Живі вакцини аттенуйовані

 

Перехресне посилання на споріднену заявку

Ця заявка заявляє перевага Австралійської попередньої заявки на патент № 2009900736, поданої 20 лютого 2009 року, яка включена тут через посилання в її повному вигляді.

Область техніки, до якої належить винахід

Даний винахід відноситься до отримання живих аттенуйованих бактерій, які продовжують зберігатися у суб'єкта, для застосування в вакцинних композиціях. Зокрема, даний винахід відноситься до видалення функції щонайменше одного АВС-транспортерного білка бактерії для отримання аттенуированной бактерії, яка продовжує існувати в суб'єкті і може бути використана у вакцини композиції.

Рівень техніки

Бактеріальні інфекції викликають суттєві економічні втрати у тваринництві внаслідок захворюваності і смертності і справляють істотний вплив на здоров'я людини. Зокрема, респіраторні інфекції та септицемії є звичайними інфекційними захворюваннями, які можуть поширюватися в групі тварин або людей (суб'єктів) і негативно впливати на здоров'я цих суб'єктів. Це може приводити до істотних втрат продуктивнос�я істотною причиною респіраторного захворювання. Септицемія зазвичай викликаєтьсяE. coli.

Відомо, що вакцинні композиції, що містять аттенуйовані патогенні мікроорганізми, такі як бактерії і віруси, є ефективними у продукуванні захисної імунної реакції у вакцинованих тварин і людей. Такі живі аттенуйовані вакцини є переважними, так як після імунізації подальше зараження патогенним організмом, на якому ґрунтується ця вакцина, призводить до швидкої повторної стимуляції імунної реакції, спочатку індукованої цією вакцинацією. Це викликає інгібування проліферації цього патогена і запобігає розвиток клінічно релевантного захворювання.

Як правило, аттенуирование патогенних організмів для використання у вакцині досягається повним або частковим видаленням одного або декількох факторів вірулентності, так що цей організм вже не є патогенним. Фактори вірулентності зазвичай відомі як властивості, які безпосередньо викликають захворювання і/чи дозволяють цього організму персистувати у господаря. Властивості, які посилюють шкідливі реакції хазяїна, також зазвичай відомі як фактори вірулентності. Типові фактори вірулентності включають, наприклад,�, що багато факторів вірулентності беруть участь в індукуванні імунітету, і, отже, видалення факторів вірулентності погіршує імуногенність організму, аттенуированного таким чином. Жива аттенуированная вакцина вигідним чином залишається антигенної і, отже, здатна індукувати достатній рівень імунітету господаря, будучи непатогенной. Зазвичай, живі аттенуйовані вакцини не зберігаються в суб'єкті, і це може сприяти зменшенню імуногенності живого аттенуированного організму, на якому ґрунтується ця вакцина.

Хоча деякі фактори вірулентності, такі як токсини, є очевидними мішенями для аттенуации, фактори, невідомі в якості факторів вірулентності, не є очевидними мішенями для аттенуации. Дії аттенуации цих факторів на вірулентність організму не є легко очевидними або передбачуваними. Члени суперсімейства АВС-транспортерів (АТФ-зв'язує касети) зазвичай не вважаються факторами вірулентності. АВС-транспортери містять мембранні білки, які виконують функцію транслокації субстратів через позаклітинні і внутрішньоклітинні мембрани. Речовини, що транспортуються АВС-транспортерами, включають пептиди, �ельностей АВС-транспортерів вказує на те, гени і білки цього суперсімейства є консервативними серед віддалено споріднених типів (филюмов).

Даний винахід передбачене на основі несподіваного відкриття, що втрата мутації функції гена АВС-транспортера в патогенних організмів, аттенуировала патогенні організми, хоча аттенуйовані організми залишалися імуногенними і продовжували існувати в суб'єкті, як було оцінено в модельній системі господар-захворювання.

Сутність винаходу

У першому аспекті забезпечена бактерія, аттенуированная мутацією щонайменше в одному гені АВС-транспортера, де мутація робить відповідний АВС-транспортерні білок нефункціональним, причому аттенуированная бактерія продовжує існувати в суб'єкті.

У другому аспекті забезпечений спосіб аттенуации бактерій, що передбачає мутирование щонайменше одного гена АВС-транспортера, причому аттенуированная бактерія продовжує існувати в суб'єкті.

У третьому аспекті забезпечена иммуногенная композиція, що містить щонайменше одну аттенуированную бактерію першого аспекту.

У четвертому аспекті забезпечена вакцинна композиція, що містить ефективне кількість щонайменше однієї Їено застосування вакцини композиції для лікування чи профілактики захворювання, причому вакцинна композиція містить щонайменше одну аттенуированную бактерію першого аспекту.

У шостому аспекті забезпечений спосіб запобігання або усунення захворювання в суб'єкті, що передбачає введення терапевтично ефективної дози вакцини композиції або иммуногенной композиції суб'єкту, причому вакцинна композиція або иммуногенная композиція містить щонайменше одну аттенуированную бактерію першого аспекту.

У сьомому аспекті забезпечений спосіб профілактики захворювання, що передбачає введення терапевтично ефективної дози вакцини композиції або иммуногенной композиції суб'єкту, потребує профілактики, причому зазначена вакцинна композиція або иммуногенная композиція містить щонайменше одну аттенуированную бактерію першого аспекту.

В одному варіанті здійснення мутація може бути генерована інсерцією, делецією, заміною або будь-якою їх комбінацією. Инсерционная мутація може бути отримана, наприклад, гомологічною рекомбінацією, транспозонним мутагенезом і ST-мутагенезом з послідовністю-міткою.

В одному варіанті здійснення ген АВС-транспортера може бути геном, кодирующим білок АВС-пептидного трансЃт кодувати OppD.

В одному варіанті здійснення бактерія може бути обрана з групи, що складається з Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Mannheimia, Ornithobacterium, Rickettsia, Ureaplasma і Pasteurella. Зокрема, аттенуированними бактеріями можуть бути Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, велика колонія і мала колонія Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum.

В одному варіанті здійснення бактерією може бути пташиний патогенний штамE. coliЕ956 або штам Mycoplasma gallisepticum Ap3AS.

В одному варіанті здійснення жива аттенуированная бактерія може експресувати гетерологичний антиген. Гетерологичний антиген може�ологичний антиген, може бути виділена з пологів, вибраних з групи, що включає Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Mannheimia, Ornithobacterium, Rickettsia, Staphylococci, Ureaplasma і Pasteurella. Зокрема, нуклеїнова кислота, що кодує гетерологичний антиген, може бути отримана з Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma gallisepticum або Mycoplasma synoviae, Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, велику колонію і малу колонію Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum. Нуклеїнова кислота, що кодує гетерологичний антиген, може бути виділена з вірусів, виділених з групи, що включає вірус хвороби Ньюкасла (псев�захворювання, вірус інфекційного ларинготрахеїту, пташиного грипу, вірус гепатиту качок, вірусного чуми качок, інфекційної курячої анемії, вірус хвороби Марека.

Суб'єкт являє собою хребетна тварина, що включає людей, ячих, собачих, котячих, козлиних, овечих, свинячих, верблюдових, кінських і пташиних. Суб'єктом коров'ячих може бути корова, бик, бізон або буйвол. Суб'єктом собачих може бути собака. Суб'єктом котячих може бути кішка. Суб'єктом козлиних може бути коза. Суб'єктом овечих може бути вівця. Суб'єктом свинячих може бути свиня. Суб'єктом верблюжих може бути верблюд, дромадер, лама, альпака, вікунья або гуанако. Суб'єктом кінських може бути кінь, осел, зебра або мул. Суб'єктом пташиних може бути будь-який з вирощених комерційно або домашніх представників сімейства пташиних. Зокрема, суб'єктом пташиних може бути курка (у тому числі карликові кури бентамкі), індичка, качка, гусак, фазан, перепілка, куріпка, голуб, цесарка, африканський страус ему або павич.

Вакцинні композиції та імуногенні композиції можуть додатково містити щонайменше один фармацевтично прийнятний носій або розріджувач, такий як вода, сольовий розчин, культуральна ж�олоко, і буфери або будь-яку їх комбінацію.

Стабілізатором може бути SPGA. Вуглеводи включають, наприклад, сорбіт, маніт, крохмаль, сахарозу, глюкозу, декстран або їх комбінації. Додатково, як фармацевтично прийнятних носіїв або розріджувачів можуть бути використані білки, такі як альбумін або казеїн, або белоксодержащие агенти, такі як бичача сироватка або знежирене молоко.

Буфери для застосування в якості фармацевтично прийнятних носіїв або розріджувачів включають малеат, фосфат, CABS, пиперидин, гліцин, цитрат, малат, форміат, сукцинат, ацетат, пропіонат, піперазин, піридин, какодилат, сукцинат, MES, гістидин, біс-трис, фосфат, етаноламін, ADA, карбонат, ACES, PIPES, імідазол, BIS-TRIS пропан, BES, MOPS, HEPES, TES, MOPSO, MOBS, DIPSO, TAPSO, TEA, пірофосфат, HEPPSO, POPSO, трицин, гідразин, глицилглицин, TRIS, EPPS, бицин, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, таурин, борат, CHES, гліцин, гідроксид амонію, CAPSO, карбонат, метиламин, піперазин, CAPS або будь-яку їх комбінацію.

Вакцинні композиції та імуногенні композиції можуть бути лиофилизировани або висушені заморожуванням.

В деяких варіантах здійснення вакцинні композиції та імуногенні композиції можуть додатково містити щонайменше один ад'ювант. Приклади адъюЃрамилдипептиди, сапоніни, мінеральне масло, рослинна олія, гідроксид алюмінію карбопол, фосфат алюмінію, оксид алюмінію, масляні емульсії (наприклад, Bayol F® або Marcol 52®), сапоніни або солюбилизат вітаміну Е або будь-яку їх комбінацію. В деяких варіантах здійснення вакцинна композиція може містити ад'юванти, що застосовуються, зокрема, для мукозного застосування, наприклад, термолабильний токсинE. coliабо холерний токсин.

Вакцинна композиція або иммуногенная композиція може вводитися інтраназально, офтальмически, внутрішньошкірно, внутрішньочеревно, внутрішньовенно, підшкірно, перорально, за допомогою аерозолю (спрей-вакцинація), через клоаку або внутрішньом'язово. Введення у вигляді очних крапель або аерозольне введення є переважними, коли суб'єктом є птах. Аерозольне введення є особливо бажаним для введення вакцини композиції або иммуногенной композиції великою кількістю суб'єктів.

Иммуногенная композиція або вакцинна композиція може містити щонайменше від приблизно 103до приблизно 105аттенуйованих бактерій, або від приблизно 105до приблизно 107аттенуйованих бактерій, або від наблизите�зительно 1011аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1011до приблизно 1013аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1013до приблизно 1015аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1015до приблизно 1017аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1017до приблизно 1019, або щонайменше приблизно 1019аттенуйованих бактерій на дозу.

Визначення

У контексті цієї заявки, єдина форма "a", "an" і "the" включає і численні посилання, якщо контекст не вказує явно інше. Наприклад, термін "ABC-транспортер" включає також безліч АВС-транспортерів.

В контексті цього опису, термін "містять" позначає "включають в основному, але необов'язково тільки". Крім того, варіації слова "містять", такі як "містять" та "містить", мають відповідно варіюються значення.

У даному контексті термін "иммуногенно ефективні" означає, що кількість живих аттенуйованих бактерій, які здійснюються при вакцинації або при введенні иммуногенной композиції, є достатнім для індукції в цьому суб'єкті ефективної імунної реакції проти вірулентних форм цієї бактерії� стан або симптоми, запобігають виникненню стану або захворювання чи іншим шляхом затримують або сповільнюють прогресування стану або захворювання або інші небажані симптоми будь-яким шляхом.

У цьому контексті терміни "персистують" і "персистуючий" відносяться до встановлення та/або збереження інфекції або колонізації щонайменше частини суб'єкта. Персистенція включає стан, в якому організм виживає в тканинах, незалежно від того, відтворюється він або не відтворюється. Персистуючий організм може бути або може не бути асоційований з клінічно релевантними захворюванням.

Короткий опис фігур

Фіг.1є схематичним планом компонентів і експериментального протоколу.А.Основна структура міченого сигнатурою (певною послідовністю) транспозона.B.Схема для експериментів з меченним сигнатурою (певною послідовністю) мутагенезу (STM).

Фіг.2.Детектування конкретних міток. Бульйонні культури, виявляють зміна забарвлення, піддавали скринінгу за допомогою ПЛР, що використовує пару праймерів P2/P4, для детектування індивідуальних сигнатурних міток. Кожну пробу піддавали елект�щий мітку Tag 02; Доріжка 2, ST-мутант, несучий мітку Tag 03; Доріжка 3, ST-мутант, несучий мітку Tag 04; Доріжка 4, ST-мутант, несучий мітку Tag 06; Доріжка 5, ST-мутант, несучий мітку Tag 07; Доріжка 6, негативний контроль. Доріжка 7, позитивний контроль, плазміда, що містить транспозон, несучий Tag 02 в якості матриці.

Фіг.3.Підтвердження трансформантів STM. Трансформанти, які виявляли зміна забарвлення, піддавали скринінгу за допомогою ПЛР, що використовує набір праймерів P2/P4, для підтвердження присутності індивідуальної сигнатурной мітки. Кожну пробу піддавали електрофорезу в 2% агарозному гелі разом зі стандартом розмірів ДНК pUC18, розщепленоїHaeIII. Доріжка 1, рекомбінантний Mg-містить Tag02; Доріжка 2, трансформант Tag03; Доріжка 3, клон Tag04; Доріжка 4, трансформант Tag06; Доріжка 5, трансформант, несучий Tag07; +, позитивний контроль з плазміди Tag02 в якості матриці, - негативний контроль без доданої матриці.

Фіг.4.Експериментальна схема підтверджує скринінгу.

Фіг.5.Послідовність і Саузерн-блот-аналіз ST-мутантів.

A.Электроферограмми, отримані прямим секвенированием. (I). ST-мутант 26-2, який ніс єдиний транспозон, з зчитується послідовністю в ному штаму-господаря в ST-мутантів 15-1 (II) і 25-1 (III).

B.Множинні інсерції, детектированние Саузерн-блоттінгом. Доріжка 1, ST-мутант 15-1; Доріжка 2, ST-мутант 15-2; Доріжка 3, ST-мутант 15-3; Доріжка 4, ST-мутант 25-1; Доріжка 5, ST-мутант 25-2; Доріжка 6, ST-мутант 25-3. Стандартами розмірів ДНК була ДНК фага λ, розщеплена HindIII.

Фіг.6.Розподіл бальних оцінок RSA і пошкоджень альвеолярних мішечків у птахах у дослідженні вірулентності і инфективности.A.Бальна оцінка RSA за 2 тижні після інфікування.B.Бальна оцінка пошкодження альвеолярних мішечків. Група 1, негативний контроль; Група 2, інфікована ST-мутантом 04-1; Група 3, інфікована ST-мутантом 33-1; Група 4, інфікована ST-мутантом 03-1; Група 5, інфікована ST-мутантом 26-1; Група 6, інфікована ST-мутантом 18-1; Група 7, інфікована ST-мутантом 20-1; Група 8, інфікована ST-мутантом 22-1; Група 9, позитивний контроль (інфікована Ap3AS дикого типу).

Фіг.7.Розподіл бальних оцінок RSA і пошкоджень альвеолярних мішечків птахів.A.Бальна оцінка RSA в день 28.B.Бальна оцінка пошкодження альвеолярних мішечків. Сумарна бальна оцінка 6 різних альвеолярних мішечків. Група 1, негативний контроль; Група 2, позитивний контроль (икцинированная (ST-мутантом 26-1) і заражена (заражена Ap3AS дикого типу).

Фіг.8.Схематична діаграма ПЛР-конструкцій, використовуваних для гомологічної рекомбінації. Ці ПЛР-продукти генерували з олигонуклеотидними праймерами, як описано. Ген канаміцину ампліфікували для конструкцій генів як oppA, так і dppD з використанням пари праймерів TX/TY. Генерували плечі конструкцій і доповнювали додатковими ПЛР-продуктами з використанням WS/WU і WY/WT для oppD або з використанням 60-мірних праймерів WE/WF в ПЛР для dppD.

Фіг.9.Детектування гомологічної рекомбінації за допомогою ПЛР. Олігонуклеотидні праймери для генів dppD (ПанельА) і oppD (ПанельBвикористовували в ПЛР для ампліфікації відповідних районів у штамахE. coliз використанням пари праймерів WS/WT для oppD і TZ/UA для dppD: E956 (доріжка 1 панелейAіB), ΔdppD (доріжка 1, панельA) і ΔoppD (доріжка 1, панельB).

Фіг.10.Саузерн-блоттінг нокаутів dppD і oppDE. coliЕ956. Канаміцин, зонди dppD і oppD мітили радіоактивно і використовували для зондування розщепленої рестриктазою PstI геномної ДНКE. coliЕ956, ΔdppD і ΔoppD, доріжки 1, 2 і 3, відповідно.

