Набір олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації burkholderia pseudomallei

 

Винахід відноситься до біотехнології, молекулярної біології і може бути використаний в медицині для виявлення генетичного матеріалу збудника меліоїдоза Burkholderia pseudomallei в пробах як для діагностики в практичній охороні здоров'я і службі Росспоживнагляду, так і для наукових досліджень.

У списку інфекційних захворювань мелиоидоз місце займає особливо небезпечної інфекції (ОНІ) з ареалом поширення в тропічних і субтропічних регіонах світу. В основному це країни південно-східної Азії: Малайзія, Сінгапур, Таїланд, а також північні регіони Австралії. Збудник Ст. pseudomallei - аеробна грамнегативна неферментирующая бактерія. В даний час проблема меліоїдоза набула значення не тільки для традиційно ендемічних районів, але і для країн, де захворювання раніше не реєструвалося (Західна Європа і Північна Америка). Це пов'язано з розширенням торговельно-економічних, транспортних, культурних взаємин між країнами світу та розвитком туризму. Поширення і вкорінення збудника в нових районах його існування можливе також і за рахунок завезення хворих тварин, зараженого грунту, води, харчових продуктів. Клінічні прояви меліоїдоза різноманітні сго персоналу визначає складність при встановленні діагнозу в неэндемичних регіонах, зокрема в Росії.

Метод полімеразної ланцюгової реакції є прямим методом виявлення ДНК збудника меліоїдоза і володіє високою специфічністю і чутливістю. В основі реакції лежить механізм реплікації, який характеризується внутрішньоклітинним подвоєнням молекул ДНК ферментом ДНК-полімеразою. Вибір специфічного фрагменту ДНК і підбір праймерів відіграє найважливішу роль у специфічності проведення ампліфікації, що позначається на якості проведення діагностики досліджуваних мікроорганізмів.

Впровадження в лабораторну діагностику методу ПЛР в режимі реального часу з флуоресцентною детекцією дозволяє проводити виявлення продуктів ампліфікації в процесі реакції і вести кількісний облік ДНК. В одній пробірці протікає і детектується реакція з використанням зондів, мічених різними флуоресцентними барвниками, за допомогою яких стає можливим автоматична реєстрація та інтерпретація отриманих результатів. Подібний підхід дає можливість відмовитися від стадії електрофорезу, що веде до різкого зменшення ймовірності контамінації досліджуваних проб продуктами ампліфікації, а також дозволяє знизити вимоги, пропоновані до ПЛР-ентной детекцією на основі послідовностей генів 23S рРНК, BTTS, bfl (патент РФ 2435861, МПК С12Р 19/30, С12Q 1/68, опубл. 10.12.2011, Бюл. №34. Ткаченко Р. А., Савченко С. С., Зінченко О. В., Антонов Ст. А., Алексєєва Ст. Ст.; патент РФ 2439159, МПК С12Р 19/30, опубл. 10.01.2012, Бюл. №1. Ткаченко Р. А., Савченко С. С., Зінченко О. В., Антонов Ст. А., Алексєєва Ст. Ст.; патент РФ 2435860, МПК С12Р 19/30, C12Q 1/68, опубл. 10.12.2011, Бюл. №34. Ткаченко Р. А., Савченко С. С., Зінченко О. В., Антонов Ст. А., Алексєєва Ст. Ст.).

У 2012 році опублікована стаття Абрамова Д. Д., Воробйова А. А., Кузнецовського Д. А., Чухланцева Н.В. Праймери і зонд, що входять в тест-систему, ідентифікують збудників меліоїдоза і сапа, але не диференціюють один від одного [Розробка і випробування молекулярно-біологічні тест-системи для виявлення ДНК патогенних видів буркхолдерий методом ПЛР у реальному часі // Молекулярна медицина. - 2012. - №3. - стор. 16-22].

Найбільш близьким аналогом є специфічні праймери, опубліковані в статті Janse I. з співавторами, що входять в тест-систему для диференціації патогенних буркхольдерий на основі мультиплексного ПЛР. Як ДНК-мішені для ідентифікації збудника меліоїдоза використаний ген psu [Janse I, Hamidjaja RA, Hendriks AC, van Rotterdam BJ. Multiplex qPCR for detection and reliable differentiation of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. BMC Infect Dis. 2013 Feb 14; 13:86. dot: 10.1186/1471-2334-13-86].

