Спосіб отримання концентрату фібриногену

 

Винахід відноситься до галузі фармацевтичної промисловості, а саме до біотехнології отримання гемостатичних препаратів. Фібриноген синтезується в печінці і секретується в плазму в концентраціях, достатніх для згортання крові. Фібриноген являє собою розчинну глікопротеїн, який перетворюється під дією тромбіну в фібрин, мережа волокон якого є основою згустку, що забезпечує гемостаз. Крім гемостатичної функції фібриноген-бере участь у загоєнні ран, розвитку пухлин і в метастазуванні (Посібник для лікарів-лаборантів з методів дослідження плазмового гемостазу. Фактори згортання крові. 2008, Москва, с. 7).

Вроджений дефіцит фібриногену (гіпофібриногенемія) може порушити гемостаз і привести до кровотеч. Більш поширеним є набутий дефіцит фібриногену, який може бути наслідком гемодилюції, крововтрати, процесу дисемінованого внутрішньосудинного згортання (ДВЗ-синдром), а також при сепсисі (Братчик A. M. Клінічні проблеми фібринолізу. 1993, Київ, с. 151-172).

Спадковий або набутий дефіцит фібриногену викликає розвиток гіпофібриногенемії, основним методом лікування і профілактики до�лярние основи згортання крові і тромбоутворення. 2000, Казань, с. 1-32).

У замісної терапії хворих гипофибриногенемией і для її профілактики застосовують препарати, що містять фібриноген.

Крім замісної терапії препарати на основі отриманого концентрату фібриногену можуть бути використані в хірургічній практиці в якості компонента фібринового клею. Склад такого клею дозволяє проводити операції на великих ранових поверхнях, чи то операції в місцях з великим ступенем васкуляции, або обробка великих поверхонь опіків, що прискорює процес регенерації покривних тканин (Зильберт А. П. Крововтрата і гемотрансфузія. Принципи і методи безкровної хірургії. 1999, Петрозаводськ, с. 55-62).

До проблем виробництва препаратів на основі фібриногену з плазми крові людини слід віднести:

- можливість інфікування реципієнта вірусами гепатитів (A, B, C), імунодефіциту людини, парвовирусом, сифілісом та іншими патогенами,

- можливість перенесення реципієнту з певною групою крові групи присутніх у препаратах (концентрати середньої чистоти) антитіл до антигенів еритроцитів інших груп крові,

- контамінація препаратів на основі фібриногену баластними білками,

Для вирішення цих проділ ретельно перевірених здорових донорів, у яких визначають можливе інфікування вірусами гепатиту, імунодефіциту людини та ін Однак для повної гарантії відсутності вірусної інфекції в процесі отримання концентратів фібриногену здійснюють вірусну інактивацію.

Відомий спосіб отримання концентрату фібриногену висаливанием з використанням спирто-сольового холодового осадження» (Препарати крові. Інструктивно-методичні матеріали з контролю і виробництва. - М., 1976, стор 145-202). Цей метод вимагає великих часових і енергетичних витрат, приготування складних буферних сольових розчинів і необхідності їх подальшого відмивання, що робить процес громіздким, а тривалість процедури призводить до значних втрат продукту в ході отримання. Спосіб не може бути рекомендований для виробництва препарату з малих кількостей крові.

Осадження фібриногену сульфатом амонію також вимагає подальшого очищення продукту від сольових розчинів, що веде до додаткових технологічних складнощів» (Патент UA №2062103). Концентрати фібриногену, отримані криопреципитацией, успішно застосовуються в зарубіжній хірургічній практиці» (Патент UA №2062103), однак досягається при цьому концентрація фібриногену залишається�ата фібриногену, представлений в Патенті US 4960757.