Детальний опис

Даний винахід відноситься до живих аттенуированним бактеріям, які персистують в суб'єкті, і їх застосований�ранспортерного білка в результаті мутації в нуклеїнової кислоти, кодує АВС-транспортерні білок. АВС-транспортерні білок може бути зроблений нефункціональним будь-яким способом, але зазвичай це досягається мутацією нуклеїнової кислоти, кодує АВС-транспортерні білок. Зазвичай мутація є інсерцією, делецією або мутацією зі зсувом рамки або будь-якою їх комбінацією. В деяких варіантах здійснення живі аттенуйовані бактерії можуть експресувати гетерологичний антиген.

У відповідності з цим винаходом може бути аттенуирован будь-який тип бактерій, хоча кращою є аттенуация патогенних бактерій хребетних тварин і, зокрема, патогенних бактерій птахів.

Бактерії

В одному варіанті здійснення, винахід відноситься до живих аттенуированним бактеріям, але не обмежується ними, пологів Actinobacillus, Aeromonas, Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Listeria, Aeromonas, Pasteurella, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Ornithobacterium, Mannheimia, Vibrio, Rickettsia, Pseudomonas, Staphylococci, Ureaplasma і Pasteurella для застосування вакцини композиції. Ці бактеріальні пологи містять велику кількість видів, які є патогенними як для представників птичь�гут бути, але не обмежуються ними, Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, велика колонія і мала колонія Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum.

В одному варіанті жива аттенуированная бактерія може бути обрана з групи, що складається зE. coliабо Mycoplasma gallisepticum.

E. coliможе бути пташиної патогенноїE. coliE956, і Mycoplasma gallisepticum може бути Mycoplasma gallisepticum Ap3AS.

Персистенція в суб'єкті

Живі аттенуйовані бактерії стійко зберігаються в суб'єкті. Персистенція аттенуйованих бактерій переважно оцінюється в модельній системі захворювання суб'єкта, але може також оцінюватися в суб'єктах, яким були введені описані тут вакцинна композиція або иммуноков та/або симптомів. Альтернативно або в додаток до цього, персистенція може оцінюватися визначенням присутності аттенуированной бактерії в пробі, взятій з цього суб'єкта. Цієї пробій може бути проба тканини (наприклад, крові, шкіри, волосся, внутриротового зіскрібка) або проба біологічної секреції або екскреції, наприклад, слизу, сечі, фекалій, слізної рідини. Проби можуть братися за життя суб'єкта або при аутопсії або розтині трупа. Присутність аттенуйованих бактерій в пробі може оцінюватися за допомогою культивування, молекулярних методів, таких як ELISA або PCR, або будь-яким способом, відомим в даній області. Крім того, обстеження уражених зон суб'єкта при аутопсії або розтині трупа може також дозволити визначення того, що аттенуированная бактерія продовжує існувати в суб'єкті.

ABC-транспортери

Транспортери АТФ-зв'язує касети (ABC-транспортери) утворюють одне з найбільших суперсемейств білків і генів з характерними представниками у всіх типах (филюмах) від найпростіших до людини. ABC-транспортери є трансмембранними білками, які використовують АТФ для транспорту речовин з певними функціями через клітинні мембрани. Ці речовини включають метабозделяются на три основні групи залежно від типу субстрату, який транслоцирует кожен з них. Цими групами є транспортери білків, транспортери пептидів і системи, які транспортують небелковие субстрати.

У відповідності з цим винаходом живі аттенуйовані бактерії можуть бути отримані мутацією щонайменше одного гена АВС-транспортера будь-якого з цих класів, так що бактерія позбавлена щонайменше одного функціонального АВС-транспортерного білка.

Особливий інтерес представляють ABC-пептидні транспортери, які включають, наприклад, CvaB (E. coli), CylB (Enterococcus faecalis), SpaB (Bacillus subtilis), NisT (Lactococcus lactis 6F3), EpiT (Staphylococcus epidermidis), Кома (Streptococcus pneumoniae), PedD (Pedіococcus acidilactici), LcnC (Lactococcus lactis subsp. lactis), McbEF (E coli) OppD і DppD (E. coliі M. gallisepticum) та їх гомологи в інших видах.

Суб'єкти

Передбачається, що суб'єктом, якому повинні вводити живі аттенуйовані бактерії, може бути будь-хребетна тварина, що включає людей, ячих, собачих, котячих, козлиних, овечих, свинячих, верблюдових, кінських і пташиних. Суб'єктом коров'ячих може бути корова, бик, бізон або буйвол. Суб'єктом собачих може бути собака. Суб'єктом котячих може бути кішка. Суб'єктом козлиних може бути коза. Суб'єктом овечих може бути вівця. Суб'єктом свин�убъектом кінських може бути кінь, осел, зебра або мул. Суб'єктом пташиних може бути будь-який з вирощених комерційно або домашніх представників сімейства пташиних. Зокрема, суб'єктом пташиних може бути курка (у тому числі карликові кури бентамкі), індичка, качка, гусак, фазан, перепілка, куріпка, голуб, цесарка, африканський страус ему або павич.

Мутації

Мутаціями, використовуваними для створення нефункціонального АВС-транспортерного білка, можуть бути инсерционние, делеционние мутації або мутації з замінами або їх комбінація, за умови, що мутація призводить до порушення експресії функціонального АВС-транспортерного білка. АВС-транспортерні білки можуть мати множинні функції, наприклад, зв'язування АТФ або зв'язування олигопептидов. Нефункціональний АВС-транспортерні білок включає АВС-транспортерні білок, який є дефектним щонайменше однієї з його функцій.

Такою мутацією може бути инсерционная мутація, делеционная мутація, мутація із заміною або їх комбінація, за умови, що ця мутація призводить до порушення експресії функціонального АВС-транспортерного білка. У кращому варіанті ця мутація є мутацією з нокаутом, де щонайменше істотна частина Ѓчена, наприклад, гомологічною рекомбінацією, транспозонним мутагенезом або ST-мутагенезом (використовують в якості міток певні послідовності).

Живі аттенуйовані бактерії для застосування згідно винаходу можуть бути отримані різними шляхами. Наприклад, живі аттенуйовані бактерії можуть бути отримані обробкою бактерій дикого типу мутагенними агентами, такими як аналоги пуринів або піримідинів, ультрафіолетове випромінювання, іонізуюча радіація, ДНК-интеркалирующие агенти, температурна обробка, транспозонний мутагенез. Ці способи не націлюють мутації на специфічні гени, і, отже, вимагають скринінгу оброблених бактерій на аттенуацию способами, відомими в даній галузі, такими як аналіз послідовності ДНК генів-мішеней у комбінації з дослідженнями патогенності.

Технологія рекомбінантних ДНК, використовуючи відомі способи, такі як сайт-спрямований мутагенез, може бути використана для введення мутації в заданому сайті конкретного гена, наприклад,oppD. Сайт-спрямований мутагенез може бути використаний для введення мутації, такий як инцерция, делеція, заміна одного або кількох нуклеотидів, так що мутірованний ген улецией ряду нуклеїнових кислот.

Делеції лише єдиного підстави, що створюють, отже, зсув рамки, можуть робити АВС-білок нефункціональним. В деяких варіантах великі кількості підстав делетировани. В інших варіантах можуть бути делетировани більшість генів або всі з генів, що кодують АВС-транспортерні білок. Мутації, які вводять стоп-кодон або поизводят зсув рамки, придатні для одержання нефункціонального АВС-транспортерного білка.

Гени, що кодують АВС-транспортерні білки, що містять не тільки кодує послідовність, але включають також регуляторні послідовності, наприклад, промотори. Гени включають також райони, істотні для корекції трансляції мРНК, наприклад, сайти зв'язування рибосом. Таким чином, живі аттенуйовані бактерії можуть містити мутації не тільки у кодують районах, а також чи альтернативно в послідовностях, істотних для транскрипції і трансляції, таких як промотори і сайти зв'язування рибосом.

На відміну від аттенуйованих бактерій, створених спонтанними мутаціями, аттенуйовані бактерії, створені такими мутаціями, як делетирование фрагментів генів АВС-транспортерів або делетирование повних АВС-транспортернися в тому, що вони не ревертируются у патогенні бактерії дикого типу. Таким чином, в кращому варіанті здійснення винахід забезпечує живі аттенуйовані бактерії, у яких щонайменше один АВС-транспортерні ген містить инсерцию та/або делецию.

Аттенуйовані бактерії, що експресують гетерологичние антигени

В одному варіанті здійснення живі аттенуйовані бактерії можуть бути використані в якості носіїв для гетерологічних генів, які кодують антигени інших патогенних бактерій або вірусів. Це дозволяють використовувати живі аттенуйовані бактерії для викликання імунної реакції щодо безлічі захворювань.

Ген, що кодує АВС-транспортерні білок, може бути використаний в якості сайту інсерції для гетерологічних генів. Застосування гена АВС-транспортера в якості інсерції є вигідним, так як инсерция послідовності, що кодує гетерологичний антиген, як інактивує АВС-транспортерні білок, так і вводить послідовність, що кодує один або кілька гетерологічних антигенів. Конструювання таких рекомбінантних бактерій може виконуватися рутинно, з використанням стандартних способів, відо�иями, обраним родів Avibacterium, Staphylococcus, Escherichia, Brucella, Salmonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Haemophilus, Ornithobacterium, Mannheimia, Pasteurella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Rickettsia, Ureaplasma і Streptococcus, які не продукують функціональний АВС-транспортер і в які инсертирована гетерологічних нуклеїнова кислота. Гетерологічних нуклеїнова кислота може кодувати антиген, вибраний з іншого патогенного мікроорганізму або вірусу. Нуклеїнова кислота може кодувати антиген або антигени з патогенних організмів, вибраних з групи, що включає Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma gallisepticum або Mycoplasma synoviae, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, велику колонію і малу колонію Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum або вірус�овируса, віспи птахів, інфекційного бурсального захворювання, вірусу інфекційного ларинготрахеїту, пташиного грипу, вірусу гепатиту качок, вірусного чуми качок, інфекційної курячої анемії і вірусу хвороби Марека.

В іншому варіанті здійснення ген АВС-транспортера може бути повністю або частково замінений нуклеїнової кислотою, кодує білок, який виконує функцію запуску або посилення імунної реакції, наприклад, інтерлейкін або інтерферон.

Вакцинні композиції

Живі аттенуйовані бактерії придатні для застосування в вакцинних композиціях. Вакцинна композиція може містити иммуногенно ефективне кількість живої аттенуированной бактерії, здатною стійко зберігатися в суб'єкті, та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. Описані тут вакцинна композиція або імуногенні композиції можуть вводитися інтраназально, офтальмически, внутрішньошкірно, внутрішньочеревно, внутрішньовенно, підшкірно, перорально, за допомогою аерозолю (спрей-вакцинація), через клоаку або внутрішньом'язово. Зокрема, введення у вигляді очних крапель або аерозолю є кращим, коли суб'єктом є птахи. Аерозольне введення є особливо бажаним для�астоящее винахід забезпечує живі аттенуйовані вакцинні композиції для запобігання або лікування тварин і людини проти інфекції бактерією, неаттенуированная форма якої містить ген АВС-транспортера.

Фармацевтично прийнятний носій або розріджувач може бути обраний із групи, що складається з води, сольового розчину, культуральної рідини, стабілізаторів, вуглеводів, білків, білковмісні агентів, таких як бичача сироватка або знежирене молоко, і буферів або їх комбінації.

Стабілізатором може бути SPGA (на літр, SPGA містить 74,62 г сахарози, 0,52 г KH2PO4, 1,25 г K2HPO4, 0,912 г глутамату калію і 10 г сироваткового альбуміну). Вуглеводами, застосовними в якості фармацевтично прийнятного носія або розріджувачів, є, наприклад, сорбіт, маніт, крохмаль, сахароза, глюкоза, декстран або їх комбінації.

Додатково, білки, такі як альбумін або казеїн, або белоксодержащие агенти, такі як бичача сироватка або знежирене молоко, можуть бути застосовні в якості фармацевтично прийнятного носія або розріджувачів.

Буфери як фармацевтично прийнятного носія або розріджувачів можуть бути обрані з групи, що включає малеат, фосфат, CABS (4-(циклогексинамино)-1-бутансульфоновую кислоту), пиперидин, гліцин, цитрат, глицилглицин, малат, форміат, сукцинат, ацетат, пропіонат, п�нову кислоту), гістидин, біс-трис (2,2-біс(гідроксиметил)-2,2',2"-нитрилотриэтанол), фосфат, етаноламін, ADA (N-(2-ацетамідо)иминодиуксусную кислоту, N-(карбамоїлметил)иминодиуксусную кислоту), карбонат, ACES (N-(2-ацетамідо)-2-аминоэтансульфоновую кислоту), PIPES (1,4-пиперазиндиэтансульфоновую кислоту), імідазол, BIS-TRIS-пропан (1,3-біс[трис(гідроксиметил)метиламино]пропан), BES (N,N-біс(2-гідроксіетил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту), HEPES (4-(2-гідроксіетил)піперазин-1-этансульфоновую кислоту), TES (2-[(2-гідрокси-1,1-біс(гідроксиметил)етил)аміно]этансульфоновую кислоту), MOPSO (3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновую кислоту), MOBS (4-(N-морфолино)бутансульфоновую кислоту), DIPSO (3-(N,N-біс[2-гідроксіетил]аміно)-2-гидроксипропансульфоновую кислоту), TAPSO (2-гідрокси-3-[трис(гідроксиметил)метиламино]-1-пропансульфоновую кислоту), TEA (триетаноламін), пірофосфат, HEPPSO (гідрат (4-(2-гідроксіетил)піперазин-1-(2-гидроксипропансульфоновой кислоти)), POPSO (дигідрат піперазин-1,4-біс(2-гидроксипропансульфоновой кислоти), трицин, гідразин, глицилглицин, TRIS (трис(гідроксиметил)аминометан), EPPS (4-(2-гідроксіетил)-1-пиперазинпропансульфоновую кислоту), бицин, HEPBS (N-(2-гідроксіетил)піперазин-N'-(4-бутансульфоновую кислоту)), TAPS ([(2-гидродроксиметил)метил-4-аминобутансульфоновую кислоту), AMPSO (N-(1,1-диметил-2-гідроксіетил)-3-аміно-2-гидроксипропансульфоновую кислоту), таурин, борат, CHES (2-(циклогексиламино)этансульфоновую кислоту), AMP (2-аміно-2-метил-1-пропанол), гліцин, гідроксид амонію, CAPSO (3-(циклогексиламино)-2-гідрокси-1-пропансульфоновую кислоту), карбонат, метиламин, піперазин, CAPS (3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновую кислоту) або будь-яку їх комбінацію.

З додаванням стабілізаторів вакцинна композиція придатна для ліофілізації або висушування заморожуванням у відповідності зі способами, відомими в даній галузі. Таким чином, в одному варіанті здійснення вакцинна композиція є висушеної виморожуванням або ліофілізованої.

В деяких варіантах вакцинна композиція може містити принаймні одне з'єднання, що має ад'ювантну активність. Приклади ад'ювантів, придатних для застосування в вакцинних композиціях, можуть бути обрані з групи, що включає повний ад'ювант Фрейнда або неповний ад'ювант Фрейнда, вітамін Е, неіонні блоксополимери, мурамилдипептиди, сапоніни, мінеральне масло, рослинна олія, гідроксид алюмінію карбопол, фосфат алюмінію, оксид алюмінію, масляні емульсії (наприклад, Bayol F® або Marcol 52®), сапоніни або солюбилЕодержать ад'юванти, застосовуються, зокрема, для мукозного застосування, наприклад, термолабильний токсинE. coliабо холерний токсин.

Вакцинні композиції даного винаходу можуть бути приготовлені у вигляді аерозолів (спрей-вакцин).

Вакцинні композиції даного винаходу можуть бути приготовані для офтальмического застосування, наприклад, у формі очних крапель. Наприклад, ці очні краплі можуть бути водними очними краплями, неводними очними краплями, суспензионними очними краплями або эмульгированними очними краплями. Приготування цих очних крапель проводять суспендированием живих аттенуйованих бактерій у водному розчиннику, такому як стерилізована дистильована вода, фізіологічний сольовий розчин або т. п., або в неводному розчиннику, такому як рослинна олія, включаючи бавовняна олія, соєва олія, кунжутна олія, арахісова олія, мінеральне масло або т. п. Необов'язково можуть бути додані изотонирующие агенти, рН-коригувальні агенти, загусники, суспендирующие агенти, емульгатори і консерванти.

Изотонизирующие агенти, наприклад, хлорид натрію, борну кислоту, нітрат натрію, нітрат калію, D-маніт, глюкозу. рН-Коригувальні агенти включають борну кислотцетат калію, карбонат натрію, буру і будь-які з перерахованих тут буферів. Загусники можуть бути обрані з групи, що включає метилцелюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, полівініловий спирт, натрій-хондроїтинсульфатів, полівінілпіролідон або будь-яку їх комбінацію.

Суспендують агент може бути обраний із групи, що включає полісорбат 80, гідрогенізована полиоксиэтилированное рицинова олія 60, полиоксикасторовое масло або їх комбінації. Додатково, приклади емульгаторів включають лецитин жовтка яйця і полісорбат 80. Крім того, можуть бути використані консерванти, такі як хлорид бензалконію, хлорид бензетония, хлорбутанол, фенілетиловий спирт, п-гидроксибензоати або їх комбінації.