Однак�ників меліоїдоза і сапа, але не диференціюють їх між собою.

Метою справжнього винаходу є розробка високоспецифічних олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації збудника меліоїдоза, а також для диференціації його від збудника сапу методом полімеразної ланцюгової реакції з флуоресцентною детекцією.

Мета досягається конструюванням видоспецифичних олігонуклеотидів для ідентифікації меліоїдоза і диференціації його від збудника сапу, що володіють активністю прямого і зворотного праймерів в реакції ампліфікації, мають наступну структуру:

5'-TGCATTCGGCCTTCAACATTCCA-3'-Bps-gp68-f

5'-CGGATCGCGCCATCTTGCTAC-3'-Bps-gp68-r

Флуоресцентна детекція реалізується за допомогою сконструйованого видоспецифичного олигонуклеотидного зонда з комплементарними кінцевими послідовностями за типом «молекулярного маяка»:

Bps-gp68-Pr 5'(ТАМРА)-TGCGCTTCATGATTGTCGGTGCGCA-(BHQ2)3',

де ТАМРА - тетраметилкарбоксиродамин, флуоресцентний барвник, довжина хвилі поглинання якого становить 546 нм, а довжина хвилі флуоресценції - 576 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценції з діапазоном гасіння 550-650 нм.

Характеристика олігонуклеотидних праймерів, зонда і ДНК-мішені для гібридизації.

Грунтуючись на так�за і диференціації його від збудника сапу були підібрані праймери, позначені Bps-gp68-f/Bps-gp68-r, і зонд Bps-gp68-Pr, комплементарні ділянки гена, що кодує білок gp68 B. pseudomallei з регіону RimL (ацетилтрансферази, що включають N-ацетилази рибосомальних білків). Розрахункова довжина специфічного фрагмента становила 221 п. н.

В якості позитивного контролю експерименти проводили на типовому штамі Ст. pseudomallei 100, використовуючи для виділення ДНК знезаражені суспензії мікроорганізму в концентраціях від 1×109м. к./мл до 1×101м. к./мл Апробація праймерів була здійснена на наборі штамів збудників меліоїдоза і сапа колекційного центру ФКУЗ Волгоградський науково-дослідний протичумний інститут Росспоживнагляду.

Чутливість реакції ампліфікації з флуоресцентною детекцією в режимі реального часу з праймерами Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і зондом Bps-gp68-Pr оцінювалася при дослідженні проб ДНК, виділених з десятикратних розведень чистих культур збудників меліоїдоза, і склала 1×104м. к./мл

Приклади конкретного виконання.

Приклад 1. Методика конструювання олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого олигонуклеотидного зонда для ідентифікації ДНК збудників меліоїдоза методом ПНР в режимі реального часу.

<даних EMBL, Genbank, DDBJ), для конструювання прямого Bps-gp68-f і зворотного Bps-gp68-r праймерів був обраний ділянку геному Ст. pseudomallei розміром 486 п. н. (GenBank NCBI, GeneID: 126221798), що кодує білок gp68 і входить до складу RimL регіону (ацетилтрансферази, що включають N-ацетилази рибосомальних білків). Розрахункова довжина передбачуваного ампликона, фланкируемого пропонованими праймерами, - 221 п. н. (табл.1).

Сконструйований флуоресцентно-мічений зонд Bps-gp68-Pr розміром 25 п. н., що володіє комплементарностью до продукту реакції ампліфікації з праймерами Bps-gp68-f/Bps-gp68-r, мічений з 5'-кінця флуоресцентним барвником ТАМРА і з 3'-кінця - гасителем флуоресценції BHQ2. Кінцеві послідовності зонда гибридизуются між собою і утворюють «шпильку» за принципом «молекулярного маяка».

При підборі праймерів і зонда керувалися загальними вимогами до олигонуклеотидним затравкам, використовуваним в ПНР. За допомогою комп'ютерних програм була проаналізована структура вибраних пар праймерів і зондів (утворення димерів, шпильок та інших вторинних структур) і показано їх теоретична придатність для успішної ініціації реакції ампліфікації та гібридизації.

