Пептиди, які проникають у клітини, і їх застосування

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ

Даний винахід відноситься до виявлення і визначення функціональних характеристик пептидів людини, проникають у клітини (CPP), і їх застосування, зокрема, в якості носіїв при трансфекції.

ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Плазматична мембрана клітини являє собою ефективний бар'єр, що запобігає надходження в клітину більшості молекул, які не піддаються активному транспорту, але тим самим також може цільова доставка терапевтичних субстанцій. Лише невеликий набір молекул, що володіють певною молекулярною масою, полярністю та/або сумарним зарядом, здатні (пасивно) дифундувати крізь клітинні мембрани. Всі інші молекули повинні активно транспортуватися, наприклад, за допомогою рецептор-опосередкованого эндоцитоза або з допомогою АТФ-зв'язуючих транспортних молекул. Крім того, можна також штучно створити умови, які змушують молекули проходити через клітинну мембрану, наприклад, за допомогою електропорації, катіонних ліпідів/ліпосом, мікроін'єкції, вірусної доставки або інкапсуляції в полімерах. Однак ці способи в основному застосовують для доставки гідрофобних молекул. Дополнительноено системами in vitro, не дозволяють цим способам стати ефективним інструментом доставки лікарських препаратів або інших терапевтично активних агентів в клітини з метою профілактики або лікування медичних станів.

Зокрема, необхідність цільової доставки також виявилося суттєвою проблемою при розробці лікарських препаратів на основі РНКі (РНК-інтерференції). Такі агенти включають малі молекули РНК (наприклад, siРНК, mirna або shРНК), які перешкоджають експресії генів, що викликають захворювання або сприяють розвитку захворювання. Після того, як в 2001 р. наявність РНКі було продемонстровано в клітинах ссавців (Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature 411, 494-498), швидко стало зрозуміло, що цей сіквенс-специфічний механізм посттранскрипционного сайленсинга генів можна застосовувати для розробки нового класу лікарських препаратів, який також може стати перспективним засобом лікування захворювань, які досі були недоступні для терапевтичного втручання (De Fougerolles, A. et al. (2007) Nat. Rev. Drug Discov. 6, 443-453).

Однак, так як РНКі відбувається в цитозолі, то для прояву свого терапевтичної дії будь-які лікарські препарати на основі РНК повинні проходити через клітинну мем�oeder; А. et al. (2010) J. Intern. Med. 267, 9-21), вірусних носіїв (Liu, Y. P: and Berkhout, B. (2009) Curr. Top.Med. Chem. 9, 1130-1143) і полікатіонних наночастинок (Howard, K. A. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 710-720).

Ще одним способом переміщення молекул через клітинну мембрану є застосування пептидів, що проникають у клітини (CPP) (званих також доменами білкової трансдукції (PTD) або послідовностями транслокації через мембрану (MTS); див. огляд, наприклад, у публікації: Fonseca, B S. et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 953-964; Heitz, F. et al. (2009) Br. J. Pharmacol. 157, 195-206).

CPP представляють собою гетерогенну групу пептидних молекул - з точки зору як їх первинних амінокислотних послідовностей, так і їх структур. Відомі приклади CPP включають домен транслокації HIV-1 TAT (Green; M. and Loewenstein, P. M. (1988) Cell 55, 1179-1188) і гомеодомен білка Antennapedia з Drosophila (Joliot; A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868). Точний механізм транслокації до цих пір залишається спірним питанням. Дослідження мутацій білка Antennapedia виявили, що послідовність з 16 амінокислот, звана пенетратином або pAntp (Derossi, D. et al. (1994) J. Товарbiol. Chem. 269, 10444-10450), є необхідним і достатнім чинником для транслокації через мембрану. Надалі були розроблені інші отримані з білків пептиди CPP, такі як основна послідовність бел� (Oehlke, J. et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1414, 127-139).

Показано, що з'єднання антисмислової ДНК або пептидо-нуклеїнових кислот (PNA) з пептидами CPP дає необхідний ефект in vivo. Однак досі обговорюється, які властивості необхідні пептиду CPP для прояву транслокационной функції. В загальному випадку між різними пептидами CPP було виявлено мало схожості з точки зору послідовності та/або структури. На даний момент відомо тільки одна загальна властивість - це досить високий вміст основних (позитивно заряджених) амінокислот, яке обумовлює позитивний сумарний заряд. Таким чином, висловлено припущення, що пептиди CPP спочатку зв'язуються з негативно зарядженими групами головки ліпідів або білками (протеогликанів) на клітинній мембрані. Однак після зв'язування пептиди залишаються всередині мембрано-зв'язаних компартментів. Механізм поглинання на подальших етапах досі активно обговорюється. Припускають, що пептиди CPP або «ретроградно» транспортуються в ЕПР, де вони потрапляють під дію існуючого в клітці механізму транслокації (Fischer, R. et al. (2004) J. Товарbiol. Chem. 279, 12625-12635), або вони безпосередньо транслоцируются через мембрану (Rothbard, J. B. et al. (2005) Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 495-504). У зав вони интернализируются всередині везикул, в основному залишаються всередині цих везикул, і тільки незначна частина вивільняється в цитоплазму.

Багато пептиди CPP мають серйозні побічні ефекти на клітини, на які вони діють, і це не дивно з урахуванням того факту, що більшість пептидів, від яких відбуваються CPP, функціонують як, наприклад, протимікробних субстанцій або токсинів. Наприклад, пептиди CPP можуть викликати витікання цитоплазми з-за пошкодження мембрани, а також надавати заважає вплив на нормальне функціонування мембранних білків. Пептиди CPP можуть також демонструвати цитотоксичні ефекти, прикладом може служити, транспортан, який впливає на ГТФазную активність (Soomets, U. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1467, 165-176). Крім того, накопичується все більше доказів того, що багато пептиди CPP виконують свою функцію лише в певних, дуже специфічних умовах, які неможливо забезпечити в системі in vivo. Ще один недолік полягає в тому, що, залежно від клітини-мішені, пептиди CPP можуть піддаватися швидкої деградації в клітинах. Нарешті, так як багато відомих пептиди CPP походять від білків, які не є білками людини, регулярно відзначалися токсичні та/або імун у людини.

Таким чином, зберігається потреба в покращених пептидах, що проникають у клітини, які дозволять подолати всі зазначені вище обмеження. Зокрема, є потреба в пептидах, що проникають у клітини, які являють собою придатні везикули або носії для трансфекції, що дозволяють здійснювати доставку сполук, таких як терапевтичні агенти, в клітини-мішені з високою ефективністю, але без прояву суттєвих цитотоксичних та/або імуногенних ефектів.

Крім того, зберігається потреба в композиціях, що містять такі пептиди CPP, а також у способах, в яких такі пептиди CPP застосовуються в якості молекулярного інструменту для діагностичних і терапевтичних застосувань.

Відповідно, мета цього винаходу - запропонувати такі пептиди CPP і відповідні композиції і способи.

СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ

Однією з особливостей справжнього винаходу є те, що воно відноситься до пептидного молекулі, яка може бути интернализирована всередину клітини, при цьому це молекула (a) має довжину щонайменше 10, переважно - щонайменше 15 амінокислотних залишків; (b) містить у своїй первинній амінокислотної последостатков; (c) интернализируется всередину клітини з ефективністю, що становить щонайменше 80%, переважно - щонайменше 90% від ефективності інтерналізації пептиду TAT, що має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1).

На конкретних прикладах втілення принаймні частина пептиду утворює альфа-спіральну вторинну структуру.

Переважно, пептид є пептидом ссавців, зокрема, переважно, відбувається від молекули людини.

У додаткових кращих варіантах втілення пептид має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з:

(SEQ ID NO: 2);

(SEQ ID NO: 3);

(SEQ ID NO: 4);

(SEQ ID NO: 5);

(SEQ ID NO: 6);

(SEQ ID NO: 7);

(SEQ ID NO: 8);

(SEQ ID NO: 9);

(SEQ ID NO: 10); і при цьому амінокислотна послідовність має по всій своїй довжині щонайменше 70%, переважно - щонайменше 80% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей ледовательность, обрану з групи, що складається з:

(SEQ ID NO: 2);

(SEQ ID NO: 3);

(SEQ ID NO: 4); і при цьому амінокислотна послідовність має по всій своїй довжині щонайменше 70%, переважно - щонайменше 80% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 4.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, кодує пептид, зазначений у цьому документі вище.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до вектора, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, описаних у цьому документі вище.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до клітини-господаря, що містить вектор, що описаний в цьому документі вище.

Додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до способу отримання пептиду, зазначеного в цьому документі вище, включає: (a) культивування клітини-господаря, зазначеної в цьому документі вище, в придатних умовах; та (b) виділення отриманого пептиду.

Ще однією особливістю насанний в цьому документі вище, приєднаний до будь молекулі, обраної з групи, що складається з однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот, одного або декількох пептидів або білків, однієї або декількох малих молекул і однієї або декількох наночастинок, при цьому приєднання здійснюють за допомогою зв'язування, вибраного з групи, що складається з ковалентного зв'язування і нековалентного зв'язування.

На конкретних прикладах втілення щонайменше один пептид у складі композиції приєднаний до одному або декільком іншим пептидів. Переважно, один чи кілька інших пептидів утворюють, щонайменше частково, альфа-спіральну вторинну структуру. В деяких варіантах втілення один або кілька інших пептидів є про-апоптотическими пептидами.

Додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до способу отримання композиції, зазначеної в цьому документі вище, включає: (a) створення щонайменше одного пептиду, зазначеного в цьому документі вище; та (b) здійснення контакту щонайменше одного пептиду з будь-молекулою, обраної з групи, що складається з однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот, одного або декількох пептидо� здійснення приєднання.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до способу виявлення здібності до інтерналізації у пептиду, зазначеного в цьому документі вище, або у композиції, зазначеної в цьому документі вище, включає: (a) введення пептиду або композиції в одну або кілька клітин; і (b) виявлення інтерналізації пептиду або композиції.

Додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до фармацевтичної композиції, що містить щонайменше один пептид, зазначений у цьому документі вище, або композицію, зазначену в цьому документі вище, і, можливо, додатково містить одне або кілька фармацевтично прийнятних допоміжних речовин та/або добавок.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до застосування пептиду, зазначеного в цьому документі вище, або композиції, зазначеної в цьому документі вище, для трансформації або трансфекції однієї або декількох клітин.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до пептиду, зазначеного в цьому документі вище, або до композиції, зазначеної в цьому документі вище, для застосування з метою профілактики та/або лікування з�удистих захворювань, неврологічних захворювань, інфекцій і запальних захворювань.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до способу профілактики та/або лікування стану, вибраного з групи, що складається з онкологічного захворювання, імунних захворювань, серцево-судинних захворювань, неврологічних захворювань, інфекцій і запальних захворювань, що включає: введення суб'єкту щонайменше одного пептиду, зазначеного в цьому документі вище, або композиції, зазначеної в цьому документі вище.

Додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до складеного набору, містить принаймні одне з наступного: (a) пептид, зазначений у цьому документі вище; (b) молекулу нуклеїнової кислоти, зазначену в цьому документі вище; (c) вектор, зазначений у цьому документі вище; (d) клітину-господаря, зазначену в цьому документі вище; та (e) композицію, зазначену в цьому документі вище.

Інші варіанти втілення цього винаходу будуть очевидні з детального опису, наведеного далі.

ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

ФІГУРА 1. Биоинформационний спосіб виявлення пептидів, що проникають в клітини людини.

Пере�rot, відносяться до білків людини, разом з їх описом та анотацією з Генної онтології (GO) (A), та проведено їх аналіз із застосуванням ковзного вікна розміром 30 амінокислотних залишків (B). Для виявлення передбачуваних пептидів, що проникають у клітини (CPP) застосовували биоинформационние фільтри (C): по-перше, відбирали тільки пептиди, що містять 10 або більше позитивних зарядів; по-друге, відбирали тільки позаклітинні білки з низькою ймовірністю прояву імуногенності («етапи 2 і 3»). Для зменшення кількості пептидів вибрали декілька підходів: поєднання найбільшого значення ізоелектричної точки (ИЭТ) і найвищого ступеня гідрофобності, схожість послідовності з послідовністю отриманого з ВІЛ пептиду TAT, а також ретельне вивчення літературних джерел і результатів BLAST-аналізу.

ФІГУРА 2. Діаграма, що демонструє гідрофобність і ИЭТ для 500 довільно вибраних пептидів.

На діаграмі відобразили гідрофобність і ИЭТ для 500 пептидів, довільно вибраних з сукупності, що складається з 10,5×10630-мірних пептидів, що належать людині. Як контролів додали пептиди TAT, полі-Arg, REV, протамин і INF7 (незафарбовані квадрати). Нетоксические і нездатні до тра�еречеркнутим незакрашенним колом, токсичні пептиди - незакрашенним колом з вписаним хрестом і нетоксические трансфецирующие пептиди - незакрашенним колом.

ПОСТАТЬ 3. Діаграма, що демонструє токсичність і здатність до трансфекції для всіх проаналізованих пептидів.

Всі пептиди були проаналізовані на здатність здійснювати трансфекцію siРНК, і їх токсичність була нанесена на діаграму як середнє значення рівнів GAPDH мРНК при концентрації 20 мкМ кожної з Aha1 siРНК і siPHK люциферази (вісь y, «Токсичність»), а також були вказані відносні відмінності показників Aha1/GAPDH при трансфекції siPHK люциферази і Aha1/GAPDH при трансфекції Aha1 siРНК у концентрації 20 мкМ кожній (вісь x, «Трансфекція»). Порогові значення для токсичності (середній вміст GAPDH мРНК на рівні 70%) і трансфекції (>TAT, 18%) вказані червоними пунктирними лініями. Пунктирні лінії ділять діаграму на 4 квадранти: верхній лівий - нетрансфецирующий нетоксические пептиди; верхній правий - трансфецирующие нетоксические пептиди; нижній лівий - токсичні пептиди; нижній правий - трансфецирующие токсичні пептиди. На вставці показано токсичні пептиди, що потрапили в діапазон, що виходить за рамки діаграми.

ФІГУРА 4. Аналіз пептиду WNT16.

WNT16 предсттот ж експериментальний підхід, що і у випадку фіг.3. Для демонстрації дозо-залежних ефектів значення вмісту мРНК, отримані при концентрації 1 мкМ, були прийняті за 100%. Життєздатність виражена як процентна частка відносно контролю (середа без добавок). Дані для Aha1 siРНК позначені у вигляді чорних зафарбованих квадратів; дані для siРНК люциферази (Luc) показані у вигляді незакрашенних гуртків.

ПОСТАТЬ 5. Аналіз пептидів BPIL3 і FALL.

BPIL3 являє собою приклад токсичного, нездатного до трансфекції пептиду. Застосовували той же експериментальний підхід, що й у випадку фіг.3. (A). Зверніть увагу, що рівні Aha1 і GAPDH демонструють схожу поведінку, при цьому GAPDH показує більш високу чутливість. Це служить поясненням підвищення значень Aha1/GAPDH. Для демонстрації потенційного терапевтичного вікна для токсичної пептиду, що володіє здатністю до трансфекції, яка маскується його токсичністю, той же аналіз провели для пептиду FALL (В). Для виявлення дозо-залежних ефектів значення рівнів мРНК для обох пептидів (A, B), отримані при концентрації 1 мкМ, взяли за 100%. Життєздатність для обох пептидів (A, B) виражена як процентна частка відносно контролю (середа без добавок). Дані для Aha1 siРНК �жков.

ФІГУРА 6. Аналіз пептиду CU025.

CU025 являє собою приклад токсичного, здатного до трансфекції пептиду. Застосовували той же експериментальний підхід, що й у випадку фіг.3. Для демонстрації дозо-залежних ефектів значення вмісту мРНК, отримані при концентрації 1 мкМ, були прийняті за 100%. Життєздатність виражена як процентна частка відносно контролю (середа без добавок). Дані для Aha1 siРНК позначені у вигляді чорних зафарбованих квадратів; дані для siРНК люциферази показані у вигляді незакрашенних гуртків.

ФІГУРА 7. Аналіз нетоксичних, здатних до трансфекції пептидів.

CPXM2, ASM3B і NRTN являють собою приклади нетоксичних, здатних до трансфекції пептидів. Застосовували той же експериментальний підхід, що й у випадку фіг.3. В якості контролю визначали співвідношення Aha1/GAPDH для пептидів TAT і полі-Arg (A). Як CPXM2 (B), так і ASM3B (C) демонструють залежне від концентрації зниження рівня Aha1 мРНК щодо GAPDH мРНК, не впливаючи суттєво на життєздатність клітин. Докладний аналіз NRTN (D) виявив суттєве зниження рівня Aha1 мРНК щодо рівня GAPDH мРНК без істотних дозо-залежних ефектів на життєздатність клітин. (A, B, C, D) У всіх випадках для демонстрації дозо-залежно�виражена як процентна частка відносно контролю (середа без добавок). Дані для Aha1 siРНК позначені у вигляді чорних зафарбованих квадратів; дані для siРНК люциферази показані у вигляді незакрашенних гуртків.

ФІГУРА 8. Аналіз зсуву електрофоретичної рухливості вибраних пептидів в гелі.

З метою демонстрації утворення відповідних комплексів пептидів TAT (A), NRTN (B) і WNT16 (D) інкубували 500 мкг дуплексної siРНК з пептидом, узятим у зазначеному молярному співвідношенні, протягом однієї години і проводили аналіз з застосуванням електрофорезу в агарозному гелі та фарбування бромідом этидия. Даний аналіз демонструє утворення комплексів між siРНК і пептидами TAT, NRTN і WNT16, відповідно. Для демонстрації впливу пептиду NRTN на доступність siРНК для броміду этидия комплекс інкубували в присутності або відсутність протеїнази K (C).

ФІГУРА 9. Опосередкованої пептидом NRTN трансфекції достатньо для впливу на клітинний фенотип.

Специфічність пептиду NRTN до послідовності siРНК досліджували із застосуванням аналізу здатності пептиду трансфецировать дуплекс siРНК, мішенню якої служить Eg5 мРНК людини. Індукцію апоптозу, викликаного нокдауном Eg5, визначали за допомогою аналізу цитотоксичності Cyto Tox-Glo (Promega Inc.) Для демонстрації дозо-залежних ефект� як процентна частка відносно контролю (середа без добавок). Дані для Aha1 siPHK позначені у вигляді чорних зафарбованих квадратів; дані для siРНК люциферази показані у вигляді незакрашенних гуртків.

ФІГУРА 10. Вирівнювання послідовностей GDNF і NRTN.

Вирівнювання амінокислотних послідовностей GDNF щури і NRTN людини продемонструвало, що вони є спорідненими з білками. Ідентичні амінокислоти показані сірим кольором на білому тлі, схожі амінокислоти - чорним кольором на світло-сірому фоні та на окремі амінокислоти - чорним кольором на білому тлі. У GDNF щури позначений відрізок, відповідний альфа-спіральній структурі. Прямокутною рамкою у складі NRTN виділено пептид, який застосовували в експериментах.

ФІГУРА 11. NTRN містить альфа-спіральний структурний елемент.

Аналіз пептидів FALL (A), NRTN (B) і TAT (C) із застосуванням спектроскопії кругового дихроїзма в УФ діапазоні. Спектри отримували в діапазоні від 195 нм до 260 нм з кроком 0,1 нм і шириною смуги пропускання 1 нм, застосовуючи розчин пептиду 0,1 мг/мл у відсутність («H2O») або в присутності 10%, 25% і 50% трифторэтанола (TFE), відповідно.

ФІГУРА 12. NRTN, TAT і FALL діють як пептидів, що проникають у клітини.

Застосування флуоресцентно-активованого клітинного сортинга (FACS) дприсутствии пептиду, обробляли протеіназою До протягом 30 хв. і проводили аналіз із застосуванням FACS для виявлення интернализированних пептидів в каналі, відповідному FITC. Чорними лініями показані сигнали при концентрації 1 мкМ, світло-сірими лініями показані сигнали при концентрації 5 мкМ і темно-сірими лініями показані сигнали при концентрації 10 мкМ.

ФІГУРА 13. NRTN демонструє активність в умовах присутності сироватки.

Провели аналіз здатності NRTN здійснювати трансфекцію дуплексів siРНК у відсутність (A) в присутності (B) сироватки у середовищі для трансфекції. Застосовували той же експериментальний підхід, що й у випадку фіг.3. Аналіз проводили або в нормальній поживному середовищі RPMI 1640, що містить 10% FCS (сироватки плодів великої рогатої худоби) (B), або з інкубацією протягом трьох годин у середовищі OptiMEM для вирощування з пониженим вмістом сироватки з подальшою заміною середовища на нормальну живильне середовище (A). Для демонстрації дозо-залежних ефектів значення вмісту мРНК, отримані при концентрації 1 мкМ, були прийняті за 100%. Дані для Aha1 siРНК позначені у вигляді чорних зафарбованих квадратів; дані для siРНК люциферази показані у вигляді незакрашенних гуртків.

ФІГУРА 14. Поглинання NRTN эндоте�TN (з N-кінцевий і C-кінцевий конъюгацией, відповідно) інкубували з ендотеліальними клітинами головного мозку hCMEC/D3 при концентрації 5 мкМ протягом 1 год при 37°C. Після цього клітини промивали і фіксували. Зображення отримували із застосуванням флуоресцентної мікроскопії. В обох випадках пептид розташовувався у внутрішньоклітинних эндосомальних структурах.

ФІГУРА 15. NRTN-опосередковане поглинання клітинами про-апоптотического пептиду Nur77.

Клітини раку молочної залози людини MCF-7 інкубували протягом 24 год у присутності різних концентрацій пептидів NRTN (квадрати), Nur (гуртки) і NurNRTN (трикутники). Відповідні амінокислотні послідовності наведені в нижній частині фігури. Для оцінки життєздатності клітин (і, таким чином, індукції апоптозу) застосовували той же експериментальний підхід, що й у випадку фіг.3.

ФІГУРА 16. NRTN-опосередковане поглинання клітинами про-апоптотического пептиду 4E-BP1.

