом кисню в якості гетероатома, які можуть бути заміщені групою R11, де зазначене кільце пов'язане з іншою частиною молекули через будь-який доступний атом С, і де один або кілька кільцевих атомів С або S необов'язково окислені з утворенням СО або SO2; і Cy2 являє собою моноциклическое карбоциклическое насичене кільце, вибране з С3-С6циклоалкила, або ароматичне моноциклическое 4-6-членное гетероциклічна кільце, що містить від 1 до 2 гетероатомів, вибраних з N і S, або ненасичених 10-членное бициклическое гетероциклічна кільце, що містить атом кисню в якості гетероатома, які можуть бути заміщені гру. �-ли, 41 пр.

Спосіб лікування інфекційного перитоніту в експерименті

Винахід відноситься до медицини, а саме до експериментальної хірургії, і може бути використане для лікування інфекційного перитоніту в експерименті. Для цього щурам внутрішньовенно вводять суспензію алогенних мезенхімальних стовбурових клітин з розрахунку 1,5×106 на 100 г маси тварини у 2 мл фізіологічного розчину. Летальність тварин в основній групі склала 27%, а в контрольній - 94%. Запропонований спосіб лікування інфекційного перитоніту в експерименті відкриває нові можливості використання клітинних технологій для зниження летальності пацієнтів при перитоніті. 11 іл., 1 пр.

Кристалічні форми гідрохлориду финголимода

Винахід відноситься до нового гидрату гидрохлоридной солі 2-аміно-2-(2-(4-октилфенил)етил)пропан-1,3-діола в кристалічній формі із зазначеними нижче характеристиками. Гідрат може бути використаний для одержання лікарського засобу для лікування або попередження відторгнення трансплантованого органу або тканини або аутоімунних захворювань в терапевтично ефективній кількості. Зазначений гідрат характеризується рентгенівської порошкової дифрактограммой, має піки при близько 2,9, 17,2, 30,6, 28,2, 24,4, 8,6 і 25,9 градусів 2-Тета, з межею помилки ±0,2 град. для кожного значення кута 2θ, який має чистоту 90% або більше та вмістом води від 5,2 до 5,9%. Винахід також характеризує фармацевтичну композицію з використанням вищезазначеного гідрату. 4 н. п. ф-ли, 4 іл., 8 табл., 14 пр.

Солі финголимода

Винахід відноситься до нових солей 2-аміно-2-[2-(4-С2-20алкилфенил)етил]пропан-1,3-діола, вибраним з тартрату, лактату бензоату, сукцинату, малоната, ацетату та пропіонату, у кристалічній формі. Кожна із зазначених солей охарактеризована даними порошкової рентгенограми. З'єднання в терапевтично ефективній кількості можуть бути використані при лікуванні аутоімунних захворювань. Кристалічні солі цього винаходу володіють підвищеною стабільністю, поліпшеною розчинністю, більш зручні при зберіганні і обробці. 9 н. і 2 з.п. ф-ли, 7 іл., 1 табл., 10 пр.

Деякі хімічні структури, композиції і способи

Винахід відноситься до нових сполук формули IV, VIII-A і IX, і їх фармацевтично прийнятним солей, що володіють інгібуючої активності відносно РІ3-кінази (фосфоинозитид-3-кінази). З'єднання можуть знайти застосування для лікування таких захворювань, як рак, ураження кісток, запальне або імунне захворювання, захворювання нервової системи, метаболічні захворювання, респіраторні, тромбоз або серцеві захворювання, опосередковані активністю РІ3-кінази. У з'єднаннях формули IV та IX і Wd вибирається з групи, що складається з: і , кожна з яких може бути заміщена. У формулі VIII-A група Wd являє собою групу або , де Ra-водень, R11-аміно; в з'єднанні IV Wa 2 являє собою CR5; Wa 3 являє собою CR6; Wa 4 представляє собою N або CR7; в з'єднанні IX Wa 1 і Wa 2 незалежно являють собою CR5, N або NR4, і Wa 4 незалежно являє собою CR7 або S, де не більш ніж два сусідніх атома в кільці являють собою азот або сірку; Wb 5 являє собою N; являє собою угруповання формули II , а також у разі з'єднання IV означає C1-С10алкил, С3-С10циклоалкил, С3-С10гетероциклоалкил, має від одного до шести кільцевих гетероатомів, вибраних з N, О і S; в разі з'єднання IX В також про�0арил або 5-18-членний гетероарил, має один або більше кільцевих гетероатомів, вибраних з N, О і S, або феніл або 6-членний гетероарил, відповідно, q дорівнює цілому числу 0, 1, 2, 3 або 4; X відсутня або являє собою -(CH(R9))z-, відповідно; z дорівнює 1; Y відсутня. Інші значення радикалів вказані у формулі винаходу. 5 н. і 63 з.п. ф-ли, 11 іл., 7 табл., 55 пр.