Праймери Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і зонд Bps-gp68-Pr були проаналізовані з використанням комп'ютера�/) для встановлення гомології між ними і нуклеотидними послідовностями близькоспоріднених буркхольдерий, у тому числі з В. mallei та інших гетерологічних мікроорганізмів, присутніх в базах даних EMBL, GenBank, DDBJ, Pathema). На момент проведення комп'ютерного аналізу гомології виявлено не було.

Приклад 2. Ампліфікація і детекція специфічних фрагментів ДНК за допомогою розроблених праймерів Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і флуоресцентно-міченого зонда Bps-gp68-Pr для ідентифікації збудника меліоїдоза методом ПНР в режимі реального часу.

До складу реакційної суміші крім аналізованої ДНК входили розроблені комплементарні специфічного фрагменту ДНК Ст. pseudomallei олигонуклеотидний зонд Bps-gp68-Pr, прямий Bps-gp68-f і зворотний Bps-gp68-r праймери, а також дезоксирибонуклеозидтрифосфати, буферний розчин і фермент Taq-F-полімераза (ФБУН ЦНДІ Епідеміології Росспоживнагляду"). Ампліфікацію тривалістю 45 циклів проводили в обсязі 25 мкл. В якості негативного контрольного зразка в реакційну суміш додавали ТІ-буфер.

Аналіз продуктів ПЛР здійснювали в режимі реального часу на приладі «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралія). Реєстрацію результатів проводили в табличній і графічній формі. Результат ампліфікації кожного штаму В. pseudomallei вважався позитивним, у разі якщо крива накопичення флуореуоресценции, на циклі, що не перевищує граничне значення порогового циклу реакції (Ct) у відповідній графі таблиці результатів (рис.1). Рисунок 1 відображає графік наростання флуоресцентних кривих, отриманих при ампліфікації ДНК штамів збудника меліоїдоза з праймерами Bps-gp68-f /Bps-gp68-r і зондом Bps-gp68-Pr (зображені криві 1 - Ст. pseudomallei 100 в концентрації 105м. к./мл; 2 - В. pseudomallei 100 в концентрації 104м. к./мл, 3 - негативний контроль і криві накопичення флуоресценції проб Ст. pseudomallei в концентрації менше 103м. к./мл, не перетинають порогову лінію).

Приклад 3. Визначення чутливості і специфічності реакції ампліфікації за допомогою розроблених олігонуклеотидних праймерів Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і флуоресцентно-міченого зонда Bps-gp68-Pr для ідентифікації ДНК збудника меліоїдоза і диференціації його від збудника сапу.

Чутливість реакції ампліфікації з розробленими специфічними праймерами Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і флуоресцентно-міченим зондом Bps-gp68-Pr оцінювалася при дослідженні проб ДНК, виділених з бактеріальних суспензій клітин Ст. pseudomallei. Штами буркхольдерий вирощували на щільних живильних середовищах протягом 1-2 діб. Готували бактеріальні суспензії клітин в 4 мл 0,15 М розчину натѲича (ВЗГ 42-28-85 П) і розводили таким чином, щоб концентрації збудників сапу становила від 1×109до 1×101м. к./мл

Враховуючи, що збудник меліоїдоза відноситься до агентів II групи патогенності, пробоподготовку і знезараження матеріалу для проведення ПЛР здійснювали згідно ГО 1.3.2569-09 «Організація роботи лабораторій, що використовують методи ампліфікації нуклеїнових кислот при роботі з матеріалом, що містить мікроорганізми I-IV груп патогенності» і МУ 4.2.2787-10 «Лабораторна діагностика меліоїдоза». Знезараження досліджуваних проб проводили додаванням розчину мертиолята натрію до кінцевої концентрації 0,01% і прогріванням протягом 30 хв при температурі 56°С. Виділення ДНК з чистих культур буркхольдерий, близькоспоріднених і гетерологічних мікроорганізмів проводили шляхом нуклеосорбции і лізису клітин гуанидинтиоцианатом з допомогою набору «ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНДІ Епідеміології Росспоживнагляду) у відповідності з інструкцією по застосуванню.