Клітини раку молочної залози людини MCF-7 інкубували протягом 24 год у присутності різних концентрацій пептидів 4E-BP1 (гуртки), TAT4E-BP1 (квадрати) і NRTN4E-BP1 (трикутники) (верхня частина фігури). Додатково проводили порівняння відповідних ефектів двох химерних пептидів (суцільні лінії) з їх неактивними варіантами (TATinact4E-BP1 і NRTNinact4E-BP1; пунктидени в нижній частині фігури. Для оцінки життєздатності клітин (і, таким чином, індукції апоптозу) застосовували той же експериментальний підхід, що й у випадку фіг.3.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

В основі цього винаходу лежить несподівано виявлений факт, що з допомогою поєднання біоінформаційної скринінгу і подальшої експериментальної оцінки кандидатних пептидів можна виявити кілька пептидів CPP, які демонструють покращений функціональний профіль, порівняно з попереднім «золотим стандартом» - еталонним пептидом TAT, зокрема, більш високу загальну ефективність трансфекції, більш високу трансфекционную активність у присутності сироватки, а також більш низьку ступінь цитотоксичності. Примітно, що ці пептиди CPP не демонструють істотної подібності їх первинних амінокислотних послідовностей. Таким чином, ці пептиди можуть служити в якості модулів при розробці нових ефективних агентів для доставки з метою застосування при терапевтичного втручання.

Даний винахід, наочний опис якого наведено далі, може застосовуватись на практиці у відсутність будь-якого елементу або елементів, обмеження або обмежень, не розкритих спец�«містить», не виключається наявність інших елементів або етапів. Для цілей цього винаходу передбачається, що термін «складається з» є кращим варіантом втілення терміна «містить». Якщо далі в цьому документі зазначено, що група містить щонайменше певну кількість варіантів втілення, це також слід розуміти як розкриття групи, яка переважно складається тільки з цих варіантів втілення.

У разі якщо використовується іменник в однині, воно включає в себе і форму множини цього іменника, особливо якщо не зазначено інакше.

У разі зазначення в контексті цього винаходу числових значень фахівця в даній галузі буде зрозуміло, що технічна дія розглянутої особливості гарантовано знаходиться в інтервалі, який визначається з певною точністю, який в типовому випадку включає відхилення від даного числового значення на ±10% і переважно - на ±5%.

Додатково, терміни «перший», «другий», «третій», «(a)», «(b)», «(c)» і т. п. в описі і у формулі винаходу використовуються для відділення один від одного схожих елементів і не обов'язково для опису послідовності илияемими при відповідних умовах, і що варіанти втілення винаходу, описані в цьому документі, можуть бути здійснені в послідовності, відмінній від описаної або проілюстрованою в цьому документі.

Додаткові визначення термінів будуть наведені далі, в контексті, в якому ці терміни використовуються. Наведені далі терміни або визначення представлені виключно для полегшення розуміння винаходу. Ці визначення не слід тлумачити як такі, що мають менший обсяг, ніж обсяг, який розуміється фахівцем в даній області.

Першою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до пептидного молекулі, яка може бути интернализирована всередину клітини, при цьому це молекула:

(a) має довжину щонайменше 10, переважно - щонайменше 15 амінокислотних залишків;

(b) містить у своїй первинній амінокислотної послідовності щонайменше 25%, переважно - щонайменше 30% позитивно заряджених амінокислотних залишків;

(c) интернализируется всередину клітини з ефективністю, що становить щонайменше 80%, переважно - щонайменше 90% від ефективності інтерналізації пептиду TAT, що має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID Nдокументе означає будь-які мають природне походження або синтетичні (наприклад, отримані із застосуванням хімічного синтезу або технології рекомбінантних ДНК) лінійні макромолекули, що містять безліч природних або модифікованих амінокислотних залишків, сполучених пептидними зв'язками. Такі пептиди можуть утворювати олігомери, що складаються щонайменше з двох ідентичних або різних пептидних молекул.

Пептиди щодо винаходу мають довжину щонайменше 10 амінокислотних залишків (наприклад, 10, 11, 12, 13 або 14 амінокислотних залишків) і переважно мають довжину щонайменше 15 амінокислотних залишків, щонайменше 20 амінокислотних залишків, щонайменше 25 амінокислотних залишків, щонайменше 30 амінокислотних залишків, щонайменше 35 амінокислотних залишків, щонайменше 40 амінокислотних залишків або щонайменше 45 амінокислотних залишків. На конкретних прикладах втілення пептиди щодо винаходу мають довжину 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44 або 45 амінокислотних залишків.

Термін «природні амінокислотні залишки» при використанні в цьому документі позначає будь-яку з 22 «канонічних» амінокислот, які в природі вбудовуються в пептиди. З цих двадцяти двох амінокислот двадцять безпосередньо�н, вбудовуються в білки з допомогою унікальних механізмів синтезу. У типовому випадку амінокислотні залишки пептиду щодо винаходу представлені у формі L-ізомерів. В деяких варіантах втілення один або кілька амінокислотних залишків пептиду щодо винаходу представлені у формі D-ізомерів. Термін «модифікований амінокислотний залишок» при використанні в цьому документі позначає неканонічні амінокислоти, такі як посттрансляционно модифіковані амінокислоти. Приклади посттрансляційних модифікацій включають, серед іншого, фосфорилювання, глікозилювання, ацилювання (наприклад, ацетилювання, миристоилирование, пальмитоилирование), алкілування, карбоксилирование, гідроксилювання, гликирование, биотинилирование, убиквитилирование, зміни хімічної природи (наприклад, деимидирование, деамидирование за механізмом β-елімінування) і структурні зміни (наприклад, утворення дисульфідних містків).

Амінокислотні послідовності пептидів, зазначені в цьому документі, представлені, відповідно до загальноприйнятим правилом, від амино (M)-до кінця карбокси (C)-кінця. Однак відповідні «зворотні» пептиди також включені в обсяг цього изй ж послідовністю, що і їх «нормальні» аналоги, але представлені в зворотному орієнтації, тобто, від C-кінця до N-кінця. Наприклад, «нормальний» пептид TAT має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ. Відповідний «зворотний» пептид TAT має аминокислотную послідовність QPPRRRQRRKKRG.

Пептиди по справжньому винаходу містять у своїх відповідних первинних амінокислотних послідовностях (тобто по всій своїй довжині) щонайменше 25%, переважно - щонайменше 30% позитивно заряджених амінокислотних залишків. Термін «позитивно заряджені амінокислоти» (в цьому документі звані також «основними амінокислотами») при використанні в цьому документі позначає сукупність залишків лізину (K), гістидину (H) і аргініну (R), присутніх в конкретному пептиді. На конкретних прикладах втілення пептид по справжньому винаходу містить у своїй первинній амінокислотної послідовності 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% або 35% позитивно заряджених амінокислотних залишків. В інших варіантах втілення пептиди щодо винаходу містять у своїх відповідних первинних амінокислотних послідовностях щонайменше 35%, щонайменше 40%, щонайменше 45%, щонайменше 50%, по м� интернализирован всередину клітини» при використанні в цьому документі означає здатність пептидів проходити крізь клітинні мембрани (включаючи, серед іншого, зовнішню «обмежує» клітинну мембрану (також зазвичай звану «плазматичної мембраною»), эндосомальние мембрани і мембрани ендоплазматичного ретикулуму) та/або керувати виконанням даного агента або навантаження крізь ці клітинні мембрани. Таке проходження крізь клітинні мембрани називається в цьому документі «проникненням у клітку». Відповідно, пептиди, що володіють зазначеної здатність проходити крізь клітинні мембрани, називаються в цьому документі «пептидами, проникаючими в клітини». У контексті цього винаходу мається на увазі будь-який можливий механізм інтерналізації, включаючи як механізми енергозалежної (тобто, активного) транспорту (наприклад, эндоцтоз), так і механізм енергонезалежного (тобто, пасивного) транспорту (наприклад, дифузію). При використанні в цьому документі термін «інтерналізація» слід розуміти як включає локалізацію щонайменше частини пептидів, які пройшли крізь плазматическую клітинну мембрану, в цитоплазмі (в протилежність локалізації в інших клітинних компартментах, таких як везикули, эндосоми або ядро). На конкретних прикладах втілення даний задіяний механізм транспорту про�ре 1%, щонайменше 2%, щонайменше 5% або щонайменше 10% интернализированних пептидів або композицій були локалізовані в цитоплазмі.

Пептиди по справжньому винаходу интернализируются всередину клітини з ефективністю, що становить щонайменше 80%, переважно - щонайменше 90% від ефективності інтерналізації пептиду ТАТ, має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1; див. також публікацію: Vives; E. et al. (1997), див. вище). Інакше кажучи, характеристика функціональної активності пептидів дається в порівнянні з еталонним пептидом (пептид TAT являє собою «золотий стандарт» для пептидів, що проникають в клітини). На конкретних прикладах втілення пептиди щодо винаходу интернализируются з ефективністю, що становить 80%, 85%, 90% або 95% від ефективності інтерналізації пептиду TAT. У конкретних бажаних прикладах втілення пептиди щодо винаходу интернализируются щонайменше з такою ж ефективністю (тобто, 100%), що і пептид TAT. Зокрема, переважно, пептиди щодо винаходу интернализируются з більш високою ефективністю (тобто, більш ніж 100% або щонайменше 101%), ніж пептид TAT, наприклад, з ефективністю, складовою 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%танні в цьому документі слід розуміти в широкому сенсі. Цей термін відноситься не тільки до ступеня, в якій пептид щодо винаходу проходить крізь плазматическую мембрану клітин (тобто, до властивостей власне інтерналізації), але також до ефективності, з якою пептид управляє проходженням даного агента або навантаження крізь клітинну плазматическую мембрану (тобто, до його здатності здійснювати трансфекцію; в цьому документі її також називають «ефективністю трансфекції»). В даній області розроблено ряд способів визначення властивостей інтерналізації та/або здатності до трансфекції даного пептиду, наприклад, шляхом приєднання детектируемой мітки (такий як флуоресцентний барвник) до пептиду (і/або до навантаження, яка буде трансфецироваться) або за допомогою з'єднання пептиду з репортерной молекулою, що дозволяє проводити детекцію після того, як відбувається поглинання пептиду клітинами, наприклад, із застосуванням аналізу FACS або за допомогою специфічних антитіл (див., наприклад Ausubel, F. M. et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA). Фахівця в даній області також добре відомо, як вибрати відповідні діапазони концентрацій пептиду та, якщо застосовно, навантаження, які будуть застосовуватися в таких способах; цей вибір може зависетѽия пептиди по справжньому винаходу не виявляють істотного цитотоксичного та/або імуногенного дії щодо своїх відповідних клітин-мішеней після інтерналізації, тобто, вони не надають заважаючого впливу на життєздатність клітин (щонайменше в концентраціях, які достатні для опосередкування клітинної трансфекції та/або проникнення). Термін «несуттєвий» при використанні в цьому документі слід розуміти в тому сенсі, що менш ніж 50%, переважно - менш ніж 40% або 30% і, зокрема, менш ніж 20% або 10% клітин-мішеней гинуть після інтерналізації пептиду щодо винаходу. В інших варіантах втілення цитотоксична (і/або імуногенність) дія, що надається пептидами після інтерналізації в клітку, таке ж або менш виражено, ніж відповідне дія, що надається пептидом TAT, що мають аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1). На конкретних прикладах втілення цитотоксична (і/або імуногенність) дія, що надається пептидами після інтерналізації в клітку, таке ж або становить менш ніж 95%, менше ніж 90%, менше ніж 85%, менше ніж 80%, менш ніж 75%, менш ніж 70%, менше ніж 60%, менше ніж 50%, менш ніж 40%, менше ніж 30%, менш ніж 20% або менше ніж 10% від дії, що чиниться пептидом ТАТ. Фахівця в даній області добре відомі способи визначення цитотоксичності даного з'єднання та/або життєздатності даній до�ические набори доступні для придбання в різних постачальників.

На конкретних прикладах втілення потенційне цитотоксична та/або імуногенність дію, притаманне пептиду щодо винаходу, може «маскуватися» з допомогою внесення в пептид однієї або декількох модифікацій, наприклад, шляхом хімічного синтезу або технології рекомбінантних ДНК. Такі модифікації можуть бути пов'язані, наприклад, з додаванням, видаленням або заміною функціональних груп або з зміною положень таких функціональних груп. Фахівця в даній області добре відомо, яким чином таке «маскування» може бути досягнуто у разі даного пептиду.

У додаткових варіантах втілення пептидні молекули по винаходу містять щонайменше один структурований домен, тобто, елемент, який утворює (тобто, укладається певним чином) стабільну вторинну структуру, а саме, певне просторове розташування амінокислотних залишків, які локалізовані поруч один з одним в лінійній послідовності. Часто стерические взаємодії між амінокислотними залишками носять регулярний характер, що призводить до утворення періодичних структур, добре відомих фахівців у даній області, таких як α-спіралі (похожких ділянок, можливо, утворюють паралельні або антипараллельние β-складчасті листи). В рамках цього винаходу пептидний молекула може містити один такий структурований домен, оточений неструктурованими областями, або може містити два або кілька таких структурованих доменів (одного типу чи різних типів, наприклад, дві α-спіралі або одну α-спіраль і одну β-структури), відокремлені один від одного. В деяких варіантах втілення пептидний молекула утворює вторинну структуру по всій своїй довжині (тобто, не містить неструктурованих областей).

У кращих прикладах втілення принаймні частина пептидної молекули, описаної в цьому документі, утворює альфа-спіральну вторинну структуру. α-Спіральний елемент може містити щонайменше 4 або 6 амінокислотних залишків і, переважно, щонайменше 8 або 10 амінокислотних залишків. На конкретних прикладах втілення пептидний молекула щодо винаходу містить одиночний α-спіральний елемент в якості єдиної вторинної структури.

У кращих втіленнях пептидні молекули по справжньому винаходу походять від молекул ссавців, тобто, вони відбуваються з таких організмів, � пептидні молекули походять від молекул людини, тобто, вони є похідними від послідовностей людини або являють собою послідовності людини. Термін «є похідним від послідовностей людини» при використанні в цьому документі позначає послідовності, що походять від молекул людини, що несуть незначні модифікації (наприклад, одну або кілька амінокислотних замін) у порівнянні з послідовностями людини природного походження. Термін «являє собою послідовність людини» при використанні в цьому документі позначає послідовність, ідентичну послідовності людини природного походження (тобто, не містить варіантів або модифікацій послідовності).

У додаткових кращих варіантах втілення пептидний молекула щодо винаходу має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з:

(пептид NRTN; SEQ ID NO: 2);

(пептид СРХМ2; SEQ ID NO: 3);

(пептид ASM3B; SEQ ID NO: 4);

(пептид FGF 12; SEQ ID NO: 5);

(пептид CU025; SEQ ID NO: 6);

(пептид IGS10; SEQ ID NO: 7);

(пептид FALL39, вар.1 (також званий пептидом FALL; SEQ ID NO: 10);

І при цьому амінокислотна послідовність має по всій своїй довжині щонайменше 70%, переважно - щонайменше 80% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 10.

У конкретних бажаних варіантах втілення пептид має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; і при цьому амінокислотна послідовність має по всій своїй довжині щонайменше 70%, переважно - щонайменше 80% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 4.

Термін «відсоток (%) ідентичності послідовності» при використанні в цьому документі описує кількість збігів ідентичних амінокислот у двох або декількох вирівняних амінокислотних послідовностях порівняно з кількістю амінокислотних залишків, що утворюють повну довжину амінокислотних послідовностей, що служать зразком для порівняння. Інакше кажучи, при застосуванні вирівнювання двох або декількох послідовностей або під-послідовностей (тобто, отриманих результатів полягає в тому�що є однаковими, коли (під-)послідовності порівнюють і вирівнюють до досягнення максимального ступеня відповідності протягом вікна порівняння або протягом заданої області згідно оцінці з застосуванням відомого фахівцям в даній області алгоритму порівняння послідовностей, або при вирівнюванні вручну і візуальною оцінкою. Отже, наведене вище визначення застосовне не тільки до повнорозмірним послідовності з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 10, але також до будь-якого скороченому варіанту амінокислотних послідовностей довжиною щонайменше 10, переважно - щонайменше 15 залишків, що містяться в будь-якій послідовності з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 10.

Для оцінки рівня ідентичності між двома білковими послідовностями їх можна вирівнювати в електронному вигляді, застосовуючи придатні комп'ютерні програми, відомі фахівцям в даній області. Такі програми включають, серед іншого, BLAST (Altschul, S. F. et al. (1990) J. Mol. Товарbiol. 215, 403-410), FASTA (Lipman, D. J. and Pearson, W. R. (1985) Science 227, 1435-1441) або програми, які застосовують алгоритм Сміта-Уотермана (Smith, T. F. and Waterman, M. S. (1981) J. Mol. Товарbiol. 147, 195-197). Ці програми, крім забезпечення попарного вирівнювання послідовностей, також визначають рівень ідентичності �м явищем (значення фактора p). У разі амінокислотних послідовностей програма BLASTP застосовує в якості налаштувань за замовчуванням довжину слова (W), що дорівнює 3, і очікування (E), рівну 10. У матриці замін BLOSUM62 (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919) застосовується значення вирівнювання (В), дорівнює 50, очікування (E = 10, M=5, N=4 і порівняння обох ниток. Такі комп'ютерні програми, як CLUSTALW (Higgins, D. et al. (1994) Nucl. Acids Res. 2, 4673-4680) можна застосовувати для вирівнювання більш ніж двох послідовностей. Крім того, програма CLUSTALW при обчисленні ступеня ідентичності враховує пропуски в послідовностях.

Якщо амінокислотна послідовність має по всій своїй довжині щонайменше 70%, переважно - щонайменше 80% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 10, вона є варіантом втілення цього винаходу. Тип присутніх амінокислотних змін (наприклад, додавання на кінцях, вставка, делеція і заміна одного або декількох амінокислотних залишків чи поєднання цих змін не має значення. На конкретних прикладах втілення «похідні амінокислотних послідовностей» володіють щонайменше 70%, щонайменше 72%, по меньшй з послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 10. Переважно, «похідні амінокислотних послідовностей» володіють щонайменше 80%, щонайменше 82%, щонайменше 84%, щонайменше 86%, щонайменше 88%, щонайменше 90%, щонайменше 92%, щонайменше 94%, щонайменше 95%, щонайменше 96%, щонайменше 97%, щонайменше 98% або щонайменше 99% загальної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 за SEQ ID NO: 10.

Другою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, кодує пептидний молекулу, зазначену в цьому документі вище.

Термін «молекула нуклеїнової кислоти» при використанні в цьому документі позначає будь-яку нуклеїнову кислоту, що кодує пептид щодо винаходу. Приклади таких молекул нуклеїнової кислоти містять нуклеїнові кислоти природного походження, такі як дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) або рибонуклеїнова кислота (РНК), а також штучно створені нуклеїнові кислоти, що були хімічно синтезовані або отримані із застосуванням технології рекомбінантних генів, включаючи, наприклад, аналоги нуклеїнових кислот, такі як, серед іншого, пептидо-нуклеїнові кислоти (PNA) або «заd Spring Harbor Laboratory Press). Конкретні приклади нуклеїнових кислот природного походження містять послідовності ДНК, такі як геномна ДНК або молекули кДНК, а також послідовності РНК, такі як молекули гяРНК, мРНК або рРНК, або назад-комплементарні послідовності нуклеїнових кислот. Такі нуклеїнові кислоти можуть мати будь-яку довжину і можуть бути як одноцепочечними, так і двуцепочечними молекулами. У типовому випадку цільові нуклеїнові кислоти по винаходу мають довжину від 30 до 5000 нуклеотидів, наприклад, від 30 до 3000 нуклеотидів, від 45 до 2000 нуклеотидів, від 60 до 1000 нуклеотидів або від 75 до 500 нуклеотидів. При використанні в цьому документі термін «нуклеотид» слід розуміти як відноситься як до рибонуклеотидам, так і до дезоксирибонуклеотидам (тобто, до молекул РНК і ДНК).

Переважно, молекула нуклеїнової кислоти по справжньому винаходу являє собою складову частину генетичної конструкції (також часто позначається як «экспрессионная касета»), яка забезпечує її експресію. Генетичну конструкцію називають «здатної експресувати молекулу нуклеїнової кислоти» або здатної «забезпечувати експресію послідовності нуклеїнової кислоти (тобто, нуклеотающуюся регуляції транскрипції та/або трансляції, і якщо такі послідовності «функціонально приєднані» до нуклеотидної послідовності, що кодує пептид. Функціональне приєднання - це приєднання, при якому регуляторні елементи послідовності і послідовність, яку будуть експресувати (і/або послідовності, які будуть експресувати разом один з одним), з'єднані таким способом, при якому можлива експресія гена.

Конкретна природа регуляторних областей, необхідних для експресії гена, може варіювати в залежності від біологічного виду, але в загальному випадку ці області містять промотор, який у прокаріотів включає як власне промотор, тобто, елементи ДНК, керуючі ініціацією транскрипції, так і елементи ДНК, які після транскрипції в РНК будуть служити сигналом ініціації трансляції. Такі промоторние області зазвичай включають 5'-некодирующие послідовності, які беруть участь в ініціації транскрипції і трансляції, такі як -35/-10-бокси і елемент Шайна-Далгарно у прокаріотів або ТАТА-бокс, послідовності CAAT і 5'-кэпирующие елементи у еукаріотів. Ці галузі також можуть включати энхансерние або репрессорние елементи, а також транслюються сигнали і лидерние посл�е прокариотические промотори включають, серед іншого, промотори lacUV5, trp, tet і tac з E. coli і промотор фага T7. Придатні эукариотические промотори включають, серед іншого, ранній і пізній промотори SV40, промотори RSV і CMV та промотори дріжджів A0X1 і GAL1. Крім того, 3'-некодирующие послідовності можуть містити регуляторні елементи, які беруть участь у термінації транскрипції, полиаденилировании або т. п. Однак, якщо ці послідовності термінації не забезпечують задовільне функціонування в клітині-хазяїні, то вони можуть бути замінені на сигнальні послідовності, функціонально активні в цій клітці. Спеціалісту добре відомі всі ці регуляторні елементи, і він здатний вибрати такі елементи, придатні для експресії молекули нуклеїнової кислоти в заданих умовах.

Молекули нуклеїнової кислоти по винаходу, можливо, будучи частиною экспрессионной касети, також можуть перебувати у складі вектора або іншого носія для клонування. Відповідно, додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до вектора, що містить молекулу нуклеїнової кислоти по справжньому винаходу.

