Гуманізоване антитіло до фнп-α, його антигенсвязивающий фрагмент (fab) та їх застосування

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ

Даний винахід відноситься до гуманизированним антитілам до фактору некрозу пухлини-α людини (ФНП-α), їх антигенсвязивающим фрагментів (Fab) та застосування зазначених антитіл і фрагментів.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Розвиток і прогресування аутоімунних захворювань є складним процесом, який виникає як наслідок порушеної рівноваги в регуляції багатьох активних цитокінів. Було показано, що фактор некрозу пухлини-α (ФНП-α) відіграє важливу роль в імунній регуляції багатьох цитокінів. Однак було продемонстровано, що його надекспресія є однією з основних причин аутоімунних та інших захворювань. Відповідно, застосування біофармацевтичних препаратів, що пригнічують активність ФНП-α, стає одним з найбільш успішних способів лікування таких захворювань. Свідчення, які були схвалені для таких препаратів, включають головним чином ревматоїдний артрит, хвороба Крона, бляшковий псоріаз, псоріатичний артрит, анкілозуючий спондиліт, виразковий коліт і юнацький ідіопатичний артрит, а багато подібні захворювання в даний час вивчаються в клінічних дослідженнях.

В даний час на ринку Європи і Америки з'яви� білків Fc, такі як Ремікейд. Однак Ремікейд володіє меншим періодом напіввиведення in vivo, який становить приблизно 9 днів. Крім того, хоча Ремікейд володіє високою спорідненістю до зв'язування, біологічною активністю та клінічною ефективністю, оскільки він є химерним антитілом, що містить 1/3 послідовностей від миші і 2/3 послідовностей від людини, приблизно у 10%-47% пацієнтів після введення Ремикейда виникає імунна відповідь, звичайно приводить до утворення антимишиних антитіл людини (HAMA), які погано впливають на активність і тривалість застосування зазначеного антитіла. Відповідно, існує велика потреба у розробці антитіла проти ФНП-α з високим ступенем гуманізації і максимально зниженою часткою послідовностей, отриманих від миші, щоб зменшити відсоток матеріалу мишачого походження і забезпечити безпечне застосування при лікуванні захворювань у людини. Звичайним способом гуманізації антитіл є щеплення частин гипервариабельних областей (CDR) варіабельних областей (VH, VK) антитіла, отриманого від миші, в каркасну область раніше відібраного антитіла людини. Утворюється антитіло містить в основному послі�ня щодо того ж антигену. Однак вказаний спосіб, як правило, тягне за собою втрату спорідненості зазначеного антитіла.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Одне із завдань цього винаходу полягає в забезпеченні гуманізованих антитіл до фактора некрозу пухлини-α людини (ФНП-α) та їх антигенсвязивающих фрагментів (Fab), спорідненість яких до фактору некрозу пухлини-α людини можна порівняти або навіть вище, ніж у Ремикейда - химерного антитіла людини/миші.

Гуманізовані антитіла до фактору некрозу пухлини-α людини (ФНП-α) або Fab, запропоновані в цьому винаході, містять вариабельную область важкої ланцюга і вариабельную область легкої ланцюга, причому послідовність амінокислот змінної галузі важкої ланцюга показана в SEQ ID №:1 або 3 в переліку послідовностей, а послідовність амінокислот змінної галузі легкої ланцюга показана в SEQ ID№:15, 9, 11, 7, 13 або 5 в переліку послідовностей, і першим залишком амінокислоти в SEQ ID №:1 є Glu або Gln.

Зазначене антитіло вибирають, зокрема з одного з таких a)-l):

a) KS10, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:1, і вариабельную область легкої ланцюга SH08 з последовательностьюностью амінокислот, показаної в SEQ ID №:1, і вариабельную область легкої ланцюга SH05 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:9;

c) KS06, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:1, і вариабельную область легкої ланцюга SH06 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:11;

d) KS12, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:3, і вариабельную область легкої ланцюга SH08 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:15;

e) KS04, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:3, і вариабельную область легкої ланцюга SH05 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:9;

f) KS07, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:3, і вариабельную область легкої ланцюга SH06 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:11;

g) KS02, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:3, і вариабельную область легкої ланцюга SH03 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:5;

h) KS08, що містить вариабельнукой ланцюга SH04 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:7;

i) KS11, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:3, і вариабельную область легкої ланцюга SH07 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:13;

j) KS01, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:1, і вариабельную область легкої ланцюга SH03 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:5;

k) KS05, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:1, і вариабельную область легкої ланцюга SH04 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:7;

l) KS09, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:1, і вариабельную область легкої ланцюга SH07 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:13;

причому першим залишком амінокислоти в SEQ ID №:1 є Glu або Gln.

Ще одне завдання цього винаходу полягає в забезпеченні антигенсвязивающего фрагмента Fab) гуманизированного антитіла до фактору некрозу пухлини-α людини. Зазначений Fab містить вариабельную область важкої ланцюга, послідовність амінокислот якої відпо�епі, послідовність амінокислот якої відповідає положенням 1-109 в SEQ ID №:31 або SEQ ID №:29 у переліку послідовностей.

Антитіло, запропоноване у цьому винаході, складається з важкої ланцюга, в якій послідовність амінокислот константною області ідентична послідовності амінокислот важкої ланцюга антитіла людини, і легкого ланцюга, в якій послідовність амінокислот константною області ідентична послідовності амінокислот легкої ланцюга антитіла людини.

Константна область важкої ланцюга описуваного антитіла може бути отриманої від людини константною областю будь-якого класу (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) або підкласу (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2), а електронний область легкої ланцюга описуваного антитіла може бути отриманої від людини константною областю легкої ланцюга будь-якого класу (κ або λ) або підкласу (λ1, λ2, λ3, λ4), або аллотипа (κm (1), κm (2), κm (3)).

Послідовність амінокислот константною галузі важкої ланцюга зазначеного антитіла, зокрема, показана в SEQ ID №:17 у переліку послідовностей; а послідовність амінокислот константною галузі легкої ланцюга, зокрема, показана в SEQ ID №:19 у переліку послідовностей.

Послідовність аминокислт зазначеної легкої ланцюга, зокрема, показана в SEQ ID №:23 у переліку послідовностей. Залишки амінокислот у положеннях 1-120 SEQ ID №:21 відповідають змінної галузі важкої ланцюга, а залишки амінокислот у положеннях 121-450 тій же послідовності відповідають константною галузі важкої ланцюга. Залишки амінокислот у положеннях 1-109 SEQ ID №:23 відповідають змінної галузі легкої ланцюга, а залишки амінокислот у положеннях 110-214 тій же послідовності відповідають константною галузі легкої ланцюга. Першим залишком амінокислоти в SEQ ID №:21 є Glu або Gln.

Фрагмент Fab, запропонований у цьому винаході, складається з фрагмента Fd важкої ланцюга і легкого ланцюга; причому зазначений фрагмент Fd важкої ланцюга включає VHі CH1, а зазначена легка ланцюг включає VKі константну область легкої ланцюга; причому послідовність амінокислот зазначеної CH1 ідентична CH1 константною галузі важкої ланцюга антитіла людини, а послідовність амінокислот зазначеної константною галузі легкої ланцюга ідентична константною галузі легкої ланцюга антитіла людини.

CH1 зазначеного фрагмента Fd описаного вище Fab може бути CH1 константною областю, отриманої від людини, будь-якого класу (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) або підкласу (IgG1, IgG2, кой ланцюга, отриманої від людини, будь-якого класу (κ або λ) або підкласу (λ1, λ2, λ3, λ4), або аллотипа (κm (1), κm (2), κm (3)).

Послідовність амінокислот CH1 показана в SEQ ID №:33 у переліку послідовностей; послідовність амінокислот константною області зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №:19 у переліку послідовностей.

Згідно конкретних варіантів реалізації цього винаходу, зазначений Fab є одним з таких b1)-b3):

b1) KS-7F: послідовність амінокислот фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №:27 у переліку послідовностей; а послідовність амінокислот легкої ланцюга показана в SEQ ID №:31 у переліку послідовностей;

b2) KS-7A: послідовність амінокислот фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №:25 в переліку послідовностей; а послідовність амінокислот зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №:31 у переліку послідовностей;

b3) KS-2E: послідовність амінокислот фрагмента важкої ланцюга показана b SEQ ID №:25 в переліку послідовностей; а послідовність амінокислот зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №:29 у переліку послідовностей.

Ще одне завдання цього винаходу полягає в забезпеченні антигенсвязивающего фрагмента A або ан�)2, Fv (фрагменти варіабельних областей антитіла), вариабельную область важкої ланцюга, вариабельную область легкої ланцюга, фрагменти поліпептиду, обирані з змінної галузі важкої ланцюга, або фрагменти поліпептиду, обирані з змінної галузі легкої ланцюга, які отримують із зазначеного антитіла; антигенсвязивающий фрагмент B являє собою Fab', F(ab')2, Fv, вариабельную область важкої ланцюга, вариабельную область легкої ланцюга, фрагменти поліпептиду, обирані з змінної галузі важкої ланцюга, або фрагменти поліпептиду, обирані з змінної галузі легкої ланцюга, які отримують із зазначеного Fab.

Згадуваний вище F(ab')2складається з пари легких ланцюгів і пари важких ланцюгів (позначається як Fd'), які дещо більшим, ніж Fd. Гідроліз молекул IgG під дією пепсину може приводити до отримання зазначеного фрагмента F(ab')2, який містить два Fab, і таким чином, може зв'язуватися з двома антигенними эпитопами. Fd' містить близько 235 залишків амінокислот, які охоплюють VH, CH1 і шарнірну область. Fv складається із змінної галузі легкої ланцюга (VL) і змінної галузі важкої ланцюга (VH), які з'єднані разом нековаантитела, і містить єдиний антигенсвязивающий сайт. Fv включає ScFv (одноцепочечние антитіла), DsFv (стабілізовані дисульфідними зв'язками антитіла) та ін ScFv являє собою одну пептидний ланцюг, экспрессируемую з VHі VL, з'єднаних разом фрагментом відповідного олигонуклеотида (лінкера). DsFv являє собою іммобілізований дисульфідними зв'язками фрагмент Fv, утворений шляхом введення відповідного одного цистеїну в легку ланцюг і вариабельную область важкої ланцюга у відповідному сайті. Було показано, що DsFv перевершує ScFv як по спорідненості зв'язування, так і по стабільності.

Також в обсяг винаходу входить ген, що кодує будь білків A)-C):

(A) вказане антитіло; B) зазначений Fab; C) антигенсвязивающий фрагмент A або B.

Послідовності, що кодують вариабельние області важких ланцюгів як зазначеного антитіла, так і антигенсвязивающего фрагмента A, показані в SEQ ID №:2 або 4 в переліку послідовностей. Послідовності, що кодують вариабельние області легких ланцюгів як зазначеного антитіла, так і антигенсвязивающего фрагмента A, вибирають з SEQ ID№:16, 10, 12, 8, 14 і 6 у переліку послідовностей. Послідовності, що кодують вариабельние області важких�овательностей SEQ ID №:2, 4, 28 та положенням 1-360 SEQ ID №:26 у переліку послідовностей. Послідовності, що кодують вариабельние області легких ланцюгів як Fab, так і антигенсвязивающего фрагмента B, відповідають положенням 1-327 в будь послідовностей SEQ ID№:16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 і положеннями 1-327 послідовності SEQ ID №:30 у переліку послідовностей.

Серед перерахованих вище послідовностей як SEQ ID №:2, так і SEQ ID №4 містять 360 нуклеотидів, а всі послідовності SEQ ID№:6, 8, 14, 10, 12 і 16 містять 327 нуклеотидів.

Послідовність, що кодує константну область важкої ланцюга зазначеного антитіла, показана в SEQ ID №:18 у переліку послідовностей; а послідовність, що кодує константну область легкої ланцюга зазначеного антитіла, показана в SEQ ID №:20 у переліку послідовностей.

