Спосіб визначення генотипу людини з поліморфною позиції rs1613662 в гені gp6, кодує глікопротеїн vi

 

1. Область техніки.

Запропонований спосіб відноситься до галузі медицини, біології та біотехнології і може бути використаний при діагностиці захворювань з генетичної складової (генетичною схильністю), прогнозування тяжкості та швидкості прогресії захворювання і алгоритму лікування захворювання в залежності від індивідуального генетичного профілю пацієнта.

Відомо, що розвиток і перебіг багатьох захворювань людини значною мірою визначається її генотипом. За останні 10-15 років отримано перші результати ідентифікації широкого спектру генетичних маркерів різних захворювань та схильності до них.

Глікопротеїни - це складні білки, в яких білкова (натуральних) частина молекули ковалентно з'єднана з однією або кількома групами гетероолігосахарідов. Глікопротеїни є важливим структурним компонентом клітинних мембран. Глікопротеїни мембран еритроцитів, специфічно глікозильованого тими чи іншими вуглеводними залишками, але мають гомологичную білкову частину, визначають групу крові у людини. Також глікопротеїнами є всі антитіла, інтерферони, компоненти комплементу, білки плазми крові, молока, рецзаболеваний людини.

Для поліморфізму в позиції rs1613662 в гені GP6, кодує глікопротеїн VI, показано взаємозв'язок з розвитком венозного тромбозу [1].

2. Рівень техніки.

Широко поширений спосіб визначення типу нуклеотиду, перебуває в певному місці ДНК, заснований на використанні алель-специфічних праймерів з реєстрацією результатів ПЛР по закінченні реакції з допомогою електрофорезу. При використанні ПЛР з реєстрацією результатів у ході реакції відомі різні способи визначення генотипу досліджуваного зразка.

Існують різні способи, що дозволяють визначити тип нуклеотиду, перебуває в певному місці ДНК, засновані на використанні алель-специфічних праймерів з реєстрацією результатів ПЛР безпосередньо в ході реакції з допомогою використання флуоресцентно-мічених проб (олігонуклеотидів) (Andreas R. Tobler at all, "THE SNPlex Genotiping System: A Flexible and Scalable Platform for SNP Genotyping", Journal of Biomolecular Techniques, V. 16, issue 4, Desember 2005).

Наприклад, в наборах виробництва Applied Biosystems використовують одну пару праймерів для кожного алелю і два зонди з різними флуорецентними мітками, в залежності від генотипу алелю фіксують розпалювання різних позначок ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006). НЂов дослідження з-за невеликої різниці між отриманими кривими флуоресценції для різних алелей.

Пропонованим підходом до детекції генетичного поліморфізму є використання двох алель-специфічних і мічених різними флуоресцентними мітками олігонуклеотидів, а також олигонуклеотида, несучого гаситель флуоресценції і гибридизирующегося на матрицю поруч з алель-специфічним олигонуклеотидом. Гібридизація алель-специфічної олигонуклеотида на матрицю веде до перенесення енергії з знаходиться на ньому флуорофора-донора на гаситель флуоресценції розташованого поруч «гасить» олигонуклеотида. Реєстрацію результатів ампліфікації ведуть по закінченні ПЛР шляхом зняття спектру флуоресценції при зміні температури реакційної суміші в діапазоні від 25 до 80 градусів за Цельсієм (так звані «криві плавлення»). При отриманні графіків флуоресценції можливий як нагрівання так і охолодження реакційної суміші в зазначеному інтервалі температур.

Пропоноване винахід робить визначення варіабельних позицій в ДНК більш надійним і здешевлює подібні дослідження завдяки використанню стандартного обладнання.

3. Розкриття винаходу.

Технічним результатом, на досягнення якого спрямоване пропоноване винахід, є підвищення доступностже він забезпечує можливість проводити дослідження в одній пробірці, що знижує витрати на дослідження.

Використаний нами спосіб генотипування є варіантом класичного методу «примикають проб». При визначенні замін поодиноких нуклеотидів спочатку проводили ПЛР з праймерами, загальними для обох варіантів послідовності, потім температуру реакційної суміші знижували для гібридизації отриманої матриці з олигонуклеотидними пробами. Для визначення варіанту послідовності використовували два типи олігонуклеотидів, гибридизирующихся на матрицю поруч. Один з олігонуклеотидів мітили флуорофором, інший - гасителем флуоресценції.