Вектор щодо винаходу може бути, наприклад, плазміди, космидой, фагмидой, вірусом. �редпочтительно, вектор являє собою экспрессионний вектор, який здатний забезпечувати експресію молекули нуклеїнової кислоти по винаходу. Такий экспрессионний вектор може включати, крім регуляторних послідовностей, описаних вище, і послідовності нуклеїнової кислоти, яка буде экспрессироваться, щонайменше один оріджін реплікації, а також регуляторні послідовності, що відбуваються з біологічного виду, схожого з організмом-хазяїном, чиї клітини застосовують для експресії, а також один або кілька селектируемих маркерів, що забезпечують селектируемий фенотип трансфецированним клітинам. Спеціально сконструйовані вектори (тобто, човникові вектори), що містять більше одного ориджина реплікації, дозволяють здійснювати перенесення між різними власниками, наприклад, між бактеріальними клітинами і клітинами грибів або між бактеріальними клітинами і клітинами тварин. Придатні ориджини реплікації для прокариотических клітин включають, наприклад, ColE1 і M13. Прикладом ориджина реплікації в векторах для клітин ссавців є SV40. Придатні прокариотические селектируемие маркери включають, серед іншого, гени стійкості до канаміцину, амЀименять, є ген дигідрофолатредуктази і ген глутаминсинтетази. Способи, які можна застосовувати для конструювання та/або модифікації рекомбінантних векторів, добре відомі фахівцям в даній області (див., наприклад, Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001), див. вище).

Велика кількість придатних векторів доступні для придбання і добре відомі фахівцям в даній області, які також здатні визначити, які вектори придатні для експресії представляє інтерес молекули нуклеїнової кислоти в заданих умовах. Приклади таких векторів включають, серед іншого, прокариотические вектори, такі як вектори серії pUC, pBluescript, вектори серії pET, pCRTOPO, лямбда-gt11, вектори серії pBBR1-MCS і pBC2, а також вектори, сумісні з експресією в клітинах ссавців, такі як pCEP4, pXT1, pSG5, pRSVneo, pSV2-dhfr, pcDNA3 pSIR і pIRES-EGFP. Приклади плазмідних векторів, придатних для експресії генів у Pichia pastoris, включають, серед іншого, pAO815, pPIC9K і pPIC3.5K.

Згідно з іншим варіантом, молекула нуклеїнової кислоти по справжньому винаходу, описані в цьому документі, також може бути вставлена у вектори таким чином, що відбувається з'єднання з ще однією молекулою нуклеїнової кислоти, і при трансляції утворюється химерний продукц�римость та/або полегшує очищення пептиду щодо винаходу. Приклади таких векторів включають pET32, pET41 і pET43.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до клітини-господаря, що містить вектор, що описаний в цьому документі вище.

Впровадження вектора у вигляді нуклеїнової кислоти в клітину-господаря може бути здійснено із застосуванням різних способів трансформації, трансдукції або трансфекції, які добре відомі фахівцям в даній області (див., наприклад, Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001), див. вище).

В рамках цього винаходу впроваджений вектор може розмножуватися і зберігатися в клітині-хазяїні у вигляді незалежної генетичної одиниці або ж він може стабільно інтегруватися в геном клітини-хазяїна за допомогою генетичної рекомбінації. Така рекомбінація може відбуватися або у випадкових положеннях у складі геному за механізмом негомологічної рекомбінації, або в специфічних положеннях у складі геному за механізмом гомологічної рекомбінації або з участю сайт-специфічних интеграз.

Клітина-господар по справжньому винаходу може бути прокариотической або эукариотической кліткою, при цьому кращим є эукариотическая клітина. Придатні прокариотические клітини-господарі включ�robacterium tumefaciens. Придатні эукариотические клітини-господарі включають, серед іншого, дріжджі (наприклад, Pichia pastoris і Saccharomyces cerevisiae), клітини комах (наприклад, клітини S2 Drosophila melanogaaster і клітин Sf9 Spodoptera frugiperda) і клітини рослин. Переважно, застосовуються у цьому винаході эукариотические клітини-господарі є клітинами ссавців, зокрема, клітинами людини.

Придатні клітини ссавців включають, серед іншого, иммортализированние клітинні лінії, такі як клітини людини Hela, HEK293, H9, MCF7 і Jurkat, клітини миші NIH3T3, C127 і L, клітини мавп COS1 і COS7, клітини перепела QC1-3 і клітини яєчника китайського хом'яка (СНО). Всі ці клітини-господарі можуть бути отримані з депозитаріїв, таких як Американська колекція типових культур (Манассас, Вірджинія, США) або Німецька колекція мікроорганізмів та клітинних культур (Брауншвейг, Німеччина), а також від різних комерційних постачальників. Також в обсяг цього винаходу входять первинні культури клітин ссавців, тобто, культури клітин, отриманих безпосередньо з організму (на будь-якій стадії розвитку, включаючи, серед іншого, стадії бластоцисти, ембріональну, личиночную стадії і дорослі організми). Приклади придатних первинних клітинних культур включають до�бретения також входять иммортализированние стабільні клітинні лінії, отримані з первинних клітинних ліній.

В деяких варіантах втілення клітина-господар по справжньому винаходу є частиною многоклеточного організму. Іншими словами, винахід відноситься до трансгенних організмів, що містить щонайменше одну клітку-господаря, описану в цьому документі. Переважно, трансгенний організм є ссавцем, наприклад, мишею, пацюком, хом'яком, кроликом, кішкою, собакою, свинею, коровою, конем, мавпою або людиною.

Додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до способу отримання пептиду, описаного в цьому документі вище, включає:

(a) культивування клітини-господаря щодо винаходу в придатних умовах;

(b) виділення отриманого пептиду.

Доступна велика кількість придатних способів отримання пептидів у відповідних клітинах-хазяїнах. У разі поодиноких клітин, наприклад, прокариотических клітин або клітинних ліній ссавців, спеціаліст у цій галузі може застосовувати різні умови культивування. В одному варіанті вироблений пептид збирають з культурального середовища, лізатів або екстрактів культивованих клітин або з виділених (биологическитка-господар є частиною многоклеточного організму, фракція цих клітин може служити джерелом для виділення пептиду щодо винаходу.

Відповідні культуральні середовища та умови культивування для описаних вище клітин-господарів добре відомі фахівцям в даній області. Наприклад, придатні умови для культивування бактерій включають їх вирощування в умовах аерації в середовищі Луриа-Бертани (LB). З метою підвищення виходу і розчинності продукту експресії середовище можна буферізіровать або внести до неї придатні добавки, відомі фахівцям у даній галузі (такі як шаперони, тРНК для рідкісних кодонов, простетические групи, ко-фактори, іони металів тощо) У типовому випадку E. coli можна культивувати при температурі від 4°с до 37°C, при цьому конкретне значення температури або послідовність зміни температури залежить від молекули, яку будуть експресувати. У загальному випадку фахівця в даній області також зрозуміло, що ці умови, можливо, необхідно буде адаптувати до потреб клітини-господаря і вимогам, обумовленим экспрессируемим пептидом або білком. У разі, якщо для регулювання представляє інтерес експресії молекули нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні застосовують индуцибельную систему експресії � індукувати додаванням відповідного індукує агента.

В залежності від конкретного застосовуваного типу клітин і їх специфічних вимог до умов зростання, культуру клітин ссавців можна культивувати, наприклад, в середовищі RPMI 1640 або DMEM (середовище Ігла в модифікації Дульбекко) з додаванням 10% (об./про.) FCS (сироватки плодів великої рогатої худоби), 2 мМ L-глутаміну і 100 од/мл пеніциліну/стрептоміцину. Згідно з іншим варіантом, можна застосовувати живильне середовище із зниженою концентрацією сироватки, таку як OptiMEM. Клітини можна інкубувати при 37°C в водонасищенной атмосфері з 5% CO2.

Придатні середовища для культури клітин комах включають, серед іншого, середу TNM з додаванням 10% FCS або середу SF900. Клітини комах зазвичай вирощують при 27°C у вигляді адгезійних або суспензійних культур.

Придатні протоколи експресії як для прокариотических, так і для эукариотических кліток добре відомі фахівцям в даній області (див., наприклад, Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001), див. вище). Відповідні аналітичні системи, набори та реактиви доступні для придбання в різних постачальників.

Згідно з іншим способом отримання пептидних молекул по винаходу застосовують трансляцію мРНК in vitro. Придатні безклітинні системи тран� мембрани клітин підшлункової залози собаки, екстракт S30 з E. coli, а також об'єднані системи для транскрипції і трансляції. Відповідні аналітичні системи доступні для придбання в різних постачальників.

Способи виділення отриманого пептиду добре відомі фахівцям в даній області і включають, серед іншого, іонообмінну хроматографію, аффинную хроматографію, гель-фільтрацію (эксклюзионную хроматографію), високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ), обратнофазовую ВЕРХ, диск-електрофорез у гелі і иммунопреципитацию (див., наприклад, Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001), див. вище).

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до композиції (також званої в цьому документі «комплексом»), що містить щонайменше один пептид, зазначений у цьому документі вище, приєднаний щонайменше до одного іншого фрагменту (також званого в цьому документі «носієм»), при цьому принаймні один інший фрагмент переважно є фрагментом, вибраним з групи, що складається з однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот, одного або декількох пептидів або білків, однієї або декількох малих молекул і однієї або декількох наночастинок, при цьому приєднання здійснюють п�ія.

Термін «приєднання» при використанні в цьому документі слід розуміти в самому широкому сенсі, тобто, він відноситься до будь-якого типу молекулярної взаємодії між двома або декількома з'єднаннями. Термін «ковалентное зв'язування» відноситься до внутримолекулярной формі утворення хімічного зв'язку, яка характеризується обобществлением однієї або декількох пар електронів між двома компонентами, в результаті чого виникає взаємне тяжіння, яке утримує утворену в результаті молекулу як єдине ціле. Термін «нековалентное зв'язування» відноситься до різних взаємодій, які не є ковалентними за своєю природою, між молекулами або частинами молекул, які забезпечують утримання молекул або частин молекул один з одним, зазвичай специфічної орієнтації або конформації. Такі нековалентние взаємодії включають, серед іншого, іонні зв'язку, гідрофобні взаємодії, водневі зв'язки, ван-дер-ваальсові взаємодії, і диполь-дипольні зв'язки. У разі ковалентного зв'язування пептид щодо винаходу може бути з'єднаний щонайменше з одним іншим фрагментом безпосередньо або через линкерную молекулу, яка служить для фізичного поділу пептий функціонування обох компонентів з-за їх близького розташування один до одного. Залежно від щонайменше одного іншого фрагмента лінкер може бути, наприклад, пептидного зв'язком, амінокислотою, пептидом відповідної довжини або іншою молекулою, що забезпечує необхідні властивості. На конкретних прикладах втілення лінкер є залишком лізину чи аргініну, ε-аміногрупи яких придатні для приєднання пептидів, таких як описано в цьому документі, до різних іншими фрагментами. Фахівця в даній галузі відомо, як сконструювати відповідні линкерние молекули, зокрема, линкерние пептиди, виходячи із загальновідомих знань. Наприклад, пептидні линкери можна вибрати з бази даних LIP (Loops in Proteins («Петлі в білках»)) (Michalsky, E. et al. (2003) Prot. Eng. 56, 979-985). Такий лінкер може бути приєднаний до N - або C-кінця або, якщо це вважається доцільним, також не термінальному амінокислотним залишком пептиду по справжньому винаходу.

У кращих втіленнях щонайменше один пептид, такий як описано в цьому документі вище, приєднаний до щонайменше одному іншого фрагменту допомогою нековалентного взаємодії, наприклад, за допомогою (оборотного) утворення комплексу.

В інших бажаних варіантах втілення за меншою �ту допомогою ковалентного взаємодії, наприклад, у формі химерної молекули. Термін «химерна молекула» при використанні в цьому документі означає щонайменше двухчастную молекулу, що містить пептид щодо винаходу, з'єднаний щонайменше з одним іншим фрагментом з утворенням єдиної молекули. Пептид і щонайменше один інший фрагмент можуть бути розділені лінкером, як описано вище, або можуть бути з'єднані безпосередньо. Щонайменше один інший фрагмент може бути приєднаний до пептиду щодо винаходу на N-кінці, C-кінці або до будь-амінокислоти, відмінною від кінцевих амінокислот, при цьому кращим є приєднання до N-кінця. До фрагменту, вже міститься у складі химерної молекули, можуть бути приєднані додаткові фрагменти. Спеціалісту відомі способи аналізу для визначення оптимального порядку та/або поєднання фрагментів в химерну молекулі щодо винаходу. У типовому випадку, якщо химерна молекула містить пептид по винаходу і щонайменше один інший пептид, такі химерні молекули не включені в цей термін, якщо з'єднання призводить до утворення пептидів природного походження. Таку химерну молекулу можна отримати і виділити згідно із способів, описаних вище для �в, таких як описані в цьому документі. У випадку безлічі з щонайменше двох пептидів, вони можуть бути одного типу чи різних типів. І навпаки, якщо щонайменше один пептид щодо винаходу приєднано до двох або кількох елементів, ці фрагменти можуть бути одного типу чи різних типів (наприклад, дві молекули нуклеїнової кислоти або одна молекула нуклеїнової кислоти і це одна молекула). На конкретних прикладах втілення одиночний пептид щодо винаходу приєднаний до безлічі з двох або кількох інших фрагментів. В інших варіантах втілення безліч з двох або кількох пептидів щодо винаходу приєднано до одиничного іншого фрагмента.

У кращих втіленнях щонайменше один інший фрагмент обраний із групи, що складається з однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот, одного або декількох пептидів або білків, однієї або декількох малих молекул і однієї або декількох наночастинок.

Композиція по справжньому винаходу також може містити додаткові компоненти, наприклад, агенти для стабілізації з'єднання між одним або декількома пептидами, описаними в цьому документі, і щонайменше одним іншим фрагментом (наприклад�іі сумарного заряду композиції з метою полегшення поглинання клітинами.

Термін «малі молекули» при використанні в цьому документі слід розуміти в самому широкому сенсі, і він включає не тільки низькомолекулярні органічні сполуки, але також мітки і репортерние молекули (див. нижче), гаптени (тобто, малі молекули, які здатні викликати імунну відповідь тільки при їх приєднання до більш великого носія), такі як гідралазин, урушиол, флуоресцеин, біотин і дигоксигенин, і аптамери.

Термін «наночастинки» при використанні в цьому документі позначає мікроскопічні частинки, розмір яких щонайменше в одному вимірі становить менше 100 нм. У типовому випадку наночастинки мають діаметр в діапазоні від 50 нм до 500 нм (тобто, від 0,05 мкм до 0,5 мкм), зберігають стабільну структуру у фізіологічних умовах і здатні утримувати всередині більш дрібні молекули, такі як лікарські речовини або інші біоактивні агенти, які потім можуть доставлятися в потрібну область. Багато наночастинки (або наноносители) є температурочувствительними та/або чутливими до значення pH, тобто, вони вивільняють свою навантаження при нагріванні та/або зміну значення pH. Такі наноносители захищають знаходяться всередині них з'єднання від деградації і пищеваере один пептид щодо винаходу, який перебуває у складі композиції, приєднаний до однієї або кількох молекул нуклеїнової кислоти. Переважно, щонайменше один пептид щодо винаходу, до якого приєднано один або кілька молекул нуклеїнової кислоти, має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, і при цьому амінокислотна послідовність має по всій своїй довжині щонайменше 70%, переважно - щонайменше 80% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 4.

Одна або декілька молекул нуклеїнової кислоти, до яких приєднаний щонайменше один пептид, такий як описаний в цьому документі, можуть бути молекулами ДНК або молекулами РНК природного або штучного походження, що мають будь-яку довжину (у тому числі аптамерамі), і можуть бути одноцепочечними або двуцепочечними. У варіантах втілення з більш ніж однією молекулою нуклеїнової кислоти, приєднаної щонайменше до одного пептиду, ці молекули нуклеїнової кислоти можуть бути одного типу (тобто, мати ідентичні нуклеотидні послідовності) або різних типів. У типовому випадку один пептид за изобрелько молекул нуклеїнової кислоти є молекулами РНК, у типовому випадку - молекулами малих некодирующих РНК (тобто, РНК, які не транслюються в пептид або білок, таких як мяРНК, мядРНК, stРНК, siРНК, mirna і shРНК), і переважно молекули РНК обрані з групи, що складається з молекул siРНК, молекул mirna і молекул shРНК.

Термін «молекула mirna» (або «mirna») при використанні в цьому документі має свій звичайний сенс, прийнятий в даній області (див. огляд, наприклад, у публікаціях: Bartel, D. P. (2004) Cell 23, 281-292; He, L. and Hannon, G. J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522-531). Відповідно, термін «микроРНК» позначає ендогенну молекулу РНК, яка відбувається від геномного локусу, яка була процессирована з транскриптів, які здатні утворювати локальні структури, характерні для РНК-попередників міРНК. Зріла mirna зазвичай має довжину 20, 21, 22, 23, 24 або 25 нуклеотидів, хоча також може бути інша кількість нуклеотидів, наприклад, 18, 19, 26 або 27 нуклеотидів.

Послідовність, що кодує міРНК, має здатність спаровуватися з фланкуючими геномними послідовностями, при цьому зріла mirna бере участь в утворенні недосконалого дуплексу (також званого в цьому документі структурою стебло-петля або шпилечной структурою або пре-міРНК), який служить до�роцессинг в типовому випадку відбувається шляхом послідовної дії двох специфічних эндонуклеаз, званих Drosha і Dicer, відповідно. В результаті дії Drosha з первинного транскрипту (званого «при-mirna») утворюється попередник mirna (також позначається в загальному випадку «пре-mirna»), який у загальному випадку згортається в шпилечную структури або структури стебло-петля. З цього попередника mirna під дією Dicer вирізається дуплекс міРНК, який містить зрілу mirna в одному плечі шпилечной структури або структури стебло-петля і має схожий розмір сегмент (зазвичай позначається mirna*) в іншому плечі. Після цього mirna направляється до її цільової мРНК для виконання своєї функції, при цьому mirna* у багатьох випадках деградируется. Залежно від ступеня комплементарності між mirna і її цільової мРНК, mirna може запускати різні регуляторні процеси. Цільові мРНК, які у високій мірі комплементарни міРНК, специфічно розщеплюються за участю механізмів, ідентичних РНК-інтерференції (РНКі), a mirna виконують роль малих інтерферуючих РНК (siРНК). Цільові мРНК, які в меншій мірі комплементарни міРНК, або направляються в метаболічні шляхи деградації в клітці та/або їх трансляція пригнічується. Однак механізм, з допомогою якого mirna пригнічує трансляцію сво�про молекул нуклеїнової кислоти, приєднані щонайменше до одного пептиду, такого як описаний в цьому документі, є зрілими молекулами міРНК. В інших варіантах втілення застосовують молекули попередника міРНК. Термін «попередник mirna» (або «mirna-попередник» або «пре-mirna») при використанні в цьому документі позначає частину первинного транскрипту міРНК, з якої в результаті процесингу утворюється зріла міРНК. У типовому випадку пре-mirna складається в стабільну шпилечную структуру (тобто, дуплекс) або структуру стебло-петля. Шпилечная структура має довжину в діапазоні від 50 до 120 нуклеотидів, у типовому випадку - від 55 до 100 нуклеотидів і переважно - від 60 до 90 нуклеотидів (з урахуванням залишків нуклеотидів, пару з mirna (тобто, «стебла») і будь-яких проміжних сегментів (тобто, «петлі»), але без урахування розташованих більш дистально послідовностей).

Термін «молекула siРНК» (або «siРНК») при використанні в цьому документі також має своє звичайне значення, прийняте в даній області (див. огляд, наприклад, у публікаціях: Dorsett, Y. and Tuschl, T. (2004) Nat. Rev. Drug Disc. 3, 318-329; Rana, T. M. (2007) Nat. Rev. Mol. Cell Товарbiol. 8, 23-36). Відповідно, термін «siРНК» позначає двуцепочечную молекулу РНК, у типовому випадку має 2 неспаренниѸ 25 нуклеотидів, хоча також може бути інша кількість нуклеотидів, наприклад, 18, 19, 26 або 27 нуклеотидів. В рамках цього винаходу також можуть застосовуватися молекули попередника siРНК, що мають довжину до 49 нуклеотидів. Зріла siРНК утворюється з такого попередника в результаті процесингу з участю Dicer.

Традиційно термін «siРНК» застосовували для позначення інтерферуючих РНК, які екзогенно вводять у клітину. Однак у різних організмах були виявлені ендогенні siРНК, які відносяться щонайменше до чотирьох класів: транс-діючі siРНК (tasiРНК), асоційовані з повторами siРНК (rasiРНК) скануючі малі (scn)РНК і взаємодіючі з Piwi (pi)РНК (див. огляд, наприклад, у публікації: Rana, T. M. (2007), див. вище).

Одна ланцюжок siРНК входить до складу рибонуклеопротеинового комплексу, відомого як комплекс, який здійснює індукований РНК сайленсинг (RISC). Комплекс RISC використовує дану ланцюг siРНК для виявлення цільових молекул мРНК, які щонайменше частково комплементарни що входить в його склад нитки siРНК, а потім розщеплює ці цільові мРНК. Нитка siРНК, яка входить до складу комплексу RISC, називають ниткою-гідом або антисмислової ниткою. Інша нитка siРНК, звана ниткою-пас�исту в даній області буде зрозуміло, що, в принципі, будь-яка нитка siРНК може входити до складу комплексу RISC і виконувати функцію нитки-гіда. Однак особливості будови siРНК (наприклад, знижена стабільність дуплексу siРНК на 5'-кінці нитки, яка повинна служити гідом) можуть сприяти включенню в комплекс RISC потрібної нитки-гіда. Антисмисловая нитка siРНК є активним агентом, що виконує в siРНК роль гіда, в тому сенсі, що антисмисловая нитка включається до складу комплексу RISC, дозволяючи тим самим комплексу RISC виявляти цільові мРНК, які мають щонайменше часткової комплементарностью з антисмислової ниткою siРНК, з метою розщеплення або придушення трансляції. Опосередковане комплексом RISC розщеплення мРНК, що мають послідовність, щонайменше частково комплементарну нитки-гіду, веде до зниження рівноважного рівня цієї мРНК і відповідного білка.

Термін «молекула shPHK» (тобто, молекула короткої шпилечной РНК) при використанні в цьому документі означає штучно створені одноцепочечние інтерферуючі молекули РНК, що містять як смислове, так і антисмисловую нитки «дуплексу siРНК» у складі структури стебло-петля або шпилечной структури. Стебло цієї шпилечной структури в типовому випадку має � (див., наприклад, Siolas, D. et al. (2004) Nat. Biotechnol. 23, 227-231). Зазвичай молекула shРНК кодується ДНК у складі экспрессионного вектора під контролем промотору для РНК-полімерази III (наприклад, промотора U6).