Послідовність, що кодує область CH1 зазначеного Fab, показана в SEQ ID №:34 у переліку послідовностей; послідовність, що кодує константну область легкої ланцюга зазначеного Fab, показана в SEQ ID №:20 у переліку послідовностей.

Згідно варіанту реалізації цього винаходу послідовність, що кодує важку ланцюг зазначеного антитіла, показано, зокрема, в SEQ ID №:22 у переліку последовательнос�е послідовностей.

Послідовність, що кодує зазначений Fab, є однією з наступних c1-c3):

c1) KS-7F: послідовність, що кодує фрагмент важкої ланцюга зазначеного Fab показана в SEQ ID №:28 у переліку послідовностей; а послідовність, що кодує легку ланцюг зазначеного Fab, показана в SEQ ID №:32 у переліку послідовностей;

c2) KS-7A: послідовність, що кодує фрагмент важкої ланцюга зазначеного Fab показана в SEQ ID №:26 у переліку послідовностей; а послідовність, що кодує легку ланцюг зазначеного Fab, показана в SEQ ID №:32 у переліку послідовностей;

c3) KS-2E: послідовність, що кодує фрагмент важкої ланцюга зазначеного Fab показана в SEQ ID №:26 у переліку послідовностей; а послідовність, що кодує легку ланцюг зазначеного Fab, показана в SEQ ID №:30 у переліку послідовностей.

Тоді як нуклеотиди в положеннях 1-360 і 360-1350 послідовності SEQ ID №:22 відповідають нуклеотидам згаданої змінної галузі важкої ланцюга і нуклеотидам константною галузі важкої ланцюга, відповідно; нуклеотиди в положеннях 1-327 і 328-642 послідовності SEQ ID №:24 відповідають нуклеотидам згаданої змінної галузі легкої ланцюга і нуклеотидам константною галузі легкої ланцюга, соотвиала: рекомбінантного вектора, рекомбінантної бактерії,

рекомбінантної лінії клітин; рекомбінантного вірусу або касети експресії, що містить ген, описаний вище.

Зазначений рекомбінантний вектор являє собою вектор експресії у прокаріотів або еукаріотів для експресії зазначеного антитіла, Fab або антиген-зв'язуючого фрагмента. Зазначена рекомбінантна бактерія являє собою Escherichia coli, що містить ген, описаний вище. Зазначена рекомбінантна лінія клітин являє собою трансгенну лінію клітин або гібридну лінію клітин, причому зазначена трансгенна лінія клітин може представляти собою лінію клітин ссавців, в яких трансфецировали зазначений ген, що кодує гуманізоване антитіло до фактору некрозу пухлини-α людини, або Fab, або його антигенсвязивающий фрагмент згідно з цим винаходу, переважно лінія клітин CHO (яєчника китайського хом'яка), або лінія клітин 293 та її сублинии; зазначена гібридна лінія клітин являє собою клітини гибридоми, які можуть секретувати зазначене гуманізоване антитіло до фактору некрозу пухлини-α людини, згадуване в цьому винаході. Зазначений рекомбінантний вірус являє собою рекомбінантний аденовисета експресії являє собою молекулу ДНК, яка включає три фрагмента в напрямку протікання транскрипції в наступному порядку: промотор; ген, що кодує зазначене антитіло або Fab, або його антигенсвязивающий фрагмент, транскрипція якого ініціюється з зазначеного промотору; і термінатор.

Якщо клітину-господаря трансфецируют або трансформують рекомбінантним вектором, що містить ген, що кодує зазначене антитіло, Fab або антигенсвязивающий фрагмент, можуть экспрессироваться відповідні білки, і таким чином можна отримувати зазначене антитіло, Fab або антигенсвязивающий фрагмент. Зазначена клітина-господар може бути кліткою еукаріотів, а може бути кліткою прокаріотів, включаючи, але не обмежуючись клітинами ссавців, бактерій, дріжджів, комах та ін Для масштабної експресії білків застосовується широкий спектр клітин ссавців, таких як клітини 293, CHO, SP20, NS0, COS, BHK або PerC6 та ін. Існують різні способи трансфекції клітини, включаючи без обмежень электропорацию, опосредуемую ліпосомами трансфекцію, опосредуемую фосфатом кальцію трансфекцію та ін

Кращий спосіб експресії зазначеного антитіла, Fab або антигенсвязивающего фрагмента наступний: проведення ампліфікації гена за допомогою рекомбінантного�бинантного білка. Наприклад, дефіцитну за DHFR клітку-господаря стабільно трансфецируют рекомбінантним вектором, що містить ген дигідрофолатредуктази (DHFR), а потім у живильне середовище для культивування клітин можна додавати метотрексат (МТХ) в концентрації, достатньої для збільшення числа копій зазначеного рекомбінантного вектора в клітині-хазяїні.

Після експресії зазначеного Fab або IgG, що містить поєднання кодують послідовностей гена, для визначення концентрації білка в живильному середовищі можна застосовувати твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) або інші види аналізу. Для зазначених фрагментів Fab можна проводити очистку за допомогою афінної хроматографії з застосуванням білка G; білки IgG можна очистити за допомогою афінної хроматографії з застосуванням білка A.

Також в обсяг цього винаходу потрапляє застосування зазначеного антитіла, або Fab, або антигенсвязивающего фрагмента, або зазначеного гена, або зазначеного генетичного матеріалу при:

d1) одержання лікарського засобу для профілактики та/або лікування захворювань, асоційованих з фактором некрозу пухлини-α людини, або

d2) одержання продукту для нейтралізації фактора некрозу пухлини-α людини, або

d3) пол�м захворюванням, асоційованим з фактором некрозу пухлини-α людини, є захворювання, викликане підвищенням рівня фактора некрозу пухлини-α людини, переважно ревматоїдний артрит, аутоімунний увеїт, хвороба Крона, бляшковий псоріаз, псоріатичний артрит, анкілозуючий спондиліт, виразковий коліт або юнацький ідіопатичний артрит.

Ще одне завдання цього винаходу полягає в забезпеченні фармацевтичної композиції, що містить допоміжні речовини і активні інгредієнти, причому зазначені активні інгредієнти включають принаймні одне з наступних речовин: антитіло, Fab, антигенсвязивающий фрагмент, ген і генетичний матеріал, описані вище, а вказане допоміжна речовина являє собою фармацевтично прийнятний носій або наповнювач. Зазначеними активними інгредієнтами в фармацевтичної композиції може бути тільки один будь-який із зазначених Fab або антитіл, описуваних вище, або будь-один з антигенсвязивающих фрагментів, описуваних вище, або будь-один з генів, описуваних вище, або будь-один з генетичних матеріалів, описаних вище.

Також в обсяг цього винаходу потрапляє застосування будь-якої з таких речовин для лече�вающего фрагмента, зазначеного гена, генетичного матеріалу і фармацевтичної композиції, описуваних вище.

Зазначене захворювання, асоційоване з фактором некрозу пухлини-α людини, викликане збільшенням рівня фактора некрозу пухлини-α людини, і переважно є аутоімунним увеитом, ревматоїдним артритом, хворобою Крона, бляшковим псоріазом, псоріатичний артрит, анкілозивний спондиліт, виразковим колітом або юнацьким ідіопатичний артрит.

Опис доданих креслень:

На Фіг.1 показано визначення біологічної активності зазначеного гуманизированного Fab щодо придушення ФНП-α за допомогою ELISA.

На Фіг.2 показано визначення біологічної активності зазначеного гуманизированного Fab щодо нейтралізації ФНП-α в експерименті з оцінки цитотоксичності L929.

На Фіг.3 показаний аналіз зв'язування KS10 з антигенним ФНП-α з різних видів.

На Фіг.4 показані бали, оцінюють лікування KS10 у експериментальних щурів, які страждають на ревматоїдний артрит. Зліва направо показані - здорова група, негативний контроль, модельна група, група, яка отримує 5 мг/кг KS10, група, яка отримує 10 мг/кг KS10, і група, яка отримує 20 мг/кг KS10.

На Фіг.5 показано дію KS10 �вматоидним артритом. Зліва направо показані - здорова група, негативний контроль, модельна група, група, яка отримує 5 мг/кг KS10, група, яка отримує 10 мг/кг KS10, і група, яка отримує 20 мг/кг KS10.

На Фіг.6 показано дію KS10 на рівень IL-6 у синовіальній рідині/тканини суглобів експериментальних щурів з ревматоїдним артритом. Зліва направо показані - здорова група, негативний контроль, модельна група, група, яка отримує 5 мг/кг KS10, група, яка отримує 10 мг/кг KS10, і група, яка отримує 20 мг/кг KS10.

Приклади

Наступні приклади представлені для забезпечення більш повного уявлення про справжній винахід, але не для обмеження винаходу. Якщо не вказано інше, експериментальні способи, про які йдеться нижче, відповідають традиційним експериментальним способами. Якщо не вказано інше, експериментальні матеріали, що застосовуються у даних прикладах, всі можуть бути придбані в звичайних компаніях, що виробляють біомедичні реактиви. Кількісний аналіз у наступних прикладах проводили в трьох паралельних визначеннях, і за результат брали середні значення.

Щеплення CDR важких і легких ланцюгів гуманизированного антитіла до ФНП-α, сайт-спрямований мутагенез за допомогою ПЛР (полімеразно-ланцюгово�іі з традиційними технологіями рекомбінації генів та імунологічними способами, заснованими на взаємодії атиген-антитіло, а детальні експериментальні способи та етапи задокументовані в "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 3rd edition, by Joseph Sambrook, Science Press, і similar experiment handbooks. EC50(концентрація, що забезпечує 50% від максимального ефекту) у наступних прикладах отримували шляхом введення значень оптичної щільності (OD450) в програму GraphPad Prism 5, і генерування підсумкових графіків.

Приклад 1: Експресія Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α та визначення його активності

В даному прикладі застосовують три Fab гуманізованих антитіл до ФНП-α (вказаний Fab складається з Fd фрагмента важкої ланцюга і легкого ланцюга зазначеного антитіла), а саме KS-2E, KS-7A, і KS-7F.

1. Конструювання векторів експресії для KS-2E, KS-7A і KS-7F

(1) Отримання послідовностей легких і важких ланцюгів

Клітини гибридоми отримували від мишей, вакцинованих ФНП-α людини (R&D Co., каталожний номер: 210-ТА-050) і піддавали їх скринінгу на продуцентів моноклональних антитіл, а потім повну РНК екстрагували і застосовували в якості матриці, з якої ампліфікували послідовності нуклеотидів для змінної галузі важкої ланцюга за допомогою ПЛР із застосуванням звичайних праймерів Р1: 5'-GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3', Р2: 5'ли за допомогою ПЛР із застосуванням звичайних праймерів Р3: 5'-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3', P4: 5'-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3'. Зрізи гелю, що містять розглянуті смуги, вирізали для подальшого відновлення. Продукти ампліфікації важких і легких ланцюгів зазначеного антитіла індивідуально вбудовували в вектор pMD18-T (TaKaRa Co., каталожний номер: D101C). Поодинокі колонії окремо витягували і прослідковували з метою ідентифікації послідовностей нуклеотидів варіабельних областей легких і важких ланцюгів зазначеного антитіла.

(2) Конструювання гуманизированного Fab

Проводили порівняння подібності послідовностей амінокислот між отриманою змінної областю легкого ланцюга і змінної областю легкої ланцюга гуманизированного антитіла, між отриманою змінної галуззю важкої ланцюга і змінної галуззю важкої ланцюга гуманизированного антитіла. Пошук схожості послідовностей проводили окремо в IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) і IMGT (ImMunoGeneTics, IMGT: http://www.imgt.org). На підставі результатів пошуку в якості матриці для отримання гуманизированного антитіла вибирали антитіло з більш високим відсотком схожості послідовностей у відношенні як легких, так і важких ланцюгів. Отриману вариабельную область важкої ланцюга VH прищеплювали в каркасну область антитіла �ученную вариабельную область легкої ланцюга VK прищеплювали в каркасну область антитіла людини IGKV6-21*01 (Номер доступу: Х63399), володіє більш високим відсотком схожості послідовностей.