В реакції використовували один загальний олигоиуклеотид з гасителем флуоресценції і пару алель-специфічних (сіквенс-специфічних) олігонуклеотидів, несучих флуорофор. Олігонуклеотидні проби, відповідні того чи іншого варіанту послідовності, мітили різними флуорофорами, що дозволило визначати обидва варіанти в одній пробірці. Визначення генотипу проводили після ПЛР та гібридизації шляхом вимірювання рівня флуоресценції в ході термічної денатурації дуплексів олігонуклеотидів та отриманих матриць (або навпаки - гібридизації). Дане вимірювання проводили в режимі реального часу, ев температурах плавлення досконалого і недосконалого дуплексів. Таким чином, якщо аналізований зразок містив тільки один варіант послідовності, тобто був гомозиготен з даного поліморфізму, температура плавлення для проби, що утворює досконалий дуплекс, була істотно вище, ніж для проби, що утворює недосконалий дуплекс. Якщо ж аналізували гетерозиготний зразок, температури плавлення були практично однакові.

Зазначений результат досягається шляхом використання при постановці ПЛР флуоресцентно-мічених алель-специфічних олігонуклеотидних проб і праймерів:

GP6_3sGGGGTCCGTGTACCTCATACGC
GP6_3aGAGGAAACTCAGTCACGGAGATGT
GP6_3p1GCTACCGGGGAAGGTG-FAM
GP6_3p2GCTACCGAGGAAGGTG-HEX
GP6_3pqBHQ1-GTTCTGTTGGTAACCGGCT-3'-(P)

FAM означає флуоресцентний барвник FAM, HEX означає флуоресцентний барвник HEX, BHQ1 означає приєднаний до 5' - кінцевого нуклеотиду темнової гаситель флуоресценції.

Склад амплификационной суміші (на одну реакцію)

Обсяг
ПЛР - буфера*1,25-кратний18 мкл
суміш dNTP0,25 мМ (кожного)0,24 мкл
Праймери100 пМ/мклпо 0,14 мкл
Олигонуклеотиди, мічені флуорофорами100 пМ/мклпо 0,07 мкл
Олигонуклеотид, мічений гасителем флуоресценції100 пМ/мкл0,14 мкл
Taq-полімераза10 од. активності/мкл0,5 мкл
H2O (деіонізована)-до 30 мкл
Геномна ДНК-5 мкл
*Склад буфера для проведення ПЛР
84 мМ Трис-HCl pH 8,6
0,003% Tween-20
0,003% NP-40
6,25% гліцерин

4. Здійснення винаходу.

В якості матеріалу для дослідження рекомендується використовувати кров, зіскрібки букального епітелію, біоптати м'яких тканин людини або інший стандартний біологічний матеріал. Виділення ДНК із біоматеріалу проводиться з використанням комплекту реагентів для виділення ДНК (не є предметом даного патенту).

Полімеразну ланцюгову реакцію та визначення температури плавлення олігонуклеотидних проб проводили за допомогою детектирующего ампліфікатора «ДТпрайм» (ТОВ «НВО ДНК-Технологія», Росія). Використовували наступний температурний режим ампліфікації: 94°C - 10 с, 64°C - 30 с протягом 50 циклів. По завершенні реакції ампліфікації реакційну суміш охолоджували до 25°C зі швидкістю 2°C/сек. Криві плавлення одержували наступним чином: температуру реакційної суміші підвищували з 25°C до 75°C з кроком 1°C, вимірюючи рівень флуоресценції на кожному кроці.

Результати, тобто віднесення зразка до гомозиготе або гетерозиготе за даним аллелю, оцінюються за формою кривих плавлення ДНК (рис. 1).

Джерело інформації

1. Bezemer ID, Bare LA, �поділу поліморфізму гена GP6 людини, кодує глікопротеїн VI, з поліморфною позиції rs 1613662, заснований на зняття кривих плавлення з флуоресцентно-міченими алель-специфічними олигонуклеотидними пробами, що відрізняється тим, що використовують загальну для всіх алелів пару праймерів, що відрізняються для кожного алелю флуоресцентно-мічені алель-специфічні олігонуклеотидні проби і універсальний олигонуклеотид, мічений гасителем флуоресценції, при цьому перераховані вище праймери, проби і універсальний олигонуклеотид мають наступний склад:

де FAM означає флуоресцентний барвник FAM, HEX означає флуоресцентний барвник HEX, BHQ1 означає приєднаний до 5'-кінцевого нуклеотиду темнової гаситель флуоресценції, а віднесення зразка до гомозиготе або гетерозиготе за даним аллелю проводять за формою кривих плавлення ДНК (по максимуму першої похідної графіків флуоресценції), при цьому наявність одного піку на графіку свідчить про гомозиготності зразка з аллелю, відповідному більш тугоплавкої флуоресцентно-міченої алель-специфічної олигонуклеотидной пробі, а наявність двох піків на графіку свідчить про гетерозиготності зразка.