В деяких варіантах втілення молекули РНК, описані вище, містять структуру остова, що включає тільки рибонуклеотидние одиниці. В інших варіантах втілення такі молекули РНК містять щонайменше одну рибонуклеотидную одиницю остова і щонайменше одну дезоксирибонуклеотидную одиницю остова. Додатково, молекула РНК може містити одну або кілька модифікацій 2'-OH-групи рибози 2'-O-метильної групи або 2'-O-метоксиэтильную групу (також званих «2'-»«O»«-метилированием»), які запобігають деградацію нуклеазами в культуральному середовищі і, що особливо важливо, також запобігають эндонуклеолитическое розщеплення нуклеазой комплексу, здійснює індукований РНК сайленсинг, яке веде до незворотного інгібування молекули РНК малої. Ще одна можлива модифікація, яка функціонально еквівалентна 2'-O-метилированию, включає «замкнені» нуклеїнові кислоти (LNA), які являють собою аналоги нуклеїнових кислот, що містять один або кілька нуклеотидних мо�ацию цукру в складі РНК (див., наприклад, Orom, U. A. et al. (2006) Gene 372, 137-141).

В деяких інших варіантах втілення молекули нуклеїнової кислоти, призначені для приєднання до щонайменше однієї пептидної молекулі щодо винаходу, являють собою агенти, що викликають сайленсинг експресії ендогенних міРНК. Одним з прикладів такого агента, що викликає сайленсинг, є сконструйовані хімічними способами олигонуклеотиди, звані «антагомирами», які являють собою одноцепочечние молекули РНК довжиною 23 нуклеотиду, кон'юговані з холестеролом (Krutzfeldt, J. et al. (2005) Nature 438, 685-689). В якості альтернативи таким хімічно модифікованим олигонуклеотидам були отримані інгібітори микроРНК, які здатні экспрессироваться в клітинах у вигляді РНК, синтезованих з трансгенів. Ці конкурентні інгібітори, звані «губками для микроРНК», є транскриптами, экспрессируемими з сильних промоторів і містять множинні тандемно розташовані сайти зв'язування для представляє інтерес микроРНК (Ebert, M. S. et al. (2007) Nat. Methods 4, 721-726).

В особливо кращих прикладах втілення щонайменше один пептид у складі композиції приєднаний до одному або декільком іншим пептидів. Терми�ті можуть бути интернализировани всередину клітини, таких як описані в цьому документі (тобто, пептидів, зазначених у формулі винаходу).

Зокрема, переважно, щонайменше один пептид щодо винаходу, до якого приєднано один або кілька молекул інших пептидів, має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, і при цьому амінокислотна послідовність має по всій своїй довжині щонайменше 70%, переважно - щонайменше 80% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 4.

Один або кілька інших пептидів, до яких приєднаний щонайменше один пептид, що описаний в цьому документі, можуть бути молекулами природного походження або штучно створеними молекулами будь-якої довжини. Наприклад, довжина таких пептидів може перебувати в діапазоні від 2 до 500 амінокислот або від 5 до 200 амінокислот. У типовому випадку такі пептиди мають довжину від 8 до 100 амінокислот або від 10 до 50 амінокислот. Переважно, довжина таких пептидів може перебувати в діапазоні від 10 до 40 амінокислот, від 12 до 35 амінокислот або від 15 до 30 амінокислот. Штучно створені пептидні молекули можуть бути отримані з застосований�оби синтезу добре відомі фахівцям в даній області (див., наприклад, Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001), див. вище).

У варіантах втілення з більш ніж однією молекулою інших пептидів, приєднаної щонайменше до одного пептиду щодо винаходу, ці молекули інших пептидів можуть бути одного типу (тобто, мати ідентичні амінокислотні послідовності) або різних типів. У типовому випадку один пептид щодо винаходу приєднаний до однієї молекулі іншого пептиду.

У додаткових варіантах втілення одна або декілька молекул інших пептидів містять щонайменше один структурований домен, тобто, елемент, який утворює (тобто, укладається певним чином) стабільну вторинну структуру, а саме, певне просторове розташування амінокислотних залишків, які локалізовані поруч один з одним в лінійній послідовності. Часто стерические взаємодії між амінокислотними залишками носять регулярний характер, що призводить до утворення періодичних структур, добре відомих фахівців у даній області, таких як α-спіралі (схожа на стрижень щільно згорнута спіральна структура) і β-структури (витягнутий ділянку, при цьому безліч таких ділянок, можливо, утворюють паралельні або антипараллельние β-скурированними областями, або можуть містити два або кілька таких структурованих доменів (одного типу чи різних типів, наприклад, дві α-спіралі або одну α-спіраль і одну β-структури), відокремлені один від одного. Пептидні молекули можуть утворювати таку вторинну структуру по всій своїй довжині (тобто, не містити неструктурованих областей). У разі, якщо у складі композиції, описаної в цьому документі міститься більш ніж одна молекула інших пептидів, можливо також, що частина молекул інших пептидів, що містять щонайменше один структурований домен, при цьому інша частина є неструктурованою.

У кращих прикладах втілення щонайменше частина однієї або кількох молекул інших пептидів, описаних у цьому документі, утворює альфа-спіральну вторинну структуру. α-Спіральний елемент може містити щонайменше 4 або 6 амінокислотних залишків і, переважно, щонайменше 8 або 10 амінокислотних залишків. На конкретних прикладах втілення пептидний молекула щодо винаходу містить одиночний α-спіральний елемент в якості єдиної вторинної структури.

В інших бажаних варіантах втілення один або кілька інших пептидів є � програмовану клітинну загибель). Фахівця в даній галузі будуть відомі білкові чинники, які відповідають за індукцію та/або опосередкування апоптозу, а також придатні способи вибору пептидних послідовностей, які мають про-апоптотической функціональною активністю. Наприклад, інформацію про таких про-апоптотичних факторах можна знайти в наукових публікаціях, а також в різних базах даних, таких як «APOPTOSIS Databas» (Doctor, K. S. et al. (2003) Cell Death Diff. 10, 621-623).

В інших варіантах втілення один або кілька інших пептидів мають функціональні активності, вибрані з групи, що складається з активації/зняття репресії супресорів пухлинних клітин, інгібування клітинних онкогенів та інгібування конститутивно активних варіантів білків. В інших варіантах втілення один або кілька пептидів представляють собою ліганди природного походження або синтетичні ліганди (наприклад, агоністи і антагоністи) клітинних рецепторів, таких як рецептори цитокінів, рецептори ангіотензину, рецептори ендотеліну, рецептори вазопресину і рецептори брадикініну. Знову ж, безліч таких пептидів добре відомі фахівцям у даній галузі, або інформацію про них можна легко знайти в різних джерелах.

До�ції, зазначеної в цьому документі вище, включає:

(a) створення щонайменше одного пептиду щодо винаходу;

(b) здійснення контакту щонайменше одного пептиду з будь-молекулою, обраної з групи, що складається з однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот, одного або декількох пептидів або білків, однієї або декількох малих молекул і однієї або декількох наночастинок, для того, щоб забезпечити здійснення приєднання.

Фахівця в даній галузі будуть відомі придатні умови проведення реакцій з метою здійснення такого способу (див., наприклад, Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001), див. вище; Ausubel, F. M. et al. (2001), див. вище).

Додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до способу виявлення здібності до інтерналізації у пептиду щодо винаходу або композиції (тобто, щонайменше одного пептиду, приєднаного до навантаження) щодо винаходу, що включає:

(a) введення пептиду або композиції в одну або кілька клітин;

(b) виявлення інтерналізації пептиду або композиції.

Цей спосіб може бути особливо кращим для оцінки можливості застосування пептиду або композиції для медичних (наприклад, діагностичних) іі і, можливо, їх локалізація в цитоплазмі, це свідчить про те, що відповідне з'єднання можна застосовувати для певної задачі.

З цією метою пептид або композицію з винаходу можна приєднати до одного або декількох детектируемим мітках. Мітки, які можна застосовувати у відповідності з винаходом, включають будь-яке з'єднання, яке прямо або опосередковано викликає утворення детектованого з'єднання або сигналу в результаті хімічної, фізичної або ферментативної реакції. Мічення і подальшу детекцію можна здійснювати способами, добре відомими фахівцям в даній області (див., наприклад, Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001), див. вище; і Lottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germany). Мітки можуть бути обрані, серед іншого, з флуоресцентних міток, ферментативних міток, хромогенних міток, люмінесцентних міток, радіоактивних міток, гаптенів, біотину, комплексів з металами, металів і колоїдного золота. Всі ці типи міток добре відомі фахівцям в даній області, і їх можна придбати у різних постачальників. Прикладом фізичної реакції, яку опосередковує такі мітки, є випущення флуоресценції або фосфоресценции при опроміненні. Луго�еток, які каталізують утворення хромогенних продуктів реакції і які можна застосовувати в цьому винаході.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до застосування пептиду, описаного в цьому документі, або композиції, описаної в цьому документі, для трансформації або трансфекції однієї або декількох клітин, тобто, до застосування вказаних сполук в якості носія для доставки з метою перенесення навантаження в конкретні цільові клітини.

На конкретних прикладах втілення винахід відноситься до застосування композиції, описаної в цьому документі вище, містить щонайменше один пептид щодо винаходу, який приєднаний до щонайменше одному з'єднанню з групи, що складається з однієї або кількох молекул нуклеїнової кислоти і одного або декількох пептидів або білків, для трансфекції та/або цільової доставки агентів в конкретні клітини.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до фармацевтичної композиції, що містить щонайменше одну пептидний молекулу, зазначену в цьому документі, або композицію, зазначену в цьому документі (тобто, щонайменше один пептид, приєднаний до навантаження),�в і/або домішок.

Термін «фармацевтична композиція» при використанні в цьому документі ставиться до композиції, призначеної для введення суб'єкту, переважно - пацієнту, який є людиною. Фармацевтичні композиції по справжньому винаходу включають будь-які фармацевтичні лікарські форми, відомі в цій галузі, такі як, серед іншого, капсули, мікрокапсули, крохмальні капсули, драже, таблетки, порошки, пілюлі, багатокомпонентні готові лікарські форми (наприклад, кульки, гранули або кристали), аерозолі, спреї, емульсії, піни, розчини, дисперсії, настоянки, сиропи, еліксири, суспензії, емульсії типу вода в маслі, наприклад, мазі, емульсії типу олія-у-воді, наприклад, креми, лосьйони і бальзами. Готові лікарські форми можуть бути упаковані у вигляді окремих одиниць дозування або в многодозових контейнерах.

Фармацевтичні композиції з винаходу включають готові лікарські форми, придатні для перорального, ректального, назального, місцевого (у тому числі букального і під'язикові), перитонеального і парентерального (включаючи внутрішньом'язове, підшкірне і внутрішньовенне) введення або для введення за допомогою інгаляції або інсуфляції. Введення може бути місцеві�бами (див., наприклад, Gennaro, A. L. and Gennaro, A. R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA; Crowder, T. M. et al. (2003J A Guide to Pharmaceutical Particulate Science. Interpharm/CRC, Boca Raton, FL; Niazi, S. K. (2004) Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, CRC Press, Boca Raton, FL).

Для приготування зазначених композицій можна застосовувати одну або кілька фармацевтично прийнятних (тобто, інертних) неорганічних або органічних допоміжних речовин (тобто, носіїв). Для приготування, наприклад, драже, таблеток, капсул або гранул, можна застосовувати, наприклад, лактозу, тальк, стеаринову кислоту та її солі, жири, воски, тверді або рідкі високомолекулярні спирти, природні та гідрогенізовані олії. Придатні допоміжні речовини для виробництва розчинів, суспензій, емульсій, аерозольних сумішей або порошків для приготування відновлених розчинів або аерозольних сумішей перед застосуванням включають, серед іншого, воду, спирти, гліцерин, високомолекулярні спирти та їх суміші придатні, а також рослинні масла. Фармацевтична композиція також може містити добавки, такі як, наприклад, наповнювачі, зв'язувальні речовини, змочувальні агенти, ковзаючі речовини, стабілізатори, консерванти, емульгуючі агенти і додаткові розчин�я. В останньому випадку передбачається, що активні пептиди або композиції з винаходу можуть бути впроваджені в системи для повільного або відстроченого вивільнення або для цільової доставки, такі як ліпосоми, наночастинки і мікрокапсули.

Фармацевтична композиція з винаходу буде вводитися суб'єкту в придатною дозуванні. Конкретний застосовуваний режим дозування буде визначений лікарем, а також буде залежати від клінічних факторів. Як добре відомо фахівцям у галузі медицини, відповідна для даного пацієнта дозування залежить від безлічі факторів, включаючи масу, стать і вік пацієнта, конкретне з'єднання, яке буде вводитися, час і шлях введення, загальний стан здоров'я, вже існуючі стану та інші ліки, які вводяться паралельно. Терапевтично ефективна кількість для даної ситуації буде легко визначити з застосуванням стандартних експериментальних способів, і це може здійснити звичайний клініцист або лікар. У загальному випадку дозування при регулярному введенні повинна знаходитися в діапазоні від 1 мкг до 1 г на день. Однак переважна дозування може перебувати в діапазоні від 0,01 мг до 100 мг, більш краща�ень.

Ще однією особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до пептиду, який зазначено в цьому документі, або до композиції, зазначеної в цьому документі, для застосування з метою профілактики та/або лікування стану, при цьому стан переважно вибрано з групи, що складається з онкологічного захворювання, імунних захворювань, серцево-судинних захворювань, неврологічних захворювань, інфекцій і запальних захворювань. З цією метою пептид або композиція з винаходу можуть бути приготовлені у вигляді фармацевтичної композиції, такий як описана в цьому документі вище, і введені суб'єкту, переважно - пацієнту, який є людиною.

Термін «онкологічне захворювання» при використанні в цьому документі позначає будь-який тип або форми злоякісного новоутворення, що характеризується неконтрольованим розподілом цільових клітин в результаті генетичного ре-програмування і здатністю цільових клітин розповсюджуватися як шляхом безпосереднього вростання в сусідні тканини допомогою інвазії, так і шляхом імплантації в віддалені області з утворенням метастазів (при цьому ракові клітини переносяться по кровоносній або лімфатичної Ѿбластому, глиобластому, меланому, рак печінки та рак легенів.

Термін «імунне захворювання» при використанні в цьому документі ставиться до будь-якого порушення, затрагивающему імунну систему. Приклади таких імунних захворювань включають, серед іншого, імунодефіцити (тобто, вроджені або придбані стани, при яких здатність імунної системи боротися з інфекційними захворюваннями пригнічена або повністю відсутній, такі як СНІД або ТКИД), гіперчутливість (наприклад, алергії або астми) та аутоімунні захворювання. Термін «аутоімунне захворювання» при використанні в цьому документі слід розуміти як позначає будь-яке порушення, що виникає в результаті занадто активної імунної відповіді організму, спрямованого проти ендогенних субстанцій і тканин, при цьому організм атакує свої власні клітини. Приклади аутоімунного захворювання включають, серед іншого, множинний склероз, хвороба Крона, червоний вовчак, міастенію гравіс, ревматоїдний артрит і поліартрит.

Термін «серцево-судинне захворювання» при використанні в цьому документі ставиться до будь-якого порушення, затрагивающему серце і коронарні судини. Приклади серцево-судинних занфаркт міокарда, ішемію і міокардит.

Термін «неврологічне захворювання» (або «неврологічне порушення») при використанні в цьому документі означає будь-яке порушення, що зачіпає нервову систему, включаючи захворювання центральної нервової системи (ЦНС) (тобто, головного і спинного мозку) і захворювання периферичної нервової системи. Приклади захворювань ЦНС включають, серед іншого, хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, хвороба Хантінгтона, бодрствующую кому і синдром Туретта. Приклади захворювань периферичної нервової системи включають, наприклад, множинний мононеврит і поліневропатію.

Термін «інфекція» при використанні в цьому документі означає будь-яке порушення, зумовлене колонізацією організму-господаря чужорідним патогеном, таких як бактерії, віруси та гриби. Приклади бактеріальних інфекцій включають, серед іншого, бактеріальний менінгіт, холеру, дифтерію, лістеріоз, коклюш, сальмонельоз, правець і висипний тиф. Приклади вірусних інфекцій включають, серед іншого, застуду, грип, лихоманку денге, геморагічну лихоманку Ебола, гепатит, епідемічний паротит, поліомієліт, сказ і чорну віспу. Приклади грибкових інфекцій включають, серед іншого, дермофитию стопи, бласто�е порушення, асоційоване з запаленням, включаючи, наприклад, акне, астму, сінну лихоманку, артрит, запальне захворювання кишечника, запальне захворювання органів таза і відторгнення трансплантата.

Додатковою особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до способу профілактики та/або лікування стану, вибраного з групи, що складається з онкологічного захворювання, імунних захворювань, серцево-судинних захворювань, неврологічних захворювань, інфекцій і запальних захворювань, що включає: введення суб'єкту щонайменше одного пептиду щодо винаходу або композиції з винаходу. Переважно, суб'єкт є людиною.

Заключною особливістю цього винаходу є те, що воно відноситься до складеного набору, містить принаймні одне з наступного:

(a) пептидний молекулу, описану в цьому документі вище;

(b) молекулу нуклеїнової кислоти, описаних у цьому документі вище;

(c) вектор, що описаний в цьому документі вище;

(d) клітину-господаря, описану в цьому документі вище;

(e) композицію, описану в цьому документі вище.

Різні компоненти (a)-(e) набору можуть бути упаковані в один або кілька �ить упакований в окремий контейнер.

Вищевказані компоненти набору можуть поставлятися в ліофілізованої або сухої формі або розчиненими в придатному буферному розчині, такому як фосфатно-сольовий буферний розчин або буферний розчин трис/ЕДТА (TE). Клітина-господар по справжньому винаходу може поставлятися, наприклад, у вигляді культури, завданої у вигляді штрихів на чашку з агаром або в будь-якій іншій формі, придатної для тривалого зберігання. Такі способи зберігання добре відомі фахівцям в даній області.

Набір може містити додаткові реактиви, включаючи, серед іншого, консерванти, живильне середовище і/або буферні розчини для зберігання та/або відновлення вищевказаних компонентів, розчини для промивання і т. п. Ці реактиви можуть поставлятися в поєднанні з одним або кількома компонентами (a)-(e), тобто, в тому ж контейнері (наприклад, молекула пептиду або нуклеїнової кислоти, розчинена у відповідному буферному розчині). Згідно з іншим варіантом, щонайменше деякі з цих додаткових реактивів можуть поставлятися в окремих контейнерах.

Винахід додатково описано з допомогою наступних фігур і далі прикладів, які служать виключно для ілюстрації Ђоящего винаходу яким-небудь чином.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1: Матеріали і способи

1.1 Культура клітин ссавців

Клітини MCF7 посіяли при щільності 15000 клітин на лунку у 96-лункові планшети. Клітини інкубували протягом 24 год при 37°C, 5% CO2і вологості 85% в середовищі RPMI 1640 з додаванням 10% FCS (сироватки плодів великої рогатої худоби) і L-глутаміну. Для проведення аналізу функціональної активності клітини промивали в середовищі OptiMEM і замінювали середовище RPMI 1640 на OptiMEM (всі реактиви купували в компанії Invitrogen Corporation, Карлсбад, Каліфорнія, США). Для утворення комплексів siРНК з пептидами проводили інкубацію 100 нМ siРНК з вказаними концентраціями пептидів в середовищі OptiMEM протягом 30 хв. при кімнатній температурі. Комплекси додавали до клітин і інкубували протягом 3 ч. Потім середу OptiMEM замінювали на нормальну живильне середовище RPMI 1640. Клітини інкубували ще протягом 21 год для отримання лізатів для аналізу за допомогою p-ДНК і протягом додаткових 45 год для проведення аналізу з наборами CellTiter-Glo або CytoTox-Glo (див. нижче).

1.2 Кількісне визначення рівнів мРНК

З метою кількісного визначення рівнів клітинних мРНК проводили аналіз за методом p-ДНК (розгалуженої ДНК), який дозволяє оцінювати рівні індивідуальних мРНК. Для эвили на ніч для прикріплення. На наступний день провели трансфекцію клітин молекулами siРНК.

Через 24 год провели кількісне визначення індивідуальних мРНК із застосуванням аналітичного набору QuantiGene Plex 2.0 згідно з рекомендаціями виробника (Affymetrix Inc., Санта-Клара, Каліфорнія, США). Коротко: клітинні лізати переносили в планшет з захоплюючим агентом у присутності набору ген-специфічних зондів і інкубували при 53°C протягом ночі. Після промивання лунки послідовно інкубували при 53°C з амплифицирующим агентом і з зондом, конъюгированним з лужною фосфатазой (AP), а між цими етапами проводили промивання. Далі додавали люмінесцентний субстрат для AP - диоксетан - і інкубували протягом 30 хв. при 53°C. Рівень люмінесценції вимірювали із застосуванням рідера для визначення люмінесценції InfiniteF200 (Tecan Austria GmbH, Грединг, Австрія).

1.3 Аналіз життєздатності клітин

Для визначення кількості живих клітин застосовували аналітичний набір CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation,Мадисон, Вісконсін, США) згідно з протоколом, запропонованих виробником. Клітини інкубували протягом 48 год у присутності пептидів і siРНК. Після цього проводили лізис клітин і индуцировали люмінесцентний сигнал, котоутствующих живих клітин. Рівень люмінесценції аналізували за допомогою рідера для визначення люмінесценції InfiniteF200.

1.4 Аналіз цитотоксичності

Для визначення цитотоксичності пептидів застосовували аналітичний набір CytoTox-Glo Cytotocity Assay (Promega Corporation, Мадисон, Вісконсін, США) згідно з протоколом, запропонованих виробником. Клітини інкубували протягом 48 год у присутності пептидів і siРНК. Потім клітини обробляли люминогенним пептидним субстратом з метою вимірювання активності протеаз мертвих клітин, які вивільняються з клітин, в яких порушена цілісність мембрани. Субстрат не може проходити крізь інтактну мембрану живих клітин і не генерує значного сигналу при додаванні до популяції живих клітин. Таким чином, рівень люмінесценції при даному аналізі відповідає кількості мертвих клітин. Аналіз 96-лункових планшетів проводили в рідері для визначення люмінесценції InfiniteF200.