Спосіб полягає в отриманні концентрату фібриногену з осаду, що містить фібриноген, отриманого в процесі виділення препарату фактора VIII, здійснюваного згідно патенту German Patent No. 2916711. Вихідна сировина розчиняють в буфері, що містить NaCl, при нагріванні до 37°с і перемішуванні з підтриманням pH=7,5 2N розчином NaOH. Далі до концентрату фібриногену додають розчин CaCl2.2H2O і сахарозу до концентрації 60% в кінцевому розчині. Далі розчин фібриногену зі стабілізаторами піддають термічній пастеризації на водяній бані при температурі 60°C з метою інактивації вірусів і інших патогенів. Після пастеризації розчин фібриногену розбавляють буфером, що містить хлорид натрію і цитрат натрію та двократному переосаждают гліцином. Недоліком даного методу є зменшення концентрації фібриногену в кінцевому продукті із-за часткової полімеризації на стадії термоінактивації. Утворився на даній стадії фібрин відокремлюють дворазовим переосаждением гліцином. Тим самим вихід з фибриногену на кінцевій стадії стає менше.

Метою цього винаходу була розробка способу отримання очищеного фібриногену. Дана циногена. Перевагою цього методу є виділення використання буферного розчину, що містить антикоагулирующий агент - цитрат натрію. Так само одним з переваг є використання Tween-80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитан) і TnBP (три-н-бутилфосфат) в якості детергентів при проведенні вірусної інактивації. У цьому методі також проводиться процедура очищення концентрату фібриногену від продуктів процесу вірусної інактивації.

Технологія передбачає розчинення вихідної сировини (кріопреципітат свіжозамороженої плазми людини) у воді в присутності 1-3 од. гепарину, обробку розчину кріопреципітату гелем гідроксиду алюмінію, осадження фібриногену 20-30% розчином ПЭГа, подальше розчинення відібраного осаду в буфері з цитратом натрію та хлоридом натрію, вірусну інактивацію розчину сольвент/детергентами Tween-80 і TnBP протягом 6-10 годин, видалення продуктів інактивації і інактивують агентів екстракцією розчину вазеліновим маслом, очищення від баластних білків дворазовим переосаждением гліцином з концентрацією 1-2.5 моль/л, подальше стерильну фільтрування, розлив і лиофилизацию.

Розробку технології виділення фібриногену спочатку проводили в лаборатоизводства. Виробництво препарату фібриногену здійснювали у відповідності з правилами Належної Виробничої Практики (GMP), стандартними операційними процедурами (СОП) і необхідними умовами стерильності».

Сировиною для одержання концентрату фібриногену був заморожений кріопреципітат свіжозамороженої плазми людини.

На всіх стадіях виробництва вихідне сировину, проміжні продукти і цільової препарат тестували за вмістом фібриногену методом Клауса.

Нижче представлений конкретний приклад здійснення винаходу.

Приклад

1. Вихідна сировина (кріопреципітат свіжозамороженої плазми) в кількості 100 р. розчиняють у трикратному об'ємі дистильованої води, що містить 1-3 од. гепарину і додають 3%-ний гель Al(ОН)3(у співвідношенні: на 1 кг зваженого кріопреципітату - 10 г гідроксиду алюмінію).

2. Далі до отриманої суміші додають 30%-ний розчин ПЭГа, до концентрації 3%, а рн розчину доводять до величини, близької до ізоелектричної точці фібриногену (6,6-6,8) розчином оцтової кислоти. Під дією ПЭГа фібриноген випадає в осад, який відокремлюють від супернатанту центрифугуванням. Далі супернатант передають на виробництво очищеного фактора VIII.

4. Вірусну інактивацію фібриногену проводять у присутності 1% Tween-80®і 0,3% TnBP, інкубуючи отриманий розчин при кімнатній температурі при безперервному перемішуванні протягом 6-10 годин.

5. Видалення продуктів інактивації і инактивируюших агентів проводять екстракцією розчину фібриногену вазеліновим маслом. Для цього до вирусинактивированному концентрату фібриногену додають вазелінове масло в пропорції 2:1 та інтенсивно перемішують 20 хв. Далі суміш центрифугують при 2000 об/хв 10 хвилин і відокремлюють водний шар. Цю процедуру проводять триразово.