Після множинних циклів мутагенезу у вихідних фрагментах важких ланцюгів (Fd) і легких ланцюгах людини поєднання різних легких ланцюгів і фрагментів важких ланцюгів (Fd) вбудовували в вектор pTLR (модифікований pET22b (+) вектор). Більш конкретно, готували різні ДНК для легких ланцюгів з сайтами рестрикції BamHI та EcoRI, відповідно, на кожному кінці, і різні ДНК фрагментів важких ланцюгів (Fd) з сайтами рестрикції NotI і XhoI відповідно, на кожному кінці. Дві групи ДНК окремо клонували у вектор pTLR (модифікований pET22b (+) вектор) між відповідними сайтами рестрикції, тобто, різні ДНК для зазначених легких ланцюгів вбудовували між сайтами рестрикції BamHI та EcoRI, різні ДНК для зазначених фрагментів важких ланцюгів (Fd) вбудовували між сайтами рестрикції NotI і XhoI, що призвело до отримання декількох векторів експресії Fab (включаючи три вектора експресії Fab, з яких експресуються KS-2E, KS-7A і KS-7F, відповідно).

Різні сполучення зазначених легких ланцюгів і зазначених фрагментів важких ланцюгів, згаданих вище, включають три зазначених Fab, KS-2E, KS-7F, і KS-7A. Послідовність амінокислот фрагмента важкої ланцюга KS-2E показана в SEQ ID №:ь амінокислот легкої ланцюга KS-2E показана в SEQ ID №:29 у переліку послідовностей, її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:30. Послідовність амінокислот фрагмента важкої ланцюга KS-7A показана в SEQ ID №:25 в переліку послідовностей, його послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:26, а послідовність амінокислот легкої ланцюга KS-7A показана в SEQ ID №:31 у переліку послідовностей, її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:32. Послідовність амінокислот фрагмента важкої ланцюга KS-7F показана в SEQ ID №:27 у переліку послідовностей, його послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:28, а послідовність амінокислот легкої ланцюга KS-7F показана в SEQ ID №:31 у переліку послідовностей, її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:32.

Більш детально, спосіб модифікації вектора pET22b (+) з метою отримання згадуваного вище вектора pTLR був наступним: спочатку штучним шляхом синтезували сегмент ДНК (скорочено - послідовність ДНК T-L-R, показана в SEQ ID №:35 у переліку послідовностей), який містив послідовність промотору Р7, оператор лактозного оперона і сайт зв'язування з рибосомой (RBS), з сайтами рестрикції SalI < і NotI, розташованими на кожному кінці; потім окремо розщепленню піддавали вектор pET22b (+) (продук�К-лігази Т4 і трансформували; і в кінці - традиційним способом відбирали окрему колонію і проводили подальший скринінг на правильно модифікований вектор.

2. Експресія KS-2E, KS-7A і KS-7F у прокаріотів

Штам E. coli Top 10 трансформували окремо сконструйованими, як згадувалося вище, векторами експресії Fab (включаючи три вектора експресії Fab, які експресують KS-2E, KS-7A і KS-7F, відповідно), а потім його поміщали в планшет 2-YT (пептон 1,6%, екстракт дріжджів 1%, NaCl-0,5%, і агар в порошку 1,5%) з хлорамфеніколом. На наступний день обирали планшет з відповідною щільністю колонії для відбору кількох поодиноких колоній. Для кожної позитивної колонії відбирали вісім поодиноких колоній і поміщали в планшет з 96 глибокими лунками, потім индуцировали експресію за допомогою IPTG (изопропилтиогалактозид). Кожну одиночну колонію додавали в пробірку з 6 мл рідкого середовища 2-YT YT (пептон 1,6%, екстракт дріжджів 1%, NaCl-0,5%), що містить хлорамфенікол, і взбалтивали при 250 об/хв при 37°с протягом 12 годин. 0,2 мкл зазначеної суспензії бактерій відбирали піпеткою з кожної пробірки і переносили на планшет з 2-YT з хлорамфеніколом для зберігання. 5 мл зазначеної суспензії бактерій засівали на 500 мл рідкого середовища 2-YT, що містить хлорамфенікол, і кукси�рейковою концентрації 50 мкл, щоб індукувати експресію різних Fab, з часом індукції 3 години. Після того, як індукована експресія завершувалася, зазначену живильне середовище центрифугували при 5100 об/хв і 10°C протягом 15 хвилин. Надосадову рідину зливали, а осад з бактеріями повністю повторно суспендованих в 40 мл попередньо охолодженого розчину TES (Трис-(гідроксиметил)-метил-2-аминоэтансульфоновая кислоти); 66 мл попереднього охолодженого розведеного 20% розчину TES з H2O додавали повторно повторно суспендований розчин бактерій і інкубували на льоді протягом 40 хвилин, після чого центрифугували при 13000 об/хв, 4°C протягом 10 хвилин. Після центрифугування забирали надосадову рідину, яка являє собою периплазматический екстракт, що містить білки Fab (білки KS-2E, KS-7A або KS-7F). Зазначений периплазматический екстракт обессоливали шляхом пропускання через колонку G-25 («GE Co.», 17-0034-01). Готували колонку, заздалегідь заповнену білком G («GE Co.», 17-0618-04), врівноважували її розчином для врівноваження (20 мМ фосфатного буфера, рн 6,5), а потім завантажували на неї зазначену пробу білка. Після завантаження вказаної проби колонку послідовно промивали розчином для врівноваження, а зате�бирали, і pH элюируемих фракцій швидко коригували до 7,0, заздалегідь додаючи 1,0 М Трис-HCl буфер (рн 9,0) у пробірки для відбору фракцій перед їх відбором, причому відношення обсягів Трис-буфера і элюируемих фракцій становило 1:9. Відібрана рідина містить розглянуті білки. Чистоту зазначеного білка оцінювали за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію), і оцінювали концентрацію білка в зазначених пробах білка. У підсумку, зазначену пробу білка упаковували і зберігали при -80°C, отримуючи в результаті білки Fab з більш високим ступенем чистоти (включаючи три білка KS-2E, KS-7A і KS-7F).

3. Визначення біологічної активності KS-2E, KS-7A і KS-7F

1) Аналіз зв'язування гуманізованих Fab до ФНП-α методом ELISA

Білки Fab, які зв'язуються з ФНП-α, піддавали скринінгу за допомогою наступних етапів: планшет для ELISA в якості субстрату покривали 100 нг отриманого від людини ФНП-α (R&D Co.», каталожний номер: 210-ТА-050) на лунку; додавали 2-кратні серійні розведення 40 нМ білків Fab (приготовані на 2 етапі, включаючи три білка KS-2E, KS-7A і KS-7F), і потім інкубували; додавали вторинне козяче античеловеческое антитіло З-Каппа, меченное пероксидазою хрону («Sigma Co.», каталожний номер: K35�; таким чином, визначали зв'язування білків Fab з ФНП-α. У відповідності з таким способом скринінгу були отримані три Fab з більш високою активністю: KS-2E, KS-7F і KS-7A, зазначені білки загалом містять два різних VH (VH01 і VH02, причому послідовність амінокислот VH01 показана в SEQ ID №:25, а її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:26; послідовність амінокислот VH02 показана в SEQ ID №:27, а її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:28), і два різних VK (VK03 і VK05, причому послідовність амінокислот VK03 показана в SEQ ID №:29, а її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:30; послідовність амінокислот VK05 показана в SEQ ID №:31, а її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:32 (Таблиця 1)).

Результат тестування активності зв'язування гуманизированного Fab до ФНП-α методом ELISA проілюстрований на Фіг.1. Даний результат показує, що три гуманізованих Fab, отриманих, як описано вище, володіють спорідненістю до антигену, близьким до спорідненості, яким володіє фрагмент Fab Ремикейда - химерного антитіла людини-миші, причому EC50для зв'язування KS-7A і KS-7F з ФНП-α вище, ніж для зв'язування фрагмента Fab химерного антитіла людини-миші Ремикейда (таблиця 2).

Fab гуманізованих антитіл до ФНП-α
Фрагмент FabVHVK
KS-2EVH01VK03
НПVH02VK03
KS-7FVH01VK05
KS-7AVH02VK05
Примітка: «НП» позначає, що фрагмент Fab не був охарактеризований з-за низької активності.

У Таблиці 2 наведено EC50для зв'язування фрагмента Fab гуманізованих антитіл до ФНП-α з ФНП-α при ELISA

Таблиця 2
ПробаEC50(нМ)
Fab Ремикейда3,324
KS-2E6,659
KS-7A3,027
KS-7F

2. Визначення біологічної активності гуманізованих Fab при придушенні ФНП-α в експерименті з цитотоксичність L929.

Крім того, біологічну активність трьох гуманізованих Fab, зазначених вище (KS-2E, KS-7F і KS-7A), щодо нейтралізації ФНП-α перевіряли в клітинно-біологічному експерименті - в пробі на цитотоксичність L929. В даному експерименті 1×104клітин L929 в логарифмічній фазі росту засівали на середовище DMEM (середовище Ігла, модифікована за способом Дульбекко) (10% ембріональної бичачої сироватки - ЕБС, «Gibco») в планшет на 96 лунок. Через 24 години додавали 0,5 нг/мл ФНП-α людського походження («R&D Co.», каталожний номер: 210-ТА-050) і 0,5 мкг/мл аd («Fluka»). Зазначені клітини розділяли на чотири групи, і три гуманізованих Fab, згаданих вище, а також фрагмент Fab контрольного антитіла Ремікейд індивідуально додавали до кожної групи, зазначені клітини культивували протягом 24 годин. У підсумку, життєздатність клітин аналізували за допомогою набору CCK8 («Dojindo Laboratories»). Результат показано на Фіг.2 і він свідчить, що три гуманізованих Fab, згаданих вище, можуть виявляти біологічну активність, ефективно нейтралізуючи ФНП-α, причому біологічна а�а-миші Ремикейда. Дані на Фіг.2 представлені як середнє ± стандартне відхилення для триразових експериментів.

Приклад 2: Конструювання бібліотеки «дозрівання спорідненості» для CDR3 Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α

Щоб ще більше збільшити спорідненість фрагментів Fab згадуваного вище гуманизированного антитіла до ФНП-α до антигену, окремо створювали бібліотеки «дозрівання спорідненості» для CDR3 важкої ланцюга VH02 і для CDR3 легкої ланцюга VK05 у векторі експресії Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α. Оскільки області CDR3 важкої ланцюга і легкого ланцюга є найбільш важливими областями для зв'язування антитіла з антигеном, для отримання антитіла з більш високою спорідненістю можна проводити сайт-насичує мутагенез області CDR3, а потім скринінг. Для конструювання бібліотеки сайт-насиченого мутагенезу для CDR3 важкої і легкої ланцюгів, розробляли серії праймерів для сайт-спрямованого мутагенезу і застосовували їх в ПЛР. Отримані продукти, амплифицированние в ході ПЛР, змішували з серіями праймерів в рівних відносинах виродженість і клонували у вектор експресії для Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α. Конструювання бібліотеки сайт-спрямованого мутагенезу для CDR3 легкої ланцюга проводили наступним оЂакже із застосуванням ДНК легкої ланцюга в якості матриці для отримання розглянутих продуктів ДНК, потім - клонування зазначених продуктів ДНК у вектор експресії Fab, проведення электроблоттинга і інкубація в планшетах для отримання бібліотеки сайт-спрямованого мутагенезу для CDR3 легкого ланцюга. Серія праймерів 5 містить мутантний сайт в CDR3, і все в неї входить 19 праймерів, перерахованих в Таблиці 3. Конструювання бібліотеки сайт-спрямованого мутагенезу для CDR3 важкої ланцюга проводили наступним чином: проведення ПЛР з серією праймерів 7 та із зворотним праймером 8 для важкої ланцюга (5'-CCGCTCGAGGCGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCCTG-3'), а також із застосуванням важкої ланцюга ДНК в якості матриці для отримання розглянутих продуктів ДНК, потім - клонування зазначених продуктів ДНК в плазміду експресії Fab, проведення электроблоттинга і інкубація в планшетах для отримання бібліотеки сайт-спрямованого мутагенезу для CDR3 важкої ланцюга. Серія праймерів 7 містить мутантний сайт в CDR3, і все в неї входить 22 праймера, перерахованих в Таблиці 4. З отриманої в результаті бібліотеки мутагенезу для легких і важких ланцюгів Fab вибирали Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α з більш високою здатністю зв'язування антигену ФНП-α (R&D Co.») на підставі результатів ELISA. Скринінг мутантів важких ланцюгів для отримання двох вариабеля отримання шести варіабельних областей легких ланцюгів з більш високою активністю, а саме SH03, SH04, SH05, SH06, SH07 і SH08.