1.5 Синтез пептидів

Синтез пептидів проводили згідно з прийнятими протоколами («FastMoc 0.25 mmol») в автоматизованому пептидном синтезаторі Applied Biosystems ABI 433A із застосуванням хімічної реакції з участю Fmoc. В ході повторюваних циклів збирали відповідні пептидні послідовності шляхом�ву Fmoc-групу видаляли за допомогою обробки смоли 20%-им розчином пиперидина N-метилпирролидоне. Приєднання здійснювали із застосуванням Fmoc-захищених амінокислот (1 ммоль), активованих розчином гексафторфосфат-O-(бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилурония / 1-гидроксибензотриазола (HBTU/HOBt, по 1 ммоль кожного) і диизопропилэтиламина (DIPEA, 2 ммоль) в диметилформамиде (DMF). Після етапу приєднання проводили приєднання захисних груп до непрореагировавшим аминогруппам з допомогою обробки сумішшю Ac2O (0,5 М), DIPEA (0,125 М) і HOBt (0,015 М) в NMP. Між двома етапами смолу рясно промивали N-метилпирролидоном в DMF. Введення створюють стерические перешкоди амінокислот проводили із застосуванням автоматизованого подвійного приєднання. Для цього смолу двічі обробляли з допомогою 1 ммоля активованого стандартного блоку без проміжного етапу приєднання захисних груп. По завершенні синтезу цільової послідовності приєднували до пептиду Fmoc-12-аміно-4,7,10-триоксадодекановую кислоту (TEG-спейсер), застосовуючи стандартні умови проведення реакції. Після цього приєднували Fmoc-Cys(Trt)-OH до аминоконцу всіх пептидних послідовностей. Після зняття захисних Fmoc-груп несучу пептиди смолу поміщали у фриттовий фільтр і обробляли сумішшю трифторацетатной кислоти, води і триизопропи�аждали пептиди з допомогою додавання охолодженого (0°C) диизопропилового ефіру (300 мл) з отриманням безбарвного твердого речовини, яка повторно промивали диизопропиловим ефіром. Неочищений продукт повторно розчиняли в суміші оцтової кислоти та води, лиофилизировали і очищали з застосуванням препаративної обратнофазовой ВЕРХ, використовуючи градієнт ацетонітрил / вода, що містить 0,1% трифторуксусную кислоту (TFA) (колонка Chromolith prep RP-18e, 100×25 мм; Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина).

1.6 Аналіз із застосуванням FACS (флуоресцентно-активованого клітинного сортинга)

Для проведення аналізу з застосуванням FACS здійснювали відкріплення клітин MCF7 (ATCC № HTB-22) шляхом інкубації протягом 15 хв. з аккутазой (розчином ферменту, який володіє протеолітичною і коллагенолитической активностями; доступний для придбання в різних постачальників). Після промивання буферним розчином для FACS (фосфатно-сольовим буфером (PBS), що містить 5% FCS) клітини посіяли в 96-лунковий планшет з лунками, мають округле дно (кат. №3799, Corning Inc., Корнінг, Нью-Йорк, США), при кінцевої щільності 3×105клітин/мл і відразу ж застосовували. Клітини інкубували у присутності, відповідно, 1 мкМ, 5 мкМ і 10 мкМ FITC-мічених пептидів в середовищі OptiMEM протягом 3 год при 37°C. Після цього клітини промивали у буферному розчині для FACS і інкубували в буферному розчині, що містить протеіназу�рє, Каліфорнія, США) із застосуванням каналу для FITC.

1.7 Аналіз зсуву електрофоретичної рухливості в гелі

Аналіз зсуву електрофоретичної рухливості в гелі проводили шляхом змішування 500 мкг дуплексу siРНК з відповідними пептидами у зазначеному молярному співвідношенні у воді. Комплекси утворювалися протягом 1 год при 37°C, після чого проводили їх аналіз в 2,5% агарозному гелі з бромідом этидия (поділ: 40 хв. при 125). Для обробки протеіназою До додавали 1 мкл протеїнази К в стандартну реакцію, як зазначено вище.

Приклад 2: Виявлення потенційних пептидів CPP людини

2.1 Биоинформационний спосіб

Одна група пептидів, що проникають у клітини (CPP), прикладами якої є походить з ВІЛ пептид TAT (Frankel, A. D. and Pabo, С. О. (1988) Cell 55, 1189-1193; Vives; E. et al. (1997), див. вище) та модельний пептид полиаргинин (Wender, P. A. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13003-13008; Futaki, S. et al. (2001) J. Товарbiol. Chem. 276, 5836-5840), характеризується високим вмістом позитивно заряджених амінокислот. Інші пептиди CPP, так звані пептиди, що мають структуру спіралі з асиметричним розподілом гідрофобних залишків (tilted peptides), складаються як із заряджених гідрофільних ділянок, так і з незаряджених ліпофільних ділянок амінокислот (Lins, L. �арактеристиками. З метою виявлення таких послідовностей в складі протеому людини застосовували биоинформационний спосіб. На Фіг.1 наведена схема процесу, застосованого для отримання списків кандидатних пептидів.

Для отримання пептидної бібліотеки застосовували спосіб ковзного вікна. Було обрано вікно розміром в 30 амінокислот, яку застосували щодо всіх записів в базі даних по білках SwissProt (Swiss Institute of Bioinformatics; http://www.expasy.org/sprot/). В результаті була отримана бібліотека з 10459557 індивідуальних пептидів, з яких 1024818 були унікальними. 163887 пептидів були виявлені більше одного разу, в середньому 2,7 разів, що відображає наявність у структурі деяких білків повторюваних послідовностей. У згенерованої бібліотеці кожна індивідуальна пептидний послідовність пов'язана з відповідною їй вихідною інформацією (послідовність пептиду, вихідний білок і становище в складі цього білка), а також з анотаціями до генної онтології (GO) (Ashburner, М. et al. (2000) Nat. Genet. 25, 25-39) про вихідному білку. Додаткова інформація, пов'язана з кожним пептидом, включає його амінокислотний склад, наприклад, кількість зарядів, изоэлектрическую точку (ИЭТ) і передбачені гідрофобні властивості. Ох пептидів, чим зазвичай застосовуються в якості пептидів CPP, так як більш довгі пептиди з більшою ймовірністю утворюють вторинну структуру (наприклад, альфа-спіралі або бета-шари). Було показано, що пептиди, що містять такі вторинні структури, що володіють перевагами для проникнення в клітини, порівняно з неструктурованими пептидами (Deshayes, S. et al. (2004) Biochemistry 43, 7698-7706). Крім того, повідомлялося, що альфа-спіральні пептиди довжиною менше 12 амінокислот мають знижену здатність взаємодіяти з молекулами нуклеїнових кислот і, таким чином, переносити їх (Niidome, T. et al. (1999) Bioconjug. Chem. 10, 773-780).

На наступному етапі були відфільтровані пептиди, що містять у своїй первинній амінокислотної послідовності понад 30% позитивно заряджених амінокислотних залишків (тобто, аргініну (R), гістидину (H) і лізину (K)) з метою одержання пептидів, що володіють більш високою схожістю з позитивно зарядженими модельними пептидами TAT і полі-Arg. В результаті застосування цього фільтра було відібрано 227307 індивідуальних пептидів. Для збагачення отриманої вибірки пептидами, які володіють більш високим потенціалом переносимості для імунної системи (тобто, які з меншою ймовірністю є иммуногенним�точними білками. В кінцевому результаті застосування цього фільтра (тобто, вибірки кандидатів, отриманих з позаклітинних білків людини, які, таким чином, є «видимими» для імунної системи людини) суттєво знизило кількість пептидів до 8630 від 583 індивідуальних білків.

2.2 Вибір кандидатних пептидів для експериментального визначення параметрів

Основним фактором для зниження кількості кандидатних пептидів був перехід від способів in silico (за допомогою яких можна аналізувати практично необмежену кількість проб) до експериментального аналізу в умовах лабораторії (при якому можливе ретельне дослідження лише обмеженої кількості кандидатних молекул). Крім того, ще одним практичним міркуванням на користь зменшення списку кандидатних пептидів була легкість застосування, застосовність в біологічних способи аналізу і, нарешті, можливість розробки фармакологічно активного з'єднання. З іншого боку, з подальшої оцінки були виключені пептидні послідовності, які очевидно погано розчиняються або важкі для синтезу.

Для того, щоб уникнути ситуації, коли вибір кандидатних молекул на останньому етапі визначається одним або, можливо, двя різними способами.

Одна підгрупа кандидатних пептидів характеризується вмістом не тільки щонайменше 30% позитивно заряджених («KHR30»), але також великою кількістю гідрофобних залишків. Отже, пептиди були ранжовані з точки зору їх ИЭТ, а також їх гідрофобності. Перетин підмножин обох списків, кожне з яких складалося з 1000 пептидів, які мають найвищу оцінку, дало в результаті 91 пептид, що відбувається з 29 білків. Нарешті, були обрані 20 пептидів, що походять з 20 білків, з найвищими значеннями у складі перетину.

Другу підгрупу кандидатних пептидів отримали на підставі схожості з послідовністю пептиду ТАТ. Всі пептиди піддавали порівнянні на ступінь гомології з застосуванням алгоритму FASTA (Lipman, D. J. and Pearson, W. R. (1985), див. вище). Пептиди ранжирували у відповідності з їхніми відносними значеннями Е (чим нижче значення Е, тим вище місце у списку). В результаті застосування цього способу відібрали 135 пептидів, що відбуваються з 10 білків. Нарешті, для подальшого аналізу вибрали 5 пептидів, що походять з 5 білків.

В якості третьої підгрупи для експериментальної оцінки вибрали 36 кандидатних пептидів, що походять від 25 індивідуальних білків, грунтуючись на анае між кількістю пептидів і кількістю білків пояснюється застосуванням безлічі послідовностей з одного білка (наприклад, CO9_mot1a, CO9_mot1b) або різних варіантів однієї послідовності (наприклад, включають або не містять дисульфідні містки, таких як гранулизин WT (дикого типу), гранулизин G8, гранулизин G9). У загальному випадку зберігали довжину до 30 амінокислот, але якщо було виявлено, що такий 30-заходів містить відомий мотив, то довжину пептиду збільшували до 39 амінокислотних залишків, як у випадку пептиду FALL (Yang, X. Y. et al. (2004) Acta Pharmacol. Sin. 25, 239-245), або до 48 амінокислотних залишків, як у випадку LIP_Cons_C_WT, консенсусної послідовності для безлічі ліпаз (Demant, Т. et al. (1988) J. Lipid Res. 29, 1603-1611). Обмеження ґрунтувалося на ретельному аналізі літературних даних і результатів BLAST-аналізу, отриманих для цих послідовностей. Перевагу віддавали: пептидів, що походить від білків, про яких відомо, що вони чинять руйнівний вплив мембрани, таких як чинники системи комплементу; пептидів, що походить від білків, які беруть участь у деградації ліпідів (таких як ліпази); пептидів, що походить від білків, які є попередниками бактерицидних факторів, таких як FALL (Nijink, A. and Hancock, R. E. (2009) Curr. Opin. Hematol. 16, 41-47) або BPIL3 (Mulero, J. J. et al. (2002) Immunogenetics 54, 293-300); і пептидів, схожим з пептидами, про яких повідомлялося, що вони дм числі контрольні), які піддавали подальшої експериментальної оцінки, наведено в таблиці 1.

Для візуальної демонстрації початкового фільтра побудували графік залежності ИЭТ пептидів від їх гідрофобності. При порівнянні з 500 випадковим чином вибраних пептидами (з безлічі розміром приблизно 10×106) очевидно, що початковий фільтр дозволяє виділити область скупчення вибраних пептидів (див. фіг.2). Для додаткового порівняння були також включені п'ять пептидів в якості позитивного контролю (тобто, TAT, REV, протамин, полі-Arg і INF7). Даний аналіз показує, що позитивно заряджені контрольні пептиди TAT, REV, протамин і 10×Arg відповідають критеріям фільтра, тоді як INF7, який є негативно зарядженим і гідрофобним пептидом, виявляється на іншому кінці шкали.

На додаток до вибраних кандидатним пептидів CPP людини як контролів при скринінгу були додані вісім пептидів, для яких повідомляється про те, що вони володіють активністю CPP (див. таблицю 1). Ці пептиди здатні утворювати нековалентние комплекси з нуклеотидами і володіють здатністю до трансфекції: TAT, пептид CPP, що походить від трансактивирующего білка ВІЛ (Ignatovich, I. A. et al. (2003) J. Товарbiol. Chem. 278, 42625-42636); REV, прикладу позитивно зарядженого пептиду; кротамин (Nascimento, F. D. et al. (2007) J. Товарbiol. Chem. 282, 21349-21360). Крім того, укорочений протамин (Song, E. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 709-717) та N-кінцевий фрагмент перфорина додали в якості прикладів пептидів людини. Додатковими двома контролями, що не належать до класу TAT-подібних пептидів CPP, були Inf7, пептид, що походить від HA вірусу грипу (негативно заряджений і гідрофобний пептид; Plank, С. et al. (1994) J. Товарbiol. Chem. 269, 12918-12924) і MTS (в основному гідрофобний пептид; Lin, Y. Z. et al. (1995) J. Товарbiol. Chem. 270, 14255-14258).

Приклад 3: Скринінг пептидів, опосередковуючи трансфекцію siРНК

Для аналізу потенційних пептидів СРР на здатність здійснювати трансфекцію siРНК у клітини ссавців застосовували зростаючі концентрації пептидів (від 1 мкМ до 20 мкМ) при постійній концентрації siРНК (100 нМ). Цей діапазон концентрацій пептидів застосовували бо було показано, що позитивно заряджені пептиди, такі як ТАТ, интернализируются всередину клітин у діапазоні концентрацій від 10 мкМ і зберігаються у внутрішньоклітинних обмежених мембраною компартментах без істотного виходу в цитозрль (Duchardt, F. et al. (2007) Traffic 8, 848-866). Показано, що ці пептиди виходять в цитозрль тільки при концентрації вище порогового значення, рівного приблизно 5-10 мкМ. Концес застосуванням реактиву для трансфекції DharmaFECT (Dharmacon, Inc., Лафейетт, Колорадо, США; дані не показані).

Застосовуються олигонуклеотиди siРНК були розроблені проти Aha1 мРНК людини (Panaretou, В. et al. (2002) Mol. Cell 10, 1307-1318) або проти мРНК люциферази, яка виступає в якості контролю.

Комплекси siPHK і відповідних пептидів утворювалися в середовищі OptiMEM при інкубації протягом 15 хв. при кімнатній температурі. Клітини інкубували у присутності комплексів протягом трьох годин у середовищі OptiMEM. Після промивання клітини інкубували додатково протягом 21 год або 45 год в нормальній живильному середовищі. Після цього за допомогою методу розгалуженої ДНК визначали рівні Aha1 мРНК і контрольної мРНК (т. е. GAPDH мРНК). Цей аналіз проводили для клітин, які були трансфецировани siAHA1 або контрольної siРНК (siGL3, проти люциферази), відповідно.

Для кількісної оцінки специфічної РНКі зниження рівнів Aha1 мРНК щодо рівнів GAPDH мРНК порівнювали в клітинах, трансфекованих siAHA1, і в клітинах, трансфекованих siGL3. Трансфекція, опосередкована специфічної siPHK, викликає зниження значень співвідношення рівнів Aha1/GAPDH мРНК у клітинах, трансфекованих siAhA1, порівняно з клітинами, трансфецированними siGL3. На фіг.3 наведені дані скринінгу, отримані в результ�для кожного експерименту) і значення Aha1/GAPDH мРНК для трансфекованих siAha1 або siGL3 клітин висловлювали щодо цих значень. Для такого нормованого набору даних визначали різниці між відносними рівнями Aha1/GAPDH мРНК у клітинах, трансфекованих siAha1 і siGL3. Специфічні пептиди викликали суттєве зниження при трансфекції siAha1, при цьому зниження не спостерігалося при трансфекції siGL3, що призводить до позитивним значенням різниці. Чим більш явно виражені ці значення, тим більш специфічним є спостережуваний процес РНКі (див. фіг.3).

У вибраних пробах зниження рівнів Aha1 мРНК та/або GAPDH мРНК спостерігалося при всіх способах трансфекції. Це вказує на схильність до інгібування росту і надання токсичного впливу застосовуваних у пептидів, незалежно від специфічності siРНК. Пептиди, які порушують цілісність мембран (тобто, пептиди CPP), часто мають початково притаманною їм здатністю пошкоджувати клітини, і це підтверджується тим фактом, що деякі з цих пептидів також діють як бактерицидні агентів (Arrighi, R. B. et al. (2008), див. вище). Тому цитотоксичну активність передбачуваних пептидів CPP людини проаналізували із застосуванням аналітичних наборів CytoTox-Glo і CellTiter-Glo (Promega Corporation, Мадисон, Вісконсін, США). Опосередковані пептидами інгібування росту або цитотоксичність, �ижением рівнів GAPDH мРНК. Виходячи з цього спостереження, рівні GAPDH мРНК застосовували в якості загального показника токсичності: середнє значення показника, що дорівнює 100% GAPDH мРНК щодо контролю з живильним середовищем, вважали свідченням відсутності токсичності, значення від 99% до 70% - свідченням помірної токсичності і значення менше 70% - свідченням наявності токсичності (див. фіг.3).

На підставі ефективності пептидів в опосередкуванні трансфекції та/або інгібування росту/цитотоксичності були виділені різні фенотипові категорії: пептиди, які демонстрували більш низьку Aha1-специфічну трансфекцію siРНК, ніж пептид TAT, були віднесені до категорії «нетрансфецирующие» пептиди; пептиди, які демонстрували рівну або вищу ефективність трансфекції щодо пептиду TAT, були названі «трансфецирующими» пептидами. Схожим чином, пептиди, що призводять до значень GAPDH мРНК>70% класифікували як «нетоксические», тоді як пептиди, які викликали слабке зниження рівнів GAPDH мРНК, були названі «токсичними».

На підставі цих категорій все пептиди були віднесені до одного з чотирьох класів:

(a) нефункціональні пептиди (нетрансфецирующие і нетоксиче�фецирующие нетоксические пептиди.

3.1 Нефункціональні пептиди

У цю категорію потрапив 41 з 61 минулого скринінг пептиду, що відбувається від білків людини (таблиця 1 і фіг.3). Ці пептиди не демонструють істотною токсичність відносно клітин, а також не здатні опосередкувати трансфекцію siРНК при концентраціях, які були застосовані. Таким чином, 67% пептидів, які були відібрані в якості передбачуваних пептидів CPP в ході способу in silico, не продемонстрували будь-яких фенотипового прояву в експериментах по дослідженню трансфекції і життєздатності. У групі, що складається з 8 контрольних пептидів, для яких раніше повідомлялося про наявність у них активності CPP, три пептиду (кротамин, MTS і перфорин) потрапили в цю категорію.

В якості прикладу, на фіг.4 зображено фенотипическое прояв дії пептиду, що відбувається від білка WNT16, який бере участь у сигнальному шляху WNT (Mazieres, J. et al. (2005) Oncogene 24, 5396-5400). Послідовність пептиду WNT16 була включена в якості кандидатного пептиду для експериментальної оцінки, тому що вона відповідає параметрам пошуку «KHR10 + позаклітинна локалізація».

3.2 Нетрансфецирующие токсичні пептиди

У цю категорію потрапили 11 з 61 минулого скринінг пептиду, проеспособности та/або >70% зниження рівня GAPDH мРНК), але не були здатні опосередкувати трансфекцію siРНК застосованих концентраціях (див. таблицю 1 і фіг.3). Таким чином, їх здатність здійснювати трансфекцію була нижче, ніж у пептиду TAT. Жоден з проаналізованих пептидів, що є (позитивними) контролями, не потрапив у цю категорію, що свідчить про те, що контроль дійсно мають здатність до трансфекції. На фіг.5 представлено фенотипическое прояв для двох прикладів пептидів, що належать до даного класу.

Один пептид походить від білка людини BPLI3 (фіг.5A; Bingle, C. D. and Craven, C. J. (2004) Trends Immunol. 25, 53-55). При аналізі CellTiter-Glo у клітин, підданих дії цим пептидом, спостерігали дозозалежне зниження життєздатності. Паралельно з цим спостерігалося дозозалежне зниження рівнів GAPDH мРНК, що свідчить на користь застосування середніх значень рівнів GAPDH мРНК в якості показника пригнічення росту і/або токсичності. Цікаво відзначити, що аналіз CytoTox-Glo не показав істотного рівня апоптозу у клітинах, підданих дії пептиду BPIL3 (дані не наведені). Таким чином, цей пептид викликає інгібування росту і/або загибель клітин за механізмом, відмінним від апоптозу. Трансфекционная активність е один пептид з цитотоксичними властивостями (фіг.5B) походить від білка людини кателицидина (Nijink, A. and Hancock, R. E. (2009), с/в. вище). Також повідомлялося, що пептид, званий FALL, має протимікробну функціональною активністю. Пептид FALL продемонстрував істотний рівень токсичності при дії на клітини, що виражалося у втраті клітинами життєздатності і зниженні рівнів GAPDH мРНК. Аналіз потенційної трансфекционной активності дозволив виявити лише не дозволяють зробити остаточний висновок свідоцтва специфічного зниження рівнів Aha1 мРНК (в порівнянні з GAPDH мРНК) при концентраціях 10 мкМ або вище, при яких явно виражені токсичні властивості. У цих (токсичних) умовах спостерігалося лише деяке незначне зниження рівнів мРНК. Однак при більш низьких концентраціях (5 мкМ) можна спостерігати явно виражене і специфічне зниження рівнів Aha1 мРНК. Це свідчить про те, що пептид FALL, можливо, здатний здійснювати трансфекцію siРНК, хоча і з меншою ефективністю трансфекції, ніж пептид ТАТ, тобто, з ефективністю, що знаходиться нижче порогового значення, встановленого для цього класу трансфецирующих пептидів.

3.3 Трансфицирующие токсичні пептиди

Цей клас пептидів не включає жодного з контрольних пептидів, але містить 5 кандидатниун Aha1), а також викликали інгібування росту клітин і/або токсичність.

В якості прикладу на фіг.6 показаний фенотип клітин, підданих дії пептиду, що відбувається від білка CU025. CU025 - це білок, що містить кальцій-зв'язуючий домен, функціональна активність якого не відома (SwissProt, номер доступу: Q9Y426). Експерименти по трансфекції siРНК продемонстрували істотне і специфічне зниження рівнів Aha1 мРНК порівняно з рівнями GAPDH мРНК. Однак цей пептид також викликав інгібування росту і/або токсичність, як показав аналіз життєздатності та істотне зниження рівнів GAPDH мРНК. Ця знижена життєздатність ставала очевидною вже при концентраціях пептиду, які необхідні для досягнення трансфекції і РНКі. Таким чином, застосовність цього пептиду та інших членів даного класу пептидів для трансфекції siРНК істотно обмежена їх токсичними фенотипическими проявами.