 

Схожі патенти:

Пептиди, які проникають у клітини, і їх застосування

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до інтерналізації терапевтичних молекул всередину клітини, і може бути використане в медицині. Отримують композицію для доставки молекул нуклеїнових кислот в клітини, що містить щонайменше один пептид з щонайменше 92% ідентичністю до GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); або YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), приєднаний до однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот. Винахід дозволяє підвищити ефективність доставки молекул нуклеїнових кислот всередину клітини ссавця за рахунок пептиду, здатного интернализироваться всередину клітини ссавця з ефективністю, що становить щонайменше 200% від ефективності інтерналізації пептиду ТАТ, має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1). 5 н. і 3 з.п. ф-ли, 16 іл., 1 табл., 8 пр.

Спосіб аналізу рнк

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до способу аналізу придатності РНК, екстрагованої з тканини або клітини (клітин), фіксованих за допомогою фіксатора, для аналізу експресії генів. Спосіб включає проведення електрофорезу з зазначеної РНК. Визначають, чи відповідає зазначена РНК наступному рівнянню: В/А≤1, де А являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні від 1000 до 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом, а являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні більш ніж 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом. Якщо зазначена РНК, экстрагированная з тканини або клітини (клітин), що задовольняє вказаним рівнянню, то вона придатна для аналізу експресії генів. Запропоноване винахід дозволяє швидко і з високою ефективністю визначити придатність РНК для аналізу експресії генів. 6 з.п. ф-ли, 3 іл., 11 табл., 7 пр.

Виборчий лізис клітин

Група винаходів відноситься до області лізису клітин. Запропоновано спосіб виборчого лізису клітин тварин, а також прилад для виявлення мікроорганізмів. Спосіб виборчого лізису тварин клітин в пробі води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, включає етапи забезпечення проби води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, додавання в згадану пробу неіоногенної детергенту і буферного розчину для одержання розчину зі значенням pH близько 9,5 або вище, інкубації цього розчину протягом періоду, достатнього для лізису клітин тварин. Прилад для виявлення мікроорганізмів у пробі складається з лизисной камери для прийняття проби води з тваринами клітинами, посудини з лужним буферним розчином із значенням pH 9,5 або вище і неіоногенним детергентом, або посудини з лужним буферним розчином із значенням pH близько 9,5 або більше і посудини з неіоногенним детергентом, фільтра, сполученого з лизисной камерою для фільтрування проби після лізису клітин тварин, камери індикації для аналізу присутності ДНК мікроорганізмів. Запропоновані винаходу забезпечують обробку зразка без його значного брабативать більш значні обсяги зразка і визначати низькі концентрації хвороботворних мікроорганізмів у зразку. 2 н. і 11 з.п. ф-ли, 12 іл., 8 пр.

Спосіб диференціації токсигенних генетично змінених штамів vibrio cholerae біовару ель-тор з різним епідемічним потенціалом методом мультиплексного полімеразної ланцюгової реакції та тест-система для його здійснення

Винаходи належать до галузі медичної мікробіології і стосуються способу диференціації токсигенних генетично змінених штамів V. cholerae біовару Ель-Тор і тест-системи. Охарактеризований спосіб включає проведення ПЛР з використанням специфічних праймерів до генам vc0497, vc0502 і vc0514 з острова пандемичности VSP-II. Охарактеризована тест-система містить компоненти для виділення ДНК, компоненти для проведення ПЛР, що включають, зокрема, суміш праймерів VSPIIreg-F - 5'-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3', VSPIIreg-R - 5'-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3' ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5'-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3', VSPIIpilin-R - 5'-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3' ген vc0502, VSPIIchem-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3', VSPIIchem-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3' ген vc0514, взятих у співвідношенні 1:1:1:1:1:1 відповідно. Винаходи дозволяють швидко і достовірно диференціювати токсигенні генетично змінені штами V. cholerae біовару Ель-Тор на геноварианти з низьким і високим епідемічним потенціалом. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 2 табл.

Спосіб виявлення мутацій в гені myo7a, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти і синдромом ушера

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу виявлення мутацій в гені MYO7A, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти або синдром Ушера. Спосіб включає виділення ДНК з лімфоцитів периферичної крові методом фенольно-хлороформною екстракції, проведення ПЛР, ампліфікацію 18 ділянок гена MYO7A, детекцію в денатурирующем акриламидном гелі і секвенування. ПЛР проводять з використанням спеціально підібраних послідовностей олігонуклеотидів, фланкують області 18 екзонів гена MYO7A з можливим вмістом різних мутацій. Винахід дозволяє спростити спосіб і підвищити точність визначення мутацій гена MYO7A, а також скоротити час дослідження. 3 іл., 1 пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується специфічних олігонуклеотидних праймерів. Представлені праймери включають сайти эндонуклеазного розщеплення, фланкуючі ділянки геному, що кодують глікопротеїни Gn і Gc, а також нуклеопротеин N, для отримання бібліотеки генів, що кодують глікопротеїни Gn і Gc і нуклеопротеин N вірусу лихоманки долини Ріфт. Охарактеризованное винахід може бути використаний у створенні банку нуклеотидних послідовностей, що кодують імунодомінантні білки вірусу лихоманки долини Ріфт Gn, Gc і N, які можна використовувати при створенні діагностичних і вакцинних препаратів на основі рекомбінантних технологій. 3пр.