Доза

Підлягає введенню доза, як правило, варіюватися залежно від віку, маси і тварини, підлягає вакцинації, поряд зі способом введення і типом патогена, проти якого потрібна вакцинація.

Ця вакцинна композиція може містити будь-яку дозу бактерій, достатню для викликання імунної реакції. Наприклад, дози можуть містити від щонайменше 103до приблизно 105аттенуйованих бактерій, або від приблизно 105до приблизитрованних бактерій, або від приблизно 109до приблизно 1011аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1011до приблизно 1013аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1013до приблизно 1015аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1015до приблизно 1017аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1017до приблизно 1019, або щонайменше приблизно 1019аттенуйованих бактерій.

В одному варіанті здійснення, вакцинна композиція може доставлятися у вигляді аерозолю. Доза для обробки 1 кубічного метра може містити від щонайменше 106до приблизно 108аттенуйованих бактерій або від приблизно 108до приблизно 1010аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1010до приблизно 1012, або від приблизно 1012до приблизно 1014аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1016до приблизно 1018аттенуйованих бактерій, або від приблизно 108до приблизно 1020аттенуйованих бактерій, або щонайменше приблизно 1020аттенуйованих бактерій.

але, через клоаку, внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, підшкірно, перорально, за допомогою аерозолю (спрей-вакцинація), у питній воді, в кормі або внутрішньом'язово. Для застосування до свійської птиці, бажаним є аерозольний введення або введення у вигляді очних крапель.

Спрей-вакцинування є особливо доцільним, так як воно робить можливою вакцинацію великих кількостей суб'єктів простим розпиленням або створенням аерозолю вакцини композиції в присутності підлягають вакцинації суб'єктів. Розпорошення вакцини композиції створює аерозоль цієї вакцини композиції (живих аттенуйованих бактерій), і при інгаляції цього аерозолю тваринами живої аттенуірований вірус потрапляє в тварину і вторгається в дихальні шляхи, імітуючи распираторное захворювання. Цей спосіб вакцинації є особливо ефективним, оскільки трудомістка, віднімає час опрацювання окремих тварин не є необхідною.

Даний винахід буде тепер описано більш докладно з посиланням на такі конкретні приклади, які не повинні розумітися як обмежуючі яким-небудь чином обсяг винаходу.

Приклади

Приклад 1: Створення та ідентифікація бібліотеки мутЀования та ідентифікації бібліотеки мутантів M. gallisepticum. STM-стратегія показано на фіг.1. Унікальні ДНК-мітки вбудовують в транспозон, який використовують для трансформації патогенів, що призводить до випадкової інсерції сигнатурной мітки в геном. Час від часу, сигнатурная мітка (Фіг.1A) може інтегруватися в ген і інактивувати ген з утворенням інсерційної мутації. Потім використовують спосіб негативного відбору для скринінгу пулу ST-мутантів відповідної моделі тварини. Вводиться пул і ST-мутанти, витягнуті з тварини, порівнюють за допомогою ПЛР-ампліфікації індивідуальних міток з подальшою гібридизацією. Цей спосіб ідентифікує окремі мутанти, які присутні під вводиться (перед відбором) пулі, але зникають з пулу, витягнутого після переходу в суб'єкта (тварина) (фіг.1В). Найбільш ймовірно, що відсутні мутанти містять мутації в генах, відповідальних за колонізацію і зростання в суб'єкті, і, отже, ці гени, мабуть, кодують пов'язані з вірулентністю детермінанти.

Матеріали і способи

Бактеріальний штам і умови культивування

M. gallisepticum (Mg) Ap3AS був спочатку виділений з альвеолярних мішечків бройлерної курки в Австралії і є високо патогенним. Його виращиЄази (рН приблизно 6,8).

Мічені сигнатурою транспозони

Бібліотеку ST-мутантів готували з використанням плазміди pISM 2062.2, несучої транспозон Tn4001mod, який містив ген стійкості до гентаміцину. Кожна сигнатурная мітка складалася з унікальною олигонуклеотидной ДНК-послідовності 40 п. н. ([NK]20; N = A, C, G або T; K = G або T), фланкированной двома незмінними плечима 20 п. н., які роблять можливими ампліфікацію і мічення унікальних районів за допомогою ПЛР з використанням пари праймерів P2/або P3 P4/P5. Сигнатурну мітку клонували в сайт рестрикціїKpnI pISM 2062.2 (фіг.1А). Послідовності індивідуальних сигнатурних міток наведено у списку в таблиці 1.

Таблиця 1
ДНК-послідовності сигнатурних міток, що використовуються в цьому дослідженні
*ДНК-послідовність унікального олигонуклеотида без незмінних плечей
#набір праймерів P2/P4 генерували з незмінних плечей�">

Мічений сигнатурою мутагенез

Трансформація сигнатурними мітками

Розведення Mg Ap3AS вирощували в 1,5 мл MB протягом ночі при 37°С. Розведення, виявляють зміна забарвлення, об'єднували, і клітини осаджували центрифугуванням протягом 5 хвилин при 16000 g при кімнатній температурі. Ці клітини ресуспендували в 200 мкл охолодженого HEPES-сахарозного буфера (8 мМ HEPES, 272 мМ сахароза (pH 7,4)). Клітини осаджували центрифугуванням протягом 5 хвилин при 16000 g при кімнатній температурі і промивали ще два рази охолодженим HEPES-сахарозним буфером, потім остаточно ресуспендували в 400 мкл HEPES-сахарозного буфера, охолодженого до 4°С.

Аликвоту клітин 100 мкл поміщали на лід і додавали 10 мкг плазмідної ДНК. Потім суміш клітин-плазмідної ДНК переносили в охолоджену gap-кювету 0,2 см (Bio-Rad) на льоду і відразу ж электропорировали з використанням Gene Pulser™ (Bio-Rad) з установками 2,5 кВ, стійкістю 100 Ω і ємністю 25 мкФ. Потім электропорированние клітини обережно ресуспендували в 1 мл охолодженого (4°С) МВ і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин з подальшою інкубацією при 37°С протягом 2-3 годин, в залежності від того, було чи зміна забарвлення. Пробу 500 мкл элеванием, і надлишок видаляли за допомогою пастерівської піпетки. Потім чашку сушили і інкубували при 37°С протягом 7-10 днів в герметичній посудині.

Підтвердження ST-мутантів

Mg-колонії, що ростуть на чашках, відбирали з використанням пастерівської піпетки, поміщали в 1 мл МВ, який містить гентаміцин (160 мкг/мл), і цю культуру інкубували, поки середовище не виявляла зміна забарвлення. Клітини з об'єму 200 мкл культури осаджували центрифугуванням микрофужной пробірці при 16000 g протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, й осад ресуспендували в однієї десятої початкового об'єму дистильованої води. Потім клітини нагрівали при 100°С протягом 5 хвилин, і 2 мкл з них використовували в якості матриці для ПЛР. Для підтвердження присутності ST-транспозона використовували праймери Р2 і Р4 (таблиця 2) для ампліфікації району в незмінних плечах, які містили унікальну послідовність (фіг.3). ПЛР проводили в реакційному об'ємі 20 мкл, і вона містила 2 мкл 10 × реакційного буфера, 1 мкМ кожного праймера, 200 мкМ кожного dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 1,5 Е ДНК-полімерази Taq (Promega) і 2 мкл матричної ДНК. Реакції виконували в термоциклере (Omnigene, Hybaid) з одним циклом при 98°C протягом 2 хвилин, з подальшими 35 циклами 94°C протягом�Р-продукти піддавали електрофорезу в 2% агарозному гелі разом зі стандартами розмірів (pUC18, розщепленої HaeIII).

Таблиця 2
Олигонуклеотиди, використовувані в дослідженнях STM
Рядкова буква вказує модифікацію нуклеотиду для отримання сайту розщеплення рестрикційної ендонуклеази.

Визначення точок інсерції транспозона

Виділення ДНК зST-мутантів

Кожен ST-трансформант вирощували в 40 мл MB, доповненого 160 мкг гентаміцину/мл, при 37°С до пізньої логарифмічної фази (pH приблизно 6,8). Клітини збирали центрифугуванням при 20000 g протягом 30 хвилин і промивали двічі в охолодженому PBS, додавали SDS для лізису цих клітин, і потім розчин пропускали через голку калібру 26 для гідродинамічного фрагментованість геномної ДНК. Екстракцію геномної ДНК виконували з набором HighPure PCR (Roche) згідно з протоколом виробника, з мінорними модифікаціями. Початкову обробку лізоцимом опускали і ДНК элюи�ством електрофорезу проби 1 мкл у 0,7% агарозному гелі разом зі стандартами молекулярної маси відомої концентрації (ДНК фага λ, розщепленоїHindIII).

Секвенування ДНК генома

Процедура для секвенування ДНК генома було адаптовано та модифіковано відповідно до Wada (2000). Праймер IGstmGenmeF3 (таблиця 2), який зв'язується з Tn4001, використовували для секвенування через точку з'єднання транспозон-геномна ДНК і геномну ДНК Ap3AS. Цю послідовність визначали з використанням хімічного способу ABI PRISM Big Dye 3.1 Terminator (Applied Biosystems Incorporated). Кожна реакційна суміш складалася з 2-3 мкг очищеної геномної ДНК, 10 мкМ праймера і 4 мкл суміші ферментів Big Dye 3.1, і циклічне секвенування виконували в iCycler™ (Bio-Rad) з використанням одного циклу при 95°C протягом 5 хвилин, з подальшими 60 циклами 95°C протягом 30 секунд, 55°C протягом 30 секунд і 60°C протягом 4 хвилин. Потім продукт очищали відповідно з рекомендаціями виробника і потім аналізували з використанням капілярного секвенатора ABI 3100 і релевантного програмного забезпечення (Applied Biosystems Incorporated). Сайт інсерції для кожного ST-транспозона визначали з використанням програми BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI) або версії 3.3t07 FASTA (Pearson and Lipman, 1988) для порівняння ДНК-послідовності з послідовністю геному штаму M. gallisepticum Rlow.

Детектировигонуклеотиди ресуспендували в буфері ТІ до концентрації 100 мкМ. Обсяг 10 мкл розчину кожного олигонуклеотида (містить 3 пикомоля) наносили у вигляді плям на нейлонову мембрану Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech) з використанням приладу для мікрофільтрації Bio-Dot SF® (Bio-Rad) у відповідності з інструкціями виробника, і потім олигонуклеотиди фіксували на мембрані УФ-зшиванням протягом 3 хвилин. Синтезували ДНК-зонди, відповідні кожній сигнатурной мітці, з використанням описаної вище ПЛР-реакції, за винятком того, що олігонуклеотидні праймери P2 і P4 були комерційно позначені дигоксигенином (DIG) (Roche). DIG-мічені зонди гибридизовали з мембранами в буфері DIG Easy Hyb (Roche) протягом 16-18 годин при 40°C у встряхиваемой водяній бані, і потім мембрани промивали у відповідності з інструкціями виробника, за винятком того, що другу промивку виконували при 45°C. Пов'язані зонди детектировали з використанням набору для люмінесцентного детектування DIG (Roche), і детектування реєстрували з використанням плівки Biomax (Kodak). Проводили також ПЛР для підтвердження присутності гена стійкості до гентаміцину та виду трансплантата мікоплазми. Кожну ПЛР-реакцію виконували з використанням 1,5 Е ДНК-полімеразиTaqв 25 мкл реакційної суміші, що містить 1,5 мМ MgCl2

Перехресна гібридизація між сигнатурними мітками з використанням системи детектування DIG

Пул DIG-мічених сигнатурних міток гибридизовали з однією мембраною, що містить 37 олігонуклеотидів з сигнатурними мітками, як описано вище. Можна було очікувати, що DIG-мічені мітки будуть зв'язуватися тільки з відповідними унікальними олигонуклеотидами, якщо б не було перехресного гібридизації між цими мітками і зондами. Наприклад, очікувалося, що пул, що містить мічені Tag 02, 03 і 04, зв'язується з олигонуклеотидними мітками Tag 02, 03, 04 на дот-блоті, і будь-які інші позитивні реакції повинні були розглядатися як перехресні реакції. Реакції перехресної гібридизації оцінювали з використанням 13 різних пулів мічених сигнатурних міток.

Предварит�тво життєздатних клітин кожної культури ST-мутантів, вимірюється у вигляді одиниць зміни забарвлення на мл (CCU/мл), визначали з використанням наступної процедури. У кожну лунку стерильного 96-лункового микротитрационного планшета (Nunculon, Nunc) додавали 225 мкл стерильного MB, який містить гентаміцин (160 мкг/мл). До першого стовпця з 8 лунок додавали 25 мкл культури мутанта в кожну лунку, перемішували кілька разів пипетированием, і 25 мкл з кожної лунки переносили в наступний стовпець і перемішували з використанням свіжого набору кінчиків піпеток. Цю послідовність серійних 10-кратних розведень повторювали до стовпця 10, з якого викидали 25 мкл. Стовпці лунок 11 і 12 використовували в якості негативних контролів. Потім цей планшет герметизували з використанням Linbro® plate seal (ICN Biochemicals) і інкубували при 37°C протягом періоду до 2 тижнів. Зниження рН середовища відображало зростання цієї культури і вказувалося зміною забарвлення з червоної до жовтої фенолового червоного індикатора в середовищі. Стовпець 1 розглядали як розведення 1/10, і після корекції на початкові розведення культури розраховували кількості CCU/мл з використанням таблиць найбільш ймовірних кількостей. Доза кожного трансформанта, необхідна для інокуляції курей, була 1×107CCU/м�елий леггорн утримували в ізоляторі зі склопластику з позитивним тиском (тиском вище атмосферного). Серію розведень десяти ST-мутантів вирощували протягом ночі в микротитрационном планшеті в МВ, який містить гентаміцин при 160 мкг/мл (таблиця 3). Зростання кожного клону оцінювали на наступний день, і 100 мкл брали з розведення, що оцінюється як розведення, яке перебуває в логарифмічній фазі, і додавали до пулу. Потім об'єднані ST-мутанти розводили ще у десять разів на МВ, і цей об'єднаний пул використовували в якості інокулята. Дванадцять з шістнадцяти курей інфікували об'єднаними ST-мутантами введенням у вигляді аерозолю. Решта 4 птиці служили в якості контролю в контакті і були поміщені в ізолятор 3 дні після аерозольного інфікування. Шість з інфікованих аерозолем птахів эвтанизировали, та брали проби через 14 днів після інфікування, і те ж саме виконували щодо інших птахів, в тому числі всіх знаходяться в контакті птахів, через 28 днів після інфікування.

Таблиця 3
Тестовані транспозони
ST-мутант% гена до точки інсерції
02-1(68,3)
(0,2)
06-154,6
09-160,3
17-180,1
19-188,6
32-152,0
35-176,4
37-120,5

Збір і аналіз проб

Проби крові збирали у всіх птахів перед аерозольним інфікуванням і перед евтаназією і залишали для згортання при кімнатній температурі на 3 години. Потім збирали сироватку центрифугуванням проби при 10000 g протягом 5 хвилин при кімнатній температурі і потім тестували за допомогою RSA-тесту для визначення реакцій у вигляді антитіл проти M. gallisepticum. RSA-тест виконували змішуванням 25 мкл нерозведеної сироватки і 25 мкл пофарбованого комерційного антигену Mg RSA (Intervet International) на скляній чашці і хитанням протягом 1 хвилини. Тест оцінювали в балах від 0 (відсутність агрегації) до 4 (великі скупчення антигену). Кожен тест включав як негативну сироватку, так і позитивну сироватку в якості ко�ярних мішечків і оцінювали в балах на тяжкість за шкалою 0-3 наступним чином:

0 = відсутність пошкоджень, тонка прозора плівка альвеолярних мішечків;

1 = малі плями сирнистого (кавеозного) фібрину, приєднані до цих альвеолярним мішечків;

2 = альвеолярні мішечки здаються каламутними і потовщеними, з помірними кількостями сирнистого фібрину, приєднаними до альвеолярним мішечків;

3 = потовщені альвеолярні мішечки і поверхня, покрита товстим сирнистий фібрином.

Оцінка півбала давалася щодо ушкоджень, які знаходяться між цими визначеннями. Реєстрували бальні оцінки для альвеолярних мішечків лівої і правої передньої торакальної частини, альвеолярних мішечків лівої і правої задньої торакальної частини і лівих і правих черевних альвеолярних мішечків. Суму цих шести бальних оцінок використовували як кінцевої бальної оцінки для кожної окремої птиці. Брали мазки з альвеолярних мішечків, трахеї, легенів, селезінки, печінки, нирок та головного мозку кожної птиці. Мазки використовували для інокуляції планшетів МА, що містять 160 мкг гентаміцину/мл, а також планшета МА без гентаміцину, і потім поміщали в 3 мл МВ, доповненого гентаміцином при 160 мкг/мл Планшети MA інкубували при 37°С і досліджували з использотранспозона Tn4001 з деяких мутантів під час експериментів in vivo через 14 днів після інокуляції. Ці мутанти відновлювали фенотип дикого типу, але не могли виживати при тиску відбору гентаміцину. Коли кількості колоній на чашках, не містять гентаміцину, були в десть або більше разів більшими, ніж кількості колоній на чашках, що містять гентаміцин, підозрювали втрату транспозона. МВ-культури інкубували при 37°С, і ДНК екстрагували з бульйонів, виявляють зміна забарвлення, і використовували в якості матриці ПЛР, як описано вище, для ампліфікації унікальних районів мітки з використанням пари праймерів P2/P4.