Таблиця 3
Серія праймерів 5 для сайт-спрямованого мутагенезу в CDR3 легкої ланцюга
ПозначенняПослідовність
Праймер 5-1Q1GCAACCTACTACTGCNBKCAGAGCCATAGCTGG
Праймер 5-1Q2GCAACCTACTACTGCDAKCAGAGCCATAGCTGG
Праймер 5-1Q3GCAACCTACTACTGCCATCAGAGCCATAGCTGG
Праймер 5-2Q1GCAACCTACTACTGCCAGNBKAGCCATAGCTGGCCG
Праймер 5-2Q2GCAACCTACTACTGCCAGDAKAGCCATAGCTGGCCG
Праймер 5-2Q3GCAACCTACTACTGCCAGCATAGCCATAGCTGGCCG
Праймер 5-3S1GCAACCTACTACTGCCAGCAGBDKCATAGCTGGCCGTTC
Праймер 5-3S2GCAACCTACTACTGCCAGCAGVCTCATAGCTGGCCGTTC
Праймер 5-3S3GCAACCTACTACTGCCAGCAGAWKCATAGCTGGCCGTTC
Праймер 5-4Н1
Праймер 5-4Н3GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCAGAGCTGGCCGTTCACC
Праймер 5-5S1GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATBDKTGGCCGTTCACCTTC
Праймер 5-5S2GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATVCTTGGCCGTTCACCTTC
Праймер 5-5S3GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAWKTGGCCGTTCACCTTC
Праймер 5-6W1GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCHNKCCGTTCACCTTCGGC
Праймер 5-6W2GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCHGTCCGTTCACCTTCGGC
Праймер 5-6Р1GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCTGGNDKTTCACCTTCGGCAGC
Праймер 5-6Р2GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCTGGDCTTTCACCTTCGGCAGC

Таблиця 4
Серія праймерів 7для сайт-спрямованого мутагенезу в CDR3 важкої ланцюга
ПозначенняПослідовність
Праймер 7-1N1GTATTACTGCAGCCGTNBKTACTACGGCAGCACC
GTATTACTGCAGCCGTAAATACTACGGCAGCACC
Праймер 7-2Y1GTATTACTGCAGCCGTAATNBKTACGGCAGCACCTACG
Праймер 7-2Y2GTATTACTGCAGCCGTAATVAKTACGGCAGCACCTACG
Праймер 7-3Y1GTATTACTGCAGCCGTAATTACNBKGGCAGCACCTACGATTAC
Праймер 7-3Y2GTATTACTGCAGCCGTAATTACVAKGGCAGCACCTACGATTAC
Праймер 7-4G1GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACNHKAGCACCTACGATTACTG
Праймер 7-4G2GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACHGKAGCACCTACGATTACTG
Праймер 7-5S1GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCBDKACCTACGATTACTGGGC
Праймер 7-5S2GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCVCTACCTACGATTACTGGGC
Праймер 7-5S3GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAWKACCTACGATTACTGGGC
Праймер 7-6Т1GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCNDKTACGATTACTGGGCCC
Праймер 7-6Т2GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCBCTTACGATTACTGGGCCC
Праймер 7-7Y1GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCNBKGATTACTGGGGCCAGG
Пра>td align="left">GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACNBKTACTGGGGCCAGGGC
Праймер 7-8D2GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACHAKTACTGGGGCCAGGGC
Праймер 7-8D3GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGAATACTGGGGCCAGGGC
Праймер 7-9Y1GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGATNBKTGGGGCCAGGGCACC
Праймер 7-9Y2GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGATVAKTGGGGCCAGGGCACC

Приклад 3: Експресія Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α з високою спорідненістю та аналіз активності

Даний приклад відноситься до двох Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α, які позначають FA01 і FA02, відповідно. Послідовність амінокислот змінної галузі легкої ланцюга FA01 показана в SEQ ID №:15 у переліку послідовностей (її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:16 у переліку послідовностей), а послідовність амінокислот константною галузі легкої ланцюга показана в SEQ ID №:19 у переліку послідовностей (її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:20 у переліку послідовностей), послідовність амінокислот змінної області фрагмента Fd її важкої ланцюга показана в SEQ ID №:1 �стей), а послідовність амінокислот константною галузі важкої ланцюга CH1 показана в SEQ ID №:33 у переліку послідовностей (її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:34 у переліку послідовностей). Послідовність амінокислот змінної галузі легкої ланцюга FA02 показана в SEQ ID №:9 в переліку послідовностей (її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:10 у переліку послідовностей), послідовність амінокислот константною області її легкої ланцюга показана в SEQ ID №:19 у переліку послідовностей (її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:20 у переліку послідовностей), послідовність амінокислот змінної області фрагмента Fd важкої ланцюга показана в SEQ ID №:1 в переліку послідовностей (її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:2 в переліку послідовностей), послідовність амінокислот константною галузі легкої ланцюга її CH1 показана в SEQ ID №:33 у переліку послідовностей (її послідовність нуклеотидів показана в SEQ ID №:34 у переліку послідовностей).

1. Конструювання та експресія Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α з високою спорідненістю

Спосіб конструювання двох Fab зазначеного гуманизированного аного антитіла до ФНП-α, згаданих вище, окремо вбудовували в відповідні сайти в векторі pTLR, отримуючи вектори експресії pFA01Fab для FA01 і pFA02Fab для FA02. Білки FA01 і FA02 з більш високим ступенем чистоти отримували згідно з протоколом, наведеним у прикладі 1.

2. Визначення біологічної активності Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α з високою спорідненістю

За допомогою експерименту з цитотксичностью L929 два Fab гуманизированного антитіла до ФНП-α (FA01 і FA02), згадувані вище, аналізували з метою оцінки біологічної активності. Більш детально, спосіб збігався зі способом, описаним у прикладі 1. Одержувані в результаті значення OD450 вводили в програму GraphPad Prism 5 і розраховували EC50. Результати наведені в таблиці 5, і вони показують, що активність FA01 і FA02 більш висока, ніж активність у фрагмента Fab антитіла Ремікейд.

n="1">2,870
Таблиця 5
Біологічна активність гуманізованих Fab щодо нейтралізації ФНП-α
ГрупаEC50(нМ)
Fab Ремикейда3,184
Примітка: Дані у таблиці 5 представлені як середні значення для триразових експериментів.

Приклад 4: Експресія IgG гуманизированного антитіла до ФНП-α та визначення його активності

1. Конструювання рекомбінантного вектора експресії IgG гуманизированного антитіла до ФНП-α

Фрагменти ДНК, що кодують два зазначених фрагмента Fd важких ланцюгів (включаючи SH01 і SH02 відповідно) і шести легких ланцюгів (включаючи SH03, SH05, SH04, SH06, SH07 і SH08, відповідно), отримані в прикладі 1 і 2, взаємно поєднували таким чином, як показано в таблиці 6, збираючи їх разом з фрагментом ДНК для константною області Fc IgG1 допомогою ПЛР з вікон подовженням, потім вбудовували в плазміду експресії pcDNA3.1(+) за допомогою рекомбінації. Сконструйованими таким чином плазмідами експресії трансфецировали клітини CHO, і экспрессировали повнорозмірні гуманізовані антитіла.

Більш детально протокол можна представити наступним чином: (1) фрагменти ДНК для зазначених легких ланцюгів вбудовували безпосередньо в вектор експресії еукаріотів pcDNA3.1(+) шляхом рекомбінації. Були розроблені наступні праймери 5'-TGAAAGCTTATGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTC-3' (підкреслять спосредством ПЛР. Амплифицированние продукти піддавали подвійним розщепленню з участю рестриктаз HindIII (R0104L, продукт компанії «NEB Co.») і XhoI (R0146L, продукт компанії «NEB З.»), зшивали з великими фрагментами pcDNA3.1(+), які піддали подвійному розщепленню з участю ДНК-лігази Т4. (2) фрагменти ДНК для зазначених важких ланцюгів потрібно було зібрати разом з фрагментом ДНК для константною області Fc IgG1 допомогою ПЛР з вікон подовженням, і їх вбудовували в pcDNA3.1 (+) за допомогою рекомбінації. 5'-ACTGGTACCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG-3' (підкреслять сайт рестрикції KpnI); 5'-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3'; 5'-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3'; 5'-AATCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3' (підкреслять сайт рестрикції XhoI). Зібрані разом продукти ПЛР піддавали подвійним розщепленню з участю рестриктаз KpnI (R0142L, продукт компанії «NEB Co.») і XhoI (R0146L, продукт компанії «NEB Co.»), потім вбудовували в плазміду експресії pcDNA3.1 (+), яку піддали подвійному розщепленню з участю тих же ферментів, за допомогою рекомбінації, та ідентифікували за допомогою рестрикційного аналізу і секвенування, отримуючи потрібні рекомбинанти.

Вектори експресії для 18 антитіл в таблиці 7 отримували згідно способом, описаним вище. Всі послідовності ДНК, що кодують вариабельние про�послідовність нуклеотидів в положеннях 1-3 є GAG), і кодують вариабельние області важких ланцюгів, показані в SEQ ID №:1 (першої амінокислотою є Gln); все з послідовностей ДНК, які кодують вариабельние області важких ланцюгів KS01 (Gln), KS03 (Gln), KS05 (Gln), KS06 (Gln), KS09 (Gln) і KS10 (Gln), показані в SEQ ID №:2 в переліку послідовностей, в якій послідовність нуклеотидів в положенні 1-3 була замінена на CAG, і кодують вариабельние області важких ланцюгів, показані в SEQ ID №:1 (першої амінокислотою є Gln); все з послідовностей ДНК, які кодують вариабельние області важких ланцюгів KS02, KS04, KS07, KS08, KS11 і KS12, показані в SEQ ID №:4 в переліку послідовностей і кодують вариабельние області важких ланцюгів, показані в SEQ ID №:3; все з послідовностей ДНК, які кодують вариабельние області легких ланцюгів KS01 (Glu), KS01 (Gln) і KS02, показані в SEQ ID №:6 в переліку послідовностей і кодують вариабельние області легких ланцюгів, показані в SEQ ID №:5; все з послідовностей ДНК, які кодують вариабельние області легких ланцюгів KS03 (Glu), KS03 (Gln) і KS04, показані в SEQ ID №:10 у переліку послідовностей і кодують вариабельние області легких ланцюгів, показані в SEQ ID №:9; все з послідовностей ДНК, які кодують вариабельние області легких ланцюгів KS05 (Glu); KS05 (Gln) і KS08, показано з послідовностей ДНК, кодують вариабельние області легких ланцюгів KS06 (Glu), KS06 (Gln) і KS07 показані в SEQ ID №:12 у переліку послідовностей і кодують вариабельние області легких ланцюгів, показані в SEQ ID №:11; все з послідовностей ДНК, які кодують вариабельние області легких ланцюгів KS09 (Glu), KS09 (Gln) і KS11, показані в SEQ ID №:14 у переліку послідовностей і кодують вариабельние області легких ланцюгів, показані в SEQ ID №:13; все з послідовностей ДНК, кодують вариабельние області легких ланцюгів KS10 (Glu), KS10 (Gln) і KS12, показані в SEQ ID №:16 у переліку послідовностей і кодують вариабельние області легких ланцюгів, показані в SEQ ID №:15. Послідовність ДНК, що кодує константну область важкої ланцюга вісімнадцяти зазначених антитіл, показана в SEQ ID №:18 у переліку послідовностей, і кодує константну область важкої ланцюга, показану в SEQ ID №:17; послідовність ДНК, що кодує константну область важкої ланцюга вісімнадцяти зазначених антитіл, показана в SEQ ID №:20 у переліку послідовностей, і кодує константну область легкої ланцюга, показану в SEQ ID №:19.