Олігонуклеотидні праймери і спосіб виявлення днк mycobacterium avium методом полімеразної ланцюгової реакції

Винаходи належать до галузі біотехнології і стосуються олігонуклеотидних праймерів і способи виявлення ДНК Mycobacterium avium з їх використанням. Охарактеризовані олігонуклеотидні праймери комплементарни специфічної області mig-гена Mycobacterium avium і мають наступний нуклеотидний склад: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' та 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Спосіб виявлення ДНК Mycobacterium avium вимикає виділення ДНК, проведення ампліфікації ДНК з використанням олігонуклеотидних праймерів, перенесення продукту ампліфікації на гель з подальшим детектуванням результатів аналізу на трансиллюминаторе. У разі позитивної реакції синтезується фрагмент, відповідний розміру 157 п. н. Представлені винаходи можуть використовуватися у ветеринарних діагностичних і науково-практичних лабораторіях для виявлення генетичного матеріалу Mycobacterium avium у пробах. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 4 пр.

Набір синтетичних олігонуклеотидів для визначення нуклеотидної послідовності кодуючої частини генів nkx2.5, cfc1, gata4 і виявлення мутацій, асоційованих з орфанной моногенной патології, яка лежить в основі сімейних форм вроджених вад серця

Винахід відноситься до галузі кардіології і стосується набору синтетичних олигонуклотидов. Представлений набір використовується для виявлення мутацій кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4, асоційованих з орфанной моногенной патології, яка лежить в основі сімейних форм вроджених вад серця. Мутації виявляють шляхом визначення повної нуклеотидної послідовності кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4. Здійснюють ампліфікацію кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4 з допомогою 15 пар синтетичних олігонуклеотидів при одній температурі та часу відпалу з подальшим секвенированием отриманих продуктів ампліфікації за допомогою однієї пари універсальних праймерів. Запропоноване винахід дозволяє чутливо і специфічно визначати мутації генів NKX2.5, CFC1, GATA4, при цьому скорочуються час реакції ампліфікації, кількість маніпуляцій, час внесення реактивів для реакції секвенування і знижується ймовірність помилки при постановці реакції. 2 з.п. ф-ли, 1 іл., 4 табл.

Пара синтетичних олігонуклеотидних праймерів для виявлення вірусу імунодефіциту кішок і спосіб діагностики вірусного імунодефіциту кішок

Винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до пари синтетичних олігонуклеотидних праймерів, які застосовуються для виділення ДНК провірусу і РНК вірусу імунодефіциту кішок, і до способу діагностики вірусного імунодефіциту кішок з використанням даних праймерів. Пара праймерів має наступну структуру - PF: 5'-TGGAGAAGGGAATTTCAGATGGG-3' та PR: 5'-TTTGGGTCAAGTGCTACATATTGTGG-3'. Спосіб включає проведення ПЛР з детекцією отриманих результатів методом горизонтального електрофорезу в 1,5%-ному агарозному гелі. Ампліфікацію проводять в такому режимі: тотальна денатурація при 95°С протягом 5 хв, цикл денатурація при 95°С протягом 20 або 60 с, відпал при 56°С протягом 20 або 60 сек, елонгація при 72°С протягом 40 або 60 сек. Цикл денатурація - відпал - елонгація повторюється 35 разів. Проводять заключну элонгацию при 72°С протягом 5 хв. У разі наявності ампліфікованого фрагмента нуклеотидної послідовності довжиною 366 п. н. судять про наявність FIV в організмі кішки. Запропоноване винахід дозволяє провести діагностику вірусного імунодефіциту кішок з високою ефективністю. 2 н. п. ф-ли, 6 іл., 3 табл., 3 пр.

Набір олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації рнк вірусу лихоманки долини ріфт методом від плр у реальному часі

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до набору олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації вірусу лихоманки долини Ріфт методом назад транскриптазной полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Винахід дозволяє ефективно ідентифікувати вірус лихоманки долини Ріфт. 2 іл., 2 табл., 2 пр.
Up!