Специфічність розроблених праймерів Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і флуоресцентно-міченого зонда Bps-gp68-Pr оцінена на колекції з 84 штамів, з яких 48 штамів Ст. pseudomallei і 36 гетерологічних штамів мікроорганізмів (14 штамів Ст. mallei, 10 штамів Ст. cepacia, 5 штамів Ст. thailandensis і по 1 штаму�ла відсутність перехресних реакцій з близькородинними гетерологичними штамами, у тому числі з ДНК Ст. mallei, і наявність специфічної ампліфікації з усіма штамами Ст. pseudomallei.

Чутливість тест-системи оцінювали на десятикратних розведеннях бактеріальних суспензій штамів Ст. pseudomallei. У амплификационную суміш додавали по 10 мкл ДНК, виділеної з розведень від 1×105до 1×101м. к./мл Аналіз результатів показав, що за допомогою розроблених праймерів Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і флуоресцентно-міченого зонда Bps-gp68-Pr виявляють ДНК збудника меліоїдоза при концентрації в пробі 1×104м. к./мл

Таким чином, розроблені праймери Bps-gp68-f/Bps-gp68-r і флуоресцентно-мічений зонд Bps-gp68-Pr можуть бути використані для виявлення ДНК збудника меліоїдоза і дозволяють у короткий термін з високою чутливістю і специфічністю детектувати збудника меліоїдоза і диференціювати його від збудника сапу в пробах чистих культур та біологічному матеріалі.

Набір олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації Burkholderia pseudomallei і диференціації від збудника сапу методом полімеразної ланцюгової реакції з флуоресцентною детекцією, комплементарних ділянці гену, що кодує білок gp68 Ст. pseudomallei з регіону RimL ацетилтрансферази, включаючи N-ацети�нда з комплементарними кінцевими послідовностями за типом «молекулярного маяка», забезпечує флуоресцентну детекцію, що мають наступну структуру:
5'-TGCATTCGGCCTTCAACATTCCA-3'-Bps-gp68-ƒ
5'-CGGATCGCGCCATCTTGCTAC-3'-Bps-gp68-r
5'(ТАМРА)-TGCGCTTCATGATTGTCGGTGCGCA-(BHQ2)3'-Bps-gp68-Pr,
де ТАМРА - тетраметилкарбоксиродамин, флуоресцентний барвник, довжина хвилі поглинання якого становить 546 нм, а довжина хвилі флуоресценції - 576 нм; BHQ2 - гаситель флуоресценції з діапазоном гасіння 550-650 нм.



 

Схожі патенти:

Спосіб визначення генотипу людини з поліморфною позиції rs1613662 в гені gp6, кодує глікопротеїн vi

Винахід відноситься до галузі медицини, молекулярної біології та біотехнології. Запропоновано спосіб визначення поліморфізму гена GP6 людини, що кодує глікопротеїн VI, з поліморфною позиції rs 1613662, заснований на зняття кривих плавлення з флуоресцентно-міченими алель-специфічними олигонуклеотидними пробами. Завдяки збільшенню надійності визначення варіабельних позицій і можливості проводити визначення в одній пробірці на стандартному обладнанні спосіб може бути ефективно використаний для діагностики спадкових схильностей людини з реєстрацією результатів ПЛР в реальному часі. 1 іл.

Пептиди, які проникають у клітини, і їх застосування

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до інтерналізації терапевтичних молекул всередину клітини, і може бути використане в медицині. Отримують композицію для доставки молекул нуклеїнових кислот в клітини, що містить щонайменше один пептид з щонайменше 92% ідентичністю до GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); або YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), приєднаний до однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот. Винахід дозволяє підвищити ефективність доставки молекул нуклеїнових кислот всередину клітини ссавця за рахунок пептиду, здатного интернализироваться всередину клітини ссавця з ефективністю, що становить щонайменше 200% від ефективності інтерналізації пептиду ТАТ, має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1). 5 н. і 3 з.п. ф-ли, 16 іл., 1 табл., 8 пр.