2. Експресія і очищення повнорозмірного IgG гуманизированного антитіла до ФНП-α

Рекомбінантні плазміди для легкого ланцюга і рекомбінантні пламиди дл�мініатюрні гуманізовані антитіла. Після спільної стабільної трансфекції поєднання відповідних плазмід, як показано в таблиці 6, у клітини CHO за допомогою традиційних способів, надосадову рідину живильного середовища секретировались дванадцять відповідних рекомбінантних повнорозмірних антитіл. Зазначену надосадову рідину очищали, отримуючи відповідний IgG повнорозмірних антитіл. Більш детально етапи очищення були наступні:

1) Наповнювач для хроматографирования

Mabselect Sure (продукт компанії «GE Co.»), Супердекс 200 (продукт компанії «GE З.»)

2) Буфер

Рівноважний буфер для афінної хроматографії (ФСБ): 0,2 М вторинний кислий фосфат натрію: 82,5 мл/л 0,2 М первинного кислого фосфату натрію: 17,5 мл/л хлориду натрію; 2М хлорид натрію: 75 мл/л; додають води надвисокої чистоти, повністю перемішують і ретельно змішують, коригують pH 1 М гідроксидом натрію або 1М соляною кислотою до 7,1-7,3.

Элюирующий буфер для афінної хроматографії: NaCl 2,922 г/л, безводного натрію ацетату 0,49 г/л, додають 2,9 мл/л крижаної оцтової кислоти, рн 3,4-3,6.

Регенеруючий буфер для афінної хроматографії: 5,8 мл/л крижаної оцтової кислоти, рн 3,0.

Буфер для очищення на місці (CIP) для афінної хроматографії: 1М гідроксид натр�лого фосфату натрію: 17,5 мл/л хлориду натрію; 2М хлорид натрію: 75 мл/л; додають води надвисокої чистоти, повністю перемішують і ретельно змішують, коригують pH 1 М гідроксидом натрію або 1М соляною кислотою до 6,8.

3) Приготування проби (освітлюючий фільтрування)

Центрифугування: зазначену пробу центрифугують при 5000-6000 об/хв протягом 10-15 хв.

Фільтрація: після центрифугування, надосадову рідину з вказаної проби фільтрували за допомогою фільтра Н7 (0,45+0,2 мкм).

4) Аффинная хроматографія

Встановлюють систему очищення AKTA і колонку для афінної хроматографії (Mabselect або Mabselect Sure). Промивають 2 обсягами колонки надчистої води. Промивають 5 обсягами колонки рівноважного буфера для афінної хроматографії до тих пір, поки вихідний рівень не стане стабільним, і вводять пробу. Після введення проби промивають 5-10 обсягами колонки рівноважного буфера для афінної хроматографії. Потім проводять десорбцію вмісту колонки элюирующим буфером для афінної хроматографії, фракції, що відповідають головному піку поглинання на 280 нм, відбирають, проводять подальшу десорбцію 1 обсягом колонки. Проводять десорбцію вмісту колонки 3 обсягами колонки регенеруючого буфера для афінної хроматографії. Промиваю�ки буфера Mabselect CIP buffer або Mabselect Sure CIP. Промивають 3 обсягами колонки рівноважного буфера для афінної хроматографії до тих пір, поки вихідний рівень не стане стабільним. Промивають 3 обсягами колонки надчистої води до тих пір, поки вихідний рівень не стане стабільним. Промивають 3 обсягами колонки 20% етанолу і зберігають колонку для афінної хроматографії.

5) Гельфильтрация

Встановлюють систему очищення AKTA з аналізатором і колонку для гельфильтраций Superdex 200. Коригують швидкість потоку до 5 мл/хв, промити 1 обсягом колонки надчистої води і промивають 2 обсягами колонки рівноважним розчином для Superdex 200. Коригують швидкість потоку до 2,5 мл/хв, у відібраних фракціях, що відповідають пікам афінної хроматографії, коригують pH і проводять їх введення прямо в зазначену колонку. Після введення проби проводять десорбцію вмісту колонки рівноважним розчином для Superdex 200, і відбирають розглянутий пік на 280 нм. Продовжують промивати 1 обсягом колонки. Зазначену хроматографічну колонку зберігають з 0,01 М NaOH.

3. Визначення активності IgG гуманизированного антитіла до ФНП-α

12 IgG гуманізованих антитіл до ФНП-α, отриманих на 2 етапі, піддавали тестування, щоб визначити їх біологічну активність у плані�алі підсумкові значення OD450і їх вводили в програму GraphPad Prism 5 для розрахунку EC50. Значення EC50для дванадцяти зазначених IgG гуманізованих антитіл до ФНП-α, що показують пригнічення біологічної активності ФНП-α, наведені в таблиці 7. Отримані результати показують, що біологічна активність зазначених гуманізованих антитіл до ФНП-α суттєво підвищена, і що KS10 володіє самою високою активністю. Таким чином, подальше дослідження активності антитіл проводили головним чином щодо KS10.

Таблиця 6
Гуманізовані антитіла до ФНП-α з високою спорідненістю
Антитіло IgGVHVK
KS01SH01SH03
KS02SH02SH03
KS03SH01SH05
KS04SH02SH05
SH01SH06
KS07SH02SH06
KS08SH02SH04
KS09SH01SH07
KS10SH01SH08
KS11SH02SH07
KS12SH02SH08

Таблиця 7
Біологічна активність повнорозмірного гуманизированного антитіла до ФНП-α щодо нейтралізації ФНП-α
ГрупаЄС50(нМ)
KS01 (Glu)0,081
KS01 (Gln)0,087
KS020,109
KS03 (Glu)KS040,126
KS05 (Glu)0,051
KS05 (Gln)0,064
KS06 (Glu)0,059
KS06 (Gln)0,068
KS070,100
KS080,113
KS09 (Glu)0,036
KS09 (Gln)0,032
KS10 (Glu)0,028
KS10 (Gln)0,025
KS110,059
KS120,136
Remicade0,174

Приклад 5 Кінетичний аналіз зв'язування KS10 (Glu) з чФНО-α

чФНО-α (R&D Co.», 210-TA-050) і NHS-LCLC-біотин (каталожний номер: 21338, придбаний у компанії «Thermo-fisher Co.») змішували до однорідного стану в співвідношенні 1:3 і зберігали при кімнатній температурі протягом 1 години. Потім остампании «GE З.»). Підсумкові продукти кон'югації включали 50 мкг/мл біотин-чФНО-α.

Кінетичні параметри зв'язування KS10 з чФНО-α визначали за допомогою системи Octet RED 96 («ForteBio Co.») на технологічній платформі Octet, причому експериментальний спосіб налаштовували у відповідності з інструкцією по експлуатації зазначеного інструменту. 50 мкг/мл біотин-чФНО-α зв'язувався з біосенсором на основі стрептавидина (SA), завантаживши; відповідний діапазон концентрацій зазначеного антитіла визначали у пробному випробуванні, і він склав: 6000 нМ, 2000 нМ, 666,7 нМ, 222,2 нМ, 74,1 нМ і 24,7 нМ. В якості позитивного контролю застосовували Ремікейд, а як порожній проби застосовували ФСБ (pH 7,4). Результат (таблиця 8) показує, що значення KD (константи дисоціації) KS10 менше, ніж у Ремикейда, що вказує на те, що спорідненість KS10 до чФНО-α вище, ніж спорідненість химерного антитіла людини-миші - Ремикейда.

Крім того, визначали спорідненість зв'язування KS10 з ФНП-α шимпанзе (з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:36 і послідовністю нуклеотидів, показаної в SEQ ID №:37), макаки-резус (з послідовністю амінокислот, показаної SEQ ID №:38 і послідовністю нуклеотидів, показаної в SEQ ID №:39), миші (мФНО-α) (каталожний номеROSPEC»). Згідно з критеріями оцінки спорідненості, закладеними в системі Octet RED 96, відстань заміни світлової хвилі внаслідок зв'язування антигену з антитілом побічно відображає спорідненість між двома речовинами, і чим більше відстань заміни світлової хвилі, тим вище спорідненість. Результат (Фіг.3) показує, що KS10 дуже сильно зв'язується з ФНП-α людини, також значно зв'язується з ФНП-α шимпанзе, слабко зв'язується з ФНП-α макаки-резус, неміцно з ФНП-α миші і з ФНП-β людини. Отже, підтверджено, що антитіла, запропоновані в цьому винаході, мають здатність до специфічного зв'язування після гуманізації.

Таблиця 8
кінетичні параметри зв'язування KS10 з чФНО-α
Клас антитілаKD (M)kon (l/Ms)kdis (l/s)
Ремікейд8,12 Е-121,95 Е+041,58 Е-07
KS102,18 Е-124,69 Е+04

Приклад 6: Ефект KS10 (Glu) на індукований ФНП-α людини ревматоїдний артрит у моделі на щурах

Застосовували сімдесят дві щури Спраг-Доули (ліцензія на роботу з лабораторними тваринами: SCXK (Sichuan) 2008-24) у віці 4-6 тижнів, ступеня SPF, половина з яких були самки, а половина - самці, з масою тіла 140-180 р. Зазначених щурів піддавали акліматизації протягом одного тижня, а потім рандомізовали в шість груп по 12 щурів на групу, а саме, група здорових щурів, група негативного контролю, група контролю моделі, група, яка отримує 5 мг/кг KS10, група, яка отримує 10 мг/кг KS10, і група, яка отримує 20 мг/кг KS10. На початку експерименту щурів кожної групи піддавали анестезії за допомогою 10% хлоральгидрата (350 мг/кг), за винятком щурів здорової групи. Перед отриманням моделі щурам з груп, які одержують лікарський препарат, через хвостову вену вводили три різних дози KS10 (5 мг/кг, 10 мг/кг та 20 мг/кг), а щурам з групи негативного контролю і групи контролю моделі вводили в хвостову вену еквівалентні об'єми фізіологічного розчину. Через п'ятнадцять хвилин вводили 0,5 мг/мл чФНО-α (R&D Co.», каталожний номер 210-ТА-050) (розчинений�ностопного суглоба щурів з трьох груп, отримували KS10, і щурам з групи контролю моделі, щоб індукувати гострий артрит (моделювання в одній стопі), а щурам з групи негативного контролю в суглобову порожнину лівого гомілковостопного суглоба вводили еквівалентний об'єм 1% БСА. На успішність ін'єкції вказував поступово розвивається набряк з обох сторін на западинах суглобової порожнини. Щурів із здорової групи не піддавали ніяким зазначеним вище ін'єкцій.

Через 18 годин після впровадження зазначеної моделі ступінь набряку лівого гомілковостопного суглоба щурів у кожній групі оцінювали індивідуально в балах відповідно з модифікованими критеріями оцінки 0-4, наступним чином: 0: немає почервоніння і набряку; 1: почервоніння та/або набряк тільки в гомілковостопному суглобі; 2: почервоніння та/або набряк у гомілковостопному суглобі і набряк підошви стопи; 3: почервоніння та/або набряк у гомілковостопному суглобі і на підошві; 4: почервоніння та/або набряк у гомілковостопному суглобі, на підошві і на поверхні стопи [Посилання: R Про Williams, M Feldmann, і R N Maini. Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 October 15; 89 (20): 9784-9788]. Через 20 годин після впровадження зазначеної моделі відбирали синовіальну рідину з суглоба. М'які тканини, що оточують зазначений суглоб, про�мощі набору на основі ELISA (IL-1β придбаний у компанії «R&D Co.», каталожний номер: RLB00; IL-6 придбаний у компанії «R&D Co.», каталожний номер: R6000B).