Результати

Підтвердження ST-мутантів

Очікуваний розмір ПЛР-продукту, що генерується з сигнатурних міток з використанням пари праймерів P2/P4, знаходився між 79 і 81 п. н., за винятком розміру продукту ПЛР з Tag 25, який був дорівнює 67 п. н. Кожну плазміду, що містить сигнатурну мітку, вводили в штам Mg Ap3AS, і відбирали трансформантів випадковим чином і вирощували в середовищі, доповненої гентаміцином. Всі МВ-культури, виявляють зростання, піддавали ПЛР для детектування присутності ST-мутанта, який містить унікальну сигнатурну мітку (фіг.2). Встановлювали бібліотеку ST-мутантів з щонайменше 9 трансформантами, що генеруються з кожної �зона

Сайт інсерції транспозона для кожного з десяти Mg ST-клонів, використаних у дослідженнях, описаних у цій частині, визначали прямим секвенированием геномної ДНК (таблиця 3). Транспозони инсертировались в райони, що кодують або унікальні, або консервативні гіпотетичні білки в п'яти ST-мутантів.

Оптимізоване детектування ST-мутантів

Перехресна гібридизація між сигнатурними мітками

Більшість міток були специфічними, тільки з невеликою перехресної гібридизацією з олигонуклеотидами, комплементарними іншим мітках. Була сильна перехресна реакція між Tag 02 і 37 (в пулах A, E, G і H). Деяку перехресне гібридизацію детектировали також між Tag 15 і 30 (в пулах D, I і J), але не детектировали перехресної гібридизації з пулом Ст. Була одностороння гібридизація між Tag 13, коли вона була присутня в пулі, і Tag 28. Це можна бачити з Tag 29 і 23 (пули D і H) і Tag 29 і 24 (пули D та H).

Попереднє оцінювання інфекції курей з ST-мутантами

Серологічне тестування та макроскопічне дослідження альвеолярних мішечків

Реакції анти-M. gallisepticum-антитіла визначали за допомогою RSA (таблиця 4) до і після інфікування. До ін�е птахи мали бальні оцінки RSA, більш високі, ніж бальна оцінка за 2 тижні після інфікування, і всі птахи були позитивними через 4 тижні після інфікування, з бальними оцінками RSA між 1 і 4. Тільки один з контролів в контакті мав бальну оцінку RSA 1. Слабкі пошкодження альвеолярних мішечків (бальна оцінка 0,5) спостерігали у 2 птахах з 6 птахів через 2 тижні після інфікування і в 3 птахів з 6 птахів за 4 тижні після інфікування, у той час як одна птиця мала важкі пошкодження черевних альвеолярних мішечках (бальна оцінка 2,5). Тільки один з контролів в контакті мав слабкі пошкодження (бальна оцінка 0,5). Детальні результати показані в таблиці 4.

Таблиця 4
ST-мутанти, отримані з різних сайтів у птахів в попередньому експерименті
ЧасПтахиRSAАльвеолярні мішечкиТрахеяЛегкеСерцеСе�lign="center" namest="c18" nameend="c19">Головний мозок
ПошкодженняМАMBМАMBМАMBМАMBМАMBМАMBМАMBМАMB
74400----------------
Тиждень 2
74510,5----------------
74610,5-37*+35, 37--------
74700---32------------
74800--+32---------75100---32, 37------------
74110-----+------
Тиждень 4
74210---------+-35
74320,5-32+32-----+------
74942,5+-+----+---+-+10--+35---+-+---+--
75721,0-37+37-------+----
73700-------------+-+
Контроль в контакті (Тиждень 4)73800-забр.-02---------+--
73900---------------1">0,5---------------+
RSA: швидка аглютинація сироватки забр.: забруднена культура
* Детектированний tag ID згідно гібридизації і позитивний згідно ПЛР на наявність гена гентаміцину і гена Mg 16s рРНК.
+: показує, що Mg-колонії росли на МА або що зміна забарвлення спостерігали в МВ.
-: не спостерігали зростання на чашці МА або в МВ.

Реверсія і ідентифікація виділених ST-мутантів

MA-чашки випробовували на ріст M. gallisepticum в присутності та у відсутності гентаміцину. Не виявляли втрати транспозона з ST-мутантів після пасажу in vivo. M. gallisepticum виділяли тільки на МА-чашках, інокульованих мазками альвеолярних мішечків однієї птиці і трахей двох птахів за 2 тижні після інокуляції, і трахей чотирьох ку�ній після інфікування. M. gallisepticum не виділяли з мазків будь-якого органу в контролях в контакті (таблиця 4). Один культуральний бульйон мазка альвеолярних мішечків, взятого за 2 тижні після інфікування, і чотири з трахей виявляли зміна забарвлення з 3 з 10 унікальних міток, детектируемая DIG-гібридизацією з цих проб. Бульйонні культури, виявляють зміна забарвлення, отримували з мазків альвеолярних мещочков двох птахів і мазків трахей трьох птахів в день 28 після інфікування, а також з мазків інших органів, у тому числі легких п'яти птахів, сердець чотирьох птахів, печеней двох птахів, нирок трьох птахів, селезенок чотирьох птахів і головного мозку однієї птиці. Бульйонні культури, виявляють зміна забарвлення, одержували також з мазків трахей однієї птиці, нирок двох птахів і головного мозку двох птахів контролю в контакті. Однак, ПЛР, що проводяться для детектування присутності гена стійкості до гентаміцину і гена Mg 16S рРНК, в культурах, що виявляють зміна забарвлення після 21 дня інкубування, всі були негативними, що дозволяє припустити, що зміна забарвлення, що спостерігається в цих культурах, не призводило до зростання M. gallisepticum. Мутанти, несучі Tag 02, 32, 35, 37, були дійсно отримані з альвеолярних мішечків, трах�(таблиця 4). Кілька бульйонних культур виявляли зміна забарвлення в межах 7 днів після інкубування, але не були детектировани мітки DIG-гібридизацією (дані не показані).

Приклад 2: In vivo аналіз ST-мутантів M. gallisepticum

Вбудовування

STM-спосіб складається з двох основних стадій: створення бібліотек мічених мутантів in vitro і потім негативний відбір in vivo у тваринному. З використанням модифікованої системи гибридизационного детектування, описаної в прикладі 1 вище, вводиться пул містив тільки мутанти, отримані з міток, які не гибридизуются перехресно один з одним, а також дають чіткі сигнали для детектування. Бібліотеку ST-мутантів прикладу 1 генерували з використанням 37 різних мічених транспозонів. Цей приклад описує скринінг 102 ST-мутантів, що містять 34 різні мітки, для ідентифікації генів, що беруть участь у вірулентності або необхідних для виживання in vivo, з використанням негативного відбору у інфікованих курах.

Матеріали і способи

Визначення сайтів інсерції в ST-мутантів

Геномну ДНК з кожного ST-мутанта піддавали прямим секвенированию з використанням специфічного праймера (таблиця 2). Для тих ST-мутантів, иЕеквенирования після кінця транспозона, використовували блоттінг по Саузерну для визначення кількості инсерций транспозонів. Потім ST-мутанти з більш ніж однієї інсерцією транспозона виключали з подальших спроб ідентифікації точок інсерції транспозонів. Зонди для блот по Саузерну готували з використанням DIG-мічених праймерів (P2 і P4) для ампліфікації району сигнатурной мітки (таблиця 2). Геномну ДНК ST-мутанта розщеплювали протягом ночі 20 Е рестрикційної ендонуклеази BglII (New England Biolabs) при 37°С, і отримані фрагменти поділяли на 0,7% агарозному гелі протягом ночі при 2,5 В/див. Потім розділені фрагменти переносили на нейлонову мембрану Hybond N+, гибридизованную з DIG-меченним зондом і гібридизацію детектировали з використанням набору для люмінесцентного детектування DIG (Roche) у відповідності з інструкціями виробника, і люмінесценцію реєстрували на плівці Biomax (Kodak).

Скринінг ST-мутантів інфікованих птахів

Приготування ST-мутантів

Серії десятикратних розведень кожного з 34 ST-мутантів, кожен з яких містив відрізняється мітку, для кожного з трьох инокулятов (Груп А, В і С) (102 мутанта в цілому для трьох експериментальних груп) готували в микротитрационних планшетах в МВ, доповнене продукувало відповідне зміна забарвлення, використовували для інокуляції. Брали пробу 0,1 мл підходящої культури кожного мутанта і змішували з культурами інших мутантів для створення об'єднаного інокулята. Потім об'єднані ST-мутанти використовували відразу ж для аерозольної інокуляції курей.

Таблиця 5
Сайти інсерції транспозонів у ST-мутантів, що утворюються у цьому дослідженні (Инокулят А)
ST-мутантСайт інсерції в геномі
(% гена до точки інсерції)
Функція зруйнованого гена
26-1MGA_0220 (34,2)АТФ-зв'язуючий білок OppD
26-2MGA_0220 (34,2)АТФ-зв'язуючий білок OppD
26-3MGA_0220 (34,2)АТФ-зв'язуючий білок OppD

Первинний скринінг

План експерименту

В цілому 90 четирехнедельних SPF-курей випадковим чином розподіляли на 3 групи, кожну з яких містили окремо (30 птахів на групу) в изЀуппе інокулював пулом ST-мутантів за допомогою аерозолю, причому решта 10 курей використовували в якості контролів в контакті, які поміщали з инокулированними птахами через три дні після подвергания дії аерозолю. Контроль в контакті використовували для дослідження здатності контактного поширення ST-мутантів. В день 14 після інфікування брали проби крові з десяти інокульованих курей, і їх эвтанизировали і досліджували щодо пошкоджень. Проби крові тестували на антитіла проти M. gallisepticum з використанням RSA-тесту, як описано нижче. Всіх птахів випробовували на макроскопічні пошкодження альвеолярних мішечків, і їх оцінювали на тяжкість за шкалою 0-3, як описано нижче. Мазки альвеолярних мішечків і трахеї кожній птиці культивували для отримання мікоплазм, як описано нижче. ДНК екстрагували з кожної бульонной культури, яка зраджувала забарвлення, і використовували в якості матриці ПЛР для ампліфікації унікального району мітки. Потім ПЛР-продукти використовували в блотах по Саузерну для ідентифікації ST-мутантів, які були присутні, як описано нижче. Чашки МА перевіряли після інкубації протягом 10 днів, як описано нижче. Інших птахів эвтанизировали, обстежили і брали проби з використанням тих же самих процедур пticum

Розведення ST-мутантів, які не були повторно виділені в первісному експерименті скринінгу, вирощували в МВ, містить 160 мкг гентаміцину/мл, при 37°С протягом ночі. Розведення кожного ST-мутанта, яке викликало відповідну ступінь зміни забарвлення, використовували для інокуляції. Пробу 0,1 мл культури кожного мутанта змішували з пробами інших мутантів, і цей пул потім розводили в десять разів у МВ для застосування в якості нового об'єднаного інокулята, який використовували для інокуляції курей допомогою аерозолю.

План експерименту

Підтверджує експеримент проводили для звуження кількості кандидатних ST-мутантів для дефинитивного тестування. План і способи цього експерименту були схожими з початковим експериментом скринінгу, який показаний на малюнку 4. В цілому сорок 4-тижневих курей SPF розподіляли на дві групи. ST-мутанти, які не могли бути детектировани в інокульованих птахів у первісному експерименті скринінгу, відносили до одного з двох инокулятов, кожен з яких використовували для інокуляції однієї з двох груп цих птахів за допомогою аерозолю. Контроль в контакті не включали в цьому експерименті. Однак усіх 40 птахів поміщали в той жеся в якості контролю в контакті для іншої групи. Збір проб виконували через 14 днів після інокуляції з використанням тих же самих процедур, описаних раніше. Коротенько, проби крові збирали перед інокуляцією і безпосередньо перед евтаназією. Мазки з альвеолярних мішечків і трахеї збиралиpost mortemдля виділення мікоплазм. Всіх птахів исседовали на макроскопічні пошкодження альвеолярних мішечків. Сироватки тестували з використанням RSA-аналізу. ДНК екстрагували з кожної бульонной культури, яка зраджувала забарвлення, і використовували в якості матриці ПЛР для ампліфікації районів унікальних міток, які потім використовували в якості зондів у дот-блот-гибридизационних аналізах. Чашки МА перевіряли після інкубації протягом 10 днів при 37°С, як описано раніше. Кілька колоній збирали з чашок МА і культивували в МВ, доповненому гентаміцином, при 37°С, поки не спостерігали зміни забарвлення. ДНК екстрагували і використовували в якості матриці ПЛР-аналізи для підтвердження виду мікоплазми ампліфікацією фрагмента 219 п. н. гена Mg 16S рРНК, як описано раніше в прикладі 1 (фіг.4).

ПЛР-підтвердження специфічних ST-мутантів, виділених з інфікованих птахів

На підставі результатів цього секвенування конструювання�х з праймером IGstmGenmeF3 для детектування кожного з ST-мутантів у культурах з інокульованих птахів. ПЛР проводили в обсягах 20 мкл, які містять 2 мкл екстрагованої ДНК в якості матриці, 2 мкл 10 × реакційного буфера, 1 мкМ кожного праймера, 200 мкМ кожного dNTP і 1,5 Е ДНК-полімерази Taq (Promega). ПЛР виконували в термоциклере (Omnigene, Hybaid), з одним циклом при 95°C протягом 2 хвилин з наступними 35 циклами 94°C протягом 45 секунд, 52°C протягом 45 секунд і 72°C протягом 1 хвилини і кінцевим инкубированием при 2°С протягом 7 хвилин.

Результати

Картування точок інсерції в ST-мутантів

Сайт інсерції транспозона визначали в 91 ST-мутант з використанням способу прямого геномного секвенування. Достовірні дані послідовності не могли бути отримані для 11 мутантів (таблиця 5). У більшості випадків сайт інсерції був одним і тим же в Групах А, В і С, і єдиними винятками є ST-мутанти 01-1, 02-2, 02-3, 04-3, 09-3 і 17-3.

ST-мутанти, які не могли бути секвенировани безпосередньо, піддавали блоттингу по Саузерну для визначення кількості инсерций транспозона. Секвенирующие хроматографи показали, що перші 100 п. н. даних, які відповідають транспозону, були даними хорошої якості, але що отримували змішані сигнали після досягнення точки з'єднання транспозона і геляет в послідовності транспозона, кількість смуг, пов'язаних цим зондом, повинне відображати, скільки разів цей транспозон присутній в геномах ST-мутантів. Множинні інсерції транспозона були підтверджені в ST-мутантів 15-1, 15-2, 15-3, 25-1, 25-2, 25-3, 34-1, 34-2, 34-3, 09-3 і 17-3 допомогою блот по Саузерну, і мутанти, що несуть одну і ту ж сигнатурну мітку, мають, мабуть, ідентичні інсерції (таблиці 5 та 6, фіг.5В).

Початковий експеримент скринінгу

Патологічні та серологічні відкриття

RSA-результати з кожної експериментальної групи показані в таблиці 7. У сироватці з будь-якої птиці у момент інокуляції не детектировани анти-мікоплазма-антитіла. Зазвичай більша кількість сироваток були позитивними при 4 тижнях, ніж за 2 тижні після інфікування, і антитіла не були детектировани в контролі в контакті ні в одній групі. Більше число птахів мали пошкодження альвеолярних мішечків за 2 тижні (2, 2 і 4 у Групах A, B і C, відповідно), ніж при 4 тижнях (0, 1 і 2 в Групах А, В і С, відповідно) після інокуляції. Більш важкі пошкодження альвеолярних мішечків спостерігали за 2 тижні після інокуляції (бальні оцінки 0,5 у Групі А, 1,0-2,0 в Групі В і 0,5-2,5 в Групі С), за винятком того, що в Групі З одна ку�очок було виявлено в Групі С. Тяжкість ушкоджень не добре корелювала з результатами RSA, тобто деякі птахи мали високі бальні оцінки RSA, але не мали детектируемая ушкоджень альвеолярних мішечків.