Спосіб аналізу рнк

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до способу аналізу придатності РНК, екстрагованої з тканини або клітини (клітин), фіксованих за допомогою фіксатора, для аналізу експресії генів. Спосіб включає проведення електрофорезу з зазначеної РНК. Визначають, чи відповідає зазначена РНК наступному рівнянню: В/А≤1, де А являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні від 1000 до 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом, а являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні більш ніж 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом. Якщо зазначена РНК, экстрагированная з тканини або клітини (клітин), що задовольняє вказаним рівнянню, то вона придатна для аналізу експресії генів. Запропоноване винахід дозволяє швидко і з високою ефективністю визначити придатність РНК для аналізу експресії генів. 6 з.п. ф-ли, 3 іл., 11 табл., 7 пр.

Виборчий лізис клітин

Група винаходів відноситься до області лізису клітин. Запропоновано спосіб виборчого лізису клітин тварин, а також прилад для виявлення мікроорганізмів. Спосіб виборчого лізису тварин клітин в пробі води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, включає етапи забезпечення проби води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, додавання в згадану пробу неіоногенної детергенту і буферного розчину для одержання розчину зі значенням pH близько 9,5 або вище, інкубації цього розчину протягом періоду, достатнього для лізису клітин тварин. Прилад для виявлення мікроорганізмів у пробі складається з лизисной камери для прийняття проби води з тваринами клітинами, посудини з лужним буферним розчином із значенням pH 9,5 або вище і неіоногенним детергентом, або посудини з лужним буферним розчином із значенням pH близько 9,5 або більше і посудини з неіоногенним детергентом, фільтра, сполученого з лизисной камерою для фільтрування проби після лізису клітин тварин, камери індикації для аналізу присутності ДНК мікроорганізмів. Запропоновані винаходу забезпечують обробку зразка без його значного брабативать більш значні обсяги зразка і визначати низькі концентрації хвороботворних мікроорганізмів у зразку. 2 н. і 11 з.п. ф-ли, 12 іл., 8 пр.

Спосіб диференціації токсигенних генетично змінених штамів vibrio cholerae біовару ель-тор з різним епідемічним потенціалом методом мультиплексного полімеразної ланцюгової реакції та тест-система для його здійснення

Винаходи належать до галузі медичної мікробіології і стосуються способу диференціації токсигенних генетично змінених штамів V. cholerae біовару Ель-Тор і тест-системи. Охарактеризований спосіб включає проведення ПЛР з використанням специфічних праймерів до генам vc0497, vc0502 і vc0514 з острова пандемичности VSP-II. Охарактеризована тест-система містить компоненти для виділення ДНК, компоненти для проведення ПЛР, що включають, зокрема, суміш праймерів VSPIIreg-F - 5'-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3', VSPIIreg-R - 5'-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3' ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5'-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3', VSPIIpilin-R - 5'-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3' ген vc0502, VSPIIchem-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3', VSPIIchem-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3' ген vc0514, взятих у співвідношенні 1:1:1:1:1:1 відповідно. Винаходи дозволяють швидко і достовірно диференціювати токсигенні генетично змінені штами V. cholerae біовару Ель-Тор на геноварианти з низьким і високим епідемічним потенціалом. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 2 табл.

Спосіб виявлення мутацій в гені myo7a, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти і синдромом ушера

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу виявлення мутацій в гені MYO7A, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти або синдром Ушера. Спосіб включає виділення ДНК з лімфоцитів периферичної крові методом фенольно-хлороформною екстракції, проведення ПЛР, ампліфікацію 18 ділянок гена MYO7A, детекцію в денатурирующем акриламидном гелі і секвенування. ПЛР проводять з використанням спеціально підібраних послідовностей олігонуклеотидів, фланкують області 18 екзонів гена MYO7A з можливим вмістом різних мутацій. Винахід дозволяє спростити спосіб і підвищити точність визначення мутацій гена MYO7A, а також скоротити час дослідження. 3 іл., 1 пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується специфічних олігонуклеотидних праймерів. Представлені праймери включають сайти эндонуклеазного розщеплення, фланкуючі ділянки геному, що кодують глікопротеїни Gn і Gc, а також нуклеопротеин N, для отримання бібліотеки генів, що кодують глікопротеїни Gn і Gc і нуклеопротеин N вірусу лихоманки долини Ріфт. Охарактеризованное винахід може бути використаний у створенні банку нуклеотидних послідовностей, що кодують імунодомінантні білки вірусу лихоманки долини Ріфт Gn, Gc і N, які можна використовувати при створенні діагностичних і вакцинних препаратів на основі рекомбінантних технологій. 3пр.