На підставі балів (Фігура 4) показано, що три зазначені дози KS10 можуть істотно полегшувати викликаються чФНО-α почервоніння і набряк суглобів у щурів і значною мірою протидіяти розвитку викликається чФНО-α ревматоїдного артриту. У пробі з зазначеними цитокінами показано, що три зазначені дози KS10 можуть значно знижувати рівень IL-1β (Фіг.5) і IL-6 (Фіг.6) у синовіальній рідині та у м'яких тканинах, що оточують суглоб, що вказує на те, що KS10 може повністю блокувати підвищення рівня IL-1β та IL-6, що викликається ФНП-α, і є прямим доказом дії KS10 проти ФНП-α людини.

Приклад 7: Терапевтичний ефект KS10 (Glu) на увеїт, що викликається ФНП-α людини, в моделі на щурах

40 здорових щурів лінії Льюїс рандомізовали в нормальну групу, модельну групу, групу негативного контролю і групу, яка одержує KS10. Зазначеним щурам вводили внутрішньочеревно 10% хлоральгидрат (доза - 0,35 мг/кг). Після проведення анестезії щурам вводили 10 мкл фізіологічного розчину (за допомогою голки 30 G1/2) в склоподібне тіло через плоску частину війкового м'яза кожної щура з групи контролю моделі і групи отрі�з групи KS10. Через тридцять хвилин кожної щура з групи контролю моделі і групи KS10 в склоподібне тіло вводили 10 мкл чФНО-α (приблизно 0,5 мг/мл), а кожній щура в групі негативного контролю в склоподібне тіло вводили 10 мкл 1% БСА. Через 24 години і 48 годин після впровадження зазначеної моделі шляхом першого введення щурів піддавали анестезії, проводили обстеження під щілинною лампою, і оцінювали в балах, відповідно. Критерії оцінки були запозичені з літератури [Fleisher LN, Ferrell JB, Smith MG, McGahan MC. Lipid mediators of tumor necrosis factor-α-induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991 Jul; 32 (8): 2393-9.] і кілька переглянуто: 0-2: гіперемія райдужної оболонки 0-2 (0: немає гіперемії, 1: легка гіперемія; 2: важка гіперемія); звуження зіниці 0-1 (0: нормальний зіниця; 1: звужений зіницю); ексудація в передній камері 0-2 (0: немає ексудації в передній камері; 1: легка ексудація в передній камері; 2: сильна ексудація в передній камері), замутніння зіниці або задня синехия 0-2 (0: немає синехії; 1: синехия в одному з ділянок; 2: синехия в обох ділянках).

Результат оцінки в балах показано в таблиці 9 і вказує на те, що KS10 може значно знижувати бал за критеріями оцінки увеїту, що відповідає зменшення гіперемії райдужної оболонки, ексудації фібрину і �о, що KS10 проявляє значну антагоністичну дію відносно викликається чФНО-α увеїту.

Таблиця 9
Бали, відповідні лікувальній дії KS10 на викликається ФНП-α людини увеїт у моделі на щурах
ГрупаЧас після створення моделі шляхом першого введення
24 год48 год
Здорова0,88±0,8340,38±0,518
Негативний контроль0,90±0,7370,38±0,744
Модель3,5±0,9713,78±1,202
KS102,5±0,971*1,55±2,422*
Примітка: * вказує *P < 0,05, порівняно з модельної групою()

Промислове застосування

За рахунок мутагенезу антитіла з щепленими CDR даний винахід дозволяє ефективно подолати той недолік, що спорідненість антитіла зазвичай порушується при традиційному способі гуманізації антитіла (при якому гипервариабельную область (CDR) змінної області отриманого від миші антитіла (VH, VK) безпосередньо прищеплюють в каркасну область антитіла людини), і в підсумку отримують гуманізоване антитіло, схоже з вихідним антитілом. Fab і антитіла IgG, запропоновані в цьому винаході, володіє значно підвищеним ступенем гуманізації (до 95% і вище) і експериментально підтверджено, що вони володіють спорідненістю та біологічною активністю, близькими або навіть перевищують спорідненість і біологічну активність, химерного антитіла людини-миші Ремикейда, більш вираженим нейтралізує дію на ФНП-α людини і більш ефективні при лікування захворювань, асоційованих з ФНП-α, переважно ревматоїдного артриту, аутоімунного увеїту, хвороби Крона, бляшечного псоріазу, псоріатичного артриту, анкілозуючого спондиліту, виразкового коліту або юнацького ідіопатичного артриту.�казанного антитіла, для зв'язування з фактором некрозу пухлини-α людини, яке містить вариабельную область важкої ланцюга і вариабельную область легкої ланцюга, причому послідовність амінокислот змінної галузі важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 1 або 3 в переліку послідовностей; послідовність амінокислот змінної галузі легкої ланцюга показана в SEQ ID№: 15, 9, 11, 7, 13 і 5 в переліку послідовностей, і першим залишком амінокислоти послідовності SEQ ID №: 1 є Glu або Gln.

2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло є одним з таких а)-1):
a) KS10, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 1, і вариабельную область легкої ланцюга SH08 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 15;
b) KS03, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 1, і вариабельную область легкої ланцюга SH05 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 9;
c) KS06, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 1, і вариабельную область легкої ланцюга SH06 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №:EQ ID №: 3, і вариабельную область легкої ланцюга SH08 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 15;
e) KS04, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 3, і вариабельную область легкої ланцюга SН05 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 9;
f) KS07, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 3, і вариабельную область легкої ланцюга SH06 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 11;
g) KS02, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 3, і вариабельную область легкої ланцюга SH03 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 5;
h) KS08, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 3, і вариабельную область легкої ланцюга SH04 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 7;
i) KS11, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH02 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 3, і вариабельную область легкої ланцюга SH07 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 13;
j) KS01, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH�ельностью амінокислот, показаної в SEQ ID №: 5;
k) KS05, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 1, і вариабельную область легкої ланцюга SН04 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 7;
l) KS09, що містить вариабельную область важкої ланцюга SH01 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 1, і вариабельную область легкої ланцюга SH07 з послідовністю амінокислот, показаної в SEQ ID №: 13;
причому першим залишком амінокислоти в SEQ ID №: 1 є Glu або Gln.

3. Антитіло за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що зазначене антитіло складається з важкої ланцюга, в якій послідовність амінокислот константною області ідентична послідовності амінокислот константною галузі важкої ланцюга антитіла людини, і легкого ланцюга, в якій послідовність амінокислот константною області ідентична послідовності амінокислот константною галузі легкої ланцюга антитіла людини.

4. Антитіло за п. 3, відрізняється тим, що послідовність амінокислот константною області зазначеної важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 17 у переліку послідовностей, а послідовність амінокислот константною області зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 19�казанной важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 21 у переліку послідовностей, а послідовність амінокислот зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 23 у переліку послідовностей, причому першим залишком амінокислоти в SEQ ID №: 21 є Glu або Gln.

6. Fab за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений Fab складається з фрагмента важкої ланцюга, що складається із змінної області зазначеної важкої ланцюга та константною області СН1 важкої ланцюга, а також легкої ланцюга, що складається із змінної області зазначеної легкої ланцюга та системою галузі легкої ланцюга, причому послідовність амінокислот зазначеної СН1 ідентична СН1 константною галузі важкої ланцюга антитіла людини, а послідовність амінокислот зазначеної константною галузі легкої ланцюга ідентична послідовності константною галузі легкої ланцюга антитіла людини.

7. Fab за п. 6, відрізняється тим, що послідовність амінокислот зазначеної СН1 показана в SEQ ID №: 33 у переліку послідовностей, і послідовність амінокислот константною області у зазначеній легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 19 у переліку послідовностей.

8. Fab за п. 6, відрізняється тим, що зазначений Fab є одним з таких b1)-b3):
b1) KS-7F: послідовність амінокислот зазначеного фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 27 в переліку п�ледовательностей;
b2) KS-7A: послідовність амінокислот зазначеного фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 25 в переліку послідовностей, а послідовність амінокислот зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 31 у переліку послідовностей;
b3) KS-2E: послідовність амінокислот зазначеного фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 25 в переліку послідовностей, а послідовність амінокислот зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 29 у переліку послідовностей.

9. Антигенсвязивающий фрагмент Fab гуманизированного антитіла до фактору некрозу пухлини-α людини, що містить вариабельную область важкої ланцюга і вариабельную область легкої ланцюга, причому послідовність амінокислот зазначеної змінної галузі важкої ланцюга відповідає положенням 1-120 в SEQ ID №: 27 або положенням 1-120 в SEQ ID №: 25 в переліку послідовностей, а послідовність амінокислот зазначеної змінної галузі легкої ланцюга відповідає положенням 1-109 в SEQ ID №: 31 або положенням 1-109 в SEQ ID №: 29 у переліку послідовностей.

10. Fab за п. 9, що відрізняється тим, що зазначений Fab складається з фрагмента важкої ланцюга, що складається із змінної області зазначеної важкої ланцюга та константною області СН1 важкої ланцюга, а �, причому послідовність амінокислот зазначеної СН1 ідентична СН1 константною галузі важкої ланцюга антитіла людини, а послідовність амінокислот зазначеної константною галузі легкої ланцюга ідентична послідовності константною галузі легкої ланцюга антитіла людини.

11. Fab за п. 10, відрізняється тим, що послідовність амінокислот зазначеної СН1 показана в SEQ ID №: 33 у переліку послідовностей, і послідовність амінокислот константною області у зазначеній легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 19 у переліку послідовностей.

12. Fab за п. 10, відрізняється тим, що зазначений Fab є одним з таких b1)-b3):
bl) KS-7F: послідовність амінокислот зазначеного фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 27 у переліку послідовностей, а послідовність амінокислот зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 31 у переліку послідовностей;
b2) KS-7A: послідовність амінокислот зазначеного фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 25 в переліку послідовностей, а послідовність амінокислот зазначеної легкої ланцюга показана в SEQ ID №: 31 у переліку послідовностей;
b3) KS-2E: послідовність амінокислот зазначеного фрагмента важкої ланцюга показана в SEQ ID №: 25 в переліку� послідовностей.

13. Ген, що кодує будь-який з наступних білків А)-В), представлених нижче:
A) антитіло по кожному з пп. 1-5;
B) Fab по кожному з пп. 1 і 6-12;

14. Ген за п. 13, відрізняється тим, що послідовності, що кодують вариабельние області важких ланцюгів антитіл по кожному з пп. 1-5, показані в SEQ ID №: 2 або 4 в переліку послідовностей; послідовності, що кодують вариабельние області легких ланцюгів антитіл по кожному з пп. 1-5, показані у будь-якому з SEQ ID№: 16, 10, 12, 8, 14 і 6 у переліку послідовностей;
послідовності, що кодують вариабельние області важких ланцюгів Fab по кожному з пп. 1 і 6-12, відповідають положенням 1-360 в будь послідовностей SEQ ID №: 2, 4, 28 і 26 переліку послідовностей; послідовності, що кодують вариабельние області легких ланцюгів Fab по кожному з пп. 1 і 6-12, відповідають положенням 1-327 в будь послідовностей SEQ ID№: 16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 і 30 в переліку послідовностей.