3.4 Трансфицирующие нетоксические пептиди

Цей клас пептидів представляє найбільший інтерес з точки зору застосувань, що включають трансфекцію siРНК, так як ці пептиди володіють трансфекционной функціональною активністю в концентраціях, які не надають негативндатного пептиду людини, відібраного для експериментальної оцінки, три пептиду продемонстрували явні свідчення трансфекционной активності у концентраціях, які не опосередковують негативного впливу на життєздатність клітин, або викликають лише мінімальне такий вплив. Ці пептиди походили від CPXM2, раніше не охарактеризованной карбоксипептидази (номер доступу в SwissProt: Q8N436), від ASM3B (номер доступу в SwissProt: Q92485), кислої сфингомиелиназо-подібної фосфодіестерази і від GDNF-подібного нейротрофічних фактора людини неуртурина (NRTN; Kotzbauer, P. T. et at. (1996) Nature 384, 467-470).

На фіг.7 наведено порівняння опосередкованого трансфекцией специфічного нокдауну Aha1 і впливів на життєздатність клітин пептидів CPXM2 (фіг.7B), ASM3B (фіг.7C) і NRTN (фіг.7D) з цими ж показниками пептидів TAT і полі-Arg (фіг.7A). Як CPXM2, так і ASM3B викликали суттєве зниження рівнів ендогенної Aha1 мРНК при їх сумісному застосуванні з siРНК, специфічної щодо Aha1, при цьому не викликаючи істотною токсичності. Це фенотипическое прояв було схожим з таким, які спостерігаються у разі контрольних пептидів TAT і полі-Arg (дані не показані).

Пептид NRTN опосредовал навіть більш істотне зниження рівнів Aha1 мРНК щодо рівнів GAPDH мзнеспособность спостерігалося лише при високих концентраціях (більше 10 мкМ). Цікаво відзначити, що пептид NRTN демонстрував значну трансфекционную активність навіть при більш низьких, нетоксичних, концентраціях. При цих концентраціях ефективність трансфекції пептидів, що походять від NRTN, була вище, ніж у всіх проаналізованих пептидів, службовців (позитивними) контролями. Беручи до уваги це фенотипическое прояв, для пептиду NRTN провели більш детальне визначення параметрів.

Приклад 4: Освіта комплексів пептид/siРНК є необхідним, але не достатнім фактором для опосередкування трансфекції

Механізми, які можуть пояснити трансфекционную функціональну активність заряджених пептидів, таких як TAT або протамин, включають утворення комплексів між позитивно зарядженими пептидами і негативно зарядженими нуклеїновими кислотами. Такі комплекси роблять можливими функціональні активності пептид-опосередкованому взаємодії з мембранами та/або виходу з эндосом, необхідні для перенесення знаходяться в комплексі нуклеїнових кислот у цитозрль клітин (Law, М. et al. (2008) Biotechnol. Prog. 24, 957-963). Для з'ясування того, чи є описаний вище механізм застосовним також і для випадку пептиду, що відбувається від NTRN, пров�зі зростаючими концентраціями пептиду, після чого проводили аналіз їх міграції при поділі гель-електрофорезом. Пептид TAT продемонстрував очікуване (від позитивного контролю) залежне від концентрації уповільнення міграції siРНК (фіг.8A). Таким чином, пептид TAT утворює комплекси з молекулами siРНК. У разі пептиду TAT зрушення електрофоретичної рухливості в гелі спостерігався починаючи з співвідношення пептид: siРНК, рівного 10:1, при цьому найбільш виражений ефект спостерігався при співвідношенні 25:1 або вище.

Паралельно проведений аналіз з участю siРНК, підданої впливу пептиду, що відбувається від NTRN, показано на фіг.8B. Уповільнення міграції siРНК спостерігалося вже при співвідношенні пептид : siРНК. рівному 1:1 або вище. Крім того, на відміну від пептиду ТАТ (який завжди входив в гель), при співвідношенні пептид NTRN : siРНК, рівному 25:1, спостерігалося утримування утворених комплексів в кишені гелю. При більш високих співвідношеннях було неможливо проводити детекцію із застосуванням броміду этидия. Ці результати відповідають спостереження, що свідчить про те, що комплекси нуклеїнових кислот з поликатионними пептидами мають меншу доступність для интеркалирующих агентів (Wolfert, M. A. and Seymour, L. W. (1996) Gene Ther. 3, 269-273). Однак після обробки п�й від NRTN, здатний утворювати стабільні комплекси з siРНК, які, мабуть, мають високий ступінь компактизації.

Ці результати показали, що утворення комплексів пептид/siРНК пов'язано з трансфекционной функціональною активністю як пептиду, що відбувається від TAT, так і пептиду, що відбувається від NTRN. Отже, можна припустити, що зазначене комплексоутворення (тобто утворення комплексів) необхідно для того, щоб застосовувати функціональні активності пептидів по взаємодії з мембранами та/або «виходу з эндосом» для трансфекції siРНК. Однак, необхідно з'ясувати, чи є виявлене комплексоутворення також і достатнім для прояву трансфекционной функціональної активності? Відповідно, здатність до комплексоутворення з siРНК також проаналізували для пептиду, що відбувається від WNT16, який не демонструє ні цитотоксичності, ні трансфекционной функціональної активності (див. вище). Аналіз зсуву електрофоретичної рухливості в гелі для siРНК, підданої впливу пептиду, що відбувається від WNT16, показав явне дозозалежне уповільнення електрофоретичної рухливості siРНК, навіть більш сильне, ніж спостерігалося у разі пептиду TAT (див. фіг.8D� 1:1 або вище. Спостереження ефективного утворення комплексів нетрансфецирующим пептидом вказує на те, що комплексоутворення між пептидом і siРНК саме по собі не є достатнім для забезпечення трансфекционной функціональної активності. Таким чином, комплексоутворення з siРНК, мабуть, є необхідною передумовою для прояву функціональної активності, але додаткові особливості послідовності та/або структури пептидів також можуть відігравати важливу роль в опосередкуванні трансфекції.

Наведені вище дані показали, що пептид, що походить від NTRN, ефективно утворює комплекси з молекулами siРНК і опосередковує їх трансфекцію. Застосованої siРНК була siAha1, яка націлена на мРНК клітинного продукту гена «домашнього господарства», активатора гомолога 1 Атфази білка теплового шоку 90 (Panaretou, В. et al. (2002), див. вище). В якості контролю використовували siРНК, спрямовану проти мРНК люциферази.

Для підтвердження того, що пептид NTRN в загальному випадку застосуємо для трансфекції siРНК (і його функціональність не обмежена послідовністю конкретної siРНК), досліджували його здатність трансфецировать siРНК, відмінну від siAha1. На фіг.9 показані результати опосередкованої пептидом NTRN�нижение рівнів клітинної Eg5 мРНК було виявлено при концентраціях <10 мкМ. При таких дозах пептид NTRN не чинить негативного впливу на життєздатність клітин. Відомо, що ефективне зниження рівнів Eg5 мРНК викликає зупинку мітозу, що в результаті призводить до початку апоптозу (Blangy, A. et al. (1995), див. вище). У відповідності з цим при опосередкованої пептидом NTRN трансфекції siEg5 спостерігали апоптотический фенотип (фіг.9). Трансфекція контрольної siРНК в таких же умовах не давала цитотоксичного ефекту, підтверджуючи тим самим, що апоптотический фенотип був викликаний зниженням рівня Eg5 мРНК.

Наведені вище дані демонструють не тільки те, що пептид, що походить від NRTN людини, в загальному випадку застосуємо для опосередкування трансфекції siРНК, але також те, що його ефективність трансфекції є достатньою для прояви клітинних фенотипів, обумовлених siРНК.

Приклад 5: Здатні до трансфекції пептиди интернализируются всередину клітин

Для визначення здатності до інтерналізації у пептидів CPP, виявлених в ході процедури скринінгу провели аналіз FITC-мічених похідних зазначених пептидів (при концентраціях 1 мкМ, 5 мкМ і 10 мкМ, відповідно) із застосуванням FACS. Застосовували наступні пептиди: NRTN як трансфецирующего пептиду, WNT16 як нетого контролю) (див. фіг.12). Клітини MCF7 інкубували в присутності флуоресцентно мічених похідних пептидів протягом 3 годин при 37°C в середовищі OptiMEM. Після цього клітини обробляли протеіназою До протягом 30 хв. при 37°C з метою видалення пов'язаних з поверхнею пептидів для того, щоб гарантувати дослідження тільки интернализированних пептидів. Потім клітини промили в PBS і проаналізували із застосуванням FACS.

Результати показують, що контрольний пептид TAT интернализируется всередину клітин MCF (див. фіг.12A). Поглинання пептиду TAT всередину клітин демонструє лінійну залежність від концентрації пептиду, що також узгоджується з наглядом, свідчить про те, що пептид TAT функціонує в якості реактиву для трансфекції siРНК (див. вище). Нетрансфецирующий нетоксический пептид WNT16 не демонстрував суттєвого рівня поглинання всередину клітин MCF7 (фіг.12B), що узгоджується з спостережуваної нездатністю цього пептиду здійснювати трансфекцію siРНК. Це також демонструє відсутність простої кореляції між поглинанням пептиду і наявністю позитивно заряджених амінокислот. Токсичний пептид FALL интернализировался всередину клітин MCF, і процес демонстрував лінійну залежність від концентрації (фчие від інших пептидів, NRTN не демонстрував лінійної залежності поглинання від концентрації. Фактично при підвищенні концентрації 5 мкМ до 10 мкМ спостерігалося сильне підвищення інтерналізації. Ці дані припускають, що є порогове значення, нижче якого поглинання є значимим, але слабким. Вище цього порогу спостерігається значне підвищення рівня поглинання клітинами.

В цілому, ці результати демонструють здатність володіють трансфекционной активністю пептидів взаємодіяти з клітинами і бути интернализированними в клітини. Крім того, ці дані показують, що проаналізовані пептиди не тільки функціонують в якості реактивів для трансфекції, але також діють як пептиди, що проникають в клітини.

Приклад 6: Сортинг, фільтрування та класифікація кандидатних пептидів

З допомогою об'єднання способів in silico і експериментального скринінгу в протеоме людини були виявлені пептидні послідовності, потенційно мають функціональні активності CPP або трансфекционних агентів. Виявлено, що серед цих кандидатних молекул три пептиду були здатні здійснювати трансфекцію і не були токсичними, тобто, вони володіли трансфекционной функ�тиди можуть, серед іншого, служити в якості модулів для розробки агента для доставки siРНК, що є частиною ліків на основі siРНК, які будуть розроблятися в майбутньому.

6.1 Биоинформационний спосіб

Застосовані способи in silico були засновані на бібліотеці 30-мірних пептидів, яка містила всі накладання пептиди, присутні в білках людини. Серед цих більш ніж 10×106пептидів були виявлені 8630 пептидів, що походять від 583 позаклітинних білків людини, які відповідали початковим умовам пошуку (>30% позитивно заряджених амінокислотних залишків (тобто, H+K+R) у складі 30-мірного пептиду).

З метою отримання остаточного списку пептидів, які піддавали експериментальним лабораторним дослідженням, кількість кандидатних молекул додатково обмежили із застосуванням етапів негативного і позитивного відбору: у випадках, коли із-за наявності довгих основних ділянок спостерігалося безліч пептидів, розташованих в одному і тому ж білку, такої множинності уникали. У більшості таких випадків вибирали один представницький пептид, що походить від даного білка. Пептиди, які, мабуть, важко синтезувати або з якими важко р�, �сключали з подальшого розгляду. З метою вибору (з решти списку) кандидатних молекул для експериментальної оцінки застосували кілька параметрів позитивного відбору, включаючи: (i) високе значення ИЭТ і високий ступінь гідрофобності; (ii) схожість послідовності з пептидом TAT; і (iii) передбачувану функціональну активність щодо взаємодії з мембранами, притаманну білків, від яких відбуваються пептиди, таких як білки системи комплементу, бактерицидні фактори і ліпази.

6.2 Спосіб експериментальної оцінки

При експериментальній оцінці кандидатние пептиди (вибрані в результаті способу скринінгу in-silico) були розділені на чотири класи: (a) нефункціональні пептиди (тобто, нетрансфецирующие і нетоксические), (b) нетрансфецирующие токсичні пептиди, (c) трансфецирующие токсичні пептиди і (d) трансфецирующие нетоксические пептиди.

Перший спосіб полягав у тому, що кандидатние пептиди були відібрані на підставі їх перебування на верхніх позиціях у списку, ранжируваному за ознакою значень ИЭТ і профілів гідрофобності, наприклад, здатні до трансфекції токсичні пептиди CU025 і CPXM, не здатні до трансфекції токсичні пептиди CD026 і MMP25. Слідчий збагачених позитивно зарядженими амінокислотами.

Інший застосований фільтр був заснований на схожості послідовностей кандидатних пептидів з пептидом порівняння - TAT. Експериментальної оцінки були піддані п'ять пептидів, що володіють найбільш вираженим схожістю з пептидом TAT. Однак чотири з цих пептидів (включаючи пептид PROK2, демонструє найвищу ступінь схожості з TAT) не показали детектируемой трансфекционной активності в дозах, що не чинять негативного впливу на життєздатність клітин. Пептид, що походить від NRTN, був єдиним функціонально активним членом групи (тобто, був здатний здійснювати трансфекцію). Цей пептид показав найвищу трансфекционную функціональну активність в ході проведених досліджень, при цьому його ефективність була вищою, ніж навіть у пептиду TAT. Це свідчить про те, що трансфекционная активність даних пептидів визначається не тільки первинної амінокислотною послідовністю, але також певними мотивами послідовності і, зокрема, вторинними структурами.

При третьому способі для обмеження списку кандидатних пептидів застосовували дані літературних джерел та результати аналізу BLAST. Вибрані для експериментальної оцінки пептидие з мембранами. Більшість відібраних пептидів не продемонстрували будь-якого функціонального фенотипового прояву (тобто, здатності здійснювати трансфекцію). Навіть пептиди, що походять від білків, про які добре відомо, що вони порушують цілісність мембран (таких як чинники системи комплементу або перфорин), не показали трансфекционной функціональної активності. Ці результати припускають, що для додання цим пептидів активності за порушення цілісності мембран можуть бути необхідні належним чином структуровані домени (наприклад, домен MACPF (Rosado, C. J. et al. (2008) Cell. Microbiol. 10, 1765-1774)). Очевидно, що ця функціональна активність не може відтворюватися пептидами, навіть якщо вони відповідають застосованої стратегії пошуку.

З іншого боку, у цю третю групу включені трансфецирующие нетоксические пептиди, що походять від CPXM2 і ASM3B, відповідно, і токсичні пептиди, що походять від BPIL3 і FALL39. Цікаво відзначити, що деякі з пептидів, класифікованих як токсичні, походили від бактерицидних пептидів. Такі пептиди впливають на цілісність мембран патогенів. У високих концентраціях ці пептиди токсичні для ракових клітин людини. За краsiРНК. Одним з пояснень цього результату може бути утворення перфорацій плазматичної мембрани, через які може відбуватися неспецифічне поглинання siРНК. Іншим поясненням може бути опосередковане пептидом поглинання siРНК, яке маскується токсичністю пептиду. Крім того, нещодавно запропонований механізм репарації мембран, залучений до поглинання пептидів CPP (Palm-Apergi, C. et al. (2009) FASEB J. 23, 214-223), також може бути притягнутий у якості пояснення часткового прояву функціональної активності цими пептидами.

Однак той факт, що ці пептиди знижують життєздатність клітин вже в концентраціях, які необхідні для трансфекції, перешкоджає застосуванню цього класу пептидів для доставки siРНК.

Приклад 7: Визначення параметрів пептиду, що відбувається від NRTN

7.1 Структурні особливості пептиду, що відбувається від NRTN

Пептид, що походить від неуртурина (NRTN) був кандидатной молекулою, виявленої в ході цього скринінгу, яка демонструвала стабільно найвищий рівень здатності здійснювати трансфекцію siРНК в концентраціях, які не чинили негативного впливу на життєздатність клітин. Цей пептид здатний утворювати нековалентние ком�ом, показав, що siРНК, що знаходиться в комплексі з NRTN, недоступна для інтеркаляції броміду этидия. Як визначено із застосуванням аналізу зсуву електрофоретичної рухливості в гелі, утворення комплексів між NRTN і siРНК було максимальним при співвідношенні 1:50. Це відповідає співвідношенню 100 нМ siРНК до 5 мкМ пептиду в застосовуваної тут системі випробування функціональної активності in vitro (тобто, здатності здійснювати трансфекцію). Однак, якщо концентрація NRTN в системі in vitro підвищується до співвідношень, що перевищують співвідношення, при якому спостерігається насичення комплексів, спостерігається додаткове збільшення трансфекционной активності. Цей результат може бути пояснено здатністю вільного позитивно зарядженого пептиду NRTN захищати комплекси siРНК-NRTN від руйнування аніонними протеогликанів на поверхні клітин.

Що може служити механізмом, з допомогою якого пептид NRTN опосередковує трансфекцію siРНК? Освіта комплексів з нуклеїновими кислотами, безсумнівно, є одним з вимог до функціональної активності пептиду, так як всі здатні здійснювати трансфекцію пептиди демонструють таку особливість. Однак комплексоутворення саме по собі не є дос siРНК так само добре або навіть краще, чим пептид TAT, але не мають трансфекционной функціональною активністю. Крім того, малоймовірно, що композиція первинної послідовності, тобто, кількість присутніх заряджених та/або гідрофобних залишків, є єдиним чинником, опосередковуючою функціональну активність. Виявилося, що багато пептиди, що володіють схожістю послідовності з пептидом TAT (включаючи пептиди з дуже високим ступенем подібності послідовностей), є нефункциональними.

Одне з можливих пояснень наявності трансфекционной функціональної активності у пептиду, що відбувається від NRTN, можна виявити в його вторинній структурі. Вибір для проведення скринінгу 30-мірного пептиду (на противагу більшості інших способів, в яких застосовують більш короткі пептиди (Futaki, S. et al. (2001), див. вище; Crombez, L. et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35, 44-46; Jafari, M and Chen, P. (2009) Curr. Top. Med. Chem. 9, 1088-1097)) має перевагу, що полягає в тому, що ці пептиди з більш високою ймовірністю згортаються у вторинну структуру і підтримують її. NRTN є членом сімейства білків фактора росту TGF і володіє схожістю з GDNF і артемином, відповідні структури яких вже були визначені (Eigenbrot, С. and Gerber, N. (1997) Nat. Struct, Товарbiol. 4, 43�а і порівняння передбачуваних вторинних структур дозволяє побачити, що володіє трансфекционной активністю відрізок пептиду NRTN може утворювати вторинну структуру (див. фіг.10). Послідовність, що відповідає функціонально активного пептиду NRTN, частково розташована на доступній поверхні білка і містить позитивно заряджений альфа-спіральний відрізок амінокислот. Виявлення альфа-спіральних структур у складі NRTN повністю узгоджується з існуючою гіпотезою про те, що альфа-спіральні структури є корисними з точки зору проникнення в мембрани (Deshayes, S. et al. (2004), див. вище). Спостереження, яке показало, що проаналізований пептид, що походить від NRTN, включає повну альфа-спіральну структуру, а також навколишні області, свідчить на користь придатності цього способу скринінгу більш довгих пептидів. Залишається неясним, є наявність альфа-спіральної структури самої по собі (яка займає 12 амінокислот у складі 30-мірного пептиду) достатньою умовою для опосередкування ефективної трансфекції. Однак здається ймовірним, що принаймні деякі з додаткових залишків також необхідні для прояву функціональної активності пептиду.

З метою отримання експериментального підтвердження для цих �ой структури з застосуванням спектроскопії кругового дихроїзма в УФ-області спектра (УФ-КД) (див. огляд публікації: Whitmore, L. and Wallace, B. A. (2008) Biopolymers 89, 392-400). Дана методика дозволяє здійснювати ідентифікацію елементів послідовності, сгортаючихся у вторинну структуру, на підставі їх певного УФ-спектру в порівнянні з неструктурованими відрізками, що мають форму статистичного клубка. Цей аналіз проводили із застосуванням спектрополяриметра Jasco J 715 (Jasco, Inc., Істон, штат Меріленд, США) в діапазоні від 195 нм до 260 нм з кроком 0,1 нм і шириною смуги пропускання 1 нм. Кювету приладу мала довжину 0,1 див. Пептиди застосовували в концентрації 0,1 мг/мл (див. фіг.11).

Пептид FALL, для якого раніше було показано, що він згортається в альфа-спіральну структуру, застосовували в якості позитивного контролю (Agerberth, В. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 195-199). У водному розчині пептид FALL брав конформацію статистичного клубка. В присутності 10% трифторэтанола (TFE) в якості сорастворителя на спектрі спостерігалися характерні западини при 208 нм і 222 нм, відповідно, які ставали ще більш вираженими при підвищенні концентрації TFE (тобто, 25% TFE і 50% TFE; див. фіг.11A). Відомо, що TFE стабілізує та індукує утворення вторинних структур в пептидах і білках (Buck, М. (1998) Q. Rev. Blophys. 31, 297-355).

При аналізі пепт�., спектр із западинами при 208 нм і 222 нм, відповідно. Отже, пептид NRTN насправді містить альфа-спіральну область, яка була передбачена на підставі даних по гомології послідовностей (див. фіг.11B).

На противагу цьому, спектр, отриманий для пептиду ТАТ, не демонстрував ознак того, що цей пептид згортається у вторинну структуру. Навіть у присутності 50% TFE цей пептид брав конформацію статистичного клубка (див. фіг.11C).

Крім того, вивчення здатності до інтерналізації із застосуванням аналізу FACS продемонструвало, що пептид NRTN функціонує не тільки в якості реактиву для трансфекції, наприклад, у відношенні молекул siРНК, але також як пептиду, що проникає в клітки, навіть у відсутність молекул нуклеїнової кислоти. Ці результати свідчать, що пептид NRTN також може представляти собою придатний носій для кон'югованих навантаження, такий як інші пептиди або білки. Примітно, що інтерналізація пептиду NRTN, мабуть, не володіє лінійною залежністю від застосовуваної концентрації. Швидше за все, мабуть, існує специфічне граничне значення, при перевищенні якого відбувається поглинання клітинами. Такий ф�-Arg (Duchardt, F. et al. (2007), див. вище).

Більше того, аналіз FACS виявив сильно виражене накопичення пептиду FALL у клітинах. Цей результат узгоджується з спостереженням того факту, що FALL діє в якості цитотоксичної пептиду. Для прояви токсичності необхідно пряме фізичне взаємодія пептиду з цільовою кліткою. Однак, на відміну від пептиду NRTN, процес інтерналізації FALL характеризується лінійною залежністю від його концентрації. Отже, для токсичних властивостей пептиду FALL не існує порогового значення, що узгоджується з отриманими даними щодо життєздатності клітин, що демонструють наявність залежності цитотоксичності від концентрації.