Таблиця 6
Класифікація сайтів інсерції транспозонів у ST-мутантів у цьому дослідженні
ST-мутантСайт інсерції транспозонаФункція
26-1/-2/-3MGA 0220АТФ-зв'язуючий білок OppD
09-3Множинні інсерції
13-1/-2/-3Немає відповідності
15-1/-2/-3Множинні інсерції
17-3Множинні інсерції
25-1/-2/-3Множинні інсерції

Таблиця 7
Результати RSA, бальні оцінки пошкодження альвеолярних мішечків і міток, детектированних в кожній експериментальній групі в первинному скринінгу
RSA*Пошкодження альвеолярних мішечків*Детектированние мітки (число випадків детектування)
ГрупаТиждень 0Тиждень 2Тиждень 4КонтрольТиждень 2Тиждень 4КонтрольАльвеолярні мішечкиТрахеяНедетектированние^
А#0/307/108/90/82/1007(3), 11(1), 12(4), 14(1), 18(1), 19(2), 20(6), 21(1), 24(6), 26(1), 27(2), 28(2), 31(1), 32(1). 35(1), 38(1), 39(1)02 (Група А, В), 03, 04, 06, 09, 10, 15, 17, 22, 23, 25, 33, 34
В0/316/109/110/102/101/110/1012(1), 20(1), 28(1)07(1), 11(1), 12(3), 14(1), 16(1), 20(6), 27(1), 28(2),
З#0/295/109/100/74/102/100/702(1), 11(1), 12(1), 16(3), 18(1), 20(7), 27(1), 28(1)01(1), 02(8), 11(1), 12(5), 13(1), 14(1), 16(3), 18(1), 20(10), 24(5), 27(6), 28(5), 36(1), 38(2)
*Кількість позитивних/кількість випробуваних. Повні дані RSA і дані бальних оцінок ушкоджень альвеолярних мішечків показані в Додатку С.
#Одна інокульована птах і два птахи в контакті померли в групі А і дві птахів� груп.

Ідентифікація виділених ST-мутантів

Результати для бульйонних культур, взятих з птахів в дні 14 і 28 після інокуляції, підсумовані в таблиці 7. Картина виділення M. gallisepticum була схожою з картиною, що спостерігається в попередньому експерименті, з великими виділеннями, отриманими з трахей, ніж з альвеолярних мішечків. Як правило, більше виділень було зроблено за 2 тижні, ніж за 4 тижні після інфікування. ST-мутанти не були повторно виділені з птахів в контакті в групі В, хоча п'ять різних ST-мутантів були повторно виділені з птахів в контакті в групі А і дві з птахів у групі С. ST-мутант, несучий Tag 20, був найбільш часто вилученими з альвеолярних мішечків, а також з трахей, і мав високу ступінь детектування у всіх трьох групах. Наступним найбільш часто виділяються мутантом був мутант, несучий Tag 28. Шістнадцять ST-мутантів, представлених 12 різними мітками, не могли бути повторно виділеними, включаючи ST-мутанти 02-1 (-2), 03-1 (-2/-3), 04-1 (-2), 04-3, 06-1 (-2/-3), 09-1 (-2), 09-3, 10-1 (-2/-3), 15-1 (-2/-3), 17 -1 (-2), 17-3, 22-1 (-2/-3), 23-1 (-2/-3), 25-1 (-2/-3), 33-1 (-2/-3) і 34-1 (-2/-3).

M. gallisepticum не був виділений на чашках МА, інокульованих мазками з альвеолярних мішечків або трахей будь курей в контакті. M. gallisepticum виділяли на чаѾдной і п'яти птахів у групах А, В і С, відповідно. Їх виділяли також на чашках МА, інокульованих мазками з трахей п'яти курей в групі С, але не з якихось птахів в групах А чи Ст. M. gallisepticum виділяли на чашках МА, інокульованих мазками, зібраними з альвеолярних мішечків чотирьох, двох і шести птахів, і з трахей однієї, двох і семи курей в групах А, В і С, відповідно, при 4 тижні після інокуляції. Майже в кожному випадку, коли мікоплазми виділяли за допомогою агарової культури, їх також виділяли за допомогою бульонной культури. Ні в одному ST-мутант не детектировали втрату транспозона.

Підтверджує експеримент скринінгу

Шістнадцять ST-мутантів, які не вдалося детектувати у первісному експерименті скринінгу, ділили на дві групи. Дані послідовності щодо сайту інсерції транспозона і блоттінг по Саузерну показали, що транспозон в ST-мутантів 04-1 і 04-2 мав один і той же сайт інсерції, але інший сайт інсерції щодо сайту інсерції 04-3. Сайти інсерції транспозона в ST-мутантів 09-1 і 09-2 були ідентичними, тоді як мутант 09-3 мав множинні інсерції. Та ж сама ситуація була виявлена також у ST-мутантів 17-1, 17-2 і 17-3. Жоден з цих мутантів не міг бути детектирован в первісної�х розрізнення. Коли була потенційна передача між цими групами, і ці три сигнатурні мітки детектировали дот-блот-гібридизацією, могла бути використана ПЛР для ідентифікації мутантів, повторно виділених з птахів.

Патологічні та серологічні оцінювання

Одна птах вмирала в групі А і одна в групі під час цього експерименту. Важкі пошкодження альвеолярних мішечків (бальна оцінка 2,5) спостерігали у однієї птиці і слабкі пошкодження (0,5 і 1,0) в інших двох курей в групі А. Одна птиця мала слабкі пошкодження альвеолярних мішечків (1,0) в групі Ст. Перед інокуляцією не було детектировано анти-M gallisepticum-антитіло. За 2 тижні після інокуляції 15 з 19 курей у групі А були RSA-позитивними, тоді як в групі В 14 з 19 курей були позитивними. Детальні результати показані в таблиці 8.

Таблиця 8
Результати RSA, бальні оцінки пошкоджень альвеолярних мішечків і міток, детектированних в кожній експериментальній групі у підтримуючому скринінгу
RSA*Пошкодження альвеолярних мішечківГрупаТиждень 0Тиждень 2Тиждень 2Альвеолярні мішечкиТрахеяНедетектированние^
А#0/2015/193/1903-1(1), 09-1(1), 10-1(2), 15-1(1), 34-1(1)02-2(4), 03-1(2), 04-3(1), 06-1(1), 09-1(3), 10-1(10), 15-1(1), 17-2(12), 23-1(2), 25-1(1), 34-1(1)04-1, 33-1
В#0/2014/191/1909-3(2), 17-3(1), 23-1(2)02-2(1), 03-1(1), 09-3(14), 10-1(5), 15-1(2), 17-3(10), 22-1(2), 23-1(15), 25-1(3), 34-1(2)
*Кількість позитивних/кількість випробуваних. Повні дані RSA і дані бальних оцінок ушкоджень альвеолярних мішечків показані в Додатку D.
#Птахів у групі А інокулював пулом, що містить ST-мутанти 02-2, 03-1, 04-1, 06-1, 09-1, 10-1, 15-1 і 17-2; птахів у групі В інокулював пулом, що містить ST-мут�ваного ST-мутанта двох груп.

Повторне виділення ST-мутантів

M. gallisepticum більш часто виділяли на чашках МА, інокульованих мазками, взятими з трахей, ніж з альвеолярних мішечків, в обох групах. M. gallisepticum виділяли на чашках МА, інокульованих мазками альвеолярних мішечків двох птахів в обох групах, і з мазків 18 з 19 курей в групі Ст.

П'ять ST-мутантів витягували з альвеолярних мішечків трьох курей в групі А і три ST-мутанта витягували з альвеолярних мішечків однієї птиці в групі Ст. Більше ST-мутантів витягували в МВ, инокулированном мазками, взятими з трахей, ніж з мазків, взятих з альвеолярних мішечків. В цілому були повторно виділено одинадцять ST-мутантів з курей групи А і десять були повторно виділені з вісімнадцяти птахів в групі Ст.

Найбільш частим повторно виділеним мутантом був мутант, несучий Tag 23. Цей мутант виділяли з трахей 17 птахів і альвеолярних мішечків двох курей. Другим найбільш часто виділяються мутантом був 17-2, який виділяли з трахей 12 птахів (таблиця 8). ST-мутанти 02-2, 03-1 10-1 і 15-1, які використовували для інокуляції птахів у групі А, повторно виділяли з групи B, тоді як ST-мутанти 04-3, 23-1, 25-1 і 34-1, які використовували для інокуляції птахів в групі В, повторно виділяли з группите не була детектована втрата транспозона.

Приклад 3: Инфективность і вірулентність відібраних ST-мутантів M. gallisepticum

Отримання ST-мутантів

Два ST-мутанта, 04-1 і 33-1, які не були детектировани після первісного або підтверджує експериментів скринінгу, і п'ять, які детектировали нечасто (ST-мутанти 03, 18, 20, 22 і 26), культивували при 37°С в МВ, доповненому гентаміцином при 160 мкг/мл, до пізньої логарифмічної фази. Ap3AS дикого типу культивували при 37°С в МВ, який не містив гентаміцину. Концентрацію кожного штаму доводили до приблизно 1×107CCU/мл з використанням вищеописаного способу.

Аналіз вірулентності і инфективности

План експерименту

Вісім груп четирехнедельних курей SPF містили роздільно (20 птахів на групу) в ізоляторах з скловолокна з позитивним тиском (тиском вище атмосферного). Кожну з цих шести груп інокулював відрізняється ST-мутантом допомогою аерозольного впливу. Птахів негативного контролю піддавали впливу МВ, а птахів позитивного контролю піддавали впливу Ap3AS дикого типу. Птахів эвтанизировали за 14 днів після інфікування і дослідженняpost mortemпроводили, як описано вище. Сироватки і мазкиописано вище, за винятком того, що брали мазки з інфікованою Ap3AS групи, які інокулював на чашках МА і потім поміщали в МВ без гентаміцину. ДНК виділяли з кожної бульонной культури, виявляє зміна забарвлення, і використовували в якості матриці ПЛР для ампліфікації району унікальною мітки з використанням пари праймерів P2/P4 (таблиця 2). ПЛР-продукти використовували в якості зондів у дот-блот-гибридизациях для детектування присутності специфічних міток, як раніше описано вище. ПЛР виконували також з використанням праймера IGstmGenmeF3 і праймера, специфічного для кожного ST-мутанта, в якості додаткового інструменту для ідентифікації ST-мутантів в інокульованих птахів (таблиця 2). Верхні, середні і нижні зрізи трахеї брали з кожної птиці, досліджували гістопатологічно і вимірювали товщину слизової оболонки.

Детектування повторно виділених ST-мутантів

Для детектування кожного ST-мутанта в бульйонних культур використовували дот-блот-гібридизацію і ПЛР-ампліфікацію. Дот-блот-гібридизація не могла бути використана для культур з групи позитивного контролю, так як Ap3AS дикого типу не містив сигнатурну мітку. Дот-блот-гібридизація описана підлітків�лифицировали з використанням набору DIG-мічених праймерів. Олигонуклеотиди, відповідні семи сигнатурним мітках, які ідентифікували мутанти, які використовуються в експерименті, наносили у вигляді плям на нейлонову мембрану і потім використовували в гибридизациях. Набір люмінесцентного детектування DIG (Roche) використовували для детектування гібридизації згідно інструкції виробника. ПЛР-праймери, специфічні для кожного ST-мутанта, були сконструйовані з використанням даних секвенування для кожного мутанта. Пару праймерів (STM13-KE-C'-1-Rev і STM13-KF-C') використовували для підтвердження повторного виділення штаму Ap3AS дикого типу, націленого на район, ідентифікований при секвенировании ST-мутантів 13-1, 13-2 і 13-3 (таблиця 2).

ПЛР-реакції проводили з використанням 2 мкл екстрагованої ДНК у якості матриці 20 мкл реакційної суміші, що містить 2 мкл 10 × реакційного буфера, 1 мкМ кожного праймера, 200 мкМ кожного dNTP і 1,5 Е ДНК-полімерази Taq (Promega). ПЛР інкубували при 95°C протягом 2 хвилин, з подальшими 35 циклами 94°C протягом 45 секунд, 52°C протягом 45 секунд і 72°С протягом 1 хвилини, з кінцевим инкубированием при 72°C протягом 7 хвилин.

Гістологічне дослідження

Приготування трахеальних зрізів

Проби верхній, середній і н5 р Na2HPO4на літр) і витримували протягом щонайменше 24 годин для фіксації. Потім тканини обробляли приміщенням у парафіновий віск з подальшою заливкою в вакуумі. Зрізи товщиною 2 мкм нарізали і збирали на скляних предметних стеклах. Після видалення воску і регідратації, зрізи фарбували гематоксилином та еозином і досліджували під світловим мікроскопом щодо пошкоджень і для вимірювання товщини слизової оболонки.

Дослідження трахеальних пошкоджень і вимірювання товщини слизової оболонки

Гістологічні ушкодження у верхніх, середніх і нижніх зрізах трахеї оцінювали в балах на тяжкість за шкалою 0-3 наступним чином:

0 = немає значущих змін;

0,5 = дуже малі агрегати лімфоцитів (менше 2 вогнищ) або дуже слабка, дифузна лімфоцитарна інфільтрація;

1 = малі агрегації лімфоцитів (більше 2 вогнищ) або мінорне потовщення слизової оболонки, викликане дифузною інфільтрацією лімфоцитів;

2 = помірне потовщення слизової оболонки внаслідок інфільтрації гетерофилов і лімфоцитів, а також набряк, що супроводжується дегенерацією епітелію з ексудацією або без ексудації просвітів;

3 = істотне потовщення, викликане інфільтрацією геросветов.

Товщину слизової оболонки трахеї кожній птиці визначали вимірюванням товщини в 6 точках на кожному зрізі з верхньої, середньої і нижньої трахеї з кожної птиці. Потім розраховували середню товщину для кожного з трьох районів.

Статистичні аналізи

Медіанні бальні оцінки гістологічних ушкоджень трахей для кожної експериментальної групи порівнювали з використанням U-критеріїв Манна-Уітні (Minitab version 14.2 для Windows). T-критерій Стьюдента та однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA) використовували для порівняння середньої товщини слизових оболонок трахеї. Ймовірність (P-величина) ≤0,05 вважалася значущою.

Електрофорез в ДСН-ПААГ

Клітини в пробі 1 мл культури середньої логарифмічної фази кожного з ST-мутантів, а також Ap3AS і ts-11-штамів збирали центрифугуванням при 16000 g протягом 5 хвилин, потім ресуспендували в 1 × ДСН-ПААГ лизисном буфері і інкубували при 100°C протягом 5 хвилин перед швидким охолодженням на льоду. Всі білки клітин розділяли у 12,5% поліакриламідному гелі разом зі стандартами молекулярних мас (Marker 12™ Wide Range Protein Standard, Novex) і потім фарбували Кумасси діамантовим синім.

Результати

Вірулентність і инфективность ST-мутантів

<ах, підданих впливу аерозолів ST-мутантів 04-1 (групі 2), 33-1 (групі 3) або 22-1 (групі 8), або у птахах негативного контролю (групи 1). Слабкі пошкодження (бальна оцінка 0,25) спостерігали в одній птиці, інокульованої ST-мутантом 03-1 (група 4). З 20 птахів, інфікованих ST-мутантом 26-1 (група 5), чотири мали слабкі пошкодження (0,50-1,00), в той час як пошкодження спостерігали тільки в черевних альвеолярних мішечках чотирьох птахів, підданих дії ST-мутанта 18-1 (група 6). Шість з 20 птахів мали пошкодження від слабких до важких (0,50-2,50) у групі, інфікованої ST-мутантом 20-1 (група 7), в той час як пошкодження від слабких до важких (0,50-3,00) спостерігали в 11 з 18 птахів з вірулентним штамом Ap3AS (група 9). Ці результати підсумовані у таблиці 9 показані графічно на фіг.6.

ter">0/20
Таблиця 9
RSA-результати, бальні оцінки пошкоджень альвеолярних мішечків і ступінь повторного виділення M. gallisepticum з птахів у дослідженні вірулентності і инфективности
ГрупаИнокулятRSA*Пошкоджений="c6" nameend="c7">MB^
Тиждень 2Альвеолярні мішечкиТрахеяАльвеолярні мішечкиТрахея
1Середа0/200/200/200/200/200/20
2ST-мутант 04-10/200/200/200/200/200/20
3ST-мутант 33-10/200/200/200/200/202/20
4ST-мутант 03-11/201/200/202/200/204/201/206/201/2010/20
6ST-мутант 18-120/205/205/2017/207/2019/20
7ST-мутант 20-120/206/207/2020/208/2020/20
8ST-мутант 22-10/190/190/191/190/193/19
9Ap3AS18/1811/189/1818/1810/1815/18
*Рез RSA і бальних оцінок альвеолярних мішечків показані в Додатку Е. Одна пташка померла в групі 8, і два птахи померли у групі 9 передpost mortem.
* Результати показані у вигляді відношення кількість позитивних проб/зібране кількість.
^Результати показані у вигляді відношення кількість проб з зміною забарвлення/зібране кількість. Сигнатурні мітки детектировали тільки у вигляді міток, несомих ST-мутантами, які інфікували птахів в групах 2-8.