Олігонуклеотидні праймери і спосіб виявлення днк mycobacterium avium методом полімеразної ланцюгової реакції

Винаходи належать до галузі біотехнології і стосуються олігонуклеотидних праймерів і способи виявлення ДНК Mycobacterium avium з їх використанням. Охарактеризовані олігонуклеотидні праймери комплементарни специфічної області mig-гена Mycobacterium avium і мають наступний нуклеотидний склад: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' та 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Спосіб виявлення ДНК Mycobacterium avium вимикає виділення ДНК, проведення ампліфікації ДНК з використанням олігонуклеотидних праймерів, перенесення продукту ампліфікації на гель з подальшим детектуванням результатів аналізу на трансиллюминаторе. У разі позитивної реакції синтезується фрагмент, відповідний розміру 157 п. н. Представлені винаходи можуть використовуватися у ветеринарних діагностичних і науково-практичних лабораторіях для виявлення генетичного матеріалу Mycobacterium avium у пробах. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 4 пр.

Набір синтетичних олігонуклеотидів для визначення нуклеотидної послідовності кодуючої частини генів nkx2.5, cfc1, gata4 і виявлення мутацій, асоційованих з орфанной моногенной патології, яка лежить в основі сімейних форм вроджених вад серця

Винахід відноситься до галузі кардіології і стосується набору синтетичних олигонуклотидов. Представлений набір використовується для виявлення мутацій кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4, асоційованих з орфанной моногенной патології, яка лежить в основі сімейних форм вроджених вад серця. Мутації виявляють шляхом визначення повної нуклеотидної послідовності кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4. Здійснюють ампліфікацію кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4 з допомогою 15 пар синтетичних олігонуклеотидів при одній температурі та часу відпалу з подальшим секвенированием отриманих продуктів ампліфікації за допомогою однієї пари універсальних праймерів. Запропоноване винахід дозволяє чутливо і специфічно визначати мутації генів NKX2.5, CFC1, GATA4, при цьому скорочуються час реакції ампліфікації, кількість маніпуляцій, час внесення реактивів для реакції секвенування і знижується ймовірність помилки при постановці реакції. 2 з.п. ф-ли, 1 іл., 4 табл.

Пара синтетичних олігонуклеотидних праймерів для виявлення вірусу імунодефіциту кішок і спосіб діагностики вірусного імунодефіциту кішок

Винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до пари синтетичних олігонуклеотидних праймерів, які застосовуються для виділення ДНК провірусу і РНК вірусу імунодефіциту кішок, і до способу діагностики вірусного імунодефіциту кішок з використанням даних праймерів. Пара праймерів має наступну структуру - PF: 5'-TGGAGAAGGGAATTTCAGATGGG-3' та PR: 5'-TTTGGGTCAAGTGCTACATATTGTGG-3'. Спосіб включає проведення ПЛР з детекцією отриманих результатів методом горизонтального електрофорезу в 1,5%-ному агарозному гелі. Ампліфікацію проводять в такому режимі: тотальна денатурація при 95°С протягом 5 хв, цикл денатурація при 95°С протягом 20 або 60 с, відпал при 56°С протягом 20 або 60 сек, елонгація при 72°С протягом 40 або 60 сек. Цикл денатурація - відпал - елонгація повторюється 35 разів. Проводять заключну элонгацию при 72°С протягом 5 хв. У разі наявності ампліфікованого фрагмента нуклеотидної послідовності довжиною 366 п. н. судять про наявність FIV в організмі кішки. Запропоноване винахід дозволяє провести діагностику вірусного імунодефіциту кішок з високою ефективністю. 2 н. п. ф-ли, 6 іл., 3 табл., 3 пр.
Up!