З іншого боку, нетрансфецирующий пептид WNT16 не демонстрував істотною мірою інтерналізації всередину клітин. Таким чином, єдиний факт наявності позитивно заряджених амінокислот в первинній послідовності пептидів не є ознакою застосовності пептиду в якості пептиду СРР. Справжні результати служать додатковими свідченнями на користь того, що мотиви послідовності, згортатися у вторинну структуру (як в пептиді NRTN) можуть бути основними детермінантами для поглинання клітинами �p>

Терапевтична доставка siРНК являє собою одне з перспективних застосувань виявлених CPP-подібних пептидів людини. Заміна не належать людині, що походять від патогенів, молекул на належні людині послідовності, що демонструють схожу або навіть більш високу функціональну активність, є перевагою для терапевтичних засобів, так як це дозволяє знизити ризик того, що застосовувані для трансфекції модулі можуть бути імуногенними. Терапевтичне застосування даного пептиду також вимагає, щоб цей пептид мав суттєвої (трансфекционной) активністю. Додатково, спостережувані in vitro активності пептиду також повинні виявлятися в умовах in vivo.

Більшість способів аналізу, описаних у цьому документі, здійснювали в «стандартних умовах in vitro для виявлення опосередкованої пептидами трансфекції, які добре відомі фахівцям в даній області (див., наприклад, Simeoni, F. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 2717-2724; Richard, J. P. et al. (2005) J. Товарbiol. Chem. 280, 15300-15306; Abes, R. et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35, 775-779; Kumar, P. et al. (2007) Nature 448, 39-43; Mueller, J. et al. (2008) Bioconjug. Chem. 19, 2363-2374; Sugita, Т. et al. (2008) Br. J. Pharmacol. 153, 1143-1152). Відповідно, інкубацію в якості початкового «етапу трансфекції» преті пептидів CPP здійснювати трансфекцію (див. фіг.13; див. також публікацію: Ignatovich, I. A. et al. (2003), див. вище). Однак можливість терапевтичного застосування (CPP-подібних) пептидів, очевидно, вимагає вступу в контакт з сироваткою. Примітно, що в присутності середовища (хоч і з зниженою концентрацією сироватки) пептид NRTN зберігає здатність опосередкувати трансфекцію (див. фіг.13).

7.3 Пептид, що походить від NRTN, зв'язується з епітеліальними клітинами та интернализируется всередину цих клітин в модельній культурі клітин гематоенцефалічного бар'єру

Раніше повідомлялося, що пептиди, які проникають у клітини, не тільки можна застосовувати в якості носіїв при трансфекції з метою доставки в клітку siРНК, але вони також, мабуть, володіють функціональною активністю у проникненні крізь такі бар'єри, як гематоенцефалічний бар'єр, наприклад, для опосередкування процесу РНКі в головному мозку (Mathupala, S. P. (2009) Expert Opin. Ther. Pat. 19, 137-140). Можна припустити, що пептид NRTN також може бути функціонально активний в цьому відношенні, так як NRTN є нейротрофическим фактором, вироблюваним клітинами глії (Sariola, H. and Saarma, M. (2003) J. Cell Sci. 116, 3855-3862), який потенційно володіє високою здатністю доступу в центральну нервову систему.

Для оценкинцефалический бар'єр, клітини hCMEC/D3 або первинну культуру ендотеліальних клітин головного мозку людини піддавали дії пептиду, що відбувається від NRTN, в моделі гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) (Weksler, В. о. et al. (2005) FASEB J. 19, 1872-1874; Poller, В. et al. (2008) J. Neurochem. 107. 1358-1363). Результати цього аналізу (див. фіг.14) виявили, що пептид, що походить від NRTN, накопичується (ті., интернализируется) в цих експериментальних умовах у эндосомальних структурах. В ендотеліальних клітинах ГЕБ перенесення через шар клітин гідрофільних молекул ефективно запобігає їх щільними контактами, і эндосоми є основними компонентами трансцитозольних механізмів, які дозволяють здійснювати контрольований перенесення макромолекул через гематоенцефалічний бар'єр. Таким чином, пептид, що походить від NRTN, розташовується в компартменте, який відіграє важливу роль у функціонуванні ГЕБ (тобто, в опосередкуванні і контроль транспорту через ГЕБ).

Можливе додаткове розширення області терапевтичного застосування пептидів CPP може бути пов'язано з їх поєднанням з нацеливающими молекулами, такими як антитіла і фрагменти антитіл.

Приклад 8: Застосування пептиду, що відбувається від NRTN, для внутрішньоклітинної доставки про-апоптотиѾ ці пептиди функціонують не тільки в якості реактивів для трансфекції, наприклад, у відношенні молекул siРНК, але також як «класичних» пептидів, що проникають у клітини. Ці результати свідчать, що пептид NRTN також може представляти собою придатний носій для кон'югованих навантаження, такий як інші пептиди або білки.

З метою визначення, чи здатна послідовність, що походить від NRTN, опосередкувати поглинання клітинами пептидів, справили кон'югацію різних біологічно активних пептидів з NRTN. Для застосованих в якості партнерів для кон'югації пептидів була показана здатність взаємодіяти з цитоплазматичними цільовими білками, які беруть участь в опосередкуванні апоптозу. Іншими словами, при експресії або активної доставки в цитоплазму ракових клітин ці пептиди викликають апоптоз (тобто, вони є «про-апоптотическими»). Однак ці про-апоптотические пептиди не можуть проникати через біологічні мембрани самі по собі. Тільки їх кон'югація або з'єднання з відомими пептидами CPP, такими як пептид TAT, пенетратин і полі-Arg, дозволяє домогтися поглинання клітинами і, таким чином, викликати апоптоз.

Для оцінки функціональної активності відносно проникнення в клітини, притаманною послідовності, происходящим77, який взаємодіє з білком BCL2 і перетворює його в про-апоптотическую молекулу; і (ii) пептид, що походить від 4E-BP1, який взаємодіє з фактором трансляції eIF4E, связивающимся зі структурою 5'-кэпа у складі мРНК і, як було з'ясовано, модулює апоптоз в ракових клітинах.

8.1 NRTN-опосередковане поглинання всередину клітин про-апоптотического пептиду, що відбувається від NUR77

Nur77 - це ядерний рецептор-сирота, здатний взаємодіяти з ключовими посередниками, які беруть участь в апоптозі, такими як білки BCLB і BCL2. Взаємодія Nur77 з білком BCL2 викликає конформаційні зміни білка BCL2, які призводять до експонування домену BH3. Це перетворює BCL-2 в білок з про-апоптотической функцією (Lin, В. et al. (2004) Cell 116, 527-540; Luciano, F. et al. (2007) Blood 109, 3849-3855). Такого ж перетворення можна досягти також із застосуванням пептидів, що походять від споріднених білків, таких як Nor1 (Kolluri, S. K. et al. (2008) Cancer Cell 14, 285-298).

Відповідні послідовності, які взаємодіють з BCL2, у складі Nor1 і Nur77 можна вирівняти наступним чином:

Nor1(SEQ ID NO: 70)

Nur77(SEQ ID NO: 71)

Ще більш короткий пептид, здатний взаємодіяти з BCL-2, що складається з 12 C-кінцевих аминокию молекулу, додавання останнього пептиду (тобто, «Nor/Nur»; SEQ ID NO: 72) до раковим клітинам, навіть у високих концентраціях, не є достатнім для індукції апоптозу, так як клітинний цільовий білок розташований у цитоплазмі, але пептид сам по собі не здатний ефективно проникати через клітинну мембрану для досягнення цільової молекули. Коротко, клітини раку молочної залози MCF-7 інкубували в присутності цього пептиду протягом 24 год. Зниження життєздатності клітин або індукції апоптозу не спостерігалося (див. опис аналізу цитотоксичності та життєздатності в прикладі 1). Аналогічно, вплив на ці клітини пептиду CPP NRTN людини також не впливала на життєздатність клітин або не призводило до індукції апоптозу (див. фіг.15).

Для того, щоб проаналізувати, чи має насправді пептид NRTN функціональною активністю CPP, була отримана гібридна послідовність, яка включає відрізок, що складається з пептиду, що відбувається від Nur77, на N-кінці, приєднаний до частини пептиду NRTN, розташована на с-кінці. При визначенні придатного стану для з'єднання було виявлено, що C-кінцева частина пептиду Nur77 була схожа з відрізком послідовності в складі пептиду NRTN, і цю область вибрали в якості точки з'єднаний�-партнерів схематично зображено в нижній частині фіг.15. Химерний пептид зберігає повнорозмірну послідовність відрізка з Nur77 (практично у незмінному вигляді) і укорочений N-кінцевий відрізок пептиду NRTN. Отриманий в результаті пептид володіє такою ж довжиною (30 амінокислот), що й вихідний пептид NRTN.

NurNRTN має наступну аминокислотную послідовність:

(SEQ ID NO: 73).

Для визначення, чи зберігаються у химерного пептиду NurNRTN властивості зв'язування з BCL2, властиві пептиду, що відбувається від Nur77, відповідні пептиди NurNRTN і NRTN приєднали до иодоацетильним кульок (Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, штат Іллінойс, США). Кульки інкубували з рекомбінантним BCL2 (Calbiochem/Merck, Дармштадт, Німеччина) і промивали з PBS і 0,5 М NaCl, 0,025 NaN3, 0,05% Твін-20 для видалення незв'язаного білка. Специфічне зв'язування BCL2 з іммобілізованим химерним пептидом NurNTRN визначали, элюируя зв'язаний білок з кульок із застосуванням буфера для елюції (pH 2,8), переносячи элюированную фракцію на нітроцелюлозну мембрану (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Каліфорнія, США) і визначаючи білок із застосуванням набору для оборотного фарбування білків MemCode Reversible Protein Stain Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, штат Іллінойс, США). Результати цього аналізу показали, що білок BCL2 виявляє�х пептидом NRTN, элюировались дуже невеликі кількості білка BCL2. Отже, химерний пептид NurNRTN зберігає здатність зв'язуватися з BCL2.

Далі була проведена оцінка того, чи здатний химерний пептид NurNRTN проникати через клітинні мембрани і тим самим індукувати про-апоптотическую активність всередині клітин. В якості моделі застосовували клітини раку молочної залози MCF-7. Експериментальний підхід був таким же, як описаний вище (див. приклад 1). При концентраціях пептиду, які не викликали токсичних явищ при тестуванні пептидів Nur77 і NRTN, відповідно, химерний пептид демонстрував виражену токсичну дію, що також виражається в індукції апоптозу (див. фіг.15). Цей ефект був дозозалежним: цитотоксичність зростала при підвищенні концентрації пептиду.

В якості контролю справили приєднання функціонально неактивній мутантної форми пептиду NUR до пептиду NRTN. Цей пептид не чинив негативного впливу на життєздатність клітин. Додатково, приєднання пептиду NUR до функціонально неактивного пептиду WNT16 також не справляло негативного впливу на життєздатність клітин.

Ці результати демонструють, що молекули, отримані в результаті з'єднання последовательнос�ь клітин і проявляти внутрішньоклітинну активність. Інакше кажучи, відповідна NRTN частина химерного пептиду функціонує в якості носія, необхідного для прояву пептидом Nur77 (тобто, навантаженням) про-апоптотичних властивостей всередині клітини. Додатково, ці результати свідчать на користь того, що послідовність, що походить від NRTN, яка несе зміни у своїй аміно-кінцевий області, зберігає функціональну активність пептиду CPP.

8.2 NRTN-опосередковане поглинання всередину клітин про-апоптотического пептиду, що відбувається від 4E-BP1

eIF4E - це фактор трансляції, який пов'язується зі структурою 5'-кэпа у складі мРНК і відіграє важливу роль у забезпеченні життєздатності клітин. Негативний вплив на функціональну активність eIF4E може призвести до апоптозу в ракових клітинах. Білок 4E-BP1 зв'язується і таким чином модулює/перешкоджає функціональної активності фактора eIF4E. У зв'язку з цим підвищення рівнів білка 4E-BP1 призводить до інгібування трансляції і тим самим - до індукції апоптозу у ракових клітинах завдяки здійснюваної ним модуляції функціональної активності фактора eIF4E (Flynn, A. and Proud, C. G. (1996) Cancer Surv. 27, 293-310; Robert, F. and Pelletier, J. (2009) Expert Opin. Ther. Targets 13, 1279-1293).

Про-апоптотическая функціональна активність полнорем. J. 140, 237-246). Цей пептид містить мотив зв'язування з eI4FE (YXRXXLB, де X - будь-яка амінокислота і B - гідрофобний залишок; Moerke, N. J. et al. (2007) Cell 128, 257-267). Додатковий аналіз показав, що три амінокислотних залишку в складі мотиву зв'язування (тобто, Y, R, L) важливі для прояву про-апоптотической функціональної активності (Marcotrigiano, J. et al. (1999) Mol. Cell 3, 707-716). Мутації за цим залишкам (наприклад, заміна на залишки гліцину) призводить до перетворення активних пептидів, що походять від 4EBP1, в неактивні похідні.

Амінокислотні послідовності активних і неактивних пептидів 4EBP1, що застосовуються у цьому винаході, були наступні (для всіх послідовностей див. також фіг.16, верхня частина):

4Е-ВР1(SEQ ID NO: 74)
інтактний intact4E-BP1(SEQ ID NO: 75)

Незважаючи на те, що була доведена здатність 4E-BP1 блокувати eIF4E, просте додавання пептидів, що походять від 4E-BP1, до раковим клітинам, навіть у високих концентраціях, не є достатнім для індукції апоптозу, так як клітинний цільовий білок розп�ижения цільової молекули. Коротко, клітини раку молочної залози MCF-7 інкубували в присутності цього пептиду протягом 24 год. Зниження життєздатності клітин або індукції апоптозу не спостерігалося (див. опис аналізу цитотоксичності та життєздатності в прикладі 1). Аналогічно, вплив на ці клітини пептиду CPP NRTN людини також не впливала на життєздатність клітин або не призводило до індукції апоптозу (див. фіг.16, верхня частина).

Раніше було показано, що приєднання відомих пептидів CPP, таких як пептид TAT, до пептидів, що походить від 4EPB1, призводить до поглинання химерного пептиду клітинами (Ko, S. Y. et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15, 4336-4347). В даному примерен застосовували такі химерні пептиди TAT/eIFE4:

TAT4E-BP1(SEQ ID NO: 76)
TATinact4E-BP1(SEQ ID NO: 77)

Клітини раку молочної залози MCF-7, які інкубували протягом 24 год у присутності цих химерних пептидів TAT/4E-BP1, демонстрували явні ознаки зниження життєздатності клітин і цитотоксичності в результаті індукції апоптозу (див. опис аналізу цитотоксичності та життєздатності в прикладі 1) птотическим дією) послідовністю пептиду 4E-BP1, так як відповідний мутантний варіант був повністю неактивний (див. фіг.16, середня частина).

Для того, щоб проаналізувати, чи має насправді пептид NRTN функціональною активністю CPP, була отримана гібридна послідовність, яка включає частину пептиду NRTN на N-кінці, приєднану до відрізку активного або неактивного пептиду, що відбувається від 4EBP1, розташованому на с-кінці. Амінокислотні послідовності отриманих в результаті двох химерних пептидів схематично зображено в нижній частині фіг.16. Химерні пептиди зберігають повнорозмірний відрізок послідовності з 4E-BP1, а також повнорозмірний пептид NRTN, що дає в сумі довжину 50 амінокислот. Таким чином, ці молекули істотно довше, ніж відомі пептиди CPP.

Амінокислотні послідовності активного і неактивного химерних пептидів NRTN/4E-BP1 були наступні:

NRTN4E-BP1 (SEQ ID NO: 78)

NRTNinact4E-BP1 (SEQ ID NO: 79)

Далі була проведена оцінка того, чи здатний химерний пептид NRTN4E-BP1 проникати через клітинні мембрани і тим самим індукувати про-апоптотическую активність всередині клітин. В якості моделі застосовували клітини раку молочної залози MCF-7. ЭксперименѾксических явищ при тестуванні пептидів 4E-BP1 і NRTN, відповідно, химерний пептид демонстрував помітне токсичну дію, що також виражається в індукції апоптозу (див. фіг.16, середня частина). Цей ефект був дозозалежним: цитотоксичність зростала при підвищенні концентрації пептиду.

Додатково, химерний пептид, що містить NRTN, демонстрував істотно більш високу ефективність у порівнянні зі своїм аналогом, що містить пептид TAT. Крім того, спостерігається цитотоксична дія специфічно опосередковується функціонально активної (тобто, має про-апоптотическим дією) частиною послідовності пептиду 4E-BP1, так як відповідний мутантний варіант химерного пептиду був неактивний (див. фіг.16, середня частина). Приєднання пептиду 4E-BP1 до пептиду WNT16 не справляло негативного впливу на життєздатність клітин.

Ці результати демонструють, що молекули, отримані в результаті з'єднання послідовностей, що походять від NRTN, з пептидами, які самі по собі не здатні проникати в клітини, можуть потрапляти всередину клітин і проявляти внутрішньоклітинну активність. Пряме порівняння з химерними пептидами, що містять пептид TAT, виявило, що химерні пептиди, що містять пептид NRTN, мають більш високу ефе�що несе зміни у своїй карбокси-кінцевий області, зберігає функціональну активність пептиду CPP. Нарешті, застосовуючи послідовності, що походять від NRTN, можна отримувати функціонально активні пептиди CPP, які мають довжину щонайменше 50 амінокислот.

Даний винахід, наочне описаний у цьому документі, може застосовуватись на практиці у відсутність будь-якого елементу або елементів, обмеження або обмежень, не розкритих спеціально в цьому документі. Таким чином, наприклад, терміни «містить», «включає» і т. д. слід розуміти в розширювальному тлумаченні і без обмежень. Додатково, що застосовуються в цьому документі терміни та вирази були використані в якості термінів і описів, і не накладають обмежень, а також у використанні таких термінів і виразів не є наміри виключити які-небудь особливості, еквівалентні продемонстрованим і описаних особливостей або їх частині, і зізнається, що у межах обсягу заявленого винаходу можливі різні модифікації. Таким чином, слід розуміти, що незважаючи на те, що даний винахід було специфічно розкрито з допомогою втілень і можливих особливостей, спеціаліст у цій галузі може вдатися до модифик�одят в обсяг цього винаходу.

У цьому документі винахід було описано в широкому сенсі і в загальних рисах. Кожен з більш вузьких видів і підгруп, які потрапляють у межі родового розкриття, також утворює частину винаходу. Сюди відноситься родове опис винаходу з позитивними і негативними ознаками, відсікають будь-який об'єкт від роду об'єктів, незважаючи на те, був чи виключається матеріал специфічно перераховано в цьому документі чи ні.

Інші втілення вказані у наведеній далі формулі винаходу. Крім того, у випадках, коли властивості або особливості винаходу описані в термінах груп Маркуша, фахівця в даній галузі буде зрозуміло, що винахід також тим самим описується в термінах будь-якого окремого члена або членів підгрупи групи Маркуша.

ТАБЛИЦЯ 1
Кандидатние пептиди CPP людини і контрольні пептиди, піддані експериментальній оцінці.
Контрольні пептиди виділені сірим кольором. У стовпці «Клас» зазначена функціональна класифікація пептидів з точки зору їх спроможності здійснювати трансфсические пептиди; «+/tox» - трансфецирующие токсичні пептиди; «+» - трансфицирующие нетоксические пептиди.
SEQ ID NO:НАЗВА ПЕПТИДУАМІНОКИСЛОТНА ПОСЛІДОВНІСТЬКЛАС
1TAT+
2NRTN+
3CPXM2+
4ASM3B+
5FGF12+/tox
6CU025+/tox
7IGS10CPXM+/tox
9CD026+/tox
10FALL39, вар. 1+/tox
11Полі-Arg+
12INF7+
13REV+
14Trunc_protamine (укорочений протамин)+
15Кротамин-
16/tr>
17Perforin_NT (перфорин_NT)-

18BPIL3 (38 а.к.)tox
19BPIL3 (30 а.к.)tox
20Дефенсин-Cons (CI,III,V,VI-S)tox
21LIP_Con_Ntox
22ApoL_cons_1tox
23ApoL_cons_2tox
24FAM5CFAM5Btox
26COOA1tox
27MMP25tox
28NETRtox
29SCUB3tox
30Дефенсин-Cons (CII,III,IV,VI-S)-
31Гранулизин, дикого типу-
32Гранулизин_G9-
3334CO6_mot1-
35CO8_mot1-
36CO9_mot1a-
37C09_mot1b-
38Perforin_SC (перфорин_SC)-
39Походить від фатора_Н_-
40LIP_Cons_C_WT-
41LIP_Cons_C_AA-
-

43CRSPL-
44ATS7-
45AREG-
46FA20A-
47GNAS3-
48PAP2-
49HISTATIN_1-
50HISTATIN_3-
52PROL4-
53YC002-
54CD029-
55TOR2-
56CO4AB-
57SULF1-
58PROK2-
59WNT16-
-
61APLD1-
62CBPN-
63CFAI-
64FGF5-
65LTB1L-
66LFTY1-
67LOXL3-
68PONL-
691. Композиція для доставки молекул нуклеїнових кислот в клітини, що містить щонайменше один пептид, приєднаний до однієї або кількох молекул нуклеїнових кислот, зазначений пептид здатний интернализироваться всередину клітини ссавця, де пептид:
(а) має аминокислотную послідовність, обрану з групи, що складається з:
і
амінокислотної послідовності, яка по всій своїй довжині щонайменше 92% сумарної ідентичністю послідовності стосовно будь-якої із послідовностей з SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 4; та
(б) интернализируется всередину клітини ссавця з ефективністю, що становить щонайменше 200% від ефективності інтерналізації пептиду ТАТ, має аминокислотную послідовність GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1);
при цьому приєднання здійснюють за допомогою зв'язування, вибраного з групи, що складається з ковалентного зв'язування і нековалентного зв'язування.

2. Композиція з п. 1, де щонайменше частина щонайменше одного пептиду утворює альфа-спіральну вторинну структуру.

3. Композиція з п. 1, де щонайменше один пептид є пептидом ссавців, переважно людського происхоо пептиду, визначеного у п. 1, здатного интернализироваться всередину клітини ссавця;
(б) здійснення контакту щонайменше одного пептиду з однією або декількома молекулами нуклеїнових кислот для того, щоб забезпечити здійснення приєднання.

5. Спосіб in vitro виявлення здібності до інтерналізації у композиції по кожному з пп. 1-3, включає:
(а) введення композиції по кожному з пп. 1-3 в одну або кілька клітин ссавця;
(б) виявлення інтерналізації пептиду або композиції.