Реакції у вигляді антитіл і повторне виділення ST-мутантів

У сироватці будь-яких експериментальних птахів не детектировали анти-мікоплазма-антитіл в момент інфікування за допомогою RSA-тесту. Через два тижні після інфікування, реакції у вигляді антитіл не детектировали ні в одній з птахів у групах 2, 3, 5 і 8, тоді як реакція була детектируемой тільки в одній птиці в групі 4. На противагу цьому, сильні RSA-реакції проти M. gallisepticum були детектируемими у всіх птахів у групах 6 і 7. Птахи негативного контролю (група 1) не виявляли реактивності проти Mg в RSA-тесті, тоді як всі птахи позитивного контролю (група 9) мали сильні RSA-реакції проти Mg (таблиця 9, фіг.6). M. gallisepticum не вилелялись на чашках МА, інокульованих мазками альвеолярних мішечків або трахеї будь птиці з м�лися на чашках МА, інокульованих мазками альвеолярних мішечків будь-яких птахів в групах 4 (інфікованої ST-мутантом 03-1) або 8 (інфікованої ST-мутантом 22-1), але вони виділялися з трахеї двох птахів в групі 4 і одного птаха в розділі 8. В групі 5 (інфікованої ST-мутантом 26-1), M. gallisepticum виділялися з альвеолярних мішечків однієї птиці і трахей 6 птахів. M. gallisepticum виділялися також з трахей 17 з 20 птахів в групі 6 (інфікованої ST-мутантом 18-1) і всіх птахів в групі 7 (інфікованих ST-мутантом 20-1), а також з мазків альвеолярних мішечків 5 з 20 птахів в групі 6 та 7 з 20 птахів у розділі 7. У групі позитивного контролю (група 9), M. gallisepticum виділялися з альвеолярних мішечків 9 з 18 птахів і трахей 17 з 18 птахів. M. gallisepticum більш часто виділялися з мазків, інкубували в МВ, ніж на чашках МА. M. gallisepticum не виділявся в МВ, инокулированном мазками альвеолярних мішечків або трахей будь птиці, підданої впливу ST-мутанта 04-1 (група 2) (таблиця 9). В інших, інфікованих мутантом групах, Mg витягували з МВ, інокулював мазками альвеолярних мішечків однієї птиці в групі 5 (ST-мутант 26-1), 7 птахів в групі 6 (ST-мутант 18-1) і 8 птахів в групі 7 (ST-мутант 20-1). MG витягували з трахей птахів у 6 з груп, підданих дії ST-мутантів, причому кількість ом 20-1). Ідентичність виділених ST-мутантів M. gallisepticum підтверджували з використанням унікальних сигнатурних міток, які вони несли (таблиця 9).

Трахейні пошкодження і величини товщини слизової оболонки

Медіанні бальні оцінки трахеальних ушкоджень показані в таблиці 10. Бальні оцінки птахів у всіх інфікованих мутантами групах, значимо відрізнялися від бальних оцінок птахів у групі позитивного контролю (групі 9) (P < 0,0001). Не було значущої різниці між групою негативного контролю (групою 1) і групами 5 (інфікованої ST-мутантом 26-1) або 7 (інфікованої ST-мутантом 20-1). Більш низькі бальні оцінки трахеальних ушкоджень птахів, інфікованих ST-мутантом 18-1 (група 6), не відрізнялися від бальних оцінок птахів у групах 2, 3, 4, 5 і 7, але значимо відрізнялися від бальних оцінок птахів в групі 8 (інфікованої ST-мутантом 22-1) і в групі негативного контролю (групи 1), тоді як тільки бальні оцінки пошкоджень середньої трахеї птахів у групі позитивного контролю відрізнялися від бальних оцінок птахів у будь-якій з інших груп. Середня товщина трахеальних слизової оболонки показана в таблиці 10. Ця середня товщина слизової оболонки в середній трахеї не розрізнялася значимо менше величини товщини групи негативного контролю (групи 1), за винятком цих величин у групах 2 і 7, і вони були значуще меншими, ніж ці величини групи позитивного контролю (групи 9). Не було значущої різниці між негативними контролями і групою 7 (інфікованої ST-мутантом 20-1) в товщині слизової оболонки верхніх і середніх трахей, але було розходження в нижній трахеї (P=0,004).

В цілому, ці позитивні контролі мали значимо більш важкі трахеальних пошкодження, як оцінено гістологічної бальною оцінкою ушкоджень або товщини слизової оболонки, ніж будь-яка з груп, інфікованих ST-мутантами. Група 4 (інфікована ST-мутантом 03-1) була найбільш тяжко вражена серед груп, інфікованих ST-мутантами.

Таблиця 10
Бальні оцінки трахеальних пошкоджень і величин товщини слизової оболонки у птахах у дослідженні вірулентності і инфективности

Приклад 4: Оцінювання захисту, забезпечуваною вакцинацією обраним ST-мутантомM. gallisepticum

Приготування ST-мутантної вакцини

ST-мутант 26-1 вирощували � культури, був описаний вище. Концентрацію ST-мутанта 26-1 коригували до приблизно 1×107CCU/крапля (22,5 мкл) для вакцинації, і потім кожну птицю вакцинували внутриглазно краплею культури.

План експерименту

В цілому, вісімдесят 5-тижневих курей SPF випадковим чином розподіляли на 4 групи і містили в ізоляторах склопластику при позитивному тиску. ST-мутант 26-1 вводили з використанням очних крапель в день 0. Ap3AS дикого типу вводили за допомогою аерозолю для зараження птахів через 2 тижні після імунізації. Птахи в групі 1 служили в якості негативних контролів. Цих птахів вакцинували МВ допомогою очних крапель в день 0 і заражали МВ допомогою аерозолю в день 14. Птахи в групі 2 служили в якості позитивних контролів. Їх вакцинували МВ з використанням очних крапель в день 0 і інфікували Ap3AS дикого типу за допомогою аерозолю в день 14. Птахи в групі 3 служили в якості контролів вакцинації. Цим птахам вводили ST-мутант 26-1 з використанням очних крапель в день 0. Потім МВ вводили за допомогою аерозолю через 14 днів після вакцинації. Птахи в групі 4 служили в якості вакцинированной і заражені групи. Курей иммунизировали ST-мутантом 26-1 з использспериментальних курей

Проби крові збирали з усіх курей перед вакцинацією, зараженням і евтаназією. Потім сироватки збирали і тестували за допомогою RSA для визначення концентрацій рівнів анти-мікоплазма-антитіл. Масу тіла кожного птаха також вимірювали перед імунізацією, при зараженні і приpost mortem. В день 28 (через 14 днів після зараження), курей эвтанизировали і піддавали дослідженнюpost mortem, та брали проби для культивування M. gallisepticum. Шість альвеолярних мішечків візуально оцінювали на пошкодження і давали бальну оцінку від 0 до 3, як описано вище. Брали мазки з альвеолярних мішечків і трахей птахів і висівали штриховий розводкою на МА без доданого гентаміцину і потім переносили в МВ, не містить гентаміцину, для виділення M. gallisepticum. МА-планшети інкубували при 37°С протягом 10 днів, і МВ-культури інкубували при 37°С, поки не спостерігали зміну забарвлення. Організми з бульйонів, виявляють зміна забарвлення, осаджували центрифугуванням і піддавали ПЛР-ампліфікації для ідентифікації ST-мутанта 26-1 та Ap3AS дикого типу (вище). Проби верхнього, середнього і нижнього районів трахеї кожної птахи збирали і фіксували в 10% нейтрально забуференному формаліні протягом щонайменше 24 годин. Послеии тяжкості за шкалою 0-3, як описано вище. Товщину слизової оболонки вимірювали для кожного трахеального району в 6 різних точках і потім розраховували середню товщину для кожного з цих трьох районів.

Повторне виділенняM. gallisepticum

Пару ПЛР-праймерів, яка була специфічною щодо ST-мутанта 26-1 (IGstmGenmeF3 і STM26-Rev), і набір праймерів P2/P4, які ампліфікували район унікальною мітки, використовували для повторного виділення ST-мутанта 26-1. Пару праймерів STM26-генома та STM26-Rev пов'язували на кожній стороні сайту інсерції транспозона в ST-мутант 26-1 і використовували для підтвердження повторного виділення Ap3AS дикого типу. Ця ПЛР могла легко диференціювати ST-мутант 26-1 від вихідного штаму Ap3AS (таблиця 2). ПЛР проводили з 2 мкл екстрагованої ДНК у якості матриці 20 мкл реакційної суміші, що містить 2 мкл 10 × реакційного буфера, 1 мкМ кожного праймера, 200 мкМ кожного dNTP і 1,5 Е ДНК-полімерази Taq (Promega). ПЛР інкубували при 95°C протягом 2 хвилин з наступними 35 циклами 94°C протягом 45 секунд, 52°C протягом 45 секунд і 72°C протягом 1 хвилини з кінцевим инкубированием при 72°С протягом 7 хвилин. Отримані продукти поділяли в 2% агарозному гелі разом з маркерами молекулярної маси ДНК.

Статистичні аналинием однофакторного дисперсійного аналізу ANOVA та t-критерію Стьюдента (Minitabs v14.2 для Windows). Медіанні бальні оцінки трахеальних ушкоджень порівнювали з використанням критеріїв U Манна-Уітні. Середні величини товщини слизової оболонки у верхній, середній і нижній трахеї порівнювали з використанням t-критерію Стьюдента та однофакторного дисперсійного аналізу ANOVA. Величину Р≤0,05 вважали значущою.

Результати

Макроскопічні пошкодження

Макроскопічні пошкодження альвеолярних мішечків спостерігали тільки у птахів у групі позитивного контролю (групи 2). У цій групі, 5 птахів мали пошкодження альвеолярних мішечків, з загальними бальними оцінками ушкоджень альвеолярних мішечків в діапазоні від 0,5 до 2,5. Ці результати підсумовані в таблиці 10 та показано графічно на фіг.7.

Таблиця 10
Результати RSA-тесту, бальні оцінки пошкоджень альвеолярних мішечків і повторне виділення M. gallisepticum всіх груп в дослідженні иммунопротекции
ГрупаВакцинаціяЗараженняRSA#МА-чашка^MB&
Альвеолярні мішечкиТрахея
День 14День 28Альвеолярні мішечкиТрахеяМутант 26-1Ap3ASМутант 26-1Ap3AS
1СередаСереда0/200/200/200/200/200/200/200/200/20
2СередаWt Ap3AS*0/2020/205/201/2019/200/202/20pan="0">ST Мутант 26-1Середа0/2016/200/201/202/201/200/202/200/20
4ST Мутант 26-1Wt Ap3AS0/2020/200/200/207/200/200/200/209/20
*Ap3AS дикого типу
#Повні дані RSA та оцінки пошкоджень альвеолярних мішечків показані в Додатку G.
^Кількість проб, що виявляють колонії M. gallisepticum, що ростуть на МА-чашці/загальна кількість зібраних проб.
&ПЛР проводили для визначення присутності ST-мутанта 26-1 та штаму Ap3AS.

Серологічне тестування та повторне виділенняM. gallisepticum

Сироватки, зібрані у птахів в момент вакцинації і зараження, не1) не мала ніякого детектованого сироваткового антитіла протиM. gallisepticumу моментpost mortem.На відміну від цього, велика частка птахів в інших 3 групах мала детектіруемого антитіла протиM. gallisepticumприpost mortem.Кожна птиця в групі позитивного контролю (групи 2) виробляла реакцію RSA антитіла протиM. gallisepticumвід помірної до сильної.Анти-мікоплазма-антитіла детектировали в 16 з 20 проб сироватки з групи 3, з RSA-оцінками в діапазоні від низьких до помірних. Помірні титри анти-мікоплазма-антитіл детектировали у всіх птахів в групі 4 (вакцинированной ST-мутантом 26-1 та інфікованої штамом дикого типу). Ці результати підсумовані в таблиці 10.M. gallisepticumвиділялися більш часто трахеальних мазків, ніж з мазків альвеолярних мішечків, в групах 2, 3 і 4, і не виділялися з альвеолярних мішечків або трахей жодної з птахів групи 1 (негативні контролі). Mg-колонії вирощували з мазків альвеолярних мішечків в одній птиці як в групі 2 (тільки заражені), так і групі 3 (тільки вакциновані), в той час як повторне виділення досягалося з трахеї 19 птахів і 2, відповідно. В групі 4, якій вводили ST-мутант 26-1 в якості вакцини і потім інфікували штамом Ap3AS, Mg виділяли на МА-чашках з альвеолярних мішечків однієї птиці і з� в МВ, ніж на МА-чашках. ПЛР-ампліфікація підтверджувала, що тільки мікоплазми, повторно виділені з груп 2 і 3, були штамом, який вводили цій групі. Після ПЛР-ампліфікації з використанням штам-специфічної пари праймерів тільки мікоплазми, повторно виділені з групи 4, були Ap3AS дикого типу. Ці результати показані в таблиці 10.

Прирости маси курей

Не було значущої відмінності у прирості маси між будь-якими з цих груп через 14 днів після вакцинації. За 4 тижні (14 днів після зараження) птиці позитивного контролю (групи 2) мали більш низькі середні прирости маси, ніж птахи в групах 1 (негативні контролі) або 3 (вакциновані контролі) (P=0,006 і 0,027, відповідно), але не в порівнянні з птахами в групі 4 (вакцинованими і зараженими) (P=0,332) (таблиця 11). У період між зараженням іpost mortem(день 14 - день 28) середній приріст маси курей в групі 2 (тільки заражених) був значуще нижчими, чим приріст маси птахів у кожній з інших груп. Середній приріст маси птахів у групі 3 (вакцинованих, незаражених) був не більшим, ніж приріст маси негативних контролів, але був значущо більшим, ніж приріст маси птахів в групі 4 (вакцинованих і заражених) (P=0,016). Однак, средоказани в таблиці 11.

Трахеальних пошкодження і величини товщини слизової оболонки

Медіанні бальні оцінки трахеальних ушкоджень показано в таблиці 12. Ці пошкодження були важкими в птахах у групі 2 (тільки зараженої). Медіанні бальні оцінки трахеальних ушкоджень у групі 2 (позитивних контролях) значимо відрізнялися від бальних оцінок в інших трьох групах (P < 0,0001). Оцінки пошкоджень птахів в інших групах не значимо відрізнялися один від одного. Середні величини товщини слизової оболонки верхньої, середньої і нижньої трахеї птахів в групі 2 (тільки зараженої) були значуще вищими, ніж оцінки птахів в інших трьох групах (P < 0,0001), але не було значущої різниці між оцінками цих птахів у цих трьох інших групах (таблиця 12). Однак, в середній і нижній трахеях середня товщина слизової оболонки була меншою у птахів в групі 4, ніж у птахів у групі 1 (P=0,028) або 3 (P=0,036).

Таблиця 11
Приріст маси курей у всіх експериментальних групах у дослідженні иммунопротекции

Приклад 5: Нокаут-мутанти генів олигопептидних транспортерів dppD і oppD у пташиному патогенном штаміEscherichia coliE956 (APEC E956).

Дослідження безпекиin vivoпоказували статистично значущу аттенуацию oppD-нокауту як у вигляді бальних оцінок ушкоджень, так і в ступенях повторного виділення з птахів у порівнянні з dppD-нокаутом або вихідним штамом E956. Дослідження ефективностіin vivoпоказували статистично значущу захист вакцинованих oppD-нокаутом птахів після зараження APEC E956.

Приклади 1 і 2 ілюструють кількість аттенуирующих ген мутацій, що включають гени dppD і oppD, які є гомологічними іншим бактеріальним генам, які беруть участь у транспорті олигопептидов в клітку.

Оскільки всі бактеріальні види мають майже ідентичні транспортні системи, могли б бути розвинені нові вакцини проти інших пташиних патогенів, а також патогенів інших видів тварин за допомогою продукування dppD-нокаутів.

Цей приклад ілюструє нокаути генів dppD і oppD у пташиному патогенном штаміEscherichia coliE956 (APEC E956). Кожен мутант відчували на безпеку і эффи E. coli

Пташиний патогенний штамEscherichia coliE956 (APEC E956) спочатку був виділений з одноденного курчати в бройлерному господарстві, і було виявлено, що він є чутливим до антибіотиків ампіциліну, сульфафуразолу, триметоприму, хлорамфеніколу, тетрацикліну та канаміцину. Організм розмножували в бульйоні Луриа-Бертани (LB) або на LB-агарі при 30°С або 37°С протягом ночі з відповідним добором з використанням антибіотиків (ампіциліну, 50 мкг/мл; канаміцину, 100 мкг/мл), якщо не зазначено інше. Для стандартного клонування та отримання плазмід використовували штамE. coliDH5α.

Використовували червону систему рекомбінації для посилення гомологічної рекомбінації між нокаут-конструкціями і геном-мішенню нокауту з використанням чутливою до температури плазміди pKD46, що несе ген стійкості до ампіциліну, три гени "Червоної системи" γ, λ, і exo, що кодують Gam, Bet і Exo, відповідно. Нокаут-конструкції збирали за допомогою ПЛР та лігувати у вектор pGEM-T (Promega). Плазміду, що містить кожну конструкцію, використовували в якості матриці ПЛР для одержання лінійної ДНК для трансформації.