Антагоністичні антитіла проти рецептора il-7 і способи

Винахід відноситься до області імунології та біотехнології. Запропоновані варіанти антагоністичних антитіл, які зв'язуються з рецептором інтерлейкіну-7 (IL-7R). Описані: варіанти нуклеїнових кислот, що кодують антитіла; клітина-господар, рекомбинантно яка продукує антитіло; фармацевтична композиція, що інгібуюча функцію людського IL-7R, і способи лікування та/або попередження: аутоімунного захворювання, вибраного з групи діабету 1 типу, вовчака, розсіяного склерозу, ревматоїдного артриту; діабету 2 типу або реакції «трансплантат проти господаря», засновані на використанні антитіла. Винахід забезпечує антагоністичні антитіла проти IL-7R, що може знайти застосування в медицині. 9 н. і 8 з.п. ф-ли, 15 іл., 8 табл., 13 пр.
Запропоновано застосування (R)-5-[3-хлор-4-(2,3-дигидроксипропокси)бенз[2]илиден]-2-([2]-пропилимино)-3-орто-толилтиазолидин-4-вона (Сполука 1) або його солі для отримання лікарського препарату для попередження та/або лікування хвороби або розладу, пов'язаного з активацією імунної системи, де лікарський препарат являє собою набір доз Сполуки 1, причому протягом початкової фази лікування доза індукує десенсибілізацію серця і вона нижче кінцевої дози, і при зазначеної початковій фазі лікування доза вводиться з частотою, що забезпечує підтримування десенсибілізації серця до тих пір, поки не станеться наступне гостре зниження частоти серцевих скорочень, а потім дозу титрують з підвищенням до кінцевої дози Сполуки 1; відповідні спосіб лікування і набір доз. Винахід забезпечує зниження і зведення до мінімуму небажаних побічних ефектів Сполуки 1 (гостре зниження частоти серцевих скорочень, передсердно-шлуночкової провідності, або втома і запаморочення) з метою підвищення переносимості та безпеки Сполуки 1, a також зводить до мінімуму проблеми, пов'язані з моніторингом в початковій фазі лікування або після переривання лікування в період повторног

Кристалічні форми (r)-5-[3-хлор-4-(2, 3-дигидроксипропокси)бенз[z]илиден]-2-([z]-пропилимино)-3-о-толилтиазолидин-4-вона

Винахід відноситься до кристалічним форм (R)-5-[3-хлор-4-(2,3-дигидроксипропокси)бенз[Z]илиден]-2-([(Z)-пропилимино)-3-о-толилтиазолидин-4-вона, способами їх отримання, фармацевтичної композиції, що містить дані кристалічні форми і застосування даних форм в якості з'єднань, що поліпшують судинну функцію, і як імуномодулюючих агентів. 5 н. і 17 з.п. ф-ли, 5 іл.,5 табл., 7 пр.

Нанокристали кальципотриола моногидрита

Винахід відноситься до області фармацевтики і являє собою суспензію для лікування псоріазу, що включає кальципотриол моногідрату у формі нанокристалів з розподілом розміру частинок в діапазоні 200-600 нм, які дисперговані у водній фазі, що включає неіонні, полімерне ПАР, обраний із групи, що складається з ПАР у вигляді полоксамеров або полисорбатов, в кількості 0,01-5 мас.% у розрахунку на суспензію для запобігання утворення агрегатів та/або зростання кристалів нанокристалів кальципотриола моногідрату, причому нанокристали кальципотриола моногідрату отримані в суспензії шляхом обробки суспензії способом, включає стадії зменшення розмірів частинок кристалічного кальципотриола моногідрату у водній фазі з утворенням мікрочастинок з розподілом розміру частинок в діапазоні приблизно 5-20 мкм і середнім розміром частинок близько 10 мкм та впливу на суспензію трьох циклів гомогенізації під високим тиском, кожен протягом 7-15 хвилин, причому на першому, другому та третьому циклах тиск становить 300-800 бар, 800-1200 бар і 1200-1700 бар відповідно. Винахід забезпечує створення місцевої композиції, що включає кальципотриол як активного агента, але не содержащ�
Up!