6. Відділення фібриногену від баластних білків проводять переосаждением отриманого концентрату фібриногену гліцином, доводячи його концентрацію в розчині до 1,5 моль/л. При цьому утворюється осад фібриногену, а більшість баластних білків залишаються в розчині. Осанок фібриногену відокремлюють центрифугуванням при 4000 об/хв протягом 10 хвилин і розчиняють в розчині, що містить 10 ммоль цитрату натрію і 0,15 моль хлориду натрію. Процедуру повторюють двічі, щоразу відмиваючи осад ф�адміністрації 25 г/л, піддають стерильної фільтрації, розливають по флаконам і лиофилизируют. Отриманий порошок закупорюють під вакуумом, флакони обжимають алюмінієвими ковпачками і піддають термоінактивації при 80°C протягом 72 годин.

Вихід за фибриногену становить близько 55%.

Спосіб виділення очищеного концентрату фібриногену, позбавленого від вірусів, що полягає в солюбілізації вихідної сировини, представленого кріопреципітатом свіжозамороженої плазми людини, осадженні фібриногену 20-30% розчином ПЕГ, розчиненням відібраного осаду в буфері з цитратом натрію та хлоридом натрію, вірусної інактивації розчину сольвент-детергентним методом у присутності 1-3% Tween-80 і 0,1-1,5% три-н-бутилфосфата, очищення отриманого концентрату від продуктів вірусної інактивації і сольвент-детергентів екстракцією вазеліновим маслом, проводиться триразово, подальшому переосаждении отриманого концентрату фібриногену 1,0-2,5 М розчином гліцину, стерильної фільтрації і лиофильном висушуванні з подальшим укупориванием лиофилизата під вакуумом і термоинактивацией.



 

Схожі патенти:

Рекомбінантний фактор viii, володіє підвищеною стабільністю

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до рекомбинантному фактору VIII, який містить одну або більше мутацій, що призводять до збільшення стабільності як фактора VIII, так і фактора VIIIa, а також до фармацевтичної композиції для лікування гемофілії її містить. Також розкрито молекула нуклеїнової кислоти, що кодує вищевказаний рекомбінантний фактор VIII, а також вектор експресії і клітини-господарі, що містять зазначену молекулу нуклеїнової кислоти. Винахід відноситься до способу отримання зазначеного фактора VIII, а також його застосування в способі лікування гемофілії А у тварини. Винахід дозволяє отримати біологічно активний фактор VIII з підвищеною стабільністю. 8 н. і 42 з.п. ф-ли, 12 іл., 5 табл., 9 пр.

Спосіб очищення білка фактора згортання viii і спосіб стабілізації білка фактора viii

Спосіб очищення білка Фактора згортання VIII з розчину містить: а) контактування білка з мультимодальної смолою або смолою змішаного типу дії, що містить ліганди, які включають гідрофобну частину і негативно заряджену частину; b) элюцию білка элюирующим буфером, що містить щонайменше 1,5 М солі і щонайменше 40% (вага/об'єм) етиленгліколю, пропіленгліколю або їх суміші і іони кальцію. Спосіб являє собою одностадійний хроматографічний процес, при якому відбуваються захоплення і очищення білка Фактора згортання VIII, який не потребує доведення рН або електропровідності в ході стадії завантаження. Спосіб стабілізації білка Фактора згортання VIII, при якому відбуваються захоплення і стабілізація білка Фактора згортання VIII за один прохід білка через колонку з мультимодальної смолою, яка містить ліганди, які включають гідрофобну частину і негативно заряджену частину, і элюция білка элюирующим буфером, що містить щонайменше 1,5 М солі і щонайменше 40% (вага/об'єм) етиленгліколю, пропіленгліколю або їх суміші і іони кальцію. Винахід забезпечує скорочення обсягу колонки приблизно в 250 разів і «коефіцієнт очищення», щонайменше дорівнює 30, високий показник ст