Отримання нокаут-конструкцій генів

Ген канаміцину ампліфікували з транспозона Tnphли з використанням набору для очищення UltraClean PCR (MoBio, California USA) у відповідності з інструкціями виробника і лігувати з вектором pGEM-T (Promega) у відповідності з інструкціями виробника. Суміш лігування використовували для трансформаціїE. coliDH5α электропорацией за допомогою генератора імпульсів Gene Pulser (BioRad) з установками 2500 В, 200 Ω, 250 мкФ, і рекомбинанти відбирали на LB-агарі, що містить 25 мкг/мл канаміцину. Трансформантів вирощували протягом ночі у LB-бульйоні, містить 25 мкг/мл канаміцину, і плазміду екстрагували з використанням набору (Promega) у відповідності з інструкціями виробника. Клонування гена стійкості до канаміцину підтверджували аналізом з використанням рестрикційних эндонуклеаз. Лінійну ДНК використовували для трансформації: для dppD-нокаутів ДНК отримували за допомогою ПЛР з використанням пари праймерів WE та WF, кожен з яких містить 5'-райони 40 п. н., комплементарні районах 4384-4423 п. н. і 4829-4868 п. н., відповідно, в геніdppDGenBank Accession L08399. Ці олігонуклеотидні праймери WE та WF містили 3'-райони 20 п. н., комплементарні гену канаміцину, і при використанні в ПЛР-ампліфікували ген канаміцину з 40 п. н.-кінцями, комплементарними ДНК dppD.

Таблиця 13
Олиімд src="http://img.russianpatents.com/1212/12122207-s.jpg" height="87" width="150" />

Отримання нокаутів генів

Штами APEC E956 трансформували pKD46 электропорацией з використанням генератора імпульсів Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad), встановленого при 2500 В, 200 Ω, 250 мкФ. Рекомбинанти відбирали на агарі Луриа-Бертани, що містить 100 мкг/мл ампіциліну, з подальшим инкубированием при 30°С протягом ночі. Автори винаходу отримували нокаути генів за допомогою гомологічною рекомбінації за допомогою відомих способів. Окрему свіжу колонію APEC E956/pKD46 поміщали в 5 мл LB, що містить 100 мкг/мл ампіциліну, та інкубували при струшуванні (200 об/хв) при 30°С протягом 16 годин. На наступний день гототвили розведення 1:50 нічний культури в обсязі 20 мл LB, що містить 100 мкг/мл ампіциліну, і культури струшували (200 об/хв) при 30°С в конічній колбі на 125 мл При концентрації 107клітин/мл додавали L-арабінозу (Sigma) до кінцевої концентрації 1 мМ. Культури индуцировали приблизно 1 годину при 30°С, і потім клітини піддавали тепловому шоку протягом 15 хвилин при 42°C і негайно переносили на баню з сумішшю води з льодом на 10 хвилин, потім збирали центрифугирова�про 20% гліцерин, переносили в центріфужную пробірку на 1,5 мл і центрифугували при 16000 × g протягом 30 секунд при 4°С настільної микрофуге. Супернатант видаляли і клітини ресуспендували в 1 мл 1 мМ MOPS, що містить 20% гліцерин, і центрифугували, як описано вище. Цю стадію повторювали ще один раз, і клітини, нарешті, ресуспендували в 100 мкл 1 мМ, що містить 20% гліцерин. Потім клітини додавали в попередньо охолоджені кювети для електропорації (щілина 2 мм Bio-Rad), і 50 мкл клітин з 300 нгDpnI-розщепленої ДНК трансформували з використанням вищеописаних установок. Відразу після електропорації клітини витягували суспендированием в 0,3 мл LB, розводили в 2,7 мл LB і інкубували при 37°C при струшуванні протягом 1,5 годин. Культуру 5× концентрували у LB і 0,2 мл інокулював на LB-чашки, що містять 20 мкг/мл канаміцину, та інкубували протягом ночі при 37°С. Трансформантів відбирали і вирощували в LB, містить 40 мкг/мл канаміцину, і нокаути генів підтверджували за допомогою ПЛР та блот по Саузерну.

Підтвердження штамів з нокаутами генів dppD і oppD

Для підтвердження инсертирования гена стійкості до канаміцину вdppDабоoppD, ПЛР проводили з використанням пари праймерів для dppD (TZIUA) іoppD(WSIWT)956 дляdppDіoppDбув 0,89 т. п. н. і 0,951 т. п. н., відповідно. Передвіщеним збільшенням розміру з інсерцією гена канаміцину (1,064 т. п. н.) був розмір 1,774 т. п. н. і 1,924 т. п. н.dppDіoppD,відповідно.

Екстракція і блоттінг по Саузерну геномної ДНК

Геномну ДНК APEC E956, штами ΔdppDі ΔoppDотримували з використанням фенолу/хлороформу, як описано раніше (Sambrook et al, 2001). Геномну ДНК з штамівE. coliрозщеплювали з використаннямPstI,і фрагменти разом з маркерами молекулярних мас розділяли електрофорезом в агарозному гелі. Після електрофорезу в агарозному гелі фрагменти геномної ДНК переносили на нейлонову мембрану (Hybond-N+, GE Healthcare) капілярним перенесенням. ДНК-зонди мітили [γ32P]dATP з використанням набору для випадково праймированного мічення ДНК (Roche). Попередню гібридизацію і гібридизацію проводили у буфері Черча (0,5 M Na2HPO4[pH 7,4], 7% додецилсульфат натрію, 1 мМ ЕДТА, 1% бичачий сироватковий альбумін БСА) (Church & Gilbert, 1984) протягом ночі при 54°C. Мембрани промивали у 2 ч SSC (1 × SSC являє собою 0,15 M NaCl плюс 0,015 М цитрат натрію)-0,1% додецилсульфате натрію двічі за 54°C протягом 5 хвилин у кожному випадку і потім один раз в 0,5 × SSC, 0,1% SDS протягом 15 хвилин при EC E956

Одноденних курчат інфікували штамами APEC E956, ΔdppDіΔoppDдля оцінювання патогенності кожного мутанта в порівнянні з неінфікованими і APEC E956-інфікованими. В цілому, купували 95 одноденних курчат (SPAFAS, Woodend Vic) і розподіляли на три групи по 20 курчат у кожній і одну групу з 35 курчатами. Птахів утримували в ізоляторах позитивного тиску і годували ad libitum опроміненим комерційним стартером (початковим раціоном). Мазки клоак брали у двох курчат з кожної групи і висівали штрихом на агар MacConkey для оцінювання симбионтнойE. coli. Готували нічні культури E956 ΔdppD, ΔoppD в поживному бульйоні з 40 мкг/мл канаміцину разом з E956 без канаміцину для отримання концентрації 1E+10 колонієутворюючих одиниць/мл (куо/мл). Всі групи інокулював допомогою очних крапель з введеної 10 раз нормальної іммунізуючої дозою комерційної вірусної вакцини Vic S вірусу інфекційного бронхіту (Websters, Australia). Кожна група 2 і 3 з 20 курчат отримувала 20 мл аерозолю, що містить 1E+10 куо/мл ΔdppD і ΔoppD), відповідно, тоді як група 4 з 35 птахів отримувала 20 мл 1E+10 куо/мл E956. Курчата в групі 1 залишалися необробленими і служили в якості негативного контролю. Курчат з груп 2, 3 і 4 піддавали ще два рази де�астея 10 днів. Захворювання оцінювали за макроскопічної патології, пошкодження альвеолярних мішечків оцінювали згідно з попередніми критеріями. Мазки брали з лівої і правої задньої і передньої частини альвеолярних мішечків, трахеї і асептично з печінки. Мазки інокулював на агар MacConkey з канаміцином і без канаміцину (40 мкг/мл) та інкубували протягом при 37°С. На наступний день чашки обстежили на присутність "цегляно-червоних" колоній (типовий фенотипE. coli), їх кількості підраховували і реєстрували. Якщо кількість колоній було менше 30, то проводили ПЛР для ідентифікації штамуE. coli. Штами APEC ідентифікували з використанням пари праймерів: для dppD WA/UA, для oppD WA/WT, для E956 Sidfwdseq/bwd siderophore (таблиця 13), який амплифицирует ген iucA, присутній на pVM01, і для симбионтнойE. coli16s рДНК ампліфікували з 16Sfwd/16Srev.

Ефективність нокаутів dppD і oppD APEC

Для оцінювання ефективності вакцинного кандидатаE. coliшістдесят одноденних птахів ділили на три групи з 20 птахів. Групи 2 і 3 вакцинували за допомогою аерозолю E956 ΔdppD, ΔoppD в день один, як описано вище, тоді як група 1 залишалася невакцинированной в якості контролю та містилася окремо в ізоляторах, як опис E956, як описано вище, і повторно поміщали в їх ізолятори. Після 4 днів всіх птахів эвтанизировали і піддавалиpost mortem. Пошкодження альвеолярних мішечків оцінювали, як описано вище, і мазки, взяті для повторного виділення інфекційних організмів, культивували на агарі MacConkey з канаміцином і без канаміцину (40 мкг/мл).

Аналіз результатів

Статистичний аналіз виконували на бальних оцінках швидкості та ступеня ушкоджень альвеолярних мішечків, швидкості виділення організмів і приросту маси птахів. Використовуваними критеріями були Точний критерій Фішера для швидкостей повторного виділення та критерій U Манна-Уїтні для оцінок пошкоджень і зміни маси.

Результати

Розвиток і підтвердження ΔdppD і ΔoppD APEC E956

Для трансформації APEC E956/pKD46 використовували лінійні ДНК-конструкції для нокаутів специфічних генів, що продукуються ПЛР. Трансформантів відбирали на LB-агарі, що містить 40 мкг/мл канаміцину, і потім проводили ПЛР для підтвердження клонів, що несуть ген канаміцину. Було передбачено, що розмір ампликона з E956 ΔdppD, що використовує пару олігонуклеотидних праймерів TZ/UA, дорівнює 1,774 т. п. н. внаслідок інсерції ДНК канаміцину (1,064 т. п. н.) у порівнянні з вихідним шта ΔoppD, використовує пару олигонуклеотидих праймерів WS/VT, був близьким до передбаченим розміром 1,924 т. п. н. з вихідним штамом E956, продукуючим ампликон 0,951 т. п. н., Фіг.8B і Фіг.9, Панель B, доріжки 1 і 2, відповідно.

Геномну ДНК штамів APEC E956, ΔdppD і ΔoppD, розщеплювали рестриктазоюPstIцей фермент був обраний, так як ген стійкості до канаміцину має єдиний сайтPstIв середині гена. Радіоактивно мічені зондиdppDіoppDдетектировали смуги в штамах APEC E956, ΔdppD і ΔoppD (фіг.10). Зонд dppD зв'язувався з фрагментом схожого розміру у штамах E956 і ΔoppD (фіг.10, доріжки 1 і 3), але з смугою злегка меншої молекулярної маси й іншого смугою 2 т. п. н. Зонд oppD зв'язувався з фрагментом схожого розміру у штамах E956 і ΔdppD (фіг.10, доріжки 1 і 2) і з смугами 9,8 і 7 т. п. н. ΔdppD (фіг.10, доріжка 3). Зонд гена канаміцину не зв'язувався з E956, але одні і ті ж смуги зв'язувалися зондами dppD і oppD у штамах ΔdppD і ΔoppD (фіг.10, доріжки 1 і 2).

Дослідження вірулентності з використанням штамів E956 ΔdppD і ΔoppD

Курей досліджували приpost mortemщодо ознак колибациллеза, досліджували шість альвеолярних мішечків щодо пошкоджень і брали мазок проби з лівої і правої передньої частини альвеолярного мішечка, і висівали на агар MacConkey з доданим канаміцином або без доданого канаміцину.

Результати цих досліджень обговорюються нижче і підсумовані в таблицях 14, 16 і 19 зі статистичними порівняннями, виконаними між кожною з цих груп, суммированними в таблицях 15, 17, 18, 20 і 21.

Таблиця 14
Приріст маси курей в експериментах по патогенності та ефективності
Приріст маси тіла у %
Експеримент по патогенностіЕксперимент по ефективності
Зараження (кількість птахів)PM-вакцинаціяЗараження-вакцинаціяPM-зараження
Без зараження (20)^174,5±30,6а--
E956 (23)^143,0±40,5b--
Тільки зараження (20)*
ΔdppD(19)^, (19)*143,0+40,5b255±54,0а19,3+3,1а
ΔoppD(20)^, (20)*155,0+31,1ab255±49,0а18,4±2,4а
^Експеримент по патогенності. * Експеримент по ефективності. Величини з одними і тими ж символами над рядком не є значимо різними (P≥0,05, двосторонній t-критерій Стьюдента)

Таблиця 15
Величини вірогідності (Р) для статистичного аналізу приростів маси з таблиці 14
Експеримент по патогенностіЕксперимент по ефективності
ΔdppDΔoppDE956Без вакцинації0,0060,0530,007Без вакцинації0,3020,257
ΔdppD0,2370,995ΔdppD0,990
ΔoppD0,291

Таблиця 16
Безпека нокаутів oppD і dppD в порівнянні зі штамомE. coliE956
Зараження штамом (кількість птахів)Ступінь повторного виділення
без антибіотиків
Медіанне кількість видовреждений альвеолярних мішечків (>0,5)Медіанна оцінка пошкоджень (діапазон)
LPTasRPTasТрахеяПечінкаЛіва+Права сторона альвеолярних мішечківТрахея
Без зараження (20)2/203/2011/204/200,00 (0-0,48)a0,00 (0-3,70)a0/20a0,0 (0-0,0)а
E956(23)11/2311/2321/233/230,48 (0-4,00)c2,48 (0-3,70)з17/23b3,0 (0-20)b
ΔdppD (19)10/1911/1916/198/191,0 (0-16)bc
ΔoppD (20)9/207/2010/204/200,00 (0-4,00)ab0,85 (0-3,70)a9/20c0,0 (0-20)c
Величини з одними і тими ж символами над рядком не є значимо різними (P≥0,05 відповідно до критерію Манна-Уїтні, згідно з двосторонньою вашим критерієм Фішера)

Таблиця 17
Величини ймовірності (P) для статистичного аналізу ступенів повторного виділення альвеолярних мішечків і трахей з таблиці 16
Альвеолярний мішечокТрахея
ШтамЕ956ΔdppDΔoppDЕ956Без вакцинації0,0170,01050,03997е-060,00050,3589
Е9560,42990,16960,02380,00012
ΔdppD0,12310,0089
Критерій Манна-Уїтні

Таблиця 18
Величини ймовірності (P) для статистичного аналізу оцінок і ступенів ушкоджень альвеолярних мішечків з таблиці 16
Оцінка пошкодження*Стьопі�>ΔdppDΔoppDЕ956ΔdppDΔoppD
Без вакцинації1e-050,00030,01540,0080,000010,000003
Е9560,0920,00650,05610,112
ΔdppD-0,14151,0
* Критерій Манна-Уітні, ^ двосторонній точний критерій Фішера

Таблиця 19
Дослідження эффективностаммом (кількість птахів)
Ступінь повторного виділення
без антибіотиків
Медіанне кількість виділених (Log10+1)
без антибіотиків (діапазон)
Ступінь ушкоджень альвеолярних мішечків (>0,5)Медіанна оцінка пошкоджень (діапазон)
LPTasRPTasТрахеяПечінкаЛіва+Права сторона альвеолярних мішечківТрахея
E956(20)2/201/208/200/200,00 (0-2,25)а0,15 (0-1,88)а13/20а1,25 (0-4,5)а
ΔoppD (20)1/200/209/200/200,00 (0-1,43)ab
Величини з одними і тими ж символами над рядком не є значимо різними (P≥0,05 відповідно до критерію Манна-Уїтні, згідно з двосторонньою вашим критерієм Фішера)

Таблиця 20
Величини ймовірності (P) для статистичного аналізу ступенів повторного виділення альвеолярних мішечків і трахей з таблиці 19
Альвеолярний мішечокТрахея
ШтамТільки зараженняТільки зараження
ΔoppD0,1300,0004
Критерій Манна-Уїтні

Таблиця 21
Величини ймовірності (P) для статистичного аналізу оцінок і ступенів ушкоджень альвеолярних меш�lign="left">
Ступінь зараження^
ШтамТільки зараженняТільки зараження
ΔoppD0,0110,052
* Критерій Манна-Уітні, ^ двосторонній точний критерій Фішера

Приріст маси птахів

Відмінність між відсотковим приростом маси в експерименті по патогенності між E956 (143%), ΔdppD (143%) та невакцинированними курми (174%) було несуттєво значущим, в той час як значущої різниці не спостерігали з ΔoppD (155%) щодо невакцинованих птахів (таблиця 14 і 15). В експерименті по ефективності не було статистично значущої відмінності в процентному прирості маси будь-якої групи птахів перед зараженням або приpost mortem(таблиця 14 і 15).

Ступеня повторного виділення організмів на агарі MacConkey

Не було значущої різниці між медіа кількостями організмів, повторно виділених з альвеолярного мішечка або трахеї контрольних і вакцинованих ΔoppD птахів в эксперименѰнних E956 або ΔdppD, ніж з невакцинованих птахів (таблиця 16). Результати експерименту щодо ефективності (таблиця 19) не виявляють відмінності між E956-зараженими і ΔoppD-вакцинованими птахами. Не було значущої відмінності в ступені виділень, виконаних з трахеї, в порівнянні з альвеолярними мішечками у птахах, вакцинованих або ΔdppD, або ΔoppD, хоча значуще збільшення виділення організмів з трахеї в порівнянні з альвеолярними мішечками спостерігали за птахами, вакцинованими E956 (P < 0,05).