6. Фармацевтична композиція для доставки молекул нуклеїнових кислот територію однієї або більше клітин ссавця, що містить композицію за будь-пп. 1-3 в ефективному кількості, і необов'язково додатково містить один або кілька фармацевтично прийнятних эксципиентов та/або добавок.

7. Застосування композиції на будь-якому з пп. 1-3 для in vitro трансформації або трансфекції однієї або декількох клітин ссавця.

8. Композиція по кожному з пп. 1-3 для застосування з метою профілактики або лікування стану, вибраного з групи, що складається з онкологічного захворювання, імунних захворювань, серцево-судинних захворювань, неврологічних захворювань, інфор�

 

Схожі патенти:

Спосіб аналізу рнк

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до способу аналізу придатності РНК, екстрагованої з тканини або клітини (клітин), фіксованих за допомогою фіксатора, для аналізу експресії генів. Спосіб включає проведення електрофорезу з зазначеної РНК. Визначають, чи відповідає зазначена РНК наступному рівнянню: В/А≤1, де А являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні від 1000 до 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом, а являє масове співвідношення (%) РНК в діапазоні більш ніж 4000 нуклеотидів до загальної маси РНК, що визначено електрофорезом. Якщо зазначена РНК, экстрагированная з тканини або клітини (клітин), що задовольняє вказаним рівнянню, то вона придатна для аналізу експресії генів. Запропоноване винахід дозволяє швидко і з високою ефективністю визначити придатність РНК для аналізу експресії генів. 6 з.п. ф-ли, 3 іл., 11 табл., 7 пр.

Виборчий лізис клітин

Група винаходів відноситься до області лізису клітин. Запропоновано спосіб виборчого лізису клітин тварин, а також прилад для виявлення мікроорганізмів. Спосіб виборчого лізису тварин клітин в пробі води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, включає етапи забезпечення проби води з тваринами клітинами, що містить або, можливо, містить мікроорганізми, додавання в згадану пробу неіоногенної детергенту і буферного розчину для одержання розчину зі значенням pH близько 9,5 або вище, інкубації цього розчину протягом періоду, достатнього для лізису клітин тварин. Прилад для виявлення мікроорганізмів у пробі складається з лизисной камери для прийняття проби води з тваринами клітинами, посудини з лужним буферним розчином із значенням pH 9,5 або вище і неіоногенним детергентом, або посудини з лужним буферним розчином із значенням pH близько 9,5 або більше і посудини з неіоногенним детергентом, фільтра, сполученого з лизисной камерою для фільтрування проби після лізису клітин тварин, камери індикації для аналізу присутності ДНК мікроорганізмів. Запропоновані винаходу забезпечують обробку зразка без його значного брабативать більш значні обсяги зразка і визначати низькі концентрації хвороботворних мікроорганізмів у зразку. 2 н. і 11 з.п. ф-ли, 12 іл., 8 пр.

Спосіб диференціації токсигенних генетично змінених штамів vibrio cholerae біовару ель-тор з різним епідемічним потенціалом методом мультиплексного полімеразної ланцюгової реакції та тест-система для його здійснення

Винаходи належать до галузі медичної мікробіології і стосуються способу диференціації токсигенних генетично змінених штамів V. cholerae біовару Ель-Тор і тест-системи. Охарактеризований спосіб включає проведення ПЛР з використанням специфічних праймерів до генам vc0497, vc0502 і vc0514 з острова пандемичности VSP-II. Охарактеризована тест-система містить компоненти для виділення ДНК, компоненти для проведення ПЛР, що включають, зокрема, суміш праймерів VSPIIreg-F - 5'-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3', VSPIIreg-R - 5'-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3' ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5'-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3', VSPIIpilin-R - 5'-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3' ген vc0502, VSPIIchem-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3', VSPIIchem-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3' ген vc0514, взятих у співвідношенні 1:1:1:1:1:1 відповідно. Винаходи дозволяють швидко і достовірно диференціювати токсигенні генетично змінені штами V. cholerae біовару Ель-Тор на геноварианти з низьким і високим епідемічним потенціалом. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 2 табл.

Спосіб виявлення мутацій в гені myo7a, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти і синдромом ушера

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу виявлення мутацій в гені MYO7A, що супроводжуються розвитком несиндромальной аутосомно-рецесивною глухоти або синдром Ушера. Спосіб включає виділення ДНК з лімфоцитів периферичної крові методом фенольно-хлороформною екстракції, проведення ПЛР, ампліфікацію 18 ділянок гена MYO7A, детекцію в денатурирующем акриламидном гелі і секвенування. ПЛР проводять з використанням спеціально підібраних послідовностей олігонуклеотидів, фланкують області 18 екзонів гена MYO7A з можливим вмістом різних мутацій. Винахід дозволяє спростити спосіб і підвищити точність визначення мутацій гена MYO7A, а також скоротити час дослідження. 3 іл., 1 пр.
Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується специфічних олігонуклеотидних праймерів. Представлені праймери включають сайти эндонуклеазного розщеплення, фланкуючі ділянки геному, що кодують глікопротеїни Gn і Gc, а також нуклеопротеин N, для отримання бібліотеки генів, що кодують глікопротеїни Gn і Gc і нуклеопротеин N вірусу лихоманки долини Ріфт. Охарактеризованное винахід може бути використаний у створенні банку нуклеотидних послідовностей, що кодують імунодомінантні білки вірусу лихоманки долини Ріфт Gn, Gc і N, які можна використовувати при створенні діагностичних і вакцинних препаратів на основі рекомбінантних технологій. 3пр.

Олігонуклеотидні праймери і спосіб виявлення днк mycobacterium avium методом полімеразної ланцюгової реакції

Винаходи належать до галузі біотехнології і стосуються олігонуклеотидних праймерів і способи виявлення ДНК Mycobacterium avium з їх використанням. Охарактеризовані олігонуклеотидні праймери комплементарни специфічної області mig-гена Mycobacterium avium і мають наступний нуклеотидний склад: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' та 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Спосіб виявлення ДНК Mycobacterium avium вимикає виділення ДНК, проведення ампліфікації ДНК з використанням олігонуклеотидних праймерів, перенесення продукту ампліфікації на гель з подальшим детектуванням результатів аналізу на трансиллюминаторе. У разі позитивної реакції синтезується фрагмент, відповідний розміру 157 п. н. Представлені винаходи можуть використовуватися у ветеринарних діагностичних і науково-практичних лабораторіях для виявлення генетичного матеріалу Mycobacterium avium у пробах. 2 н. п. ф-ли, 1 іл., 4 пр.

Набір синтетичних олігонуклеотидів для визначення нуклеотидної послідовності кодуючої частини генів nkx2.5, cfc1, gata4 і виявлення мутацій, асоційованих з орфанной моногенной патології, яка лежить в основі сімейних форм вроджених вад серця

Винахід відноситься до галузі кардіології і стосується набору синтетичних олигонуклотидов. Представлений набір використовується для виявлення мутацій кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4, асоційованих з орфанной моногенной патології, яка лежить в основі сімейних форм вроджених вад серця. Мутації виявляють шляхом визначення повної нуклеотидної послідовності кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4. Здійснюють ампліфікацію кодуючої частини генів NKX2.5, CFC1, GATA4 з допомогою 15 пар синтетичних олігонуклеотидів при одній температурі та часу відпалу з подальшим секвенированием отриманих продуктів ампліфікації за допомогою однієї пари універсальних праймерів. Запропоноване винахід дозволяє чутливо і специфічно визначати мутації генів NKX2.5, CFC1, GATA4, при цьому скорочуються час реакції ампліфікації, кількість маніпуляцій, час внесення реактивів для реакції секвенування і знижується ймовірність помилки при постановці реакції. 2 з.п. ф-ли, 1 іл., 4 табл.

Пара синтетичних олігонуклеотидних праймерів для виявлення вірусу імунодефіциту кішок і спосіб діагностики вірусного імунодефіциту кішок

Винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до пари синтетичних олігонуклеотидних праймерів, які застосовуються для виділення ДНК провірусу і РНК вірусу імунодефіциту кішок, і до способу діагностики вірусного імунодефіциту кішок з використанням даних праймерів. Пара праймерів має наступну структуру - PF: 5'-TGGAGAAGGGAATTTCAGATGGG-3' та PR: 5'-TTTGGGTCAAGTGCTACATATTGTGG-3'. Спосіб включає проведення ПЛР з детекцією отриманих результатів методом горизонтального електрофорезу в 1,5%-ному агарозному гелі. Ампліфікацію проводять в такому режимі: тотальна денатурація при 95°С протягом 5 хв, цикл денатурація при 95°С протягом 20 або 60 с, відпал при 56°С протягом 20 або 60 сек, елонгація при 72°С протягом 40 або 60 сек. Цикл денатурація - відпал - елонгація повторюється 35 разів. Проводять заключну элонгацию при 72°С протягом 5 хв. У разі наявності ампліфікованого фрагмента нуклеотидної послідовності довжиною 366 п. н. судять про наявність FIV в організмі кішки. Запропоноване винахід дозволяє провести діагностику вірусного імунодефіциту кішок з високою ефективністю. 2 н. п. ф-ли, 6 іл., 3 табл., 3 пр.

Набір олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації рнк вірусу лихоманки долини ріфт методом від плр у реальному часі

Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до набору олігонуклеотидних праймерів і флуоресцентно-міченого зонда для ідентифікації вірусу лихоманки долини Ріфт методом назад транскриптазной полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Винахід дозволяє ефективно ідентифікувати вірус лихоманки долини Ріфт. 2 іл., 2 табл., 2 пр.
Винахід відноситься до галузі біохімії, зокрема до способу подвидовой диференціації штамів збудника чуми. Спосіб передбачає виділення ДНК, проведення ПЛР з використанням синтезованих праймерів для ампліфікації фрагментів межгенних ділянок wzyE-dapF і YPDF_0064-YPDSF_0065 досліджуваного штаму. Диференціацію здійснюють шляхом порівняння розмірів отриманих ампліконів досліджуваного штаму з розмірами аналогічних фрагментів, характерних для штамів основного (151 п. н. і 374 п. н.), кавказького (185 п. н. і 434 п. н.), алтайського і гіссарського (202 п. н. і 374 п. н.), а також улегейского (185 п. н. і 374 п. н.) підвидів. Винахід дозволяє ефективно проводити подвидовую диференціацію штамів Y. pestis і значно скоротити час виконання аналізу. 4 пр.

Спосіб поділу лактоферринов людини і кози з допомогою диференціальної иммуноаффинной хроматографії з використанням однодоменних міні-антитіл

Винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до способу поділу лактоферринов людини і кози. Спосіб включає иммуноафинную хроматографію з використанням міні-антитіл a-hLF-1 і a-hLF-4, амінокислотні послідовності яких представлені як SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2. Винахід може застосовуватися для отримання високоочищений фракції лактоферрина людини. Запропоноване винахід дозволяє з високою ефективністю здійснювати поділ білків лактоферринов людини і кози, що міститься в молоці, з допомогою однодоменних міні-антитіл. 6 іл., 2 пр.

Модифікований биотинсвязивающий білок (варіант), нуклеїнова кислота його кодує, вектор і носій для зв'язування біотину

Представлені винаходи стосуються модифікованого білка і нуклеїнової кислоти, кодує такий білок, вектора, що містить нуклеїнову кислоту і носія для зв'язування біотину, на якому іммобілізований такий білок. Охарактеризований модифікований биотинсвязивающий білок отримано введенням мутації від одного до декількох амінокислотних залишків у послідовність, представлену в SEQ ID NO:2, або аминокислотную послідовність, ідентичну на 98% або більше зазначеної послідовності, і наявністю биотинсвязивающей активності, де щонайменше один залишок, обраний із групи, що складається із залишків від 1 до 4), представлених нижче, замінений залишком кислої амінокислоти або залишком нейтральною амінокислоти: 1) залишку на аргінін в положенні 104 SEQ ID NO: 2; 2) залишку лізину в положенні 141 SEQ ID NO: 2; 3) залишку лізину у положенні 26 SEQ ID NO: 2 і 4) залишку лізину в положенні 73 SEQ ID NO: 2. Запропоновані винаходи дозволяють отримати биотинсвязивающий білок і можуть бути застосовні для зв'язування біотину. 5 н. і 9 з.п. ф-ли, 6 іл., 11 табл., 3 пр.

Экспрессионная плазміда, що містить фрагмент днк, що кодує мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, бактерія e. coli - продуцент білка-попередника мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, спосіб отримання рекомбінантного мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, рекомбінантний мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом

Экспрессионная плазміда, що містить фрагмент днк, що кодує мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, бактерія e. coli - продуцент білка-попередника мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, спосіб отримання рекомбінантного мутеина [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом, рекомбінантний мутеин [c245s] тканинного фактора людини з неотделяемим с-кінцевим тагом // 2550027
Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використане для рекомбінантного отримання тканинного фактора людини (чТФ). Конструюють плазміду pHYP-10ETFCS6 довжиною 5912 п. о. з фізичною картою, представленої на Фіг. 2, для експресії в бактерії роду Escherichia попередника мутеина [C245S] чТФ, що містить отщепляемий N-кінцевий лидерний пептид, що містить декагистидиновий кластер і послідовність впізнавання ентерокінази, злиту в рамці з послідовністю, кодує зазначений мутеин, злитий в рамці з послідовністю, кодує додатковий неотщепляемий C-кінцевий пептид, що містить гексагистидиновий кластер. Спосіб отримання попередника мутеина [C245S] чТФ включає культивування бактерії-продуцента в живильному середовищі, виділення тілець включення, солюбилизацию білка-попередника, металлохелатную хроматографію в денатуруючих умовах, рефолдинг і диафильтрацию розчину білка. Спосіб отримання зрілого мутеина [C245S] чТФ, включає відділення N-кінцевого лидерного пептиду від вказаного попередника мутеина з використанням ентерокінази і виділення цільового білка. Винахід дозволяє підвищити рівень біосинтезу і вихід прокоагуляционно актив�

Спосіб мікробіологічного синтезу гібридного білка е7-hsp70 (варіанти)

Група винаходів відноситься до варіантів способу мікробіологічного синтезу гібридного білка E7-HSP70. Синтез білка E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 або E7(18)-HSP70 здійснюють шляхом культивування відповідно штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae МКПМ Y-3919, штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae МКПМ Y-3853, штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae МКПМ Y-4057 або штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae МКПМ Y-4058 у відповідних умовах на середовищі, що містить в якості джерела вуглецю сахарозу. Процес культивування здійснюють у дві фази. Першу фазу здійснюють при температурі 25-26°C і початкової концентрації сахарози 25-30 г/л. По досягненні концентрації сахарози в середовищі 15 мг/л проводять другу фазу процесу культивування, на якій температуру знижують і підтримують на рівні не більше 23°C, значення pH підтримують на рівні 5,7-5,9, а концентрацію сахарози підтримують шляхом експоненційної підживлення на рівні 15 мг/л. Група винаходів забезпечує отримання цільового продукту в кількості не менше 550 мг/л і дозволяє здійснювати процес культивування протягом не більше 65 4 ч. н. п. ф-ли, 12 іл., 4 пр.

Плазміда для експресії в клітці китайського хом'ячка, клітина китайського хом'ячка - продуцент білка з gla-доменом і спосіб отримання білка з gla-доменом

Даний винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використано для отримання рекомбінантних білків з Gla-доменом в клітинах китайського хом'ячка. Сконструйована плазміда для експресії в клітці китайського хом'яка, в такій послідовності, по суті, містить наступні елементи: область початку реплікації плазміди pUC; відкрита рамка зчитування бета-лактамази, що забезпечує стійкість до ампіциліну; прокариотический промотор гена bla; ділянка термінального повтору вірусу Епштейна-Барр людини; функціональний промотор гена фактора елонгації 1 альфа китайського хом'ячка, 5' нетранслируемая область цього гена і нетранскрибируемая область, фланкирующая цей ген; область, кодує послідовність Козак для кеп-залежної ініціації трансляції; ОРС субодиниці гена 1 комплексу 2,3-эпоксиредуктази вітаміну К (VKORC1) китайського хом'ячка зі стоп-кодоном; функціональний термінатор і сигнал полиаденилирования гена фактора елонгації 1 альфа китайського хом'яка, 3' нетранслируемая область цього гена і нетранскрибируемая область, фланкирующая цей ген; промотор ранніх генів вірусу SV40; ген стійкості до селекционному агенту; і сигнал полиаденилирования і термін�, які використовують в способі рекомбінантного отримання білків з Gla-доменом. Винахід дозволяє підвищити продуктивність вказаних клітин за рахунок підвищення активності нативного VKORC1. 3 н. і 9 з.п. ф-ли, 12 іл., 2 табл., 8 пр.

Нові похідні інсуліну з сильно уповільненим профілем час/дію

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до нових аналогів інсуліну, і може бути використане в медицині. Зазначений аналог інсуліну характеризується однією з таких структур: Arg(A0), His(A8), Gly(A21), Arg(В31), Arg(В32)-NH2-інсулін; His(A8), Gly(A21), Arg(В31), Arg(В32)-NH2-інсулін; Arg(А0), Glu(A15), His(A8), Gly(A21), Arg(В31), Arg(В32)-NH2-інсулін. Винахід відноситься до способу отримання зазначеного аналога, фармацевтичної композиції та лікарського засобу, що передбачає його використання для лікування цукрового діабету. Винахід дозволяє отримати аналог інсуліну, що характеризується затриманим вивільненням і рівним і більш тривалою дією, наприклад, у порівнянні з людським інсуліном або інсуліном гларгином. 6 н. і 12 з.п. ф-ли, 2 іл., 24 пр.

Лейколектини та їх застосування

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до лейколектинам, і може бути використане в медицині. Отримано поліпептид лейколектин, що характеризується SEQ ID NO:1-8. Для рекомбінантного отримання лейколектина використовують кодує його нуклеїнову кислоту, вбудовану в вектор експресії, яким трансформують клітини-господаря. Для визначення присутності або визначення кількості поліпептидів лейколектина у зразку використовують антитіло або антиген-зв'язуючий фрагмент змінної області зазначеного антитіла, який специфічно зв'язується з поліпептидом лейколектином. Поліпептид лейколектин або кодує його нуклеїнову кислоту використовують у складі фармацевтичної композиції в терапії патологічних порушень шкіри і слизових. Винахід дозволяє ефективно лікувати або проводити профілактику аутоімунних порушень шкіри, запальних захворювань шкіри або слизової оболонки, або пошкодженої шкіри тварини. 11 н. і 5 з.п. ф-ли, 19 іл., 3 табл., 12 пр.

Модифікований фактор віллебранда з подовженим напівперіодом існування in vivo, його застосування та способи отримання

Винахід відноситься до галузі біотехнології, конкретно до модифікованому фактору Віллебранда (VWF), і може бути використане в медицині. Рекомбінантним шляхом отримують модифікований VWF, злитий в С-кінцевій частині свого первинного продукту трансляції з N-кінцевою частиною альбуміну допомогою лінкера SSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS. Отриманий модифікований VWF використовують у складі фармацевтичної композиції для лікування або профілактики порушення згортання крові. Винахід дозволяє отримати модифікований VWF, який зберігає здатність до N-кінцевий дімерізаціі і С-кінцевої мультимеризации, маючи при цьому подовжений напівперіод функціонального існування в плазмі крові порівняно з напівперіодом функціонального існування VWF. 8 н. і 9 з.п. ф-ли, 5 іл., 4 табл., 11 пр.

L-фукоза α1→6 специфічний лектин

Група винаходів відноситься до галузі біохімії. Запропоновано L-фукоза α1→6-специфічний лектин, экстрагируемий з базидиального гриба або сумчастого гриба, що характеризується піковим значенням молекулярної маси близько 4500 m/z, що визначаються при мас-спектрометрическом аналізі MALDI-TOF. Новий L-фукоза α1→6-специфічний лектин володіє високою спорідненістю до L-фукоза α1→6 цукрових ланцюга, визначається константою асоціації 1,0×104 М-1 або більше (при 25ºС), і має константу асоціації 1,0×103 М-1 або менше (при 25ºС) з високоманнозними цукровими ланцюгами і/або гликолипидами, не містять L-фукоза α1→6 цукрову ланцюг. В одному варіанті запропонований L-фукоза α1→6 специфічний лектин являє собою білок або пептид, що складається з амінокислотної послідовності, обраної з SEQ ID NO:2-6. L-фукоза α1→6-специфічний лектин використовують для специфічного виявлення L-фукоза α1→6 цукрових ланцюга і ефективного очищення L-фукоза α1→6 цукрових ланцюга або цукровою ланцюга, не містить L-фукозу α1→6. 6 н. і 10 з.п. ф-ли, 38 іл., 8 табл., 4 пр.

Мутант важкої ланцюга, що приводить до підвищеного вироблення імуноглобуліну

Даний винахід відноситься до імунології та біотехнології. Запропоновані варіанти нуклеїнових кислот, кожен з яких кодує аминокислотную послідовність важкої ланцюга імуноглобуліну IgG1. Ланцюг містить на С-кінці СН3-домену гліцин-лизиновий дипептид, який кодується кодоном ggaaaa, ggcaaa або gggaaa. Описані: плазміда, що кодує важку ланцюг імуноглобуліну; клітини-варіанти, що забезпечують експресію імуноглобуліну IgG1; спосіб отримання імуноглобуліну в клітинах ссавця; спосіб поліпшення експресії імуноглобуліну в клітинах ссавця; - використовують варіанти нуклеїнової кислоти. Використання винаходу забезпечує попередження експресії побічного продукту масою 80 кДа, що може знайти застосування при виробництві імуноглобулінів. 7 н. і 11 з.п. ф-ли, 7 іл., 3 табл., 6 пр.

Рекомбінантна плазмидная днк, що кодує химерное антитіло проти фактора некрозу пухлини-альфа людини, лінія экуариотических клітин-продуцент химерного антитіла і спосіб отримання химерного антитіла

Група винаходів відноситься до галузі біотехнології. Запропоновано рекомбінантна плазмидная ДНК, що кодує химерное антитіло проти фактора некрозу пухлин-альфа людини (ФНП-альфа), на основі плазміди pOptiVECTM-TOPO®. Розглянуто лінія эукариотических кліток в якості продуцента антитіла проти ФНП-альфа, спосіб її отримання шляхом трансфекції плазмідної ДНК з винаходу, а також спосіб отримання химерного антитіла проти ФНП-альфа шляхом культивування лінії клітин по винаходу. Даний винахід забезпечує збільшення рівня синтезу антитіл проти ФНП-альфа клітинами-продуцентами. 4 н. і 8 з.п. ф-ли, 8 іл., 1 табл., 3 пр.
Up!