Поліпшення титру поліпептиду фактора viii в клітинних культурах

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до продукції терапевтично активних поліпептидів з використанням клітин ссавців, і може бути використане для продукування поліпептиду фактора VIII

Спосіб виділення плазміногену або плазміну в присутності фібриногену з суміші

Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використане для виділення плазміногену або плазміну

Сайт-спрямована модифікація fviii

Винахід відноситься до галузі молекулярної біології і біохімії і може бути використане в медицині

Видалення плазмін(оген)а з білкових розчинів

Винахід відноситься до галузі біохімії та може бути використано у фармацевтичній промисловості для очищення сумішей природного походження, що містять плазміноген і фібриноген, від плазміногену
Винахід відноситься до галузі біотехнології, зокрема до способу виділення проурокинази М5 із тілець включення, що містять дану проурокиназу. Спосіб включає стадії руйнування тілець включення, ренатурація та очищення білка. Перед проведенням ренатурації проводять передочистку білка хроматографією на Q-Сефарозе і SP-Сефарозе з використанням суміщених колонок з Q - і SP-Сефарозой. Проводять, після ренатурації, хелатні і іонообмінну хроматографію рекомбінантної проурокинази М5 без проміжної елюції цільового білка з використанням металлхелатного сорбенту, активоване іонами Со2+ і Zn2+. Запропоноване винахід дозволяє виділяти проурокиназу М5 із тілець включення, що містять дану проурокиназу, з високим виходом. 2 н. і 2 з.п. ф-ли, 2 табл., 4 пр.

Способи очищення однодоменних антигенсвязивающих молекул

Винахід відноситься до області отримання та виділення однодоменних молекул (SDAB). Описаний спосіб виділення та очищення SDAB молекули, яка являє собою трехвалентную молекулу нанотела ATN-103, спрямовану на TNFα та HAS, з суміші, що містить зазначену SDAB молекулу і одне або більше забруднюючих речовин. Призводять суміш в контакт з катионообменним носієм в умовах, які дозволяють SDAB молекулі зв'язуватися з носієм або абсорбуватися на носії. Видаляють одне або більше забруднюючих речовин і селективно элюируют SDAB з носія. При цьому провідність середовища для кондиціонування (СМ), що використовується для завантаження носія, складає приблизно від 12 до 9 мСм/см і рН в умовах завантаження коригують до величини від 4,0 до 4,3. Буфер для элюирования відповідає приблизно 50 мМ хлориду натрію або менше і має рН від 5,5 до 7,2. Розкрито спосіб або процес отримання рекомбінантного SDAB ATN-103. Підтримують клітку-господаря в умовах, при яких експресується рекомбінантна SDAB ATN-103. Отримують суміш SDAB молекули і одного або більше забруднюючих речовин. Очищають або виділяють SDAB ATN-103, використовуючи катионообменную хроматографію, як зазначено вище. Використання винаходу забезпечує нові способи пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використане для одержання антимікробних білків і пептидів комахи. Спосіб одержання комплексу антимікробних пептидів комахи передбачає інфікування жирового тіла комахи на стадії личинки бактеріями Micrococcus luteus А270 і Escherichia coli D31 з подальшим витяганням жирового тіла комахи на стадії личинки. Жирове тіло комахи поміщають в живильне середовище, що містить водний розчин цукру, неорганічних солей і антибіотик меропенем в заданому співвідношенні і інкубують протягом доби з наступною элюцией комплексу антимікробних пептидів комахи з культуральної рідини методом обращенно-фазової хроматографії на колонці Vydac С18 при лінійному градієнті ацетонітрилу від 0% до 50%. Винахід дозволяє спростити спосіб одержання антимікробних пептидів. 5 іл., 4 пр.