Ступеня ушкоджень альвеолярних мішечків

Дослідження альвеолярних мішечків і органів приpost mortemвиявляло ознаки колибациллеза e деяких птахів з перигепатитом і перикардитом. В експерименті з патогенності не було статистично значущої відмінності між птахами, вакцинованими або ΔdppD, або ΔoppD, ступеня і бальною оцінкою пошкодження альвеолярних мішечків, було менше пошкоджень, які спостерігаються між ΔoppD і E956, але не було статистично значущої відмінності між вакцинованими ΔdppD і вакцинованими E956 птахами (таблиця 16 і 18). В експерименті по захисту, порівняння ступеня і оцінок пошкодження вакцинованих ΔoppD і заражених E956 птахів виявляло статистично значуще протективное ованной і зараженої групи (таблиці 19 і 21).

1. Спосіб запобігання або лікування захворювання у суб'єкта, зумовленого патогенним організмом, що передбачає введення терапевтично ефективної дози вакцини композиції або иммуногенной композиції суб'єкту, де вакцинна композиція або иммуногенная композиція містять бактерії, аттенуйовані мутацією в гені, що кодує АВС-пептидний транспортерні білок, де:
зазначена мутація робить кодований ABC-пептидний транспортерні білок нефункціональним,
зазначені аттенуйовані бактерії можуть персистувати в суб'єкті, та
зазначений ABC-пептидний транспортерні білок являє собою OppD.

2. Спосіб за п. 1, де мутація генерується інсерцією, делецією або заміною або будь-якою їх комбінацією.

3. Спосіб за п. 2, де инсерционная мутація виконується будь-яким способом або будь-якою комбінацією способів з гомологічною рекомбінації, транспозонного мутагенезу та мутагенезу послідовності-мітки.

4. Спосіб за п. 1, де ця бактерія обрана з групи, що включає Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Mannheimia, Ornithobacterium, Rickettsia, Ureaplasma і Pasteurelultocida, Mannheimia haemolytica, E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, велика колонія і мала колонія Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum або Mycoplasma haematoparvum.

6. Спосіб за п. 5, де бактерія є пташиним патогенним штамом Е. coli Е956 або штамом Mycoplasma gallisepticum Ap3AS.

7. Спосіб за п. 1, де аттенуированная бактерія экспрессирует гетерологичний антиген.

8. Спосіб за п. 7, де гетерологичний антиген кодується нуклеїнової кислотою з того ж самого або іншого патогенного організму.

9. Спосіб за п. 8, де нуклеїнова кислота, що кодує гетерологичний антиген, виділена з пологів, вибраних з групи, що включає Avibacterium, Bacillus, Brucella, Bartonella, Bordetella, Burkholderia, Vibrio, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Chlamydia, Coxiella, Erysipelothrix, Francisella, Listeria, Actinobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Streptococcus, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Mycobacterium, Mannheimia, Ornithobacterium, Rickettsia, Ureaplasma і Pasteurella і будь �bacterium paragallinarum, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, E. coli, Clostridium perfringens, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma anatis, Mycoplasma anseris, Mycoplasma imitans, Mycoplasma arginini, Ureaplasma parvum, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma californicum, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma dispar, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae, великої колонії і малої колонії Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma alligatorus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma, Mycoplasma maleagridis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum, Mycoplasma haematoparvum або будь-якої їх комбінації.

11. Спосіб за п. 8, де нуклеїнова кислота, що кодує гетерологичний антиген, виділена з вірусів, виділених з групи, що включає вірус хвороби Ньюкасла (псевдочуми птахів), вірус інфекційного бронхіту, пташиний пневмовирус, що вірус віспи птахів, інфекційного бурсального захворювання, вірус інфекційного ларинготрахеїту, пташиного грипу, вірус гепатиту качок, чуми качок, інфекційної курячої анемії, вірус хвороби Марека і будь-яку їх комбінацію.

12. Спосіб за будь-яким із пп. 1-11, де суб'єкт являє собою хребетна тварина, обраний із групи, що включає людей, ячих, собачих, котячих, козлиних, ів корову, бика, бізона або буйвола, суб'єкт собачих являє собою собаку, суб'єкт котячих являє собою кішку, суб'єкт козлиних являє собою козу, суб'єкт овечих являє собою вівцю, суб'єкт свинячих являє собою свиню, суб'єкт верблюжих являє собою верблюда, дромадера, ламу, альпака, викунью або гуанако, суб'єкт кінських являє собою коня, осла, зебру або мула.

14. Спосіб за п. 12, де суб'єкт являє собою суб'єкта пташиних, вибраного з курей (в тому числі карликових курей, бентамок), індиків, качок, гусей, фазанів, перепелів, куріпок, перепелів, цесарок, страусів, ему та павлінів.

15. Вакцинна композиція, придатна для запобігання або лікування захворювання, спричиненого патогенним мікроорганізмом, що містить имуногенно ефективне кількість бактерій, аттенуйованих мутацією в гені, що кодує АВС-пептидний транспортерні білок, і фармакологічно прийнятний носій:
зазначена мутація робить кодований ABC-пептидний транспортерні білок нефункціональним,
зазначені аттенуйовані бактерії можуть персистувати в суб'єкті, та
зазначений ABC-пептидний транспортерні білок являє собою OppD.

16. Вакцинна композиція за п. ялина, вибрані з групи, що складається з води, сольового розчину, культуральної рідини, стабілізаторів, вуглеводів, білків, білковмісні агентів, таких як бичача сироватка або знежирене молоко, і буфери, або будь-яку їх комбінацію.

17. Вакцинна композиція за п. 16, де стабілізатори включають SPGA.

18. Вакцинна композиція по кожному з пп. 15-17, де вакцинна композиція містить, щонайменше, від приблизно 103до приблизно 105аттенуйованих бактерій, або від приблизно 105до приблизно 107аттенуйованих бактерій, або від приблизно 107до приблизно 109аттенуйованих бактерій, або від приблизно 109до приблизно 1011аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1011до приблизно 1013аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1013до приблизно 1015аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1015до приблизно 1017аттенуйованих бактерій, або від приблизно 1017до приблизно 1019, або, щонайменше, приблизно 1019аттенуйованих бактерій на дозу.

19. Застосування вакцини композиції з п. 15 для предотвращ

 

Схожі патенти:

Спосіб боротьби з корозією, викликаної бактеріями сульфатвосстанавливающими

Винахід відноситься до нафтової промисловості і може знайти застосування при придушенні зростання сульфатвосстанавливающих бактерій і інгібування корозії в системах збору і підготовки нафти

Засіб для підвищення чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів

Винахід відноситься до медичної мікробіології, зокрема до засобів для підвищення чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів

Спосіб визначення активності лізоциму в біологічних рідинах

Винахід відноситься до мікробіології

Lactobacillus johnsonii la1 nсс533 (cncm 1-1225) та імунні порушення

Винахід відноситься до композиції для лікування або запобігання порушень, пов'язаних із зниженим рівнем дефензинов. Композиція містить від 0,005 до 1000 мг Lactobacillus johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) на щоденну дозу. Причому при температурі 110-140 протягом 5-30 з щонайменше 90% L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) переведені в стан, при якому вони стають нереплицирующимися. Винахід забезпечує посилення експресії мРНК дефензина hBD1. 4 з.п. ф-ли, 2 іл.

Ферментаційна середовище та спосіб отримання рекомбінантних білків

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до ферментаційної середовищі і способу отримання рекомбінантних білків з використанням даного середовища. Ферментаційна середовище для отримання рекомбінантних білків, вибраних з групи, що включає Г-КСФ, стрептокиназу і ліпазу, з використанням мікроорганізмів, виділених з групи, що включає: E. Coli, Streptomyces sp. і Rhizomucor sp., характеризується підтримуваної концентрацією сечовини або її похідних в інтервалі від 0,5 г/л до 2 г/л. Середовище містить на літр води основні солі в наступних кількостях: ортофосфорну кислоту (85%) від 2,67 до 133,5 мл, сульфат кальцію від 0,093 до 4,65 м, сульфат калію від 1,82 до 91 м, сульфат магнію-7H2O від 1,49 до 74,5 г, гідроксид калію від 0,413 до 20,65 г, гліцерин від 4 до 200 р. Середовище містить на літр води мікроелементи в наступних кількостях: сульфат міді-5H2O від 0,6 до 30 м, йодид натрію від 0,008 до 0,4 г, сульфат марганцю-H2O від 0,3 до 15 м, модібдат натрію-H2O від 0,02 до 1 м, борна кислота від 0,002 до 0,1 г, хлорид кобальту від 0,05 до 2,5 г, хлорид цинку від 2 до 100 м, сульфат заліза двовалентного-7H2O від 6,5 до 325 м, біотин від 0,02 до 1 м, сірчану кислоту від 0,5 до 25 мл Винахід забезпечує підвищений вихід цільових продуктів. 2 н. і 4 з.п. ф-ли, 27 іл., 3 табл., 16 пр.

Штам бактерії bacillus subtilis - високоактивний продуцент пектолитических ферментів, мацерирующих рослинну тканину

Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості. Запропоновано штам бактерії Bacillus subtilis ВКПМ B-11964 - високоактивний продуцент пектолитических ферментів, мацерирующих рослинну тканину. Даний штам проявляє високі пектат-лиазную і пектин-лиазную активності по відношенню до пектинам з різних джерел. 2 табл., 5 пр.

Штам bacillus sp. для біологічної боротьби з saprolegnia sp. і його застосування

Група винаходів відноситься до галузі біотехнології і мікробіології. Запропоновано штам Bacillus sp. КССМ11143Р, володіє протигрибковою активністю щодо Saprolegnia sp., культуральна рідина, одержаний при культивуванні штаму, пробіотична композиція, кормова добавка, протигрибковий засіб і засіб для поліпшення якості води, що містять штам Bacillus sp. КССМ11143Р або його культуральну рідину. Також запропоновано спосіб культивування риби або ракоподібних, спосіб запобігання сапролегниоза у тварин і спосіб поліпшення якості води з використанням штаму Bacillus sp. КССМ11143Р або його культуральної рідини. Штам Bacillus sp. КССМ11143Р має високий рівень продуктивності сидерофоров з проявом високої здатності захоплення заліза, і таким чином інгібує ріст інших патогенних бактерій і Saprolegnia sp., сприяє збільшенню швидкості споживання їжі рибою і швидкості збільшення ваги, а також зниження рівня екскреції, що призводить до поліпшення якості води. 9 н. і 1 з.п. ф-ли, 4 іл., 11 табл., 15 пр.

Штам microbacterium species для очищення прісноводних водойм та їх донних відкладень від нафти і нафтопродуктів

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано штам Microbacterium species BKM Ac-2614D для очищення забруднених і хронічно забруднених прісноводних об'єктів в температурному діапазоні від +2ºC до +25ºC. Винахід дозволяє здійснювати очищення води і донних відкладень від нафтових вуглеводнів при низькій концентрації кисню у воді і в умовах високих широт. 3 табл., 2 пр.
Винахід відноситься до гідролізної промисловості, зокрема до способів очищення гідролізатів лігноцеллюлозного сировини від інгібіторів ацетонобутилового бродіння, і може бути використано при підготовці поживних середовищ для отримання біоетанолу, біобутанолу, ацетону. Спосіб включає обробку гідролізатів групою мікроорганізмів, причому в якості консорціуму мікроорганізмів використовується активний мул каналізаційних очисних споруд, попередньо адаптований до живильного субстрату на основі речовин, які інгібують ацетонобутиловое бродіння. Використовується активний мул міських каналізаційних очисних споруд, бактеріальна компонента якого представлена бактеріями родів Pseudomonas (64%), Bacillus (18%), Zooglea (7%), Micrococcus(5%), Chromobacterium (3%), Acinetobacter (2%), Citrobacter (1%). Також використовується активний мул каналізаційних очисних споруд свинарських підприємств, бактеріальна компонента якого представлена бактеріями родів Nocardia (35%), Rhodococcus (28%), Micrococcus (18%), Pseudomonas (13%), Bacillus (6%). Винахід дозволяє позбутися від інгібуючих факторів у процесі зброджування гідролізатів лігноцеллюлозного сировини, дозволяє уникнути корозії гідролізного обладнання, а також сприяє оптимиз

Штам бактерій pseudomonas aeruginosa для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней

Винахід відноситься до біотехнології та ветеринарії. Штам бактерій Pseudomonas aeruginosa №6-ДЕП депонований у колекції ФГБУ ВГНКИ. Штам має високу імуногенну активність і призначений для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней. При використанні вакцини на основі запропонованого штаму титр антитіл до соматичного антигену О6 Pseudomonas aeruginosa у сироватці крові кролів та свиней через 14 днів після останньої імунізації становить відповідно 1:819,2 і 1:1024. 3 табл., 4 пр.

Штам бактерій pseudomonas aeruginosa для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней

Винахід відноситься до біотехнології та ветеринарії. Штам Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП депонований у колекції ФГБУ ВГНКИ. Штам має високу імуногенну активність і призначений для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней. При використанні вакцини на основі запропонованого штаму титр антитіл до соматичного антигену О3 Pseudomonas aeruginosa у сироватці крові кролів та свиней через 14 днів після останньої імунізації становить відповідно 1:768 і 1:1024. 3 табл., 4 пр.

Штам бактерій pseudomonas aeruginosa для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней

Винахід відноситься до біотехнології та ветеринарії. Штам бактерій Pseudomonas aeruginosa №25-ДЕП депонований у колекції ФГБУ ВГНКИ. Штам має високу імуногенну активність і призначений для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней. При використанні вакцини на основі запропонованого штаму титр антитіл до соматичного антигену О19 Pseudomonas aeruginosa у сироватці крові кролів та свиней через 14 днів після останньої імунізації становить відповідно 1:512 і 1:716,8. 3 табл., 4 пр.

Штам бактерій pseudomonas aeruginosa для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней

Винахід відноситься до біотехнології та ветеринарії. Штам бактерій Pseudomonas aeruginosa №34-ДЕП депонований у колекції ФГБУ ВГНКИ. Штам має високу імуногенну активність і призначений для виготовлення вакцини проти псевдомонозу свиней. При використанні вакцини на основі запропонованого штаму титр антитіл до соматичного антигену О1 Pseudomonas aeruginosa у сироватці крові кролів та свиней через 14 днів після останньої імунізації становить відповідно 1:819,2 і 1:1024. 3 табл., 4 пр.

Комбінації менінгококового фактор н-зв'язуючого білка та пневмококових сахаридних кон'югатів

Винахід відноситься до біотехнології та імунології являє собою імуногенну композицію для активації імунної відповіді стосовно пневмококів і/або менінгококів, що містить: (i) суміш кон'югованих пневмококових капсульних сахарид; і (ii) два різних поліпептидів фактор H-зв'язуючого білкового антигену (fHBP), але не містить везикули зовнішньої мембрани менінгокока. Винахід відноситься до способу активації імунної відповіді у ссавця стосовно пневмококів і/або менінгококів, що включає введення зазначеної композиції ссавцю. Винахід дозволяє розширити асортимент комбінованих вакцин стосовно пневмококів і/або менінгококів. 2 н. і 22 з.п.ф-ли, 1 іл., 5 табл.
Запропонована група винаходів відноситься до галузі ветеринарії. Запропоновані вакцина, спрямована проти актинобациллезной плевропневмонії, що включає ліпополісахарид в комплексі з одним або більше повторів токсинів ApxI, ApxII і ApxIII, виділений з бактеріальної культури, і поліміксин для зменшення симптомів эндотоксического шоку, спричиненого липополисахаридом, спосіб отримання такої вакцини, застосування поліміксину для зниження симптомів эндотоксического шоку і спосіб зниження симптомів эндотоксического шоку при введенні вакцини, в якому поліміксин додають у вакцину в дозі від 2,6 до 60 мкг/мл Запропонована група винаходів забезпечує ефективні засоби й методи для зменшення симптомів эндотоксического шоку, спричиненого липополисахаридом, при введенні вакцини проти актинобациллезной плевропневмонії тварині. 4 н. і 10 з.п. ф-ли, 4 табл., 4 пр.

Спосіб виготовлення вакцини, асоційованої проти псевдомонозу і вірусної геморагічної хвороби кролів

Винахід стосується способу виготовлення вакцини, асоційованої проти псевдомонозу і вірусної геморагічної хвороби кроликів. Охарактеризований спосіб включає відбір уражених органів від загиблих кролів у період їх захворювання з місцевого епізоотичного вогнища, виділення чистих культур збудників хвороб, для чого проводять роздільне вирощування культур Pseudomonas aeruginosa і вірусу геморагічної хвороби кролів. Для отримання збудника псевдомонозу культуру Pseudomonas aeruginosa вирощують у м'ясопептонному бульйоні з додаванням глюкози. Для отримання вірусу геморагічної хвороби кролів заражають вірулентним вірусом геморагічної хвороби кролів з інфекційною активністю не менше 103 ЛД 50/см3. Проводять відбір печінки від грішного кролика, її подрібнення і гомогенізацію. Змішують інактивовані культури Pseudomonas aeruginosa і вірусної геморагічної хвороби кролів у рівних співвідношеннях. Вносять розчин гідроокису алюмінію, перемішують, фасують і закупорюють. Представлене винахід дозволяє виготовити нешкідливу, високоиммуногенную вакцину, стабільний при зберіганні. 1 табл.
Up!