15. Ген за п. 13 або 14, відрізняється тим, що послідовність, що кодує константну область важкої ланцюга зазначеного антитіла, показана в SEQ ID №: 18 у переліку послідовностей, а послідовність, що кодує константну область легкої ланцюга зазначеного антитіла, показана в SEQ ID №: 20 у переліку пос�ельностей; а послідовність, що кодує константну область легкої ланцюга зазначеного Fab, показана в SEQ ID №: 20 у переліку послідовностей.

16. Ген за п. 13 або 14, відрізняється тим, що послідовність, що кодує важку ланцюг зазначеного антитіла, показана в SEQ ID №: 22 у переліку послідовностей, а послідовність, що кодує легку ланцюг зазначеного антитіла, показана в SEQ ID №: 24 у переліку послідовностей;
при цьому послідовність, що кодує Fab по кожному з пп. 6-12 є однією з наступних c1)-с3):
cl) KS-7F: послідовність, що кодує фрагмент важкої ланцюга зазначеного Fab, показана в SEQ ID №: 28 у переліку послідовностей, а послідовність, що кодує легку ланцюг зазначеного Fab, показана в SEQ ID №: 32 у переліку послідовностей;
с2) KS-7A: послідовність, що кодує фрагмент важкої ланцюга зазначеного Fab, показана в SEQ ID №: 26 у переліку послідовностей, а послідовність, що кодує легку ланцюг зазначеного Fab, показана в SEQ ID №: 32 у переліку послідовностей;
с3) KS-2E: послідовність, що кодує фрагмент важкої ланцюга зазначеного Fab, показана в SEQ ID №: 26 у переліку послідовностей, а послідовність, що кодує легку ланцюг зазначеного Fab, показана в SEQ ID №: 30 в пе� такий як описано далі: рекомбінантний вектор, рекомбінантна бактерія, рекомбінантна лінія клітин; рекомбінантний вірус або касета експресії, що містять ген по кожному з пп. 13-16.

18. Генетичний матеріал по п. 17, відрізняється тим, що зазначеним рекомбінантним вектором є вектор експресії у прокаріотів або еукаріотів для експресії зазначеного Fab або антитіла; вказаної рекомбінантної бактерією є Escherichia coli, що містить зазначений ген; вказаної рекомбінантної лінією клітин є лінія клітин ссавців, які трансфецировали зазначений ген, переважно лінія клітин СНО (яєчника китайського хом'яка), або клітини 293 та їх сублинии; рекомбінантним вірусом є рекомбінантний аденовірус або рекомбінантний адено-асоційований вірус, що містить зазначений ген.

19. Застосування антитіла по кожному з пп. 1-5, або Fab по кожному з пп. 1 і 6-12, або гена по кожному з пп. 13-16, або генетичного матеріалу по п. 17 або 18 для одержання лікарського засобу для профілактики або лікування захворювань, асоційованих з фактором некрозу пухлини-α людини.

20. Застосування п. 19, відмінне тим, що вказаним захворюванням, асоційованим з фактором некрозу пухлини-α людини, є захворювання, викликане вище�езнь Крона, бляшковий псоріаз, псоріатичний артрит, анкілозуючий спондиліт, виразковий коліт або юнацький ідіопатичний артрит.

21. Фармацевтична композиція для профілактики або лікування захворювань, асоційованих з фактором некрозу пухлини-α людини, що містить допоміжні речовини та ефективне кількість активних інгредієнтів, причому зазначені активні інгредієнти включають принаймні одне з наступних речовин: антитіло по кожному з пп. 1-5, або Fab по кожному з пп. 1 і 6-12, або ген по кожному з пп. 13-16, і генетичний матеріал по п. 17 або 18; а допоміжним речовиною є фармацевтично прийнятний носій або наповнювач.

22. Застосування будь-якої з таких речовин для лікування захворювань, асоційованих з фактором некрозу пухлини-α людини: антитіло по кожному з пп. 1-5, або Fab по кожному з пп. 1 і 6-12, або ген по кожному з пп. 13-16, і генетичний матеріал по п. 17 або. 18; і фармацевтична композиція з п. 21.

23. Застосування п. 22, відмінне тим, що вказаним захворюванням, асоційованим з фактором некрозу пухлини-α людини, є захворювання, викликане підвищенням рівня фактора некрозу пухлини-α людини, переважно ревматоїдний артрит, аутоімунний у�ношеский ідіопатичний артрит.



 

Схожі патенти:

Анти-ifnar1 антитіла зі зниженою спорідненістю з лігандом fc

Пропонований винахід відноситься до імунології. Запропоновано моноклональне анти-IFNAR1 антитіло з мутаціями L234F, L235E і P331S в області Fc людського IgG1, володіє зниженим спорідненістю щодо Fcgamma RI, Fcgamma RIIIА і c1q рецепторів порівняно з немодифікованим антитілом. Описана виділена нуклеїнова кислота, що забезпечує експресію зазначеного антитіла, яка кодує антитіло нуклеотидну послідовність, і фармацевтична композиція на основі зазначеного антитіла. Використання винаходу забезпечує антитіло із зниженою спорідненістю до рецепторів Fcgamma RI, Fcgamma RIIIА і c1q, що забезпечує зниження небажаних ефекторних функцій при лікуванні хронічного запалення та аутоімунних станів. 3 н. і 6 з.п. ф-ли, 34 іл., 7 табл., 36 пр.

Рекомбінантна плазмидная днк, що кодує химерное антитіло проти фактора некрозу пухлини-альфа людини, лінія экуариотических клітин-продуцент химерного антитіла і спосіб отримання химерного антитіла

Група винаходів відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано рекомбінантна плазмидная ДНК, що кодує химерное антитіло проти фактора некрозу пухлин-альфа людини (ФНП-альфа), на основі плазміди pOptiVECTM-TOPO®. Розглянуто лінія эукариотических кліток в якості продуцента антитіла проти ФНП-альфа, спосіб її отримання шляхом трансфекції плазмідної ДНК з винаходу, а також спосіб отримання химерного антитіла проти ФНП-альфа шляхом культивування лінії клітин по винаходу. Даний винахід забезпечує збільшення рівня синтезу антитіл проти ФНП-альфа клітинами-продуцентами. 4 н. і 8 з.п. ф-ли, 8 іл., 1 табл., 3 пр.

Нейтралізуючі антитіла проти вірусу грипу а і їх використання

Пропонований винахід відноситься до імунології. Запропоновані варіанти антитіл, що нейтралізують інфекцію субтипу групи 1 та субтипу групи 2 вірусу грипу А. Антитіло характеризується: або набором 3 CDR легкої і 3 СDR важкої ланцюга, або наявністю варіабельних ділянок легкої і важкої ланцюгів. Розкриті: кодує антитіло молекула нуклеїнової кислоти; экспрессирующая антитіло клітина; а також спосіб ослаблення інфекції вірусу грипу А або зниження його ризику, що використовує антитіло в терапевтично або профілактично ефективному кількості. Використання винаходу забезпечує нейтралізують вірус грипу А антитіла, які можуть знайти застосування в медицині при лікуванні грипу субтипов: H1, H2, H3, H5, H7, H9. 6 н. і 12 з.п. ф-ли, 6 табл., 2 пр.
Пропонований винахід відноситься до галузі імунології. Розкрито варіанти антитіло людини або антиген-зв'язуючий фрагмент антитіла людини, які специфічним чином пов'язують і інгібують людську пропротеинконвертазу субтилизин/кексин тип 9 («hPCSK9»). Кожен варіант характеризується тим, що містить 6 CDR важкої і легкої ланцюга. Описані: ізольована кодує нуклеїнова кислота, вектор експресії та спосіб отримання антитіла з використанням зазначеного вектора. Запропоновано фармацевтичний складу на основі антитіла для лікування захворювання або стану, яке піддається пом'якшення, поліпшення, придушення або запобігання за допомогою антитіла до PCSK9. Використання винаходу забезпечує нові варіанти антитіл, здатні знижувати сироватковий ЛНЩ холестерин при незначних змінах або відсутності впливу на функції печінки, за даними вимірювання АЛТ і АСТ. 5 н. і 3 з.п. ф-ли, 14 іл., 28 табл., 17 пр.
Пропонований винахід відноситься до галузі імунології. Описані варіанти антитіл або антигенсвязивающих фрагментів, пов'язані з людським 4-1ВВ. Один з варіантів характеризується наявністю відповідних 3 CDR ділянок легкого ланцюга і 3 CDR ділянок важкої ланцюга. Інший варіант характеризується наявністю важкої і легкої ланцюга з відповідними амінокислотними послідовностями. Описані варіанти фармацевтичної композиції для зниження пухлинного росту або для лікування раку у суб'єкта, а також способи зниження пухлинного росту або лікування раку у суб'єкта, що використовують варіанти антитіл або антигенсвязивающих фрагментів у терапевтично ефективній кількості. Описаний спосіб лікування раку з використанням комбінації антитіла і імунотерапевтичне агента. Розкриті: варіанти кодують нуклеїнових кислот, вектор експресії і клітина-господар, що містить вектор для експресії антитіла. Описаний спосіб одержання антитіла з використанням клітини. Винахід забезпечує нові агонистические антитіла до 4-1ВВ (також званого CD137 або TNFRSF9) людини, які розпізнають епітоп, розташований в області амінокислотних залишків K115, C121, R134, R154, V156 антигену, мають спорідненість Kd, з� терапії раку і пухлинних захворювань. 12 н. і 7 з.п. ф-ли, 8 іл., 11 табл., 9 пр.

Специфічні відносно бета-амілоїду (а бета) 1-42 моноклональні антитіла, що володіють терапевтичними властивостями

Даний винахід відноситься до галузі біотехнології та імунології. Запропоновано гибридомная клітинна лінія FP12H3-C2, депонована під номером DSM ACC2750, яка продукує антитіло проти бета-амілоїду. Розглянуто способи отримання антитіла, в тому числі гуманизированного антитіла, з використанням гібридомної лінії по винаходу, а також способи діагностики асоційованого з бета-амілоїд захворювання або порушення у пацієнта або схильність до такого захворювання або порушення, спосіб визначення ступеня ураження тканини амилоидогенними бляшками, спосіб моніторингу мінімальних залишкових ознак захворювання у пацієнта після лікування антитілом або його активним фрагментом, спосіб прогнозування чутливості пацієнта, який отримує лікування антитілом або його активним фрагментом. Даний винахід може знайти подальше застосування у діагностиці та терапії пов'язаних з бета-амілоїд хвороб, таких як хвороба Альцгеймера. 8 н. і 1 з.п. ф-ли, 4 іл., 5 табл., 17 пр.

Зв'язують протеїни, специфічні по відношенню до інсулін-подібним факторам зростання, і їх використання

Даний винахід відноситься до галузі імунології. Запропоновано повністю людське моноклональне антитіло, яке зв'язує інсуліноподібний фактор росту-II (IGF-II) і має перехресну реактивність IGF-I, а також його антигенсвязивающий фрагмент. Розглянуто молекула нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло щодо винаходу, вектор і клітина-господар для експресії антитіла щодо винаходу. Описана фармацевтична композиція, а також кон'югати для лікування та діагностики злоякісної пухлини, застосування антитіла щодо винаходу в отриманні лікарського засобу та спосіб визначення рівня IGF-II і IGF-I в пробі пацієнта. Даний винахід може знайти подальше застосування в терапії раку. 8 н. і 8 з.п. ф-ли, 27 пр., 18 табл.

Оптимізований ген моноклонального антитіла інфліксімаб (варіанти), рекомбінантна клітинна лінія-продуцент цього антитіла і спосіб його біосинтезу

Винахід відноситься до біотехнології та імунології. Запропоновані оптимізовані гени легкої і важкої ланцюгів інфліксімаб - антитіла проти фактора некрозу пухлини альфа (ФНП-альфа), а також клітинна лінія МКПМ-Н-131 і спосіб біосинтезу антитіла. Нуклеотидні послідовності генів, що кодують легку і важку ланцюга инфликсимаба, оптимізовані з тим, щоб забезпечити зміст кодонов, найбільш типових для ссавців; зміст G/C повинна складати 50-60% від загального складу; відсутність протяжних трактів виродженого складу і відсутність вторинних структур РНК. Лінія клітин яєчників китайського хом'яка (СНО), отримана в результаті трансфекції экспрессионними конструкціями, що містять генетичні послідовності щодо винаходу, дозволяє одержувати не менше 50 мг/л моноклонального антитіла інфліксімаб. 4 н. п. ф-ли, 3 іл., 4 пр.