Спосіб отримання діацетату трипептиду

Винахід відноситься до області пептидної хімії і стосується отримання діацетату трипептиду H-β-Ala-Pro-DabNHBzl, що відноситься до біологічно активного з'єднання, що використовується в косметичній промисловості в якості активного компонента для косметичних засобів, зокрема для стимуляції омолодження шкіри, розгладження зморшок, запобігання появи зморшок. Спосіб заснований на 6-стадийном синтезі і не містить стадій постановки і зняття захисних груп. Спосіб включає ацилювання проліну β-хлорпропионилхлорида, подальше отримання пентафторфенилового ефіру N-(3-хлорпропионил)проліну в присутності N,N'-дициклогексилкарбодиимида. Далі конденсацією отриманого пентафторфенилового ефіру з монометиловим ефіром глутамінової кислоти одержують N-(β-хлорпропионил)-Pro-Glu(δ-OMe)OH. Здійснюють амідування бензиламином, одночасний наступний аммонолиз і заміщення хлору на аміногрупу. Отримують трипептид β-Ala-Pro-Glu(δ-NH2)NHBzl, здійснюють перегрупування по Гофману з використанням діацетату йодобензола і отримують цільовий продукт. Спосіб відрізняється простотою, ефективністю, є більш економічним, використовує більш доступні і дешеві реагенти. 6 пр.

Спосіб виділення інгібітора секреції сидерофоров, синтезованого pgm-штамами y. pestis і виділений інгібітор

Група винаходів стосується інгібітора секреції сидерофоров (SSI) та способу його виділення. Представлений спосіб отримання SSI включає наступні етапи. Штам Yersinis pestis КМ 1279 вирощують на 1,5% агарі LB, бактерії триразово відмивають холодним забуференним фізрозчином. Бактерії осаджують центрифугуванням, суспендують в розчині 5 мМ NaOH, витримують при 37°C дві години і осаджують клітини центрифугуванням. Супернатант відбирають і процедуру повторюють тричі, три супернатанту об'єднують і фільтрують через нітроцелюлозну мембрану. Фільтрат триразово екстрагують сумішшю хлороформ-метанол-вода у співвідношенні 5:2:1. Хлороформние фракції відокремлюють центрифугуванням, об'єднують і звільняють від водорозчинних домішок. Водну фракцію відокремлюють центрифугуванням і видаляють, а хлороформную фракцію висушують у вакуумному роторному випарнику і отримують сухий препарат SSI. Запропонований SSI характеризується коричневим забарвленням сухих кристалів, гідрофобними властивостями, флуоресценцією в ультрафіолеті, липопептидной природою, присутністю іонів заліза, молекулярною масою 380,6 Так. Представлені винаходи дозволяють отримати природний регулятор вірулентності збудника чуми. 2 н. п. ф-ли, 3 іл., 3 фоп

Спосіб очищення рекомбінантного білка интерфероноподобного фактора iii типу

Винахід відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано спосіб одержання рекомбінантного білка интерфероноподобного фактора III типу (ІПФ III) штаму-продуцента E. coli. Здійснюють відмивання і розчинення тел включення E. coli з використанням 2% водного розчину γ-циклодекстрину. Далі послідовно проводять хроматографії на Ni-Sepharose, Q-Sepharose і SP-Sepharose. Далі здійснюють рефолдинг цільового білка з використанням суміші цистеаміну і цистамина при рН 10,5. Потім послідовно проводять хроматографії на Amberchrome Profile ХТ20, Amberchrome Profile HPR10 і Kromasil 300-5С18. Винахід дозволяє оптимізувати умови очищення ІПФ III на етапах відмивки і розчинення тел включення клітин E. coli і забезпечує 12% вихід цільового білка.3 іл., 4 пр.