Антитіла проти фактора росту нервів (фрн), що володіють підвищеною стабільністю in vivo

Даний винахід відноситься до біотехнології і являє собою антитіла проти фактора росту нервів (ФРН). Справжній винахід також розкриває фармацевтичну композицію для полегшення болю, асоційованої з захворюванням або станом, при якому розвиток чи збереження болю опосередковано ФРН, що містить зазначені антитіла, а також набір для лікування пов'язаного з ФРН захворювання, такого як, наприклад, остеоартрит, нуклеїнові кислоти, що кодують важку або легку ланцюг антитіла, вектор експресії, що клітку-господаря для отримання зазначених антитіл, спосіб експресії зазначених антитіл проти ФРН, а також застосування зазначених антитіл в способі лікування болю і для одержання лікарського засобу для лікування болю, асоційованої з захворюванням або станом, при якому розвиток чи збереження болю опосередковано ФРН. Даний винахід дозволяє отримати антитіла проти ФРН, що характеризуються підвищеною стабільністю in vivo. 10 н. і 6 з.п. ф-ли, 7 іл., 13 табл., 8 пр.

Білки специфічного зв'язування та їх застосування

Даний винахід відноситься до галузі імунології. Запропоновано антитіло, здатне зв'язуватися з амплифицированним рецептором епідермального фактора росту (EGFR) і з усіченим варіантом EGFR - de2-7 EGFR, і охарактеризованное послідовностями варіабельних доменів. Також розглянуті засновані на використанні антитіла щодо винаходу набір для діагностування пухлини, иммуноконъюгат, фармацевтичні композиції і способи лікування злоякісної пухлини, а також одноклітинний господар для освіти антитіла по справжньому винаходу. Цей винахід може знайти подальше застосування у діагностиці та терапії раку. 8 н. і 35 з.п. ф-ли, 98 іл., 20 табл., 26 пр.

Діагностика та лікування злоякісних пухлин підшлункової залози, яєчників та інших злоякісних пухлин

Винахід відноситься до галузі біотехнології та імунології. Описано антитіло, яке специфічно зв'язує денатурований CD70. Також розкрито спосіб діагностики, прогнозування, профілактики і лікування злоякісних пухлин яєчників, підшлункової залози та інших злоякісних пухлин з використанням антитіл. Запропонована група винаходів може бути використана в медицині. 3 н. і 2 з.п. ф-ли, 10 іл., 2 табл., 9 пр.

Рекомбінантна плазмидная днк, що кодує химерное антитіло проти фактора некрозу пухлини-альфа людини, лінія экуариотических клітин-продуцент химерного антитіла і спосіб отримання химерного антитіла

Група винаходів відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано рекомбінантна плазмидная ДНК, що кодує химерное антитіло проти фактора некрозу пухлин-альфа людини (ФНП-альфа), на основі плазміди pOptiVECTM-TOPO®. Розглянуто лінія эукариотических кліток в якості продуцента антитіла проти ФНП-альфа, спосіб її отримання шляхом трансфекції плазмідної ДНК з винаходу, а також спосіб отримання химерного антитіла проти ФНП-альфа шляхом культивування лінії клітин по винаходу. Даний винахід забезпечує збільшення рівня синтезу антитіл проти ФНП-альфа клітинами-продуцентами. 4 н. і 8 з.п. ф-ли, 8 іл., 1 табл., 3 пр.

Члени зв'язування проти il-1r1

Винахід відноситься до галузі біотехнології та імунології. Описано різні варіанти антитіл, специфічні щодо IL-1R1. Розкриті антитіла можуть бути придатні для лікування розладів, опосередкованих IL-1R1, включаючи ревматоїдний артрит, астму, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ). Запропонована група винаходів може бути використана в медицині. 13 н. і 8 з.п.ф-ли, 14 іл., 12 табл., 5 пр.

Способи очищення однодоменних антигенсвязивающих молекул

Винахід відноситься до області отримання та виділення однодоменних молекул (SDAB). Описаний спосіб виділення та очищення SDAB молекули, яка являє собою трехвалентную молекулу нанотела ATN-103, спрямовану на TNFα та HAS, з суміші, що містить зазначену SDAB молекулу і одне або більше забруднюючих речовин. Призводять суміш в контакт з катионообменним носієм в умовах, які дозволяють SDAB молекулі зв'язуватися з носієм або абсорбуватися на носії. Видаляють одне або більше забруднюючих речовин і селективно элюируют SDAB з носія. При цьому провідність середовища для кондиціонування (СМ), що використовується для завантаження носія, складає приблизно від 12 до 9 мСм/см і рН в умовах завантаження коригують до величини від 4,0 до 4,3. Буфер для элюирования відповідає приблизно 50 мМ хлориду натрію або менше і має рН від 5,5 до 7,2. Розкрито спосіб або процес отримання рекомбінантного SDAB ATN-103. Підтримують клітку-господаря в умовах, при яких експресується рекомбінантна SDAB ATN-103. Отримують суміш SDAB молекули і одного або більше забруднюючих речовин. Очищають або виділяють SDAB ATN-103, використовуючи катионообменную хроматографію, як зазначено вище. Використання винаходу забезпечує нові способи пр.

Моноклональне антитіло проти інтерлейкіну-6 людини і гибридома, яка продукує даний моноклональне антитіло

Винахід відноситься до біотехнології. Представлено моноклональне антитіло проти інтерлейкіну-6 людини, що містить гипервариабельние ділянки важкої ланцюга CDRH-1: GFSLSTSGMGVG; CDRH-2: HIWWDDDKYYNPSLKS; і CDRH-3: RANYGTSYDYGMDY; і гипервариабельние ділянки легкого ланцюга CDRL-1: KASQSVSDVLT; CDRL-2: YASNRYT; і CDRL-3: QQGYRSPYT. Крім того, винахід відноситься також до штаму гибридоми, депонированному в Російській колекції клітинних культур під номером РККК(П) 751Д і продуцирующему зазначене антитіло. Винахід дозволяє розширити арсенал антитіл проти IL-6 осіб, що володіють високою здатністю до інгібування IL-6. 2 н. і 2 з. п. ф-ли, 3 іл., 2 табл., 4 пр.

Гуманізовані антитіла проти tnfα

Винахід відноситься до біохімії. Описано гуманізоване моноклональне антитіло проти TNF та його застосування. Винахід дозволяє значно знизити імуногенність мишачого антитіла при збереженні здатності антитіла розпізнавати антиген у порівнянні з консервативним химерним мишачим антитілом. Таким чином, підвищена безпека антитіла в клінічних застосуваннях. 8 н. і 3 з.п. ф-ли, 3 іл., 5 табл., 16 пр.

Гуманізоване антитіло і антигенсвязивающий фрагмент (fab), що зв'язуються з інтерфероном - γ людини, фрагменти днк, що кодують зазначене антитіло і антигенсвязивающий фрагмент, клітина, трансформована фрагментом днк, і спосіб отримання зазначеного антитіла і антигенсвязивающего фрагменту

Винахід відноситься до області імунології та біотехнології. Описані гуманізоване антитіло і його антигенсвязивающий фрагмент (Fab), які селективно зв'язують людський ІФН-γ і містять варіабельна ділянка важкої ланцюга (VH) і варіабельна ділянка легкого ланцюга (VL), де VH і VL мають послідовності амінокислот відповідно SEQ ID NO:1 і 2, представлені в описі. Також розкриті фрагменти ДНК, що кодують зазначені антитіло і його Fab-фрагмент; плазмідні ДНК для експресії зазначених специфічних білків; і модифіковані клітини бактерій і еукаріотів, що містять зазначені плазмідні ДНК і призначені для експресії зазначених антитіла і його Fab-фрагменти. Запропоновано способи отримання зазначених антитіла або його Fab-фрагменти, що включають культивування зазначених модифікованих клітин в живильному середовищі і антитіла і виділення його Fab-фрагменти справжнього винаходу з культуральної рідини. Винахід дозволяє отримати гуманізоване антитіло або його Fab-фрагмент, що зв'язуються з ІФН-γ з Кд 4,6 і IC50 не менше 1,5 нМ в тесті на клітинах U937, із збереженням афінності вихідного мишачого моноклонального антитіла. 10 н. і 3 з.п. ф-ли, 3 іл., 1 табл., 8 пр.

Лікування розсіяного склерозу

Даний винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до антагоністів гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора (GM-CSF), і може бути використане в медицині. Винахід, що полягає у використанні антитіла, специфічного щодо GM-CSF у лікуванні або профілактиці розсіяного склерозу у пацієнтів з розсіяним склерозом, дозволяє затримати початок рецидивів розсіяного склерозу. 8 з.п. ф-ли, 5 іл., 8 пр.

Антитіла проти інтерлейкіну 17 (іл-17) людини та їх застосування

Даний винахід відноситься до галузі імунології. Запропоновано: антитіло, зв'язується з інтерлейкіном-17 (ІЛ-17), що характеризується 6 CDR з легкої і важкої ланцюга, а також кодує нуклеїнова кислота і вектор для експресії зазначеного антитіла. Описана фармацевтична композиція для лікування пацієнта з розсіяний склероз, ревматоїдний артрит, псоріаз, хворобою Крона, хронічним обструктивним захворюванням легенів, астмою, відторгненням трансплантата на основі зазначеного антитіла. Розкрито спосіб отримання антитіла з використанням експресії відповідної нуклеїнової кислоти і виділенням антитіла з культури клітин або супернатанту культури клітин. Використання винаходу забезпечує антитіло з в 2 рази більш високим значенням IC50 при in vitro нейтралізації IL-6 і IL-8 у порівнянні з відомим антитілом NVP-AIN-497, яке пов'язує IL-17А та IL-17F людини, що може знайти застосування в медицині при лікуванні різних запальних захворювань. 5 н. і 4 з.п. ф-ли, 6 табл., 11 пр.

Гуманізовані антитіла проти альфа-інтерферону людини

Винахід відноситься до галузі імунології. Запропоновано гуманізоване антитіло проти IFN-α людини, отримане на основі мишачого антитіла АСО-1. Також розглянуто терапевтична композиція та спосіб запобігання, лікування або ослаблення інтенсивності симптомів аутоімунного або запального захворювання або порушення. Цей винахід може знайти подальше застосування в терапії обумовлених IFN-α захворювань. 3 н. і 10 з.п. ф-ли, 13 іл., 18 табл., 16 пр.

Спосіб профілактики розвитку постперикардиотомного синдрому у хворих на ішемічну хворобу серця, які зазнали коронарному шунтуванню

Винахід відноситься до медицини, а саме до кардіології, і стосується профілактики розвитку постперикардиотомного синдрому у хворих на ішемічну хворобу серця, які зазнали коронарному шунтуванню. Для цього в ранньому післяопераційному періоді вводять низькомолекулярні гепарини та протизапальні засоби. У якості протизапальної терапії вводять циклоферон по схемі: за добу до оперативного втручання - 2 таблетки циклоферона 0,15 м, на наступний день після оперативного втручання - 2 таблетки, наступні прийоми препарату - вранці по 2 таблетки на 2, 4, 6 день після втручання, далі - через 2 дні на третій тривалістю до 1 місяця після оперативного втручання(9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 добу). Спосіб забезпечує ефективну профілактику постперикардиотомного синдрому при зниженні ризику побічних ефектів за рахунок введення циклоферона за розробленою схемою без додаткового введення нестероїдних протизапальних засобів і глюкокортикостероїдів. 2 пр., 3 табл.
Up!