Пептидил-диацилглицериди

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до імуностимулюючу з'єднанням, і може бути використане в медицині. Імуностимулюючий пептид з амінокислотною послідовністю XLYDKGYTSKEQKDCVGI, де N-кінцевий X являє собою N-ацетилаланин, ковалентно пов'язують з жирними кислотами, обраними з С2-С25, з отриманням PDAG (пептидил-2,3-диацилглицерида). Отримане з'єднання використовують у складі фармацевтичної композиції для стимуляції імунної відповіді. Винахід дозволяє ефективно стимулювати імунну відповідь у індивідуума і посилювати імуногенність антигенного пептиду при сумісному введенні його з PDAG. 6 н. і 23 з.п. ф-ли, 10 іл., 9 пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано спосіб отримання пептидів. Проводять автолиз дріжджів. Відокремлюють клітинні оболонки центрифугуванням. Очищають автолизат на гелевому сульфокатионите у водневій формі, що містить 12-16% дивінілбензолу. Одержаний водний розчин пептидів послідовно пропускають через гелевий аніоніт до отримання розчину з рН 2,0-2,6, а потім через гелевий катіоніт з вмістом дивінілбензолу 1-2% або макропористий катіоніт. Перевагою заявленого способу є отримання пептидів високої міри очищення, які володіють біологічною активністю. 11 пр.

Очищення поліпептидів

Винахід відноситься до очищення різних гамма-карбоксильованих форм поліпептиду з використанням іонообмінної хроматографії. Зокрема, згідно винаходу запропоновано спосіб очищення поліпептиду, що має бажане вміст гамма-карбоксиглутаминовой кислоти, з зразка, що містить суміш варіантів зазначеного поліпептиду, мають різні вмісту гамма-карбоксиглутаминовой кислоти, при цьому зазначений спосіб включає стадії: (а) завантаження зазначеного зразка на анионообменний хроматографічний матеріал; (b) элюирования зазначеного поліпептиду з використанням розчину при рН менше ніж 9,0, що містить щонайменше одну сіль, обрану з ацетату амонію, хлориду амонію і ацетату натрію; і (с) відбору фракції, отриманої після зазначеного элюирования, при цьому поліпептиди в даній фракції мають бажане вміст гамма-карбоксиглутаминових кислот. 7 з.п. ф-ли, 13 іл., 6 табл., 7 пр.

Композиція, що містить антитіло, яке пов'язується з доменом ii her2, і його кислі варіанти

Винахід відноситься до біотехнології. Запропонована композиція антитіла для лікування HER2-позитивного раку, що містить в якості активного початку антитіло, що характеризується наявністю змінної області легкої і важкої ланцюга, і його кислі варіанти, а саме: глікозильований, дезаминированний варіанти, а також варіант з відновленої дисульфидной зв'язком, сиалилированний варіант і невосстанавливаемий варіант. При цьому кількість кислих варіантів становить менш ніж приблизно 25%. Описані фармацевтичний склад, що містить таку композицію для лікування HER2-позитивного раку і спосіб одержання композиції, що включає оцінку кислих варіантів з підтвердженням того, що їх кількість становить менше ніж приблизно 25%. Використання винаходу забезпечує нову композицію, в якій саме антитіло і його кислі варіанти мають подібні фармакокінетичні параметри, що може знайти застосування в терапії HER2-позитивного раку. 3 н. і 11 з.п. ф.-ли, 17 іл., 1 табл., 1 пр.

Активована лейкоцитарна композиція

Група винаходів відноситься до медицини і стосується способу виготовлення активованої лейкоцитарної композиції, що включає інкубацію лейкоцитів людини, піддає лейкоцитів гипоосмотическому шоку і додавання до лейкоцитам фізіологічно прийнятного сольового розчину в кількості, достатній для відновлення ізотонічни. Група винаходів також стосується застосування: активованої лейкоцитарної композиції у виготовленні ліків для лікування ран; пов'язки для лікування ран, що містить зазначену композицію. Група винаходів забезпечує одержання композиції, яка володіє в 90 разів великою кількістю лейкоцитів порівняно зі способами, відомими з рівня техніки. 6 н. і 10 з.п. ф-ли, 3 іл., 6 табл., 3 пр.
Up!